WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

       

На правах рукописи

БЕККУЖИНА САРА САБДЕНОВНА

ГАПЛОИДНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В УСКОРЕННОМ СОЗДАНИИ ИСХОДНЫХ ФОРМ И ЛИНИЙ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ, УСТОЙЧИВЫХ К ЗАСУХЕ И SEPTORIA NODORUM BERK.

Специальность: 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Казахском агротехническом университете

им. С. Сейфуллина

Научный консультант:

доктор биологических наук, Калашникова

профессор Елена Анатольевна 

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Поляков

профессор Алексей Васильевич

доктор сельскохозяйственных наук,  Зыкин

академик РАСХН  Владимир Александрович

доктор сельскохозяйственных наук  Шмыкова 

  Наталья Анатольевна

Ведущая организация: ГНУ Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Юго-Востока

Защита состоится 27  апреля 2011 г. в  14-30 часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете-МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д.49. Факс (499) 976-24-92.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан _____  марта 2011 г. и размещен на сайте http://www.vak.edu.gov.ru

Ученый секретарь

диссертационного совета  Л.С. Большакова

       

       

Актуальность проблемы. Расширение генетического базиса методами селекции на уровне соматических и репродуктивных клеток с включением измененных вариантов, а также константных форм, полученных с помощью гаплоидных технологий в схему традиционной селекции, может обеспечить значительный успех в селекции яровой мягкой пшеницы. Комплексное применение отбора клеточных популяций в селективных условиях и методов гаплоидии повышает эффективность получения растений устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам (В.С. Шевелуха и др., 2008). Кроме того, ускоренное размножение дигаплоидных линий и их включение в различные схемы скрещиваний в настоящее время дает практические результаты.

       Яровая мягкая пшеница — важнейшая зерновая культура для хлебных районов Северного Казахстана, урожайность которой в Казахстане за последние 10 лет не превышает 1 тонну с гектара, что значительно ниже средних мировых показателей. Это обусловлено почвенно-климатическими условиями Казахстана, сокращением водообеспеченности, засухой, появлением опасных возбудителей болезней, которые являются сдерживающими факторами повышения продуктивности пшеницы. В последние годы распространение болезней зерновых культур наносит значительный ущерб  продуктивности и качеству зерна. В рамках сотрудничества Международного центра СИММИТ и сельскохозяйственных НИУ  обследованы в северных  регионах Казахстана поля озимой и яровой мягкой пшеницы и ячменя, в результате чего установлено, что распространение особо опасных возбудителей болезней выглядит следующим образом:  Tan spot - 10-36%, Septoria nodorum - 3-21%, Bipolaris sorokiniana - 5-9%, Septoria tritici - 7% (Duveiller, 2007). В регионе массовое заболевание септориозом  посевов яровой мягкой пшеницы наблюдается в середине и в конце июля из-за заражения пикноспорами, заселяющих пожнивные остатки (Койшибаев, 2006).

       Комплексное применение скрининга клеточных популяций в условиях селекции in vitro повышает эффективность отбора яровой мягкой пшеницы к биотическому стрессу.

       Исходя из выше изложенного,  работа по усовершенствованию схемы селекции пшеницы в условиях in vitro, включающей все звенья отбора клеток под действием различных селективных агентов является актуальной.

       Цель и задачи исследования. Цель исследований — создание технологической цепи, включающей традиционные методы селекции и биотехнологические методы, путем усовершенствования эффективности гаплоидных технологий при отборе  яровой мягкой пшеницы на устойчивость к водному дефициту и к фитопатогенному грибу Septoria nodorum Вerk.

       Задачи исследований:

  • создать экспериментальную систему повышения эффективности пыльцевого эмбриогенеза  и  выяснить роль гормональных предобработок растений-доноров в индукции спорофитного пути развития микроспор яровой мягкой пшеницы;
  • провести селекцию на уровне гамет и гаметоклональных вариантов на толерантность к абиотическим факторам окружающей среды (водный стресс);
  • выявить лучшие формы селективного агента для проведения селекции in vitro к грибному патогену Septoria nodorum Вerk. Провести отбор эмбриоидов и размножить полученные линии, устойчивые к экзометаболитам гриба S. nodorum;
  • создать новые перспективные формы и линии яровой мягкой пшеницы с ценными хозяйственно-биологическими признаками на основе сочетания традиционных и биотехнологических методов с последующим  включением их в селекционные программы для облегчения и ускорения селекционного процесса и расширения генетического базиса селекции пшеницы;
  • изучить возможность использования белковых и молекулярных маркеров для отбора перспективных форм яровой пшеницы в ранних поколениях.

       Научная новизна работы. Разработана технология, сочетающая традиционные и биотехнологические подходы, обеспечивающие расширение генетического базиса селекции яровой мягкой пшеницы.

Создана экспериментальная система повышения эффективности пыльцевого эмбриогенеза  и  выявлена роль гормональных предобработок растений-доноров в индукции спорофитного пути развития микроспор яровой мягкой пшеницы. Установлено, что гормоны ауксинового типа действия – ИУК, 2,4-D при обработке растений-доноров, с учетом содержания  эндогенного ИУК, стимулируют процесс андрогенеза in vitro. Выявлено, что при предобработке ИУК срезанных растений, эмбриоиды  индуцируются из поздних стадий развития микроспор, возможно из пыльцевого зерна. Кроме того, установлено, что предобработка срезанных растений аконитовой кислотой приводит к 100% выживанию индуцированных эмбриоидов и формированию из них растений-регенерантов.

Впервые показана возможность разработки новой модификации технологии гаметной селекции, основанной на использовании активно растущего мужского гаметофита для повышения эффективности получения спорофитной генерации. Такой подход позволил получить новые линии яровой мягкой пшеницы, устойчивые к засухе.

  Константные  формы, а также гаметоклональные варианты включены в программу селекции  пшеницы на устойчивость к водному дефициту. Линии-регенеранты превысили стандарт (сорт Акмола 2) по продуктивности и проявили устойчивость к засухе и к полеганию. Полученные линии, в сравнении со стандартом, отличались по своим анатомо-морфологическим признакам и по архитектонике.

       Впервые для селекции клеточных колоний пшеницы in vitro, устойчивых к экзометаболитам гриба Septoria nodorum Вerk, одновременно применен отбор на уровне репродуктивных и соматических клеток при поверхностном и глубинном выращивании каллусных культур.

       Выявлены гибридные  комбинации с большим содержанием МДГ-ГОАТ (малатдегидрогеназа-глутамат-оксалоацетат аминотрансфераза) по сравнению с родительскими формами. Малатдегидрогеназный комплекс позволяет отобрать ценные линии на устойчивость к засухе в ранних поколениях.

       С помощью RAPD-метода выявлены изменения в геноме потомства растений-регенерантов пшеницы, полученных в результате применения гаплоидных технологий. Определены генетические расстояния между дигаплоидной линией и исходным сортом, а также гаметоклональными вариантами, отражающие степень различия  их геномов.

­        Практическая значимость работы. Отобранные в культуре пыльников яровой мягкой пшеницы линии переданы селекционным учреждениям, расположенным в различных регионах Казахстана (НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева, Карабалыкская СХОС, Актюбинский селекционный центр) для селекционной оценки и включения в гибридизацию. Перспективные  линии будут переданы на ГСИ.

       Разработанная нами технология получения перспективных форм и линий яровой мягкой пшеницы на основе сочетания традиционных и биотехнологических методов селекции, может быть применена и к другим злаковым культурам.

Полученные результаты используются в учебном процессе при чтении лекций и проведения лабораторно-практических занятий по курсу «Биотехнология растений» и «Биотехнология сельскохозяйственных культур» в Казахском агротехническом университете им. С. Сейфуллина. Основные результаты исследований по гаметоклональной селекции  растений вошли в учебник «сімдік биотехнологиясы» (С.С. Беккужина, 2009), рекомендованный Министерством образования и науки РК для преподавания в биологических и агрономических факультетах ВУЗов.

В результате исследований разработан способ получения гаплоидных растений пшеницы с повышенным регенерационным потенциалом, на который получен инновационный патент (2007/0161.1.).

       Основные положения, выносимые на защиту:

­­­        - Разработана экспериментальная система, способствующая повышению компетенции микроспор для эффективного использования гаплоидной технологии по расширению генетической основы яровой мягкой пшеницы. Баланс фитогормонов является одним из ключевых  механизмов переключения микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития. У растений-доноров с высоким эндогенным содержанием индолилуксусной кислоты при их дополнительной обработке экзогенной ИУК повышается эффективность пыльцевого эмбриогенеза.

-  Создана схема селекции на уровне репродуктивных и соматических клеток, позволяющая отбирать клеточные линии, устойчивые к засухе используя АБК, как фактор, моделирующий водный дефицит. Для получения форм устойчивых к S. nodorum Вerk. в качестве селективного агента целесообразно использовать водную форму фильтрата фитопатогенного гриба S. nodorum Вerk.

       - Создана технология, сочетающая традиционные методы селекции и методы биотехнологии для ускорения селекции яровой мягкой пшеницы по отбору ценных признаков на продуктивность и стрессоустойчивость. Включение потомства растений-регенерантов в схемы классической селекции  выявило преимущества комплексного использования этих методов по выявлению  линий, обладающих хозяйственно-ценными признаками.

- Белковые и молекулярные маркеры позволяют отбирать перспективные формы яровой мягкой пшеницы в ранних поколениях.

       Апробация работы. Основные положения работы доложены и представлены на различных международных, республиканских конференциях, симпозиумах и совещаниях, в том числе на Международном симпозиуме  «Устойчивость растений к биотическим и абиотическим факторам» (Берлин, 2009); Международном микологическом форуме (Москва, 2009, 2010); Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2009); Международной научной конференции «Актуальные вопросы биологии в Байкальском регионе» (Иркутск, 2009); IX Конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Москва, 2008); Международной конференции, посвященной 40-летию ГосНИИгенетика (Москва, 2008); Российской конференции «Генетика микроорганизмов», посвященной 100-летию со дня рождения С.А. Алиханяна (Москва-Пущино-на-Оке, 2006); Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию РГП «НПЦ ЗХ им. А.И.Бараева» (Шортанды, 2006); Международной конференции, посвященной 50-летию КазАТУ им. С. Сейфуллина (Астана, 2007); Международной конференции «Развитие ключевых направлений сельскохозяйственных наук в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы» (Астана, 2004);на Координационном совещании по Государственной программе 042 (Шортанды, 2001-2005).

       Связь работы с крупными научными программами. Теоретические и экспериментальные исследования по диссертационной работе тесно связаны с выполнением Республиканских научных программ Министерства сельского хозяйства и Министерства образования и науки по проектам:

- «Расширение генетического базиса яровой мягкой пшеницы с помощью DH-метода»;

-«Усовершенствование методов селекции пшеницы на уровне клеток, выяснение механизмов, обеспечивающих устойчивость к биотическим факторам в морфогенетическом цикле «клетка-растение-клетка».

       Публикации Основные положения диссертации изложены в 55 печатных работах, включая научные статьи, тезисы докладов, учебник, учебное пособие, методические рекомендации, инновационный патент. 

       Личный вклад автора. Экспериментальные результаты получены автором лично и совместно с коллегами из Института биологии и биотехнологии, центра биотехнологии Республики Казахстан, Института Молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина, Института проблем биологической безопасности, НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева, РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, Карабалыкской СХОС. Авторство указано в списке опубликованных работ, приведенных в диссертации и в автореферате. 

       Формулировка идей, планирование экспериментов, обработка первичных данных, их статистико-математический анализ и теоретическое обобщение результатов выполнены диссертантом. Диссертационная работа полностью написана лично автором.

Обоснованность и достоверность научных положений и выводов обеспечивается анализом обширного экспериментального материала, полученного в течение 17 лет, с использованием общепринятых и современных методик, а также разработанных нами методик и статистической обработкой результатов исследований с оценкой их точности и достоверности.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и 3 глав: обзора литературы, объектов и методов исследований, результатов и их обсуждения (7 разделов), а также выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Диссертация изложена на  страницах машинописного текста, содержит 46 таблиц, 72 рисунка. Список литературы включает  источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объектов исследований использовали яровую мягкую пшеницу Triticum aestivum L.

Пшеницу выращивали на экспериментальном участке КазАТУ им. С.Сейфуллина на мелких делянках, а также в вегетационных сосудах. В исследованиях использованы сорта, линии и гибриды пшеницы (табл.1), предложенные селекционерами НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева.

Селекцию на уровне клеток проводили на сортах, устойчивых к фитопатогенному грибу Septoria nodorum Вerk. и на линиях, отобранных в культуре пыльников.

       Селекционую оценку проводили в НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева для линий, индуцированных в культуре in vitro.

Для биохимических анализов и RAPD-анализа использовали перспективные линии и гаметоклональные варианты, полученные в культуре in vitro, а также гибриды яровой мягкой пшеницы.

Методы исследований. Исследования по культуре клеток и тканей растений проводили по общепринятой методике (Бутенко, 1999).        

       Культивирование пыльников проводили по методике Т.И. Дьячук и др. (1989), а также согласно нашим модификациям, описанным в методических рекомендациях по культивированию пыльников (Беккужина, 1999).

При предобработке срезанных растений пшеницы холодом использовали вещества гормональной природы, а также БАВ (феруловую и аконитовую кислоты). В качестве гормональных веществ изучали действие 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D), индолилуксусной кислоты (ИУК), кинетина, гибберелловой кислоты (ГК) и абсцизовой килоты (АБК). Срезанные растения помещали в растворы гормонов и БАВ в концентрации 0,005 - 0,1% и размещали в холодильной камере при температуре +40С. Математическую обработку данных проводили по И.И. Елисеевой (2009), А.В.Смиряеву с соавторами (2007), Г.Ф. Лакину (1980) и др., рассчитывали уравнения регрессии и R2 — коэффициент детерминации.

Таблица 1. Сорта, гибриды и линии яровой мягкой пшеницы, использованные в работе

Сорта

Линии

Гибриды

Акмола 2 1-2-4

Ю580R1-2-3

К 6506 (США) * Ю 580 R2-4

Казахстанская

раннеспелая1

ЛГВ2-92-21-2-3

Grapp (Франция) * Ю 580 R2-4

Омская 321 

ЛГВ1-92-21-2-3

Fason (Германия) * Ю 580 R2-4

Ишимская 981

ЛГВ3 -692-3-51-2-3

Tantra (Норвегия) * Ю 580 R2-4

Целинная Юбилейная1-2-3

АR-451-2

Dos x HXL1

Kau/Kauz/Star1

93с1

ZelxDuk1

Кустанайская 11

96 с1

TJBx Ишимская1


Эритроспермум 141

Лютесценс 164/882

Cardinal (Германия) * Ю 5802-4 R


Целинная 3с1

Лютесценс 94/91-962

Bancuti 118 (Венгрия) * Ю2-4 580 R


Целинная 3с1

Лютесценс 157/882

WW 17260 (Швеция) * Ю2-4 580 R


Ишимская 921

Лютесценс 101/882

AR-45  *  Ю 580 R2-4


Досты1

Лютесценс 9/892

Л-16 ячменно-пшеничная линия (Новосибирская обл.)  *  Ю 580R2-4


Лютесценс 11-94-1113

Ф-45 ячменно-пшеничная линия (Новосибирская обл.) *Ю 580R2-4


Л-29-943

Ю 580R * (Кенжегали * Скала) 2-4


Лютесценс 381 МS3

Гибриды F1 c 1 по  19 номера1


Шортандинская 25*Акмола 40) * Ю 580R2-4


Гибриды F1 с номерами 22/2000 40/2000, 46/2000, 47/2000, 54/2000,

56/2000, 57/2000, 61/2000, 62/2000,  64/2000, 65/2000, 76/2000, 68/2000,

72/2000, 73/2000, 78/2000, 87/2000

20/2000, 98/20002

Примечание: индексами отмечены объекты, использованные в экспериментальных исследованиях: 1 – гаплоидные технологии; 2 – биохимические и ДНК-анализы; 3 – селекция in vitro на устойчивость к Septoria nodorum; 4 – селекционная  оценка.

       Анализ микроспор и пыльцевых зёрен. Цитологические исследования проводили по общепринятым методикам (Паушева, 1970; Кихара, 1968). Работа выполнена в Национальном центре биотехнологии РК (НЦБ РК) в рамках совместной финансируемой научной программы в 2001-2005 годах (Беккужина, Созинова, 2009), в Институте биологии и биотехнологии.

Культивирование пыльников в стрессовых условиях на засухоустойчивость. При гаметной селекции на устойчивость к хлоридному засолению в индукционную питательную среду для культивирования пыльников добавляли в качестве стресс-фактора NaCl в концентрациях 0,01; 0,05; 0,1%. Полученные в этих условиях эмбриоиды переносили на среду Blaydes, а часть доращивали на безселективной среде N6. Семенное потомство линии Ю580R0 размножали методом микроклонольного размножения (МКР) и вновь вводили в культуру in vitro. В индукционные среды добавляли растворы NaCl, как и в первом цикле селекции. После II цикла селекции на уровне гамет получены растения-регенеранты (второе семенное потомство Ю580R1), которые вновь включали в III цикл селекции и получали третье семенное потомство Ю580R2.

       Для отбора эмбриогенных клеток, устойчивых к засухе через культуру пыльников, использовали АБК в концентрациях — 0,005; 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,5%. Схема селекции на засухоустойчивость отличается тем, что растения-регенеранты отбирали на средах, содержащих АБК, и размножали на среде без селективного фактора. Признак засухоустойчивости проверяли по количеству зародышевых корней и их длине по методике Г.С. Балык (1979), а так же по методическим указаниям по изучению мировой коллекции пшеницы ВИР (1985). Для отбора засухоустойчивых эмбриональных клеток использовали сорт пшеницы Эритроспермум 14, рекомендованный селекционерами НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева. Статистическую обработку проводили с применением компьютерной программы АРМ «Биометрия».

       Единичные растения размножали методом МКР. Семена дигаплоидных растений проращивали на среде Мурасиге и Скуга (МS). Индукцию кущения у молодых проростков вызывали добавлением гибберелловой кислоты и кинетина. В последующем с помощью чередования гормональной и безгормональной среды индуцировали образование дополнительных побегов, которые делили на 3 части: одну часть использовали для микроразмножения, вторую – для укоренения, третью – для тестирования.

       Биохимические исследования. Определение запасных белков и ферментного комплекса МДГ ГОАТ (малатдегидрогеназа-глутаматоксалоацетат-аминотрансфераза).        

       Для характеристики аллельного состояния глютенин кодирующих локусов проводили экстракцию глютенинов из индивидуальных зерен методом  Galili, Feldman (1983). Белковую пробу перед фракционированием алкилировали акриламидом. Разделение глютенинов в ДСН (додецилсульфат натриевом) полиакриламидном геле проводили методом  Laemmli (1970) в модификации К.М. Булатовой (1985). Высокомолекулярные субъединицы идентифицировали по каталогу (Payne, 1987). Электрофорез запасного белка глиадина проводили по общепринятой методике на базе НИИ Земледелия и растениеводства.

       Биохимический анализ ферментного комплекса МДГ-ГОАТ (малатдегидрогеназа-глутамат-оксалоацетат аминотрансфераза) семян гибридных линии пшеницы F3  проводили  по Lowry (1951) и А.И. Ермакову (1972) в Институте молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина.

       Определение суммы растворимых фенольных соединений в изолированных зародышах и каллусных культурах пшеницы. Клетки зародышей или каллусную ткань экстрагировали 96%-ным этанолом в течение 1 часа, после чего к 0,5 мл этанольного экстракта добавляли 6,5 мл дистиллированной воды и перемешивали. Прибавляли 0,5 мл реактива Фолина-Дениса, перемешивали, через 3 мин приливали 1 мл насыщенного раствора соды и доводили общий объем до 10 мл дистиллированной водой. Через 1 час определяли содержание суммы растворимых фенольных соединений при длине волны 725 нм на спектрофотометре.

       Определение содержания эндогенных гормонов в растениях пшеницы. Экстракция, очистка фитогормонов (ИУК – индолилуксусная кислота, АБК – абсцизовая кислота,  ЦТК – цитокинины, ГК – гибберелловая кислота) выполнены по методике, разработанной в лаборатории регуляторов роста и развития растений РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева.

Содержание ИУК, АБК и  цитокининов определяли с помощью  ВЭЖХ, используя систему приборов фирмы Biotronic. Определение биологической активности гиббереллинов (ГК3) проводили по росту гипокотилей салата сорта Берлинский. Количественно гиббереллины определяли по калибровочной кривой, для построения которой использовали гибберелловую кислоту (Россия).

       RAPD-анализ исходного сорта, дигаплоидной формы и гаметоклональных вариантов. Выделение ДНК и RAPD-анализ проводили по  методике Е.З. Кочиевой и др., (1999) в РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Определение количества и качества выделенной ДНК проводили на спектрофотометре Beckman K-100. Для полимеразной цепной реакции использовали наборы реактивов производства «Биомастер» и «Sigma». В работе использовали десятичленные праймеры, а также коммерческие стандартные олигонуклеотидные RAPD-праймеры серий ОРА, OPD, OPE, OPH, OPK, OPN (“Operon Technologies”, Alameda, California, USA). Всего для выявления полиморфизма между анализируемыми образцами ДНК линий пшеницы использовано 19 RAPD праймеров. На основании матриц с использованием формулы Жаккарда рассчитаны коэффициенты попарных генетических различий между образцами (Sneath et al, 1973). С помощью метода иерархического кластерного анализа (UPGMA) построена дендрограмма (пакет программ TREECON) (Van de Peer et al.,1994).

       Селекция in vitro на уровне соматических  и репродуктивных клеток.

Селекцию на уровне соматических клеток проводили по схеме  Е.А. Калашниковой (2003) и селекцию на уровне репродуктивных клеток в культуре пыльников в соответствии со схемой разработанной автором.

В качестве селективного фактора использовали культуральный фильтрат (КФ) гриба Septoria nodorum Вerk., выделенного из посевов пшеницы с опытных полей НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева. Фитотоксины получены из вышеприведенного КФ, а также из изолятов коллекции гриба S. nodorum Вerk., которая любезно предоставлена Научно-исследовательским институтом проблем биологической безопасности (НИИПББ) Ш.С. Рсалиевым и М.Б.Орынбаевым.

Выделение и количественное определение фитотоксинов гриба Septoria nodorum Вerk. проводили в соответствии с методом, изложенным в методических рекомендациях (Кобыльский, Бочарова, 1990). Экспериментальные работы по накоплению и выделению фитотоксинов проводили в НИИПББ. Принцип метода заключается в том, что фитотоксины, содержащиеся в культуральной среде и мицелиальной массе гриба, экстрагировали этилацетатом и разделяли на отдельные колонки с помощью тонкослойной хроматографии. Для наработки фитотоксичных метаболитов гриба S. nodorum Вerk. экстракт разделяли методом препаративной ТСХ на пластинах с толщиной слоя 0,25 мм. Участки хроматограммы, на которых выделялись фитотоксины, изолировали и элюировали  с помощью этилацетата (5:1) (Devys et al., 1980). В дальнейшем 5 фитотоксинов в комплексе добавляли в культуральную среду, предназначенную для культивирования зародышей и пыльников, а также в суспензионную культуру клеток пшеницы.

       Полевые испытания линий-регенерантов и их использование в селекционных программах. Посев семян изучаемых образцов в питомнике конкурсного сортоиспытания проводили в оптимальные для зоны сроки  сеялкой ССФК-7. Площадь делянок — 24-50м2 в четырехкратной повторности. Стандартом служил районированный сорт Акмола 2. Уборку проводили в сентябре комбайном Сампо 130.

       Фенологические наблюдения, оценку и учет состояния растений по фазам развития проводили в соответствии с методическими указаниями Госкомиссии по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур.

       Урожайность определяли весовым методом с пересчетом на 14% влажность.

       Содержание белка определяли на анализаторе инфракрасном – Инфраматик 8620 А; содержание и качество клейковины – МОК-1М, ИДК-3М; физические свойства теста (сила муки, отношение упругости к растяжимости P/l) – на альвеографе; разжижение теста – на фаринографе; натура зерна – по ГОСТ ИСО-7971-2-2002 (ГОСТР ИСО 7971-2-99).

       Математическая обработка данных проведена по методике Б.А. Доспехова (1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Повышение эффективности экспериментальной гаплоидии для расширения генетического базиса селекции яровой мягкой пшеницы

       Сложность механизмов спорофитного пути развития микроспор и  регуляция спорогенных клеток в условиях in vitro является важнейшей проблемой  гапалоидных технологий. В компетенции микроспор наряду с другими можно выделить два основных фактора, определяющих переключение программы развития клетки с гаметофитного на спорофитный путь развития: 1) генотип растения-донора; 2) баланс эндогенных и экзогенных фитогормонов.

               Вышеназванные и многие другие проблемы экспериментальной гаплоидии остаются открытыми, и это является сдерживающим фактором широкого практического использования дигаплоидных форм в селекционных программах.

1.1 Выяснение компетенции микроспор в культуре пыльников пшеницы

               В результате исследований установлено, что эффективность пыльцевого эмбриогенеза зависит не только от стадий развития микроспор, но и от процентного содержания микроспор, находящихся на оптимальной стадии развития в момент инокуляции пыльника. 

         Несмотря на то, что  растения были срезаны в одинаковую фазу развития, микроспоры внутри пыльника находились на разных стадиях развития. Это можно объяснить, во-первых, тем, что пыльники фиксировали до синхронизации микроспор. Во-вторых, даже внутри одного пыльника микроспоры могут быть на разных стадиях развития, и их синхронизация холодовой обработкой является недостаточной. По литературным данным известно, что наиболее оптимальной стадией развития микроспор, которая может переключиться и развиваться по спорофитной программе, является сильновакуолизированная стадия, когда ядро находится напротив поры.

       По результатам наших исследований, эффективность пыльцевого эмбриогенеза повышается только в том случае, когда доля микроспор, находящихся на 2-ой фазе развития, т.е. перед сильной вакуолизацией, составляет более 40 % (рис.1).

а б

  в г

Рис. 1 Процентное содержание микроспор находящихся в пыльнике на разных фазах развития в момент срезки растений (гибриды F1 яровой мягкой пшеницы): а F1 №3, б - F1 №19, в - F1 №5, г F1 №11

Примечание –F1 №3, F1 №19,  F1 №5, F1 №11–номера  гибридов первого поколения. 1-7 фазы развития микроспор:1-микроспора с невакуолизированной цитоплазмой с центральным ядром,2–передвижение ядра к противоположной поре прорастания,3– сильновакуолизированная микроспора, 4–пыльцевое зерно после завершения первого митоза, 5,6–ранняя и поздняя фазы развития двухклеточного пыльцевого зерна,7–зрелое пыльцевое зерно.

       Например, у гибрида F1 № 3 доля микроспор в этой фазе развития составляет 66,5% и в этом случае выход гаплоидных структур отмечается в 8,4%, случаев, а у гибрида F1 №19 количество микроспор, находящихся на 2-ой фазе развития составляет 59,9%  и пыльцевой эмбриогенез равен 6,6 %, в то время как у гибридов, где количество микроспор перед сильной вакуолизацией составляет 40% выход эмбриоидов в 2 раза ниже.

Кроме того, нами установлено, что пыльцевой эмбриогенез можно индуцировать из микроспор, находящихся на второй и третьей стадии развития  при исключении дополнительных предобработок веществами гормональной природы. При этом процентное содержание микроспор на данных фазах развития должно составлять более половины от общего числа микроспор.

Таким образом, при повышении эффективности гапалоидных технологий на первом этапе основным моментом является регуляция спорогенных клеток в условиях in vitro. При этом наряду, с другими факторами, определяющими переключение программы развития клетки с гаметофитного на спорофитный путь развития, является синхронизация микроспор на оптимальной стадии развития в момент инокуляции пыльника. 

1.2 Роль гормональных факторов и биологически активных веществ

в индукции спорофитного пути развития микроспор пшеницы

       Обсуждая роль фитогормонов в процессе эмбриогенеза in vitro, исследователи чаще всего говорят о содержании гормонов в индукционной среде. Однако эти данные малочисленны и совершенно отсутствуют сведения о применении предобработок растений-доноров биологически активными веществами и фитогормонами. Поэтому данное направление исследований представляет интерес. Известно, что обработка растений, срезанных на ранних этапах органогенеза, оказывает существенное влияние на спорофитный путь развития микроспор.

       В работе изучали влияние факторов гормональной природы (кинетин, 2,4-D, ИУК), а также феруловой и аконитовой кислот на эмбриогенез в культуре изолированных пыльников пшеницы.        

Установлено, что обработка колосьев гормонами в некоторых вариантах увеличивает частоту выхода эмбриоидов в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия. Например, кинетин в малых концентрациях повышает выход эмбриоидов. Однако увеличение концентрации данного гормона до 0,2 %, а для некоторых генотипов и до 0,3% снижает учитываемый показатель (рис. 2).

а  б

Рис. 2 Индукция пыльцевого эмбриогенеза при обработке срезанных

растений кинетином: а Ишимская 98; б - Целинная-Юбилейная

  При обработке срезанных растений гормонами ауксинового типа действия (2,4-D) выявлено, что повышение концентрации гормона увеличивает частоту выхода эмбриоидов у всех изучаемых генотипов (рис. 3). Например, частота образования эмбриоидов у линии Ю580R в контроле составило 0,6%, а при обработке 0,04%-ным раствором 2,4-D этот показатель повысился до 3%. Для сорта Целинная-Юбилейная при обработке срезанных колосьев 2,4-D в концентрации 0,03% выход эмбриоидов составил 8%.

       Результаты математической модели показывают, что параметр детерминации для всех сортов одинаково высокий, за исключением сорта Ишимская 98.

а

б

в

г

Рис. 3 Индукция пыльцевого эмбриогенеза при обработке срезанных растений 2,4-D: а Казахстанская раннеспелая, б Ю580R, в - Целинная-Юбилейная, г - Ишимская 98

       

       Результаты экспериментальных исследований по предобработке колосьев ИУК представлены на рисунке 4. Как следует из результатов, частота образования эмбриоидов находится в прямой зависимости от концентрации ауксина. Исключение составили лишь линии Ю580R, ЛГВ 20/92-2, для которых повышение концентрации исследуемого вещества до 0,05% для Ю580R и 0,04% для линии ЛГВ 20/92-2 приводит к резкому снижению частоты индукции эмбриоидов.

       Предобработка срезанных растений аконитовой кислотой не оказала существенного влияния на частоту эмбриогенеза. Однако, эмбриоиды, полученные в этом варианте, проявили высокий морфогенетический потенциал, в результате чего в 100% случаев из них формировались растения-регенеранты, что не было отмечено в других вариантах.

а

б

в

г

д

е

Рис. 4 Влияние предобработки срезанных растений ИУК на пыльцевой эмбриогенез:

а Ю580R, б Акмола 2, в Ишимская 98, г - ЛГВ2/92-2, д - ЛГВ1/92-2, е - ЛГВ6/92-3-5

       При  индукции пыльцевого эмбриогенеза одним из запусков сигнала спорофитного пути развития  микроспор является определенное содержание эндогенной и экзогенной индолилуксусной  кислоты (ИУК). Ответная реакция культуры пыльников при предобработке срезанных растений ИУК зависит от эндогенного содержания ИУК в момент инокуляции пыльника. Например, в работе В.Ю. Горбуновой (2000) показано, что экспланты с высоким содержанием эндогенных ИУК и АБК способны регулировать морфогенетические процессы в культуре пыльников пшеницы при отсутствии экзогенных гормонов. В то время как для сортов с низким содержанием ИУК, микроспоры не могут переключиться на спорофитный путь развития и для этого необходимо присутствие в питательной среде ауксина, в частности 2,4-D, в повышенных концентрациях. 

       Наши результаты согласуются с литературными данными. Однако в работе нами модифицирован регламент предобработки растений: срезанные растения обрабатывают ИУК в концентрации 0,005 - 0,1% в течение 7-10 суток с последующим культивированием пыльников на среде не содержащей ИУК.

       После определения эндогенного содержания фитогормонов (табл. 2) установлено, что индукция андрогенеза in vitro находится в прямой зависимости от уровня гормонов в растениях. Обработка ИУК повышает частоту образования эмбриоидов у линии ЛГВ2/92-2. У данной линии эмбриогенная способность в контрольном варианте составляет 5,1%, а при обработке растений 0,04%-ным раствором ИУК - до 8%.

Таблица  2. Эндогенное содержание фитогормонов в надземной части растений  яровой пшеницы в фазе кущения

Варианты

опыта

ИУК,

нг/г сухого веса

ЦТК, мкг/г сухого веса

ГК, нг/г сухого веса

АБК,

нг/г сухого веса

Ю580R

18,50 ±1,2

2,26±0,40

44,98±2,8

290,9±2,8

ЛГВ 20/92-2

37±3,1

1,17±0,2

598,58±1,3

145,5±1,2

ЛГВ 6/92-3-5

18,5±1,5

3,35±1,1

364,68±3,9

872,7±1,9

ЛГВ 1/92-2

  17,50±2,3

1,94±0,2

69,2±2,3

436,4±2,6

       Таким образом, вариабельность концентраций гормонов является генотипзависимым показателем, и оптимизированные для одного генотипа условия культивирования не могут подходить для других гибридов, сортов и линий. Сложность изучения гормональной регуляции связана с интегральным характером морфогенетических процессов и их зависимостью от многих внешних и внутренних факторов (Бутенко, 1975).

       Следующим этапом нашей работы был цитологический контроль пыльников, обработанных ИУК. На основе полученных данных мы предположили, что обработка ИУК вызывает аномалии, которые зависят от концентрации и продолжительности обработки. Например, результаты, полученные на сорте Ишимская 98, свидетельствуют о том, что при обработке колосьев 0,5 % ИУК в течение 10 суток возрастает количество аномалий в пыльце, которое составляет 7,3%, а выход эмбриоидов в этом варианте возрастает до 4,5%.  У сорта Акмола 2 без применения обработки растений ИУК, аномалии в пыльце отсутствуют, и пыльцевой эмбриогенез составляет 1,4%. При обработке 0,01%-ным раствором  ИУК  процент аномальной пыльцы у этого сорта составляет 16,6% и частота выхода эмбриоидов  повышается до 5,2%.

       Установлено, что предобработка растений-доноров ИУК повышает интенсивность развития микроспор, что приводит к индукции эмбриоидов из поздних стадий развития микроспор и, вероятно, из аномальной пыльцы. Аномалии представлены в виде увеличения количества спермиев в пыльцевом зерне. Образование эмбриоидов из гамет теоретически возможный путь при андрогенезе in vitro, но изолирование спермиев методически очень сложно.  Мы  предполагаем, что эмбриоиды, индуцированные при обработке ИУК, имеют своё происхождение из спермиев. Данное предположение подтверждено кариологическим анализом растений.

1.3 Селекция пшеницы на устойчивость к абиотическим стрессам на уровне гамет

Методы биотехнологии являются альтернативными методами изучения механизмов стрессоустойчивости и отбора осмотолерантных клеток. Особого внимания заслуживает клеточная селекция, позволяющая в  условиях in vitro отбирать из миллионов клеток стрессоустойчивые клетки и получать из них растения-регенеранты.

       Одной из возможностей использования гаплоидных технологий является индукция гаметоклональной вариабельности при селекции на уровне гамет.

       Для отбора яровой мягкой пшеницы на солеустойчивость в культуре in vitro изолированные пыльники культивировали на среде, содержащей стресс фактор NaCl в концентрациях 0,01; 0,02; 0,05; 0,1%. Через 3 недели культивирования на растрескивающихся пыльниках наблюдали образование эмбриоидов и каллусной ткани. 

       Полученные эмбриоиды переносили на среду Blaydes без добавления соли (I цикл селекции на уровне гамет). Из спонтанных дигаплоидных растений, отобранных по морфологическим признакам, без обработки колхицином получено семенное потомство Ю580R0.

       Далее линия Ю580R0 была размножена в условиях in vivo и вновь введена в культуру пыльников, где в индукционные среды добавляли так же, как и в первом цикле селекции NaCl в различных концентрациях.

       При проведении II цикла селекции на уровне гамет,  получены растения-регенеранты и их второе семенное потомство (Ю580R1), которое было вновь включено в цикл селекции (III цикл). В результате культивирования пыльников на селективных средах, получены единичные растения-регенеранты (табл. 3).

Таблица 3. Влияние условий засоления на пыльцевой эмбриогенез

Концентрации  селективного агента- NaCl,  %

Количество посаженных пыльников, шт.

Количество эмбриоидов, шт.

Частота образования

эмбриоидов, %


Целинная-Юбилейная I цикл

Контроль

200

4

2,0 (0,964,30)

0.01

800

17

2,1 (1,03,50)

0.05

9

20

1,6 (1,003,50)

0,1

720

7

0,9 (0,261.90)

Ю580 R II цикл

Контроль

480

14

2,9 (1,64,5)

0,01

510

16

3,1 (1,74,8)

0,05

723

19

2,6 (1,44,2)

0,1

617

10

1,6 (0,692,9)

Ю580 R- III цикл

0,01

500

17

3,4 (2.05,1)

0,02

160

9

4,2 (2.76.0)

0,05

500

12

2,4 (1,203.9)

0,1

580

13

2,2 (1,13,6)

       

       Из растений-ргенерантов после III цикла селекции отобрана солеустойчивая линия Ю580R2, которая была размножена in vitro и оценена в полевых условиях.

1.3.1 Ускоренное размножение устойчивых линий, их тестирование и полевая оценка

       Полученная нами в результате гаметной селекции линия Ю580R2 в лабораторных условиях была размножена методом МКР, при этом использовали питательную среду, содержащую NaCl в концентрации 1%.

       Результаты, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что линии отобранные в стрессовых условиях, через культуру пыльников, более устойчивы к NaCl. Например, по сравнению с исходным сортом  при размножении линии Ю580R1  на среде с селективным агентом из 7 побегов образовалось 32 дополнительных побега. Необходимо отметить, что у линии Ю580R1, способность к размножению была ниже, чем у Ю580R2, полученной после трех циклов селекции на солевой среде, где  количество дополнительных побегов составляет 60 из 11 первоначальных побегов.

Таблица 4. Способность к дополнительному побегообразованию на солевой среде при чередовании гормональной и безгормональной среды  МS

Сорта и варианты селективного фактора

Количество побегов, шт

Количество  дополнительных побегов, шт

Ср. коэффициент размножения, шт.

Целинная-Юбилейная — контроль 

15

56

3,7±0,4

Целинная-Юбилейная –

1% NaCl

6

18

3,3±0,6

Ю580R1 контроль

14

68

4,8±1,0

Ю580R1 1% NaCl

7

32

4,5±0,8

Ю580R2 контроль

15

80

5,3±1,1

Ю580R2 1% NaCl

11

60

5,4±1,0

       На питательной среде, содержащей селективный агент в концентрации 0,01; 0,05; 0,1% путем прямой регенерации отобраны гаметоклональные варианты и получено семенное поколение (табл. 5).

Таблица 5. Индукция эмбриоидов и регенерация растений в культуре пыльников при солевом стрессе третьего семенного поколения линии Ю580R2

Концентрация

NaCl, %

Количество пыльников, шт.

Частота выхода эмбриоидов,  %

Регенерация растений,  шт.

0,01

1562

1,4 (0,562,60)

20

0,05

1448

0,7 (0.16 1,60)

6

0,1

1949

0,7 (0.16 1,60)

1

       

На селективной среде содержащей NaCl в концентрации 0,1% отселектировано 1 растение, которое в дальнейшем будет именоваться, как ЛГВ1-92-2 (Лютесценс гаметоклональный вариант), на среде содержащей  0,05% NaCl - 6 растений (ЛГВ3-692-3-5), а на среде содержащей  0,01% NaCl - 20 растений  (ЛГВ2-92-2).

Сорт стандарт Акмола 2 и линия Ю580R2, а также гаметоклональные варианты,  отобранные на солевой среде из линии Ю580R2, были оценены в  полевых условиях (НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева) (табл. 6). Установлено, что полученные линии проявили устойчивость к засухе на уровне стандарта, и превысили стандарт по устойчивости к полеганию. Среди всех линий выделяется линия ЛГВ3-692-3-5, которая в 2005 году превысила стандарт по засухоустойчивости.

При проведении селекции растений in vitro на солеустойчивость проявление засухоустойчивости растений вполне объяснимо, так как признаки солеустойчивости и засухоустойчивости тесно связаны с механизмами осмоса. Окислительный стресс приводит к нарушению, например, структурных и ферментативных белков, липидов мембраны.

Таблица 6. Результаты полевых испытаний растений-регенерантов линии Ю580Rна устойчивость к засухе и полеганию по сравнению со стандартом Акмола 2 (баллы)

Годы 

испытаний

Линии

2004 г.

Устойчивость

2005 г.

Устойчивость

2006 г.

Устойчивость

к

засухе

к  полеганию

к

засухе

к

полеганию

к

засухе

к

полеганию

Акмола 2, st

9

7

7

7

9

7

Ю580R2

9

7

7

9

9

7

ЛГВ1-92-2

9

9

7

9

7

9

ЛГВ2-92-2

9

9

7

5

7

9

ЛГВ3-692-3-5

9

9

9

9

9

9

       При проведении полевой оценки установлено, что линия Ю580R2 обладает засухоустойчивостью, которая достигалась в основном за счет биологических свойств растений и характеризовалась удлиненным периодом «всходы-колошение» (45-46 суток). Как правило,  такие сорта имеют несколько замедленные темпы роста в начальной стадии развития, следовательно,  менее требовательны к влаге в период майско-июньской засухи и более эффективно используют июльские осадки. Засухоустойчивость линии подтверждена не только полевой визуальной оценкой, но и способностью растений формировать большое количество узловых корней и продуктивных побегов кущения в условиях острой засухи. Линия Ю580R2 по сравнению со стандартом (Акмола 2), отличалась анатомо-морфологическими признаками и общей архитектоникой.

       Таким образом, нами разработана технология гаплоидной селекции пшеницы in vitro на микроспорах, предусматривающая проведение ступенчатой селекции на устойчивость к абиотическому стрессу с последующим тестированием полученных растений.

1.3.2 Отбор засухоустойчивых растений-регенерантов при проведении селекции на уровне гамет

       Растения, подверженные недостатку влаги, претерпевают определённые биохимические изменения. Известны работы по изучению генных локусов у Trititicum aestivum, Hordeum vulgare, Secale cereale, ответственных за устойчивость к  обезвоживанию. Одним из биохимических путей, включающих ответ на уровне генов к недостатку влаги, является метаболизм, зависимый от концентрации абсцизовой кислоты.

       В связи с тем, что АБК включает систему ответной реакции растений на стресс, целью данной серии экспериментов является отбор гаплоидных растений на засухоустойчивость через культуру изолированных пыльников. Для этого в питательную среду при культивировании пыльников добавляли АБК в концентрациях 0,005%, 0,01%, 0,02%, 0,05%, 0,1% (табл. 7). В качестве исходного сорта использовали Эритроспермум 14.

Таблица 7. Влияние АБК на индукцию пыльцевого эмбриогенеза

Концентрация  АБК, %

Количество пыльников, шт.

Частота образования

эмбриоидов, %

Эритроспермум 14 I цикл

Контроль

612

2,6 (1,304,20)

0,005

754

2,5 (1.304,20)

0.01

500

2,4 (1,203,90)

0,02

750

2,2 (1,103.60)

0,05

418

1,4 (0,562.60)

0,1

480

0,8 (0,060,02)

0,5

413

0

Эритроспермум 14 R0 II цикл

  0,05

450

2,0 (0.96 3,40)

  0,1

347

1,4 (0,562,60)

  0,5

603

1,4 (0,562,60)

Эритроспермум 14 R1 III цикл

  Контроль

345

2,0 (0,963,40)

  0,05

100

4,0 (2,4 5,90)

  0,1

801

1,9 (0,893,30)

  0,5

145

2,0 (0.96 3,40)

В условиях селективного фактора индуцировано 111 эмбриоидов, которые в дальнейшем  переносили на среду Blaydes для регенерации растений. Семенное потомство единичных растений-регенерантов (АR045) использовали во втором цикле селекции (АБК присутствовала в среде в концентрации 0,05%, 0,1%, 0,5%). Из растений-регенерантов, отселектированных в этих условиях, получены растения второго семенного потомства (АR145), которые вновь вводили в культуру пыльников и проводили  3-й цикл селекции на средах, содержащих АБК. Растения, отобранные путём гаметной селекции, после 3-го цикла названы АR245.

Регенерационный потенциал эмбриоидов, индуцированных в культуре пыльников на средах в присутствии АБК,  показан в таблице 8.

Таблица 8. Регенерация растений из эмбриоидов в 3-х циклах селекции на средах, содержащих АБК (сорт Эритроспермум 14)

Концентрации  АБК, %

Регенерация растений,%

I - цикл

II - цикл

III - цикл

  Контроль

75,0 (78.771,2)

100 (99,8100)

71,0 (74,967,0)

  0,005

68,4 (72,464,3)

61,5 (65,757,2)

-

  0.01

100 (99,8100)

75,0 (78.771,2)

-

  0,02

52,9 (57,248,5)

50,0 (54,345,6)

-

  0,05

50,0 (54,345.6)

40,0 (44,235,7)

100 (99,8100)

  0,1

50,0 (54,345.6)

33,3 (37,429,1)

81,2 (77,6184,5)

Данные таблицы свидетельствуют о том, что на первом и на втором цикле селекции растения–регенеранты получены во всех вариантах селективных сред. Однако в процессе дальнейшего культивирования (3-й цикл селекции) пыльников на селективных средах частота эмбриогенеза резко снижалась. Исключение составили варианты питательных сред, в которых АБК присутствовала в концентрациях 0,05 и 0,1%. Регенерационный потенциал в этих вариантах составил 100 и 81,2%, соответственно. Можно предположить, что только устойчивые к водному дефициту клетки могли обладать способностью к регенерирации на селективных средах, содержащих повышенные концентрации АБК.

Таким образом,  в результате селекции на уровне репродуктивных клеток получены линии, которые отличались по длине зародышевых корней и их количеству. Однако при статистической обработке по длине корней двух линий Л1, Л2 и  исходного сорта Эритроспермум 14 разница между вариантами была не существенной.

Оценку устойчивости к засухе в лабораторных условиях проводили согласно методическим разработкам изучения мировой коллекции пшеницы ВИР (1985) по количеству зародышевых корней. Среди полученных растений отобраны образцы образующие по 5 и более корней, которые в дальнейшем  размножали в условиях in vitro (рис 5). Полученным линиям дано общее название AR45 и эти линии переданы в НПЦ ЗХ им. А.И. Бараева для использования их в селекционном процессе.

Во многих зерносеющих районах морфология листа является одним из важных признаков при получении растений, устойчивых к засухе. При полевой оценке, отобранная нами линия AR45, по сравнению со стандартом (Акмола 2), отличалась анатомо-морфологическими признаками и архитектоникой. У данной линии формировалась большая листовая поверхность и флаговый (верхний) лист располагался по отношению к стеблю под углом 45-550С, что способствует меньшему испарению влаги в условиях засухи.

  Рис. 5  Проростки, формирующие более 5 корней

       При полевой оценке линия АR45 показала устойчивость к засухе поэтому в дальнейшем она была включена в гибридизацию по признаку засухоустойчивости. В настоящее время проводится отбор по хозяйственно-ценным признакам.

       Таким образом, использование  гаметной селекции имеет определённые преимущества, так как селекция мужского гаметофита может иметь позитивный эффект на появляющуюся в результате спорофитную генерацию. Разработанная нами схема селекции на уровне репродуктивных клеток позволяет получать осмотолерантные растения, о чём свидетельствует оценка полевых испытаний в течение нескольких лет.

1.4 Селекция пшеницы на устойчивость к экзометаболитам  фитопатогенного гриба Septoria nodorum Berk.  на уровне соматических и репродуктивных клеток

Целью данных исследований является усовершенствование схемы селекции in vitro, которая в отличие от классической схемы включает все звенья отбора клеток под действием различных форм селективных агентов. При селекции in vitro использовали: культуральный фильтрат (КФ), фитотоксины и водную форму грибного фильтрата (ВФГФ) S. nodorum Berk.

       Токсинами гриба S. nodorum являются охрацин или меллеин, а также 3 производных дигидроизокумарина и микофеноловая кислота.

       Для расширения генетической основы пшеницы по устойчивости к грибной инфекции необходимо проводить и гаметную селекцию в условиях in vitro. Однако работы в этом направлении малочисленны. Во-первых, это связано со сложностями методологического характера индукции пыльцевого эмбриогенеза. Во-вторых, мало изучен регенерационный потенциал гаплоидных структур и не ясны многие причины абортируемости  пыльцевых зародышей. В-третьих, формируются в большом количестве альбиносные растения.

       В наших исследованиях изучали токсическое действие КФ как на уровне целого растения, так и на уровне клеток (рис. 6).

Рис. 6.  Токсическое действие 50% КФ на прорастание семян

Примечание* Отклонение от средней арифметической на 50% КФ и контрольном варианте

Разница между вариантами существенна*: td>t05

Л 11-94-111 побеги 9,9>2,04*; корни 14,8>2,04*

Л 29-94 побеги 15,4>2,04*; корни 3,45>2,04*

93 с побеги 9,6>2,04*; корни 12,8>2,04*

Полученные данные (рис. 6) свидетельствуют о том, что на 3-сутки культивирования токсичность КФ в концентрации 50% на уровне прорастания семян составляет около 60% для всех изучаемых генотипов. Данная концентрация КФ проверена и на уровне каллусных клеток. Установлено, что с увеличением концентрации КФ в питательной среде снижается прирост каллусной ткани для всех исследуемых генотипов.

                       Выделение и идентификация фитотоксичных метаболитов гриба Septoria nodorum и использование фитотоксинов в селекции in vitro

       Согласно поставленным целям исследований, из накопленной биомассы фитопатогенного гриба  S. nodorum получен этилацетатный экстракт, который разделяли методом препаративной ТСХ. При хроматографировании с использованием реактива Фолина-Чикальто было выявлено присутствие 5-и фитотоксинов — ФТ-1, ФТ-2, ФТ-3, ФТ-4, ФТ-5, которые отнесли к классу фенольных соединений. Полученные данные подтвердили ранее выявленные Е.В. Бочаровой (1991) токсины фитопатогенного гриба S. nodorum и  позволили отнести их к группе кумаринов и изокумаринов.

       Таким образом, доказана идентичность фитотоксинов выделенных нами из культурального фильтрата и экстрактов, полученных из мицелия гриба  S. nodorum.

Отбор клеток, на устойчивость к экзометаболитам гриба Septoria nodorum при поверхностном выращивании каллусной ткани

Для выявления эффективной формы селективного агента, выделенные 5 фитотоксинов смешивали и в комплексе  добавляли в питательную среду МS в концентрациях от 0,01 до 0,05%, на которой индуцировали каллусогенез. На сортах пшеницы 381МС и Лютесценс 11-94-111 с помощью относительного расчета прироста каллусной ткани выявлено токсическое действие комплекса фитотоксинов (рис. 7). Для исследуемых генотипов характерна одинаковая ответная реакция клеток на присутствие селективного агента в питательной среде. Установлена закономерность: с увеличением концентрации фитотоксинов в питательной среде уменьшается прирост каллусной ткани.

а  б

Рис. 7 Зависимость интенсивности роста каллусной ткани от концентрации фитоксина гриба Septoria nodorum в питательной среде: а- сорт 381MS; б - сорт Л-11-94-111

       Полная реализация поставленной задачи по усовершенствованию клеточной селекции на устойчивость к экзометаболитам гриба Septoria nodorum требует включения в схему экспериментальных исследований получение  морфологически выровненной суспензионной культуры.

       Выявлено, что активный рост клеточной суспензии наблюдается на 7 сутки культивирования. Более длительное выращивание каллусных клеток в условиях глубинного культивирования приводит к некротизации и дальнейшей гибели клеток. Полученные клеточные колонии после II пассажа с хорошей пролиферативной  способностью использовали в селекции in vitro.

       В результате исследований установлено, что в стандартных условиях культивирования получена стабильная суспензионная культура, характеризующаяся присутствием одиночных клеток. В то время как при введении фитотоксинов в среду, клетки слипались и образовывали крупные агрегаты, а доля одиночных клеток при этом снижалась до 25%.

Выделение водной формы культурального фильтрата фитопатогенного гриба S. nodorum и изучение его токсичности для селекции in vitro

       Цель данной серии экспериментов — модифицирование методики выделения грибного фильтрата. Для того чтобы приблизить селективный фактор  к природным условиям,  использовали не отдельную чистую культуру гриба, а возможные условия совместного культивирования гриба и семян пшеницы. Изучали токсичность данной формы фильтрата, выделенной при совместном культивировании, для проведения селекции in vitro.

       Методика выделения грибного фильтрата. Чистую культуру патогена выращивали совместно с семенами пшеницы на воде с добавлением 3 % сахарозы в течение 5-30 суток. Затем суспензию гриба фильтровали через бумажные фильтры 2 раза, после чего  полученный фильтрат в концентрации 30% и 50% добавляли в заранее проавтоклавированную питательную среду в качестве селективного фактора.

       В результате проведённых исследований выявлено, что цвет водного фильтрата, начиная с 30 суток с момента культивирования гриба в условиях in vitro, не менялся, что свидетельствует об окончании накопления токсинов в среде.

Полученный водный фильтрат гриба (ВФГФ) в дальнейшем был использован для определения его фитотоксичности. Работу проводили на семенах и хорошо пролиферирующей каллусной ткани.

       Установлено, что при совместном выращивании семян с 50% ВФГФ  наблюдается угнетение роста корней и надземной части проростков. Как показано на рисунке 8,  токсичность данной формы фильтрата на 5-е сутки достигает более 85%, что в 1,5-2 раза выше по сравнению с ранее применяемой нами методикой (Беккужина, Калашникова, 2008), при которой токсичность КФ гриба, изменялась по сортам и составляла 37,1% - 64,8%.

Рис. 8 Токсичность 50% концентрации фильтрата на уровне

проростков на 5-е сутки прорастания

       

                       В результате статистической обработки отмечена существенная разница токсичности ВФГФ на развитие корней и надземной части проростков. Далее ВФГФ использовали для определения его фитотоксичности на уровне каллусных клеток. При добавлении этого фильтрата (30%) в питательную среду прирост биомассы каллусной ткани не был отмечен  (рис. 9 а).         

а  б

Рис. 9. Относительный прирост каллусной ткани на водном фильтрате:

а   I пассаж, б II пассаж

        При сравнительной оценке токсического действия комплекса фитотоксинов и ВФГФ на прирост каллусной ткани отмечено, что данная форма фильтрата является  высокотоксичной, как и токсины фитопатогенного гриба S. nodorum. Относительный прирост каллусной ткани при 30% ВФГФ на II пассаже составляет около 10% (рис. 9 б).

Таким образом, в результате экспериментальных исследований выявлена оптимальная форма селективного агента для проведения клеточной селекции пшеницы на устойчивость к грибному патогену S. nodorum.

Гаметная селекция пшеницы на устойчивость к экзометаболитам фитопатогенного гриба Septoria nodorum Вerk.

       В индукционную питательную среду для культивирования пыльников добавляли фитотоксины в концентрации 0,01% и 0,02 %, а также ВФГФ в концентрациях от 0,5% до 3% (табл. 9, 10). При селекции использовали только эмбриональные ткани, которые были сформированы непосредственно из микроспор.

Таблица 9. Влияние фитотоксинов  гриба Septoria nodorum на пыльцевой эмбриогенез в культуре пыльников пшеницы

Сорта

Концентрации

токсина, %

Кол-во пыльников, шт.

Частота образования эмбриодов, %

+- к контролю

Лютесценс11-94-111

контроль

1700

5,8 (3,98,0 )

Лютесценс 11-94-111

0,01

1233

2,02 (0,963,40)

-3,7

Лютесценс 11-94-111

0,02

1400

1,3 (0,502,50)

-4,5

Актобе 33

контроль

1750

2,3 (1,203.80)

Актобе 33

0,01

1200

1,25 (0,502.50)

-1

Актобе 33

0,02

1350

0,5 (0.071,30)

-1,8

       Полученные результаты исследований свидетельствуют о низкой эффективности частоты образования эмбриогенных структур на средах, содержащих комплекс токсинов.        

Таблица 10. Влияние водного фильтрата на пыльцевой эмбриогенез (сорт Л 29-94)

Варианты концентраций

фильтрата, %

Количество пыльников, шт.

Частота образования эмбриоидов, %

+- к контролю

контроль

400

6,7 (4,79,0)

-

0,5

500

4,2 (2,606,20)

-2,55

1

500

2,8 (1,504,40)

-3,95

2

500

1,4 (0,552.60)

-5,35

3

500

-

-

Результаты исследований, представленные в таблице 10, свидетельствуют о том,  что на среде с добавлением 0,5% ВФГФ образование эмбриоидов составляет 4,2%, в то время как в варианте с присутствием ВФГФ в концентрации 3 % процесс эмбриогенеза нами не был отмечен.

Следовательно, можно заключить, что данные по проведению селекции на уровне репродуктивных клеток также подтверждают, что применение токсинов не является желательным по сравнению с применением водной формы фильтрата гриба.

       Изучение регенерационного потенциала клеток в стандартных и стрессовых условиях.        Известно, что пыльцевой эмбриогенез состоит из двух труднорегулируемых этапов. Первый – перепрограммирование микроспор и второй – регенерация зеленых растений из эмбриоидных структур. Кроме того, на каждом этапе андрогенеза in vitro половина индуцированных морфогенных структур может в дальнейшем не развиваться в растения-регенеранты.

       Наши исследования показали, что после двух циклов селекции во всех вариантах питательных сред, содержащих изучаемые концентрации ВФГФ, получены растения-регенеранты из ранее индуцированных эмбриоидных структур. Однако частота формирования растений, как в контрольном варианте, так и в вариантах с присутствием ВФГФ составила всего лишь 29,6% и 14,2 – 33,3%, соответственно (рис.10). Полученные растения-регенеранты в дальнейшем были размножены с помощью клонального микроразмножения за счет индукции образования адвентивных побегов (табл. 11).

 

Рис. 10  Частота регенерации (%) растений после селекции in vitro на ВФГФ

Таблица 11. Клональное микроразмножение растений-регенерантов, полученных после селекции in vitro

Генотип

Ср. коэффициент размножения, шт.*

Коэффициент размножения побегов из семян, шт.**

Количество

побегов, шт.

Количество

укоренив-

шихся

побегов, шт.

Укоренение

побегов,

%

Л-11-94-11

2,1±0,2

3,0±0,3

81

49

60,4

Л-29-94

2,5±0,2

2,6±0,2

96

78

81,3

Примечание – *коэффициент размножения побегов, полученных из каллусных тканей молодых соцветий, **коэффициент размножения побегов  из семян

       При размножении растений-регенерантов на средах, содержащих селективный фактор (ВФГФ в концентрации 10-30%) установлено, что стресс-фактор приводит к существенному снижению морфогенетической активности клеток, что проявляется на уменьшении числа адвентивных почек на один эксплант (табл. 12).

Таблица 12. Тестирование растений-регенерантов в стрессовых условиях при клональном микроразмножении

Сорта и варианты селективного фактора

Количество побегов, шт.

Количество непророс-ших

побегов, шт.

Количество

дополни-тельных

побегов, шт.

Ср. коэффициент размножения, шт

Л 29-94-10%

16

0

42

2,6±0,2

Л29-94-20%

16

5

38

2,3±0,2

Л29-94- 30%

17

12

20

1,1±0,1

Л-11-94-11-10%

25

3

39

1,5±0,1

Л-11-94-11-20%

25

14

32

1,2±0,1

Л-11-94-11-30%

28

13

47

1,6±0,1

       По результатам исследований можно сделать заключение, что признак устойчивости к экзометаболитам гриба S. nodorum, приобретенный  на уровне клеток, сохраняется при переходе на уровень целого растения, о чем свидетельствует образование дополнительных побегов в стрессовых условиях.

       При использовании в качестве селективного фактора КФ гриба в концентрации 75% были получены растения-регенеранты (сорт Л-11-94-111) из каллусной ткани. 8 растений-регенерантов дали семенное потомство.

       Таким образом, в результате многоплановых исследований нами разработана система отбора репродуктивных клеток к абиотическим и биотическим условиям окружающей среды, которая позволила создать линии, устойчивые к изучаемым стрессовым факторам (рис. 11).

Рис. 11 Схема селекции яровой мягкой пшеницы на уровне репродуктивных клеток

1.5 Изучение  биологических и хозяйственно-ценных признаков  линий, полученных методами биотехнологии и их использование в селекционных программах для создания перспективных форм пшеницы

       Включение в программу селекции пшеницы линий, полученных методами селекции in vitro, позволяет ускорить отбор растений с хозяйственно-ценными признаками. Во втором поколении растений-регенерантов отмечается высокая наследуемость изменения различных физиологических, биохимических и других признаков (даты колошения, остистости, числа побегов, окраски зерен и колосковых чешуй, воскового налета, электрофоретических спектров запасных белков).

       Для селекционной оценки использовали линии Лютесценс Ю580R2, АR45, отобранные в результате трёх циклов селекции на уровне репродуктивных клеток, а также гаметоклональные варианты, полученные в культуре пыльников из линии Лютесценс Ю580R — ЛГВ1-92-2, ЛГВ2-92-2, ЛГВ3-692-3-5.

       Погодные условия в период 2001-2005 гг. отличались контрастностью.  2001, 2002, и 2005 годы были более влагообеспеченными. Количество выпавших осадков в эти годы варьировало от 177 до 194,9 мм. Превышение их над среднемноголетним показателем составило 43,3; 51,3 и 60,3 мм, соответственно. 2003, 2004 и 2006 годы характеризовались, как засушливые.

       Изучение линий-регенерантов в контрастных погодных условиях позволило выявить варьирование продолжительности  вегетационного периода  и урожайности. Урожайность линии Лютесценс Ю580 в 2003 году составила 30,8 ц/га, что на 1,6 ц/га выше стандарта. Средняя урожайность перспективной линии за 2001-2003 гг. составила 29,6 ц/га, стандарта - 27,1 ц/га. Превышение линии над стандартом (сот Акмола 2) составило 2,5 ц/га.

       В период вегетации 2004 года, несмотря на засушливые условия, большинство изучаемых линий сформировали хороший урожай. Урожайность линий-регенерантов варьировала от 25,6 до 29,6 ц/га (рис. 12).

Рис. 12 Урожайность линий в ц/га 2004-2006 г.:

Примечание – 2004 г. - НСР0,05 =1,1; 2005 г. - НСР0,05 =1,2; 2006 г. - НСР0,05 =1,6.

В условиях 2005 года для трех линий (Ю580R, ЛГВ1-92-2, AR45) урожайность была незначительно выше стандарта. Превышение их над стандартом составило от 0,2 до 0,6 ц/га.

       Урожайность 2006 года линий-регенерантов  варьировала от 25,6  до 29,6 ц/га. Линии AR45 и ЛГВ3-692-3-5 показали достоверное превышение над стандартом на 2,9-3,6 ц/га. Эти линии в среднем за три года превысили стандарт на 3,6-4,5 ц/га.

       По продолжительности вегетационного периода эти линии можно отнести в группу среднепозднеспелых. Изучаемые линии-регенеранты обладали высокой засухоустойчивостью, которая достигалась в основном за счет биологических свойств. Все линии обладали удлиненным периодом всходы-колошение - 45-46 суток. Такие сорта имели несколько замедленные темпы роста в начальной стадии развития, а, следовательно, менее требовательны к влаге в период майско-июньской засухи и более эффективно используют июльские осадки.

       Особый интерес представляют линии ЛГВ1-92-2, ЛГВ 3-692-3-5 и АR45, которые подтвердили высокую засухоустойчивость не только полевой визуальной оценкой, но и способностью формировать большое количество узловых корней и продуктивных побегов кущения в условиях острой засухи (рис. 13).

Рис. 13 Устойчивость линий-регенерантов к засухе и полеганию

по результатам оценки 2006 года

       Анализ технологического и биохимического качества зерна показывает, что изучаемые линии по крупности, натуре зерна и содержанию белка находятся на уровне или близки к стандарту. Линии Ю580R и ЛГВ1-92-2  превосходят стандарт по натуре и содержанию белка. Индекс деформации клейковины (ИДК) свыше 75 единиц позволяет отнести их по качеству к 3 классу, а линии ЛГВ2-92-2 и AR45, у которых количество клейковины и ИДК находятся в оптимальном сочетании - к 2 классу.

       Несмотря на высокий ИДК, что вызывает разжижение теста, общая хлебопекарная оценка линий достаточно высокая и варьирует от 4,3 до 4,6 балла.

       Линия Лютесценс Ю580R использована в качестве родительской формы при создании гибридного материала. Получено 26 комбинаций скрещиваний. В качестве родительских форм использованы сорта и гибриды местного экотипа, а также образцы из США, Европы, ячменно-пшеничные линии, полученные в Сибирском отделении РАСХН.

       Линию AR45 использовали также в целенаправленной гибридизации с формами носителями генетического признака по засухоустойчивости,  и создано 19 комбинаций скрещиваний.        

       Линии, превысившие стандарт по урожайности, а также гибридные комбинации (26+19) переданы в ТОО «Карабалыкская СХОС» для размножения и отбора перспективных форм. Из них в 2008-2010 годы в гибридных питомниках отобрано 44 400 элитных колосьев.

       Таким образом, при селекционной оценке линий-регенерантов яровой мягкой пшеницы выявлены ценные признаки, которые могут быть использованы в селекционном процессе.

1.6 Использование белковых маркеров для отбора перспективных форм яровой мягкой пшеницы в ранних поколениях

       Для наиболее полного использования потенциала генетических ресурсов необходим мультидисциплинарный подход, умелое сочетание традиционных методов селекции с методами биотехнологии. В последние два десятка лет довольно ощутимы результаты использования генетических маркеров в практической селекции. Известны исследования, где установлена сопряженность генетических маркеров с целым рядом агрономических признаков пшеницы: качество муки, продуктивность и т.д. 

       Несомненный интерес в решении проблем адаптивной селекции представляет использование белковых маркеров, в частности, неслучайное распределение аллелей глиадинкодирующих локусов в сортах, созданных в различных эколого-географических зонах.

       Задача наших экспериментов - перевод в гомозиготное состояние гибридов, показавших перспективность по спектрам запасных белков. С этой целью изучали эмбриогенную способность гибридов F1 в культуре пыльников пшеницы.

       Проведенные биохимические анализы гибридов F1 показали, что локус GLU 1А представлен одной аллелью, кодирующей биосинтез субъединицы 2*. Наиболее часто встречаемые субъединицы, контролируемые локусом  GLU 1В: 7+9 (варианты с субъединицей 7 и 7*), тогда как аллели, ответственные за проявление субъединиц 17+18 встречалась лишь у единичных форм.

               Субъединицы 17+18 высокоранжируются по вкладу в оценку хлебопекарного качества мягкой пшеницы. Получение константных форм из гибридных комбинаций с вышеназванными субъединицами и использование их в селекционных программах значительно облегчает работу создания ценных генотипов по качеству зерна. Из 19 гибридов F1, предложенных селекционерами, гибридная комбинация (F1 №2) обладала высокой эмбриогенной способностью, где частота выхода эмбриоидов составляет 22%.

Для сокращения сроков селекции пшеницы в следующей серии экспериментов  изучали изменение активности ключевых ферментов азотного обмена в гибридных комбинациях раннего поколения, где в качестве одного из родителей использовали линию Ю580R, полученную в культуре пыльников.

       Известно, что ферментный комплекс МДГ-ГОАТ (малатдегидрогеназа-глутамат-оксалоацетат аминотрансфераза) может служить информативным показателем для отбора ценных линий на устойчивость к абиотическому стрессу.

       В результате исследований выявлены комбинации с большим содержанием МДГ-ГОАТ  по сравнению с родительскими формами: Л 16 ячмень - пшеничная линия х Ю580R, (Шортандинский 25 х Акмола 40) х Ю580R, (Шортандинский 125  х Омская 18) х Ю580R,  Ю580R х Fasan. Необходимо особо отметить комбинации (Кенжегали х Скала) х Ю580R х  K- 54975, где в гибридах активность МДГ-ГОАТ больше по сравнению с двумя родителями.

1.7 Молекулярное маркирование дигаплоидной линии и гаметоклональных вариантов, полученных в культуре пыльников пшеницы

       Анализ растений-регенерантов, полученных из культивируемых гамет, выявил изменчивость их геномов, которая была названа гаметоклональной вариабельностью.

       Для анализа изменений в геномах дигаплоидных линий используются различные молекулярные методы, в том числе и RAPD-метод (Random Amplified Polymorphic DNA), основанный на анализе полиморфизма длин фрагментов ДНК, амплифицируемых с помощью случайных праймеров.

Яровая мягкая пшеница Целинная-Юбилейная выбрана в качестве исходного сорта, из которой получена дигаплоидная линия Ю580R, а из нее  получены  гаметоклональные варианты ЛГВ 3-692-3-5, ЛГВ2-92-2,  ЛГВ1-92-2.

Наиболее похожие спектры амплифицировались у образцов Целинная–Юбилейная и Ю580R. Спектры гаметоклонов ЛГВ 3-692-3-5, ЛГВ1-92-2, ЛГВ2-92-2 также характеризовались присутствием специфических RAPD-фрагментов.

       Для проведения статистического анализа были составлены бинарные матрицы, рассчитаны коэффициенты попарного сходства и определены генетические расстояния между дигаплоидной линией и исходным сортом, а также гаметоклональными вариантами, отражающие степень различия  их геномов. Наименьшие геномные различия (0.02) наблюдались между сортом Целинная–Юбилейная  и полученной из нее дигаплоидной линией Ю580R.

       Дигаплоид и гаметоклональные линии, полученные из нее, образуют один кластер с исходным сортом Целинная-Юбилейная, из культуры пыльников которой они были получены. Этот кластер подразделяется по степени сходства геномов анализируемых образцов на два подкластера (рис.14).

Рис. 14 Дендрограмма, отражающая генетические различия между образцами  исходных сортов и дигаплоидных линий пшеницы:  1 Акмола 2; 2 Ю580 R; 3 Целинная-Юбилейная; 4 ЛГВ1-92-2; 5 ЛГВ2-92-2; 6 ЛГВ 3-692-3-5

       Первый подкластер составляют гаметоклональные линии ЛГВ1-92-2 и ЛГВ2-92-2. Эти две линии значительно отличаются от остальных, и при этом геномные различия между ними существенны, что подтверждается как высотой точки ветвления, так и данными по определению генетических расстояний (0,09). Интересно то, что третий гаметоклон ЛГВ 3-692-3-5 попадает в другой подкластер вместе с исходным сортом Целинная-Юбилейная и дигаплоидной линией Ю580R.

Таким образом, результаты исследований подтверждают, что гаплоидные технологии позволяют получать растения без существенных изменений в структуре генома и, следовательно, значительно ускоряют  создание чистых линий. Кроме того, полученные в результате селекции гаметоклональные линии отличаются полиморфизмом генома, что является основой генетического разнообразия.

       На основе проведенных исследований разработана технологическая схема (рис.15), позволяющая ускорить селекционный процесс яровой мягкой пшеницы. Умелое сочетание традиционных и биотехнологических методов может быть применено и к другим сельскохозяйственным культурам для улучшения их генетического базиса. Селекция на уровне гамет может достойно стать одним из ведущих направлений в поиске путей отбора растений к стрессовым воздействиям, не исключая при этом, методы классической селекции.

Рис. 15 Этапы технологии получения растений, устойчивых к абиотическому и биотическому стрессу

ВЫВОДЫ

1. Разработана комплексная технология получения форм и линий яровой мягкой пшеницы, устойчивых к водному дефициту и к фитопатогенному грибу Septorai nodorum Berk., на основе сочетания гаплоидной технологии и классических методов селекции.

       2. Создана эффективная биологическая система, позволяющая переключать развитие микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития на основе предобработки срезанных колосьев гормонами ауксинового типа действия - ИУК, 2,4-D с учетом содержания эндогенного ИУК в растениях. Разработанный способ повышает эффективность пыльцевого эмбриогенеза до 8%.

3. Впервые при гаметоклональной селекции in vitro из трех форм селективного агента: культуральный фильтрат, фитотоксины и водная форма грибного фильтрата (ВФГФ) гриба Septoria nodorum Вerk. выявлена эффективность отбора эмбриоидов на среде с ВФГФ.  Данный селективный фактор обладал фитотоксичностью в 1,5 – 2 раза выше по сравнению с КФ.

4. Установлено, что в условиях in vitro на уровне репродуктивных клеток, при использовании абсцизовой кислоты и хлорида натрия,  получены осмотолерантные клеточные линии. На основе морфогенетического цикла «клетка-растение-клетка» отобраны засухоустойчивые линии АR245, Ю580R2 и гаметоклон ЛГВ3-692-3-5, которые  проявили устойчивость к засухе при полевой оценке (7-9 баллов).

        5. Линии, полученные в результате селекции на уровне гамет, отличались анатомо-морфологическими признаками и общей архитектоникой - большей листовой поверхностью, верхний  лист  по отношению к стеблю  расположен  под значительно меньшим углом (45-550), что приводит к смещению фаз всходы-колошение на период лучшей влагообеспеченности. Растения формировали большое количество узловых корней и продуктивных побегов кущения в условиях острой засухи.

6. Линии – регенеранты превысили стандартный сорт Акмола 2 по урожайности на 3,6-4,5 ц/га.  Урожайность формировалась за счет высокой продуктивной кустистости, озерненности колоса и массы зерна с колоса. Хлебопекарная оценка линий варьирует от 4,3 до 4,6 балла. Высоким содержанием клейковины отличались линии Ю580R и ЛГВ2-92-2  - 30,0-32,4%. Линии Ю580R, AR45 использованы в гибридизации и на их основе при отборе получено 44 400 элитных колосьев.

       7. При использовании белковых маркеров на ранних этапах гибридизации выявлены ценные гибридные комбинации  по запасным белкам пшеницы. Константные формы с ценными аллелями по этим признакам переданы в селекционные центры. Выявлены гибридные  комбинации с большим содержанием МДГ-ГОАТ (малатдегидрогеназа-глутамат-оксалоацетат аминотрансфераза) по сравнению с родительскими формами. Малатдегидрогеназный комплекс позволяет отобрать ценные линии на устойчивость к засухе в ранних поколениях.

       8. RAPD анализ подтвердил наименьшие геномные различия (0.02) между исходным сортом Целинная–Юбилейная  и дигаплоидной линии Ю580R.  При сравнении спектров дигаплоидной линии Ю580R и полученной из нее гаметоклонов (ЛГВ3-692-3-5, ЛГВ2-92-2, ЛГВ1-92-2) выявлено 13 полиморфных фрагментов.

       9. Многолетние полевые испытания подтвердили наличие морфофизиологических показателей устойчивости растений пшеницы к засухе и полеганию. Показана перспективность комплексного применения методов биотехнологии  и традиционной селекции для отбора линии, обладающих хозяйственно-ценными признаками. Полученные  перспективные линии яровой мягкой пшеницы готовятся к передаче на Государственное сортоиспытание.

Список опубликованных работ

  1. Биотехнология. Генетикалы инженерия дістерін сімдік шаруашылыында олдану.// Учебное пособие, Астана, 1999, 71с.
  2. Разработка технологической цепи, включающей традиционные и нетрадиционные методы селекции яровой пшеницы.// Вестник науки ААУ, 2000, т.2, № 9, с 140-145.
  3. Получение константных форм из гибридов и линий яровой мягкой пшеницы в культуре пыльников.// Материалы научно-практической конференции «Образование и наука в современных условиях развития Казахстана: опыт, проблемы и перспективы», Уральск, 2002, с. 131-133 (в соавторстве М.Ж. Каирова).
  4. Использование DH  - метода для индукции гаметоклональных вариации в культуре пыльников яровой мягкой пшеницы Triticum aestivum L.// Биотехнология. Теория и практика, 2003, т.1, с. 60-65 (в соавторстве Зеленский Ю.И).
  5. Использование DH-метода для проведения гаметной селекции // Биология наука XXI века.7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых 14-18 апреля, Москва, 2003, Сборник тезисов, с. 90.
  6. Биотехнология в селекции пшеницы на севере Казахстана. Итоги и перспективы //Международная конференция «Развитие ключевых направлений сельскохозяйственных наук в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы». Астана, 2004, с. 354-360. (в соавторстве Зеленский Ю.И., Созинова Л.Ф., Любовцев В.В., Шек Г.О)
  7. RAPD-анализ ДНК линий-регенерантов пшеницы // Методические рекомендации, Астана, 2005, 17 с. (в соавторстве Е.З.Кочиева)
  8. Селекционная оценка линий-регенерантов яровой мягкой пшеницы,  отселектированных в условиях in vitro к водному стрессу // Современные проблемы почвозащитного земледелия и пути повышения устойчивого развития зернового производства в степных регионах. Международная научно-практическая конференция, посвященная 50-летию «НПЦ ЗХ им. А.И.Бараева». Шортанды, 2006, с.135-139 (в соавторстве Р.Н.Оковитая).
  9. Селекция на уровне гамет и молекулярно-генетическая оценка растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы // Российская школа-конференция «Генетика микроорганизмов», посвященная 100-летию со дня рождения С.А. Алиханяна. Москва-Пущино-на-Оке, 2006, с 33.
  10. Влияние экзометаболитов гриба S. nodorum на рост изолированных зародышей пшеницы и прирост каллусной ткани // Международная конференция, посвященная 50-летию Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина, Астана-2007, с. 187 (в соавторстве Калашникова  Е.А.)
  11. Оптимизация условий выращивания гриба Septoria nodorum  для проведения селекции  in vitro // Международная конференция, посвященная 50-летию Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина, Астана, 2007, с. 204 (в соавторстве Е.А. Калашникова).
  12. Эффективность мультидисциплинарного подхода в решении проблем селекции яровой мягкой пшеницы // Международная конференция, посвященная 50-летию Казахского агротехнического университета им. С.Сейфуллина, Астана, 2007, с. 196 (в соавторстве И. Рахимбаев, К. Булатова).
  13. In vitro жадайында оздырылан андрогенез арылы гамета жасушаларын срыптауды ммкіншілігі мен артышылыы.// Сакен таылымы-4 атты Республикалы ылыми-теоретикалы конференцияны материалдары. Астана, 2008, с. 99 (в соавторстве Ж.. Джардемалиев).
  14. Фенольные соединения как токсины фитопатогенных грибов  Septoria nodorum Berk. их роль в каллусных тканях яровой мягкой пшеницы, подверженных стрессовому воздействию// Поиск, № 4, 2008, с 71-13.
  15. Селекция пшеницы на уровне клеток к культуральному фильтрату патогена Septoria Nodorum Berk.// Вестник КазНУ им. Аль-Фараби, №4 (39), 2008, с. 60-63 (в соавторстве Е.А. Калашникова). 
  16. Наработка токсинов фитопатогенного гриба Septoria nodorum B. для использования в схеме селекции in vitro // Вестник науки КазАТУ им.С.Сейфуллина. № 2 (49) Астана, 2008, c. 25-31  (в соавторстве М.Б. Орынбаев, Ш.С. Рсалиев., С.М. Мамадалиев.).
  17. Cортовая специфика ответа яровой мягкой пшеницы при прорастании семян под действием экзометаболитов фитопатогенного гриба Septoria nodorum // Материалы научно-теоретической конференции «Бараевские чтения», Астана, 2008, с. 31-33.
  18. Использование селекции in vitro для индукции устойчивости к экзометаболитам фитопатогенного гриба S. nodorum Berk. // Агромеридиан 2(8). Алматы, 2008, с. 27-32.
  19. Отбор стрессоустойчивых растений пшеницы на основе малатдегидрогеназного комплекса (Triticum aestivum L.) // Известия ТСХА, 2008, выпуск № 4, с. 115-117(в соавторстве Е.А. Калашникова).
  20. Выделение фитотоксинов из культурального фильтрата и фитопатогенного гриба Septoria nodorum B // IX конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», Москва, 2008, с. 36.
  21. Выявление лучших форм селективного агента для проведения селекции пшеницы к грибному патогену в условиях in vitro (Triticum aestivum L) // Международная школа-конференция, посвященная 40-летию ГосНИИгенетика.  Москва, 2008, с. 21.
  22. RAPD – маркирование для анализа полиморфизма дигаплоидной линии и гаметоклональных вриантов пшеницы (Triticum aestivum L.). // IX конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Москва, 2008, с. 34 (в соавторстве Е.З. Кочиева).
  23. Molecular analysis of polymorphism in wheat regenerants plants offspring (Triticum aestivum L.) // Science review I (2) 2008, Journal S.Seifullin Kazakh Agro Technical University, Astana, Kazakhstan,с 51-57 (Elena Z.Kochieva).
  24. Глубинное культивирование каллусных клеток пшеницы (Triticum aestivum L) в стандартных и стрессовых условиях // Вестник науки Казахского агротехнического университета им.С.Сейфуллина. № 4 (51) Астана, 2008, c. 126-130 (в соавторстве Е.А. Калашникова, Джардемалиев Ж.К., Лесова Ж.Т., Егизбаева Т.К.).
  25. Изучение влияния фитотоксинов гриба Septoria nodorum  Berk. на прирост каллусной ткани яровой мягкой пшеницы // IX конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, Россия, 2008), с. 32.
  26. Использование белковых маркеров и гомозиготизация ценных гибридных комбинаций пшеницы методами биотехнологии (Triticum aestivum L.)  // Биологические науки Казахстана, №4, 2008, с. 30-34.
  27. Инновационный патент «Способ получения гаплоидных растений пшеницы с повышенным регенерационным потенциалом» 2007/0161.1.
  28. Selection of Wheat for Resistance to the Fungal Pathogen Septoria Nodorum Berk. in an Isolated Anther Culture.// Russian Agricultural Sciences, 2009, Vol. 35, No. 4, pp. 215–217. © Allerton Press, Inc., 2009, (E. A. Kalashnikova).
  29. Wheat double haploid lines with improved salt tolerance: in vitro selection and RAPD analysis // Crop Plant Resistance to Biotic and Abiotic factors: current Potential and Future Demands. Proceedings of the 3rd Inernational symposium on Plant Protection and Plant health in Europe, Berlin, Germany, 14-16 May 2009, p. 87-89.(Elena Z.Kochieva).
  30. Влияние генотипа на пыльцевой эмбриогенез в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.) // Материалы Международной научно-практической конференции Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения 26-28 мая, Ульяновск, 2009, c. 16-19.
  31. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к экзометаболитам гриба Septoria nodorum B. // Методические рекомендации. Астана, 2009, 24 с.
  32. Селекционная оценка линий, полученных в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.). // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана №3 2009, ТОО издательство «Бастау», с. 11-14 (в соавторстве Зеленский Ю.И).
  33. Изучение биологических и хозяйственно-ценных признаков дигаплоидной линии, полученной в культуре in vitro (Triticum aestivum L.) // Вестник науки Казахского агротехнического университета им. С.Сейфуллина. № 1 (52), 2009, c. 8-13 (в соавторстве Р.Н. Оковитая).
  34. Эффективность использования гаплоидных технологий для улучшения качества зерна пшеницы (Triticum aestivum L.) // Актуальные вопросы биологии в Байкальском регионе. Материалы международной научной конференции. Выпуск 2, Иркутск 2009, с 79-83 (К.М. Булатова).
  35. Ускоренное размножение в культуре in vitro  растений-регенерантов (Triticum aestivum L) и оценка их устойчивости к экзометаболитам Septoria nodorum B. // Агромеридиан 1-2(11-12). Алматы, 2009, с. 18-22.
  36. Использование дигаплоидных линий в селекционных программах яровой пшеницы (Triticum aestivum L.). // Вестник науки Казахского агротехнического университета им. С.Сейфуллина. № 4 (52), 2009, c. 91-95.
  37. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к экзометаболитам гриба Septoria nodorum B. // Методические рекомендации. Астана 2009, 24 с. (в соавторстве Е.А. Калашникова).
  38. Влияние стадий развития микроспор на пыльцевой эмбриогенез в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.). // Научный журнал МОН и РК: Поиск, №2, 2009, с 16-19 (в соавторстве Л.Ф.Созинова).
  39. Выделение и идентификация фитотоксинов гриба Septoria nodorum B. //  Вестник КазНУ им. Аль-Фараби, №1 (40), 2009, с. 94-97.
  40. Использование БАВ в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.). // Вестник  КазАТУ № 2 (53), 2009, с. 219-224 (в соавторстве Макашева А., Тойымбаева Д.)
  41. Индукция гаплоидных структур в стрессовых условиях культивирования пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.). // Иммунология. Аллергология. Инфектология, №1, т 1, 2009, с. 65.
  42. Размножение растений-регенерантов пшеницы (Triticum aestivum L.). устойчивостьк экзометаболитам фитопатогенного гриба Septoria Nodorum Berk. // Иммунология. Аллергология. Инфектология, №1,т 1, 2009, с. 66.
  43. Селекция пшеницы на устойчивость к грибному патогену Septoria nodorum Berk. в культуре изолированных пыльников // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук, № 4, 2009, с. 6-7.
  44. Использование дигаплоидных линий в селекционных программах яровой пшеницы (Triticum aestivum L.). // Вестник науки Казахского агротехнического университета им.С.Сейфуллина. № 4 (52) Астана, 2009, c. 87-91.
  45. сімдік биотехнологиясы Учебник, Астана, 2009, 115 с.
  46. Детерминация спорофитного пути развития микроспор в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.). // Вестник СГУим.Шакарима, №1, 2009, с. 109-112.
  47. Анализ геномного полиморфизма дигаплоидной линии и гаметоклональных вариантов, индуцированных в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.). // Доклады НАН РК, 2010, № 2, с. 89-92 (в соавторстве Е.З. Кочиева).
  48. Селекция in vitro на уровне репродуктивных клеток к водному дефициту (Triticum aestivum L.). // Естественные и технические науки, 2010. № 4, с. 101-105 (в соавторстве Е.А. Калашникова, В.С Шевелуха).
  49. Использование DH-линий в схемах традиционной селекции пшеницы (Triticum aestivum L.). // Естественные и технические науки, 2010. № 4,  с. 106-109 (в соавторстве Р.Н Оковитая, Каскарбаев Ж.А., Е.А.Калашникова).
  50. Влияние индолилуксусной кислоты на компетенцию микроспор в культуре пыльников пшеницы. // Естественные и технические науки, 2010, № 4, с. 167-171 (в соавторстве Е.А.Калашникова, И.В. Скоробогатова, Н.П. Карсункина, В.С. Шевелуха, И. Рахимбаев).
  51. Выделение водной формы культурального фильтрата гриба Septoria nodorum Berk. и изучение его токсичности для селекции in vitro. // Естественные и технические науки, 2010, № 4, с. 110-113  (в соавторстве Е.А Калашникова, И. Рахимбаев).
  52. Оценка линий-регенерантов яровой пшеницы по хозяйственно-ценным признакам (Triticum aestivum L.). // Естественные и технические науки, 2010, № 5, с.  163-166 (в соавторстве Калашникова Е.А, Каскарбаев Ж.А.).
  53. Индукция пыльцевого эмбриогенеза при солевом стрессе в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.). // Естественные и технические науки, 2010, № 5, с. 154-157  (в соавторстве Е.А.Калашникова).
  54. Роль ИУК в процессе андрогенеза in vitro яровой мягкой пшеницы //  Естественные и технические науки, 2010, № 5, с. 158-162 (в соавторстве Е.А.Калашникова).
  55. Влияние гормонального фактора на эффективность пыльцевого эмбриогенеза пшеницы (Triticum aestivum L.) // Физиолого-биохимические и генетико-селекционные исследования растений в Казахстане/ Сб. статей. Алматы, 2010, с. 95-102 (в соавторстве Макашева А., Рахимбаев И.)
 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.