WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

ВОДОВОЗОВА Елена Львовна

ФОТОАФФИННЫЕ ЛИПИДНЫЕ ЗОНДЫ С ДИАЗОЦИКЛОПЕНТАДИЕН2-ИЛКАРБОНИЛЬНОЙ МЕТКОЙ: СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ В МЕМБРАННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

03.00.04 – Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва – 2007

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Цетлин Виктор Ионович доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович доктор биологических наук, Торховская Татьяна Ивановна

Ведущая организация: Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится “ 10 “ октября 2007 года в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН) по адресу: 117997, В-437, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН.

Автореферат разослан “____“ сентября 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор химических наук, профессор В.А. Несмеянов

Актуальность темы. Метод фотоаффинного мечения (photoaffinity labeling, PAL) широко применяется в структурно-функциональных исследованиях биологических систем. Он позволяет получить прямые доказательства пространственной близости молекулярных компонентов. Зонд, аналог природного вещества, несущий фотофор (фотоаффинную фотоактивируемую фотореактивную метку), вводят в изучаемую систему и подвергают облучению. При фотолизе метки образуется высокореакционноспособный интермедиат – карбен, нитрен, бирадикал и др. – способный ковалентно связываться (сшиваться) с ближайшим фрагментом биомолекулы. Для детектирования продуктов реакции – модифицированной макромолекулы и, в конечном счете, участка ее модификации – зонд должен содержать репортерную группу (радиоактивную, хромофорную, флуоресцентную, иммунореактивную). В итоге возможно определить, например, аминокислотные остатки (а.о.) белка, входящие в контакт лигандом. Для получения такой информации чаще всего применяют рентгеновскую кристаллографию (РСА) и ЯМР высокого разрешения. Сейчас эти мощные методы анализа поддержаны технологиями получения рекомбинантных ДНК, которые позволяют получать миллиграммовые количества полипептидов и полинуклеотидов. Однако такой анализ невозможен или крайне затруднен в целом ряде случаев: при изучении комплексов транскрипционных факторов, рибосом, белков в составе везикул, локальных структурных образований цитоскелета и интегральных сигнальных комплексов. Здесь PAL является важнейшим методом идентификации субъединиц и картирования активного центра, наряду и в дополнение к исследованиям с помощью точечного мутагенеза и связывания моноклональных антител. Главное преимущество PAL состоит в том, что оно применимо к нативным белкам.

Роль биологических мембран и липид-белковых комплексов в функционировании клетки и организма в целом сложно переоценить. Наряду с физическими методами изучения строения мембран – электронной микроскопией, спектроскопией ЯМР, применением ЭПР- или флуоресцентных зондов, – а также химическими – с использованием моно- и бифункциональных реагентов, разработан метод исследования мембран с помощью фосфолипидных фотоаффинных зондов (Khorana H.G., 1975; Stoffel W., 1978; Brunner J., 1980).

Развитие этого метода путем поиска новых высокочувствительных фотофоров и синтеза на их основе липидных зондов – актуальная задача мембранологии.

Требования, предъявляемые к фотофорам, включают: инертность в отсутствие актиничного света; активацию в условиях, не разрушающих компоненты биологической системы; малое время жизни (меньше времени жизни лиганд-рецепторного комплекса) и высокую реакционную способность возбужденного состояния; минимальный размер; доступность, то есть несложность синтеза. Зонд должен содержать репортерную группу, наличие которой существенно облегчает подготовку и анализ образцов даже при использовании современных масс-спектрометрических (MS) методов идентификации продуктов PAL (Jahn O., 2004; Kotzyba-Hibert F., 2006). В качестве фотофоров в мембранных исследованиях чаще всего применялись арилазиды и фенилдиазирины. Первые довольно легко синтезировать, и они фотолизуются в мягких условиях, однако генерируемые при этом нитрены имеют невысокую реакционную способность. Фенилдиазириновая и п-(3-трифторметилдиазирино)фенильная (Tfd) группы при фотолизе образуют высокоактивные карбены, но синтезы соединений, меченных этими фотофорами, трудны.

Домены мембраносвязанных белков и участки апобелков в липидбелковых комплексах, контактирующие с гидрофобными зонами, обогащены неполярными а.о. Эффективное мечение этих областей возможно лишь при использовании фотофоров, реагирующих даже с неактивированными СНсвязями. Наше внимание привлекла диазоциклопентадиен-2-илкарбонильная (Dcp) группа. Синтез исходного соединения для ее введения – 2-диазоциклопентадиенкарбоновой кислоты – не представляет большой трудности (Martin J.C., Bloch D.R., 1971). До наших работ Dcp-группа лишь однажды применялась для создания зондов, причем нелипидной природы (Nielsen P.E., 1983).

Впервые синтез 14С- и 3H-меченых фосфатидилхолинов (РС) и сфингомиелинов, несущих Dcp-группу в -положении жирнокислотной цепи, был осуществлен в ИБХ РАН (Карюхина М.О., 1988) с использованием подходов, разработанных для зондов с 2-нитро-4-азидофенильной (Nap) меткой [2-8]. Сравнение способности зондов, несущих в sn-2-положении остатки N-Nap-аминоундекановой и N-Dcp-аминододекановой кислот, ковалентно связываться с [14С]дипальмитоил-РС или [14С]холестерином в везикулах из димиристоил-РС, подтвердило более высокую активность Dcp-метки.

Цель исследования. Целью настоящей работы явились детальные исследования фотохимических свойств диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной группы, разработка и усовершенствование методов синтеза разнообразных липидных зондов на ее основе, разработка метода получения зондов, содержащих удобный в работе высокоактивный радионуклид (125I).

Другой важнейшей задачей было применение полученных зондов для изучения ряда мембранных биологических систем как с целью доказательства эффективности PAL с использованием Dcp-фотофора, так и для получения новых данных об организации различных липид-белковых комплексов. Данная часть работы проведена в сотрудничестве с коллегами из различных лабораторий ИБХ РАН, а также других исследовательских учреждений.

Научная новизна и практическая ценность. Диссертация суммирует результаты оригинальных разработок и синтезов, которые формируют новое направление в рамках развития метода фотоаффинного мечения.

В настоящей работе впервые детально исследованы фотохимические свойства Dcp-группы. Показано, что она является высокоэффективной карбенгенерирующей меткой, превосходящей по ряду параметров, в том числе, высокой реакционной способности и мягким условиям фотолиза известные и широко применяемые фотофоры [17,22,35,41,45].

Осуществлены синтезы новых 14С-меченых РС-зондов для мембранных исследований, содержащих Dcp-группу при концевом атоме углерода ацильных остатков в sn-2 положении на различном расстоянии от полярной головной группы. С помощью этих зондов исследована топография цитохрома Р42В4 в мембране. Полученные данные хорошо коррелируют с результатами конформационного анализа, а также подтверждаются более поздними публикациями авторов, применивших другие методы исследований [9,32].

В ходе разработки синтезов 14С-меченых зондов найден новый основный катализатор – 4-аминопиридин (4PyNH2) – для проведения реакции Оацилирования в условиях карбодиимидного синтеза в среде органических растворителей. Применение 4PyNH2 в синтезах фосфо- и гликолипидов позволяет существенно увеличить выход при ацилировании малореакционноспособной вторичной ОН-группы глицерина, что имеет принципиальное значение при получении микромолярных количеств радиоактивномеченых, дорогостоящих или нестабильных соединений [10-14,27,31,33].

Обнаружена способность Dcp-группы легко подвергаться иодированию в стандартных условиях окислительного процесса. Показано, что при этом фотохимическая активность сохраняется, и заметной потери иода при фотолизе не происходит. Найденные свойства превращают Dcp-метку в высокоэффективный и удобный в применении фотофор, который позволяет осуществлять синтез нерадиоактивных зондов, а высокоактивный нуклид 125I вводить в готовую молекулу зонда непосредственно перед применением. Положение радиоизотопа в фотофоре делает более надежным анализ продуктов PAL. Эффективность применения 125I-меченого Dcp-фотофора для зондирования мембранных систем подтверждена на хорошо изученной биологической модели – вирионе гриппа [17,22,35,41,45].

Разработан синтез алифатической кислоты, несущей при -углероде Dcp-фотофор, присоединенный через сложноэфирную связь. Целевыми биомолекулами в структурных исследованиях с применением PAL чаще всего являются белки, и наличие сложноэфирной связи, лабильной в щелочной среде в отличие от пептидной, должно облегчить анализ продуктов фотомечения хроматографическими и MS методами. Кислота служит синтоном при получении различных зондов для изучения неполярной области липидного бислоя. Синтезирована и максимально короткая карбоновая кислота (в виде активированного эфира) с Dcp-оксигруппой, с помощью которой можно получать зонды для мечения полярных областей мембран и других биологических систем [22].

Новые ганглиозидные зонды [22,23,41], синтезированные на основе лизоганглиозида GM1 и несущие 125I-Dcp-фотофор в ацильной части церамидного остатка на различном расстоянии от олигосахаридной части молекулы применены для исследования взаимодействия различных субъединиц цитокиновых рецепторов с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах. Получены сведения, важные для понимания механизма сборки рецептора интерлейкина-2 и проведения сигнала внутрь клетки [29,44].

С помощью нового зонда, несущего 125I-Dcp-фотофор в олигосахаридной части молекулы ганглиозида GM1 вместо ацетила в остатке сиаловой кислоты, определены фрагменты молекулы интерлейкина-4, взаимодействующие с ганглиозидом. Исследования проведены в рамках изучения молекулярных механизмов иммуносупрессии ганглиозидами. Полученные данные в перспективе могут быть использованы при создании пептидов для цитокинотерапии различных заболеваний [46].

Впервые для идентифицикации субъединиц мембранного субкомплекса F0 митохондриальной H+-АТР-азы, непосредственно контактирующих с липидами мембраны, применен фотоаффинный фосфатидилхолин. Для многосубъединичного интегрального белка MS метод анализа продуктов PAL липидным зондом был использован впервые [21,24,37,38].

В рамках изучения механизма взаимодействия потенциальных носителей противоопухолевых препаратов – липосом, несущих углеводные детерминанты – с клетками опухолей [14-16,18-20,26,30,31,34,36,39,40,42,43,48-52], разработан синтез неогликолипидных конъюгатов с Dcp-фотофором, предназначенных для встраивания в липидный бислой липосом [25]. Зондирование 1I-Dcp-мечеными липосомами показало, что на поверхности исследованных опухолевых клеток действительно есть рецепторы (предположительно, лектины), опосредующие взаимодействие с липосомами, оснащенными различными углеводными лигандами [28,47].

Результаты данной работы показывают, что диазоциклопентадиен-2- илкарбонил, будучи компактной, доступной, стабильной в отсутствие актиничного света и фотолизующейся в мягких условиях меткой, кроме того обладает высокой реакционной способностью наряду со свойством подвергаться прямому введению 125I, что обеспечивает удобство получения зондов и высокую чувствительность метода. Указанные качества превращают Dcp-фотофор в ценный инструмент для биологических исследований.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 229 стр. текста.

Она состоит из введения, обзора литературы «Метод фотоаффинного мечения и его примение в структурно-биологических исследованиях», 10 глав, посвященных результатам и их обсуждению, экспериментальной части и выводов.

Работа иллюстрирована 41 рисунком, 16 схемами и 7 таблицами. Список цитированной литературы включает 370 наименований.

1. Изучение фотохимических свойств Dcp-группы Синтез 2-диазоциклопентадиенкарбоной кислоты (DcpOH) 1 осуществляли как описано (Martin J.C., 1971) (Схема 1). Кислоту 1 отделяли от 3-диазоциклопентадиенкарбоновой кислоты1 хроматографией на силикагеле. В отсутствие УФ-облучения DcpOH может храниться годами, устойчива к действию мягких кислот и щелочей, надуксусной кислоты и других окислителей. DcpМеченый жирный ацил реагирует с циклогексаном и iPrOH, и внедряется в Эффективность диазоциклопентадиен-3-илкарбонильной группы как фотофора существенно ниже, чем Dcp-группы (Nielsen P.E., 1983).

COOH 1. CO2 / -20 -30oC Na / iPrOH + COOH + 2. H Na SiMe3Cl / Py COOSiMeCOOSiMeCOOSiMeTosN3 / Pip COOSiMe3 COOH H2O + + COOSiMe3 COOH N2 N2 N2 N~ 1.7 : Схема 1. Синтез 2-диазоциклопентадиенкарбоновой кислоты (1).

СН-связи в модельных мембранах (Карюхина, 1988). Продукты пришивки регистрировались молекулярными пиками MS, либо радиоактивностью на пластинках ТСХ. Мы поставили задачу определить структуру аддукта Dcp-содержащей молекулы с С6Н12 и получить количественные характеристики реакции фотолиза в циклогексане. Cпособность к внедрению в неактивированные СНсвязи – показатель максимальной реакционной способности фотофора.

При фотоактивации диазоциклопентадиен образует циклопентадиенилиден, карбен, основным состоянием которого является триплетное. Однако химические реакции в растворах протекают на базе синглетного состояния, и внедрение в СН-связи происходит очень эффективно (Ando W., 1973). Ход фотолиза зонда минимального размера DcpOMe (2) представлен на Рис. 1. Время полужизни (t1/2) диазогруппы в указанных условиях < 30 сек. После фотолиза к раствору добавляли С6D12 и регистрировали спектр 1Н-ЯМР, с последующим анализом методом двойного резонанса (Рис. 2). С максимальным выходом образовался самый неполярный продукт (ТСХ). Мы интерпретировали единственный основной продукт (кроме смолы) как структуры 3а или 3б (Схема 2).

Положение сигнала протона циклогексила Н1 в очень слабом поле (3.м.д.) подтверждено двойным резонансом на соседних циклогексильных протонах в сильном поле (1.53 м.д.) при изучении спектров в d4-метаноле.

О существовании изомеров по двойным связям замещенных циклопентадиенов сообщалось ранее (Mironov V.A., 1963). Изомеры находятся в термо- Рис. 1. Фотолиз DcpOMe 2 в циклогексане (6 мМ); >3нм. Облучение светом ртутной лампы среднего давления мощности 30 Вт (макс 365 нм) на расстоянии 7 см, светофильтр – стекло Пирекс.

___________________________________________________________________ Рис. 2. Спектры 1Н-ЯМР (C6D12) DcpOMe 2 до (верхний) и после (нижний) фотолиза в циклогексане; фотолиз проводился до 80%-ной конверсии. Спектр не изменялся при хранении раствора несколько сут при 4 С.

динамическом равновесии; их соотношения зависят от характера заместителя(ей)2; переходы происходят путем переноса Н от С5 к соседнему С-атому.

COOMe COOMe COOMe a H H COOMe N3a 3б Схема 2. а) h, > 300 нм, 3 мин, циклогексан.

Например, метилциклопентадиенкарбоксилат представлен в основном 1,3-диеном (в нашем случае структура 3б).

При соотнесении интегральных интенсивностей сигналов эфира 2 до и после фотолиза продукт внедрения в СН-связь составил 42%. Фотолиз Tfdпроизводного в C6Н12 дает ряд соединений, среди которых продукт внедрения в СН-связь – 58% для 2 мМ раствора и 28% для 30 мМ (анализ ГЖХ) (Brunner J., 1995). Следовательно, по реакционной способности карбены, генерируемые Dcp-группой и Tfd-меткой, признанной лучшим фотофором, сравнимы. Важно и то, что молярная экстинкция Dcp-группы (~16000, =314 нм) существенно выше, чем Tfd (~300, =353 нм; t1/2 25 сек при облучении 3 мМ раствора в C6H12 ртутной лампой 450 Вт на расстоянии 4 см (Brunner J., 1980)). Этот факт делает Dcp-группу более привлекательной в качестве фотофора для изучения динамических и высоколабильных систем.

2. Синтез 14С-меченых3 фосфолипидных зондов, содержащих Dcp-группу Мы поставили задачу оптимизации всех стадий синтеза Dcp-фосфолипидов. Для синтеза длинноцепных зондов использовали разработанную ранее схему [2,3] (Схема 3). На заключительной стадии кислота 8 вводится в реакцию конденсации с лизо-РС или сфингозин-1-фосфохолином в присутствии DCC4 и катализатора (DMAP, PPy, 4-пиперидинопиридин). В зависимости от реакционной способности OH- или NH2-группы и основности катализатора, ацилирующий интермедиат – О-ацилизомочевина – необратимо перегруппировывается в N-ацилмочевину, побочный продукт реакции. Сфингоидная NH2-группа реагирует довольно эффективно; замена хроматографии на силикагеле5 гель-фильтрацией на липофильном сефадексе и разделением на обращенной фазе позволила повысить выход сфингомиелина 10 до 60% (в 2 раза) при эквимольном количестве кислоты 8. Ацилирование же ОН-группы, особенно вторичной, протекает гораздо медленнее. Оптимизация этой реакции – важная задача в химии липидов, т.к. модифицированные фосфолипиды (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит и т.д.) обычно получают из РС ферментативной переэтерификацией. Известные методы ацилирования втор-ОН- 3 С-Меченые соединения мало подвержены радиолизу и имеют высокую эффективность жидкостно-сцинтилляционного счета, в отличие от 3Н-меченых.

Сокращения: DCC – дициклогексилкарбодиимид, DMAP – 4-диметиламинопиридин, PPy – 4-пирролидинопиридин, SDS-PAGE – электрофорез в полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия, ТЕА – триэтиламин, DMSO – диметилсульфоксид, DMF – диметилфор-мамид, TFA – трифторуксусная кислота.

Необратимая сорбция микромолярных количеств веществ на силикагеле в случае Dcp-меченых соединений усиливается темновой реакцией пришивки больше, чем Nap-меченых.

а,б COO Ca COOH N[14C] I в,г COOMe H2N[14C] д OH Cl N2 O N2 O е,ж,з H COOH N [14C] N2 O и + N O O O P O n O O к O H N [14C] O n = 1 (~72%) n = 3 (~28%) O NHO H O + N O P O H NH O H N [14C] O O NСхема 3. а) K[14C]N; б) HCl; в) Н2/Pt; г) МеОН/HCl; д) SO2Cl/Na2CO3; е) DcpCl + 6/TEA; ж) КОН, iPrOH-H2O; з) HCl; и) лизофосфатидилхолин, DCC/DMAP;

к) сфингозин-1-фосфохолин, DCC/DMAP.

группы не лишены недостатков (низкие выходы, необходимость избытка производных жирных кислот). Развитие получил метод синтеза сложных эфиров глицерофосфолипидов из ангидридов кислот в присутствии DMAP (Khorana H.G., 1977). Но и применение более сильного катализатора PPy требует некоторого избытка ангидрида: в пересчете на саму жирную кислоту – более 2 экв.

Вариант, где лизо-РС, жирная кислота (небольшой избыток), DCC и катализатор реагируют в 1 стадию дает приемлемые (20-50%), но маловоспроизводимые выходы целевого РС (Молотковский Юл.Г., 1982).

Мы нашли, что введение 5-ти и более экв. PPy (но не DMAP) существен- но ускоряет ацилирование лизо-РС [14С]пальмитиновой кислотой. Эффект был обусловлен примесным веществом в препарате фирмы Fluka – 4-аминопиридином (4PyNH2), который является побочным продуктом синтеза PPy. Сложно представить, чтобы соединение с первичной NH2-группой катализировало реакцию ацилирования по ОН-группе. Однако показано (Joule J.A., 1972), что ацилирование 4PyNH2 проходит через стадию образования высокореакционноспособного енамида по эндоциклическому атому N. Мы полагаем, что в результате быстрого 1-N-ацилирования 4PyNH2 О-ацилизомочевиной образуется енамид (*) (Схема 4), который и ацилирует гидроксил субстрата.

+ NH2 NH2 NH PPy или 4PyNHDCC CH3(CH2)1414COOH + - H+ N N N 14 CH3(CH2)14C O CH3(CH2)14C O (*) лизо-РС 4PyNH+ N O CO(CH2)14CHO NHO P O n O O O C N n = 1 (~72%) O n = 3 (~28%) (**) [14C]PC Схема 4. Механизм катализа O-ацилирования 4PyNH2 в присутствии DCC.

Данный механизм подтверждается тем, что катализ происходит лишь при введении избытка 4PyNH2 или его сочетания с более сильным основанием PPy (Табл. 1), что должно вызывать ускорение образования енамида. Побочный продукт при избытке 4PyNH2 более 4-5 экв. – продукт необратимой перегруппировки енамида (*) в амид (**). Вещество выделено (FAB-MS: 334 [M]+).

Применение 4PyNH2 для получения зонда РС 9 (стадия и, Схема 3) дало увеличение выхода до 54% (против 17%). Первичный же гидроксил 1,2-диглицерида ацилируется количественно в присутствии 4PyNH2 в течение минут.

Синтез 14С-меченого РС 12, несущего Dcp-группу на близком расстоянии от полярной головки, осуществляли на основе [1-14C]глицина (Схема 5).

Первый вариант (стадии а,б,в,г) – ацилирование лизо-РС Вос-[1-14C]глицином Время реакции, ч Таблица 1. Выходы [14C]PC при ациКатализатор лирования лизо-РС [14C]пальмитино2 17 вой кислотой в присутствии DCC и PPy (5 экв.) 12 30 катализаторов.а___________________ а 4PyNH2 (5 экв.) 66 72 73 Из 2 мкмоль лизо-РС и экв. количества [14C]пальмитиновой кислоты после очиPPy (2.5 экв.) + 59 73 стки реакционной смеси гель-фильтра4PyNH2 (2.5 экв.) цией и хроматографией на RP-18 полу4PyNH2 (1 экв.) 3 3.5 3.чен [14C]РС (Схема 4) с выходом 58% в присутствии DCC и 4-пиперидинопиридина с последующим деблокированием и введением фотофора на последней стадии – дал выход РС 12 менее 1%.

Тогда мы применили схему синтеза РС 9 (стадии д,е,ж,з,и; Схема 5). Пониженная активность производных -аминокислот и стерические трудности взаимодействия в положении sn-2 обусловили лишь 50% конверсию при ацилировании лизо-РС в присутствии 4PyNH2/PPy. РС 12 дополнительно очищали хроматографией на Al2O3, так как зонд по размерам и гидрофобности мало д,е H ж,з H2N COOH COOMe N N2 O а,б + N O O O P O и n O O O H C N O O в,г O + N O O O P O n O O O H n = 1 (~72%) C N n = 3 (~28%) O O NСхема 5. а) Boc2O; б) лизо-РС, DCC/4-пиперидинопиридин; в) TFA; г) DcpOH, DCC/4-пиперидинопиридин; д) МеОН/HCl; е) DcpCl/TEA; ж) КОН, iPrOHH2O; з) HCl; и) лизо-РС, DCC/4PyNH2+PPy.

отличается от лизо-РС. Тем не менее, выход в 26% на этой стадии в 3 раза больше наших прежних результатов; выход, исходя из [1-14C]глицина, – 12 %.

3. Изучение топографии цитохрома Р-450 2В4 в мембране Среди биологических катализаторов цитохром Р-450 (CYP) – универсальная гемсодержащая монооксигеназа – не имеет себе равных по множеству изоформ, индукторов, субстратов и типов катализируемых реакций. Полипептидная цепь мономерного гемопротеина (44–60 кДа) содержит 45–55% неполярных а.о. Среди мембранных ферментов CYP изучены наиболее тщательно, но относительно их топологии в липидом бислое полной ясности ко времени нашей работы не было. Мембранные CYP на N-концевом фрагменте цепи несут короткий гидрофобный участок от 12 до 21 а.о. Он выполняет роль якорного пептида и содержит сигнальную последовательность, ответственную за встраивание белка в мембрану. За ним расположена стоп-сигнальная последовательность (а.о. 18-29 для CYP2В4), останавливающая встраивание пептида.

Были приняты минимум две модели ориентации в мембране микросомального CYP, построенные на основании расчета конформаций цепи с учетом вторичной структуры и гидрофобности, или по результатам трипсинолиза CYP2В4 в протеолипосомах, а также мечения сайт-специфическим флуоресцентным реагентом и моноклональными антителами к а.о. стоп-сигнального пептида. Общим было то, что большая часть гемопротеина находится вне липидного бислоя эндоплазматического ретикулума (ЭР): субстрат-связывающий участок контактирует с липидами, а гем расположен параллельно плоскости мембраны между двумя спиральными высококонсервативными последовательностями 287-307 и 435-466, связанными с поверхностью мембраны. Отличия были в организации мембраносвязанного N-концевого фрагмента: в одной модели предполагался трансмембранный якорь в виде спиральной шпильки из первых ~46 а.о., пронизывающей мембрану, где N-конец локализуется на цитоплазматической стороне ЭР (Nelson D.R., 1988), а в другой – один трансмембранный пептид с выступающим в просвет ЭР N-концом (Vergeres G., 1991).

Мы сопоставили эти модели с результатами зондирования микросомального CYP2В4 (491 а.о., ~49 кДа) в протеолипосомах, сформированных из яичного РС и фосфолипидов, несущих фотофоры на различном расстоянии от полярных головок (РС-зонд, 9:1): Dcp-PC-зондов 9 и 12, и короткоцепного Nap-сфингомиелина 13, синтезированного нами ранее. После облучения про- теолипосомы разрушали детергентом HO H O + N O P O (SDS) и освобождали от несвязашихH NH O H ся ковалентно липидов экстракцией C N O органическими растворителями. ДеO2N N3 натурированный белок растворяли в 70%-ной НСООН и обрабатывали BrCN.6 Лиофилизованную смесь пептидов растворяли в 30% НСООН в iPrOH и подвергали пред-ВЭЖХ на колонке с фазой Superose 12 в той же системе.

Хроматограммы приведены на Рис. 3a-c. Связывающий участок для РС 9, зондирующего неполярную область мембраны, представлен узким пиком (Рис.

3a). В случае РС 12 и сфингомиелина 13 (Рис. 3b и 3c, соответственно), несущих фотофоры вблизи от поверхности мембраны, видны три разделяющихся пика. На колонку наносили равные количества белка (~ 7 мг), следовательно PAL заглубленным в мембрану фотофором прошло наиболее эффективно (до 6000 имп/мин). В обоих случаях PAL у поверхности большая часть липидов (до 2000 имп/мин) связывалась с сегментом, локализованным в последовательности 273-313 (первый из трех меченых пиков на Рис. 3b и 3c). Два других участка связывания включали 700-1200 имп/мин. Эффективность PAL для зондов 12 и 13 мало отличалась, вероятно, из-за тушения карбенов и нитренов водой, содержащейся в приповерхностной зоне мембран. Далее анализировали фракции с наибольшей радиоактивностью: их разделяли на колонке Ultrapore C3RSC (Рис. 3d-f). Пептиды идентифицировали по последовательности 5-ти N-концевых а.о. Единственным пептидом, меченным зондом РС 9 оказался N-концевой фрагмент 1-46 (Рис. 3d). Зонды 12 и 13 (Рис. 3e и 3f) метили одни и те же пептиды: 273-314, 427-491 и 1-46 – 1-й, 2-й и 3-й пики радиоактивности, соответственно. Три липидных зонда связывались лишь с тремя пептидами. Следовательно, большая часть полипептидной цепи CYP2В4 экспонирована в водную среду.

Анализ фрагмента 21-119 на наличие В-эпитопов с помощью метода пептидного сканирования PEPSCAN показал высокую плотность сайтов с антигенной активностью. Следовательно, только фрагмент 1-20 глубоко погружен в мембрану или даже пронизывает ее. По данным компьютерного моде- Дальнейшая работа проведена сотрудниками Института биомедицинской химии РАМН, Москва, в содружестве с Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Gottingen, Germany.

Рис. 3. Хроматографическое разделение BrCN-пептидов модифицированного цитохрома P-450 2B4. (a-c) Разделение на Superose 12 после фотоаффинного мечения зондами PC 9 (a), РС 17 (b), SM 18 (c). (d-f) Разделение пептидов, связанных с зондами PC 9 (d), РС 17 (e), SM 18 (f) на колонке Ultrapore C3 RPSC.

(из Eur. J. Biochem. 1994, 222, 485) лирования (Рис. 4), последовательности 21-119, 273-314 и 428-491 большей частью локализованы на той же стороне молекулы, что и гидрофобная Nконцевая спираль. Так как другие части фрагментов 273-314 и 428-491 находятся в зонах связывания субстрата и гема, возможно, структурные изменения поверхности мембраны влияют на каталитическую активность CYP2В4.

Рис. 4. Компьютерное моделирование пространственной структуры цитохрома Р-450 2В4.

(из Eur. J. Biochem. 1994, 222, 488) Наиболее вероятные кандидаты для взаимодействия с мембраной – сайты в районе а.о. 283-292 и 471-480. Регуляция скорее всего осуществляется через первый сайт – торцевой участок -спирали, который, попадает непосредственно в сайт локализации гема. -Спирали предшествует -изгиб.

Сайт связывания с мембраной, расположенный вблизи С-конца, имеет неупорядоченную конформацию, и изменения в организации липидного бислоя инициированные в этой области, не могут эффективно передаваться на большое расстояние.

Наши результаты хорошо коррелируют с данными, полученными позже приизучении площади внедрения молекулы CYP2В4 в монослой из дипальмито-илфосфатидилэтаноламина с помощью фосфатидилэтаноламиновых / РС монослоев Лэнгмюра-Блоджета (Sligar S.G., 1998), и с результатами определения сайта, формирующего канал доступа субстрата в мембране, полученными для другого CYP – простагландин-I2-синтазы (Wu J., 2003) – при изучении взаимо-действия синтетических пептидов с мицеллами из додецил-РС с помощью двумерного 1H-ЯМР.

4. Иодирование диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной группы Для увеличения чувствительности PAL требуется применение высокоактивных изотопов. Но такой зонд должен быть использован сразу после приготовления. Выход из этого затруднения – синтез холодного зонда, который может сохраняться долго и в который изотоп можно ввести прямо перед опытом. Введение радиометки в остаток фотофора облегчает анализ продуктов сшивки. Наиболее подходящим изотопом можно считать 125I, который вводится в ароматическое ядро, активированное электронодонорным заместителем, путем окислительного иодирования. В реакцию при этом вступает иод-катион I+, образующийся при окислении иодида подходящим агентом (гипохлорит, хлорамин T (Greenwood F.C., 1963), Н2О2 + лактопероксидаза (Bayse G.S., 1971), надуксусная кислота (Moerlein S.M., 1988)). Разработаны методы функционализации ряда фотофоров, в том числе бензофенонового (Prestwich G.D., 1994) и Tfd (Brunner J., 1995), позволяющие вводить в них 125I, однако эти модификации значительно усложняют синтез меток и зондов. Поэтому для РАL чаще применяют производные доступных арилазидов, легко подвергающихся радиоиодированию, хотя они существенно уступают карбен-генерирующим фотофорам. Прямое иодирование Tfd-алкоксипроизводных (Hashimoto M., 2006) с использованием комбинации I2 и (CF3COO)2IPh в СH3CN сложно адаптировать к условиям радиоиодирования зондов (микромоли), когда источником 125I является коммерческий препарата Na125I (2000 Ки/ммоль, 0.5 нмоль).

Мы обнаружили, что Dcp-метка может быть легко иодирована в условиях окислительного процесса, причем в реакцию одинаково легко вступает как сама кислота DcpOH 1, так и ее производные. Способность диазоциклопентадиена вступать в реакции электрофильного замещения известна (Cram D.J., 1963), однако прямое галогенирование еще не было описано. Мы исследовали продукт(ы) иодирования субстрата-зонда минимального размера DcpОМе (Схема 6; избытки реагентов увеличивают выходы продуктов иодирования):

Ra 14 R1 = I, R2 = H (76%) COOMe 15 R1 = H, R2 = I (20%) RCOOMe N2 16 R1 = R2 = I (4%) NСхема 6. а) NaI (10 экв.), хлорамин Т (12 экв.), МеОН.

Разделением ВЭЖХ были получены индивидуальные продукты: 4-моно- (14), 5-моно- (15) и 4,5-дииодпроизводные (16) (Схема 6; 1Н-ЯМР и MS см. Табл.

2). При иодировании меняется УФ-спектр: макс эфира 2 314 нм смещается для продуктов 14, 15 и 16 – макс 322, 316 и 328 нм, соответственно7. Кислота 1 и Dcp-аминопроизводные образуют смеси моно- и дииодпродуктов вне зависимости от соотношения NaI–субстрат в интервале 0.5–10 (мол.).

Молярные коэффициенты экстинкции для эфиров 2, 14–16 определить сложно из-за их летучести; значения должны быть близки найденным для метил-11-(Dcp-окси)ундеканоата (макс 314 нм, 15000, EtOH) и смеси продуктов его иодирования (макс 326 нм, 16700).

Таблица 2. 1Н-ЯМР (500 МГц, С6D12, 25oC; /м.д., J/Гц) и MS (электронный удар, 70 эВ) характеристики соединений 2, 14, 15 и 16.

Н-3 Н-4 Н-5 СН3 m/z (%) 2 6.62 5.91 6.79 3.69 149 (100, M+-H), 121 (40, M+-H-N2);

дд (1H) дд (1H) дд (1H) с (3H) C7H6N2O2 (M+) соотв. 150.04 J3,4=3.15 J4,5=4.64 J5,3=1. J3,5=1.95 J4,3=3.15 J5,4=4.14 6.66 — 6.91 3.70 276 (90, M+), 233 (100, M+-N2-Me);

д (1H) д (1H) с (3H) C7H5N2IO2 (M+) соотв. 275.93 J3,5=2.20 J5,3=2.15 6.51 6.17 — 3.70 276 (85, M+), 233 (100, M+-N2-Me);

д (1H) д (1H) с (3H) C7H5N2IO2 (M+) см. выше J3,4=3.42 J4,3=3.16 6.70 — — 3.70 402 (62, M+), 359 (90, M+-N2-Me);

с (1H) с (3H) C7H4N2I2O2 (M+) соотв. 401.83Важный вопрос – сохранение фотофором своих свойств после иодирования, так как тяжелые атомы облегчают интеркомбинационную конверсию возбужденного синглетного состояния в триплетное, реакции которого могут приводить к простому отрыву протона (Turro N.J., 1978). Существен и вопрос об устойчивости CI-связи. Фотолиз смеси соединений 14–16 в С6Н12 сопровождался изменениями УФ-спектра (Рис. 5). Индивидуальные эфиры 14, 15 и подвергали фотолизу в С6Н12 3 мин и анализировали реакционные смеси, как описано для эфира 2. Кроме небольшого количества смолы (ТСХ), образовались неполярные продукты пришивки карбена к циклогексану (MS). Характерный спектр 1Н-ЯМР представлен на Рис. 6. Мы предложили для фотореак- Рис. 5. Фотолиз иодированного DcpOMe (14+15+16) в циклогексане (6 мМ); >320 нм (светофильтр – насыщенный aq. CuSO4).

Рис. 6. Спектры 1Н-ЯМР (C6D12) 5-иодо-DcpOMe 15 до (верхний) и после (нижний) исчерпывающего фотолиза в циклогексане; анализ методом двойного резонанса.

ции Схему 7. Механизм изомерных превращений, приводящих к образованию соединений 17–19, пока не выяснен. Отметим главное – отсутствие сигналов эфиров 3а (3б) (Рис. 2); иодфторфенилазиды при фотолизе образуют 8% деиодированного продукта СН-внедрения (Keana J.F.W., 1992). Вероятно, по аналогии с иодфенилдиазиринами (Brunner J., 1995), отсутствие заметных по- I I + + 18a COOMe COOMe C6H11 C6H17a 17б ~ 1.0 : 0.5 : 0.a + + 17б COOMe COOMe I I 16 C6H11 C6H18a 18б ~ 1.0 : 0.4 : 0.I COOMe I C6HСхема 7. а) h, > 320 нм, 3 мин, циклогексан терь иода обусловлено более длинноволновой областью поглощения иодированного Dcp-хромофора, по сравнению с фенилазидами, что ускоряет фотоактивацию в условиях PAL.

При сравнение интегральных интенсивностей сигналов в спектрах 1НЯМР эфиров 14–16 до и после фотолиза в С6Н12 (6 мМ) найдены выходы продуктов (17аб, 18а), (18аб, 17б) и 19 — 30, 30 и 26 %, соответственно. Эффективность внедрения в неактивированную СН-связь иодированной Dcp-метки немного ниже, чем неиодированной (ср. 42%),8 но достаточно высока, чтобы предположить, что при фотолизе фотофор реагирует как синглетный карбен.

При анализе результатов PAL наличие 125I-Dcp-метки в виде смеси моно- и дииодпроизводных можно не учитывать. Для увеличения включения нуклида 125I в субстрат коммерческий препарат Na125I (без носителя, 1 мКи ~ 0.5 нмоль) используют без разбавления холодным I–, и иодированной оказывается ничтожная доля зонда. Мечение 125I необходимо при разделении продуктов ограниченного протеолиза методами электрофореза и ВЭЖХ. При дальнейшем анализе меченого пептида с помощью MS сигналы молекул, связавшихся с иодированным Dcp-фотофором, зарегистрировать невозможно.

5. Синтез фосфатидилхолинового и ганглиозидных зондов Мы синтезировали Dcp-меченые аналоги липидов, предназначенные для последующего радиоиодирования: длинноцепной фосфатидилхолин 23 (Схема 8) и ганглиозиды 27 и 28, несущие фотофор на различном расстоянии от углеводной части молекулы (Схема 9). Ганглиозиды - гликосфинголипиды, несущие один или несколько остатков сиаловой кислоты - обязательные компоненты плазматических мембран эукариот; они играют важную роль в процессах межклеточного узнавания, модулируют клеточный рост и дифференциацию, выполняют функцию рецепторов, участвуют в переносе информации и в процессах апоптоза (Hakomori S.-I., 1990; Spiegel S., 2003). Определяющая роль здесь принадлежит углеводной части молекулы, но конформационные изменения затрагивают и рецепторы, находящиеся вблизи церамидной части ганглиозида внутри клеточной мембраны. Важно, что введение метки в церамидную часть молекулы не нарушает структуру олигосахаридной детерми- Ср.: для метил-4-азидо-2-иодо-3,5,6-трифторбензоата – 12% (препаративная ТСХ) (Keana J.F.W., 1992), для 2-иодо-4-[3-(трифторметил)-3Н-диазирин-3-ил]бензилацетата – 48% (ГЖХ/MS) (Brunner J., 1995), при исходных концентрациях 2 мМ в циклогексане.

нанты, и зонд сохраняет специфичность исходного ганглиозида.

Наличие лабильной связи между фотофором и остальной частью молекулы зонда существенно облегчает анализ продуктов PAL. Поскольку чаще всего изучаются липид-белковые взаимодействия, подходящей является сложноэфирная связь, лабильная, в отличие от пептидной, в условиях щелоч ного гидролиза. Мы разработали синтез жирной кислоты с Dcp-оксигруппой при -углероде 22, являющейся синтоном при получении липидных зондов, предназначенных для изучения центральной части мембран. Длина ацильной цепи с меткой соответствует длине пальмитоильного остатка, присутствующего в природных фосфо- и гликосфинголипидах. 11-Гидроксиундекановую кислоту получали из доступной 11-аминоундекановой реакцией дезаминирования под действием HNO2 (выход 38 %). Попытки получить эфир 21 путем а,б,в COOH COOMe H2N TfO г Tf = CF3SO2O COOMe N2 O д,е O COOH N2 O ж O + N n n = 1 (~72%) O O N2 n = 3 (~28%) O O P O O O O O Схема 8. а) HNO2/Н2О, 100о; б) MeOH-HCl; в) Tf2O/Py, –10оС; г) DcpOH/TEA, ацетон; д) KOH, iPrOH-H2O, 22оС; е) HCl; ж) лизо-РС, DCC/4PyNH2.

ацилирования -ОН метил-11-гидроксиундеканоата хлорангидридом DcpCl или конденсацией с DcpOH + DCC (Схема 8) успеха не имели. Для создания сложноэфирной связи мы активировали спиртовую компоненту: получили трифлат 20 (выход 86% без очистки) и ввели в реакцию с DcpОН с небольшим избытком TEA; выход эфира 21 50 % (MS, 1Н-ЯМР). Омыление эфира 21 вели до появления следов DcpОН (20 ч): скорость щелочного гидролиза эфира псевдоароматической Dcp-кислоты 1, гораздо ниже, чем эфира алифатической кислоты. Двукратной хроматографией на силикагеле и обращенной фазе выделяли кислоту 22 (выход 40%), конденсировали ее с 1 экв. лизо-РС в присутствии DCC и 4PyNH2 (5 экв) и получали зонд 23 с умеренным выходом 44% (1Н-ЯМР, MS высокого разрешения).

Ганглиозидные зонды 27 и 28 (Схема 9) получали ацилированием лизоганглиозида GM1 (лизо-GM1 – дезацилированный по сфингоидной NH2-группе ганглиозид GM1) п-нитрофениловыми (Np) эфирами в DMSO в присутствии ТЕА. Обычно для этой реакции применяют N-гидроксисукцинимидные, пентафторфенильные и др. эфиры, как правило, в DMF (Sonnino S., 2004). Мы нашли, что Np-эфиры жирных кислот в DMSO реагируют с лизо-GM1 количественно. Кислоту 22 превращали в Np-эфир 24 обработкой п-нитрофенилтрифторацетатом и на силикагеле выделяли эфир 22 (выход 50%), который с небольшим избытком (1.2 экв.) вводили в реакцию с лизо-GM1. После полной конверсии лизо-GM1 (12-16 ч) зонд 27 выделяли гель-фильтрацией; выход 98% (1 мкмоль; определяли по УФ-поглощению Dcp-метки).

а O COONp N2 O N2 O в г I COOH I COONp O COONp б б OH HO OH HO O O O OH HO OH HO H O OH O O CH3CONH O n O HO H NH -OOC O OH OH O O O m OH O N27 m = n = 1 (~60%) OH HO n = 3 (~40%) HO HNCOCH28 m = Схема 9. а) CF3COONp/Py; б) лизо-GM1/TEA; в) HONp, DCC; г) DcpOH/TEA.

Зонд 28, несущий метку вблизи от полярной головки ганглиозида, получали немного иначе. Синтезировать Np-эфир иодуксусной кислоты 25 аналогично эфиру 24 с использованием п-нитрофенилтрифторацетата не удалось, так как реагент мало отличается по хроматографическим свойствам от целевого продукта. Эфир 25 получали конденсацией ICH2COOH с п-нитрофенолом в присутствии DCC. Вещество ранее не описано (1Н-ЯМР; элементный анализ;

т. пл.). Эфир 25 вводили в реакцию с DcpОН в сухом ацетоне в присутствии ТЕА и хроматографией на силикагеле выделяли продукт 26 (выход 84%). Короткоцепной зонд 28 получали из лизо-GM1 аналогично зонду 27. Несколько меньший выход (88 %) связан, очевидно, со стерическими затруднениями при ацилировании NH2-группы сфингозинового основания. Структуры зондов 27 и 28 подтверждены спектрами 1Н-ЯМР и MS высокого разрешения. Высокие выходы мы объясняем преимуществами использования DMSO в качестве растворителя для реакции лизоганглиозида с Np-эфирами 22 и 26, а также применением для очистки микромольных количеств целевого продукта гель-фильтрации вместо адсорбционной или обращенно-фазовой хроматографии.

Для точного определения высокоаффинных сайтов связывания при изучении лиганд-рецепторных взаимодействий желательно расположить фотофор в олигосахаридной части ганглиозида, не нарушая его сродство к изучаемому рецептору. Мы получили GM1-зонд 30, несущий компактную Dcp-группу вместо ацетильной при N-5 остатка нейраминовой кислоты9 (Схема 10). В качестве исходного синтона рационально использовать дезацетил-GM1, который присутствует как промежуточный продукт в ходе модификаций GM1 с целью получения из него различных производных по церамидному остатку.Np-эфир DcpOH 29 (получен впервые; выход 64%; 1Н-ЯМР) в реакцию с дезацетил-GM1 вводили сначала с небольшим избытком (1.33 экв.). Попытки провести эту реакцию аналогично ацилированию лизо-GM1 при получении зондов 27 и 28, не имели успеха. Очевидно, NH2-группа дезацетилированной сиаловой кислоты, соединенной с остатком галактозы, находящимся внутри пентасахаридной головной группы, стерически экранирована. Важную роль здесь могут играть водородные связи. Реакцию вели в среде тщательно перегнанного сухого DMF в присутствии TEA при 50oC в течение 90 ч, дважды Сиаловые кислоты – N-5-ацильные производные нейраминовой кислоты.

Лизоганглиозид GM1 и дезацетил-GM1 любезно предоставлены к.х.н. И.И. Михалевым (лаборатория химии липидов ИБХ РАН).

прибавляя дополнительные количества эфира 29 (1.33 и 0.3 экв.) до полной конверсии дезацетил-GM1. Гель-фильтрацией и хроматографией на обращенной фазе выделяли зонд 30 (выход 23% по УФ-поглощению Dcp-метки). Невысокий выход может объясняться недостаточной чувствительностью детектирования конверсии исходного дезацетил-GM1 в условиях работы с субмик- OH HO OH HO O O O OH HO OH HO H O OH O O CH3CONH O n O HO H NH -OOC O OH OH O O OH OH HO NHHO дезацетил-GMа DcpOH ONp N2 O б OH HO OH HO O O O OH HO OH HO H O OH O O CH3CONH O n O HO H NH -OOC O OH OH O O OH OH HO NH HO n = 1 (~60%) n = 3 (~40%) O NСхема 10. а) CF3COONp/Py; б) DcpONp 29/TEA, DMF, 50oC, 90 ч.

ромольными количествами. Структура зонда подтверждена MS ESI (молекулярный ион m/z 1622.2). Очевидно, при использовании зонда 30 для структурно-биологических исследований необходимо в каждом случае проводить контроль сохранения аффинности этого аналога GM1 к изучаемому рецептору.

6. Фотоаффинное зондирование белков мембраны вируса гриппа Для проверки способности 125I-меченого Dcp-фотофора в составе РС зондировать интегральные белки мы выбрали хорошо изученную биологическую систему – вирион гриппа (Wilson J.A., 1981). Оболочка вирусной частицы образована липидным бислоем и двумя гликопротеинами - гемагглютинином (НА) и нейраминидазой (NA), собранными в шипы, выступающие на поверхности. Мономер НА состоит из двух субъединиц, связанных SS-связью:

малой субъединицы НА2, проникающей глубоко в неполярную область липидного бислоя, и большой полярной субъединицы НА1. Внутренняя поверхность вирусной мембраны выстлана матриксным белком (М1), который контактирует с нуклеокапсидным белком (NP). Был использован хорошо изученный штамм вируса гриппа типа А – вирус классической чумы птиц (FPV).

Применив в качестве окислителя надуксусную кислоту, аналогично радиоиодированию Tfd-производного (Brunner J., 1995), мы получили 125Iмеченый РС-зонд 23 с высокой удельной радиоактивностью (~500 Ки/ ммоль;

выход 90% из исходного Na125I). Для сравнения, с помощью хлорамина Т высокое включение 125I (48% для зонда 23) достигалось лишь при соотношении NaI – хлорамин Т – Dcp-субстрат, ~ 1:10:100, подобно мечению тирозина (Farah K., 1998). Мы не отделяли 125I-зонд от исходного РС 23, так как ВЭЖХ (препаративная ТСХ в данном случае неэффективна) субнаномольных количеств Dcp-субстрата усложнила бы всю процедуру и привела к потерям зонда.

Рис. 5. Фотоаффинное мечение белков вируса гриппа (FPV) (125I)PC-зондом 23. Суспензию вируса (0.1 мг белка) инкубировали с зондом (0.нмоль, 80 мкКи) 3 ч при 37оС, затем подвергали облучению 5 мин при > 320 нм. После делипидизирования смесью CHCl3–MeOH, 1:3, материал разделяли в 12.5% SDS-PAGE в восстанавливающих условиях. Гель окрашивали кумасси голубым (левая полоса), затем проводили авторадиографию (правая полоса) в течение 24 ч при –70оС. Справа указаны массы белков-стандартов (кДа).

1 I-РС 23 встраивали в наружный монослой мембраны вириона11 инкубацией мицеллярного раствора в вирусной суспензии (зонд – вирусный РС ~ 1:100, мольн.), как описано (Молотковский Юл.Г., 1984). После фотолиза несвязавшиеся липиды удаляли экстракцией органическими растворителями, а остаток анализировали SDS-PAGE в стандартной системе (Laemmli U.K., 1970), где поведение белков FPV хорошо изучено. Представленные на Рис. Образцы вируса очищены и любезно предоставлены к.х.н. Л.В. Мочаловой (ИБХ РАН).

электрофореграмма и авторадиограмма показывают, что единственным меченным белком оказалась субъединица HA2. Такая картина PAL полностью согласуется с общепринятой моделью организации вирусной оболочки.

Таким образом, Dcp-фотофор является эффективной карбен-генерирующей меткой и одновременно может служить носителем высокоактивного радиоизотопа 125I, который легко ввести в фотоаффинный зонд непосредственно перед его использованием для структурных исследований.

7. Взаимодействие различных субъединиц рецепторов интерлейкинов-и -4 с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах Явление сброса (шеддинга) ганглиозидов опухолевыми клетками описано давно, и его биологическая роль изучена (Hakomori S., 1996): циркулируя в кровотоке, ганглиозиды ингибируют некоторые иммунные ответы и стимулируют развитие опухолей, защищая их от разрушения иммунокомпетентными клетками. Однако механизмы осуществления шеддинга и иммуносупрессии изучены недостаточно. Ганглиозиды являются мощными ингибиторами цитокин-опосредованной пролиферации мышиных и человеческих Т-клеток. Причем ингибирование, например, GM1 осуществляется по смешанному типу (конкурентному и неконкурентному), что предполагает помимо прямого взаимодействия с цитокинами и другие типы ингибирующего влияния на пролиферацию Т-клеток. Экзогенные ганглиозиды, встраиваясь в плазматическую мембрану клеток IL-2-зависимой лимфоидной линии (СTLL-2; активированные Т-лимфоциты), способны интенсивно маскировать -, - и -субъединицы рецепторов интерлейкинов 2 (IL-2R) и -4 (IL-4R) от последующего связывания с антителами к соответствующим субъединицам рецепторов(Молотковская И.М., 1996). Особенно ярко эффект проявляется при инкубации клеток с ганглиозидом GM1. Однако на основании наблюдаемого феномена нельзя сделать вывод о локализации ганглиозидов в ближайшем липидном окружении изучаемых рецепторов, поскольку нельзя строго показать отсутствие их интернализации или шеддинга. Для проверки предположения о непосредственном взаимодействии ганглиозида с субъединицами IL-2R и IL-4R мы применили (125I)Dcp-аналоги GM1 27 и 28, зондирующие мембрану на различной глубине.

Мицеллы из смеси зондов с ганглиозидом GM1 (1:100) инкубировали мин с клетками, подвергали облучению и проводили электрофорез отдельных субъединиц IL-2R и IL-4R, полученных иммунопреципитацией с соответствующими антителами. Для короткоцепного зонда 28 была также проведена регистрация результатов PAL компонентов всей фракции плазматических мембран, выделенной из клеток после мечения.12 На авторадиограмме (Рис. 6) определяется полоса белка с массой ~ 75 кДа, соответствующая -субъединице IL-2R (Рис. 6б, 3). Эта полоса обнаруживается электрофорезом иммунопреципитата с антителами к -субъединице IL-2R после проведения PAL зондом 27.

В то же время, иммунопреципитаты, полученные после PAL короткоцепным зондом 28 не выявили на авторадиограмме полосы ни для одного из использованных антител (данные не приведены). Иммунопреципитация проводится антителами, специфичными к определенному эпитопу белковой молекулы. Зонд 28 мог непосредственно сшиться либо с эпитопом, либо ковалентно связавшийся ганглиозид мог его маскировать, делая невозможным извлечение продуктов PAL иммунопреципитацией. Поэтому был проанализирован весь пул белков плазматических мембран после PAL 125I-GM1-зондом 28 и на авторадиограмме удалось зарегистрировать полосу, соответствующую по массе субъединице IL-2R (Рис. 7б, 2). Карбен, образуемый зондом 28, гораздо более доступен для тушения водой из-за малой глубины погружения в бислой, что может быть причиной его слабой по сравнению с зондом 27 сшивки с IL-2R (Рис. 6б, 3). Это обусловливает и появление прореагировавших с водой мономеров, которые вместе с липидными димерами образуют на авторадиограммах яркую полосу в области соединений с низкими массами в образце липидного экстракта плазматических мембран (Рис. 7б, 4). В образце делипидизированных мембран (Рис. 7б, 3) сшивка зонда 28 с IL-2R не детектируется, вероятно, из-за частичной потери модифицированного ганглиозидом белка в органический экстракт и выхода за пределы чувствительности.

В настоящее время широко обсуждается проблема сборки IL-2R; имеются разные данные относительно локализации - и -субъединиц рецептора до и после получения клетками сигнала от лиганда (IL-2). Наши результаты свидетельствуют о том, что в клетках линии СТLL-2, не активированных IL-2, ганглиозид GM1 локализуется в ближайшем липидном окружении -субъединицы IL-2R. Кроме того, получены косвенные доказательства сшивки короткоцепного зонда 28 с пептидом IL-2R, расположенным на С-конце субъеди- Работа проведена И.В. Холоденко в лаборатории межклеточных взаимодействий ИБХ РАН под руководством к.б.н. И.М. Молотковской (Дисс. на соискание уч. ст. к.б.н., 2006).

Рис. 6. 10% SDS-PAGЕ белков активированных Т-лимфоцитов после PAL клеток 125I-GM1-зондом 27 и иммунопреципитации (а) и результаты авторадиографии (2 мес) (б): – стандарты Sigma; 2 – белки клеток после фотомечения и последующей иммунопреципитации антителами к -субъединице IL-2R; 3 – то же, но с антителами к -субъединице; 4 – то же, но с антителами к -субъединице; 5 – то же, но с антителами к IL-4R. Окрашивание серебряным реагентом; 60 мкг белка/дорожка.

Рис. 7. 10% SDS-PAGЕ белков мем бран активированных Т-лимфоци тов после фотомечения 125I-GM1 зондом 28 (а) и результаты автора диографии (2 мес) (б): 1 – стандар ты Sigma; 2 – белки плазматических мембран после PAL; 3 – то же, но с последующим делипидизированием CНCl3-MeOH (1:3); 4 – органиче ский экстракт.

ницы. Таким образом, применение зондов с фотофорами, расположенными в -положении жирнокислотных остатков различной длины, позволяет определить места взаимодействия с рецептором со значительной точностью.

8. Определение фрагментов молекулы IL-4, участвующих во взаимодей- ствии с ганглиозидом GMМолекулярные механизмы иммуносупрессии ганглиозидами связывают, в том числе, с их прямым взаимодействием с IL-2 и IL-4: ганглиозиды перехватывают цитокины, необходимые для активации Т-лимфоцитов, усугубляя иммуносупрессию, развивающуюся при опухолевой патологии. В данной работе мы применили GM1-зонд 30, несущий метку в олигосахаридной части молекулы, для идентификации сайта(ов) связывания IL-4. В перспективе полученная информация может быть полезной для создания новых препаратов, способных эффективно перехватывать циркулирующие в крови свободные ганглиозиды, но лишенных недостатков молекул рекомбинантного интерлейкина. Ранее с помощью зонда GD1b, несущего арилазидный фотофор в глицериновом остатке концевой сиаловой кислоты, был установлен сайт связывания ганглиозидов в молекуле токсина столбняка (Shapiro R.E., 1997).

Изучение влияния замены ацетила нейраминовой кислоты в молекуле GM1 Dcp-группой на сродство к IL-4 с помощью кинетического анализа в функциональных тестах с Т-лимфоцитами потребовало бы существенных количеств зонда. В качестве модельных исследований мы проверили, образует ли GM1 30 в условиях PAL продукт сшивки с В-субъединицей холерного токсина (CTB), который можно зарегистрировать с помощью MALDI-MS13. GM– высокоаффинный рецептор СТВ, причем во взаимодействии участвует сиалильный остаток (Sia). После РАL (СТВ/зонд 30, 2:1, мольн.) в масс-спектре наряду с молекулярным (m/z 11622.4) и двухзарядным (m/z 5812.3) пиками исходной субъединицы было отмечено появление пиков одно- (m/z 11724.8;

11775.3; 11965.9; 12002.9) и двухзарядных ионов (m/z 5862.3; 5888.6; 5930.7;

5984.9) производных CTB, несущих фрагменты зонда. Фрагментация ближе всего соответствует отщеплению модифицированной Sia-группы по гликозидной связи, что чаще всего и происходит с молекулой GM1 в условиях MS MALDI. Полученные данные косвенно свидетельствуют о возможности применения аналога GM1 30 для изучения взаимодействия ганглиозида с IL-4.

Прежде чем приступить к PAL молекулы человеческого rIL-4, был проведен полный MS-анализ белка и его фрагментов после протеолиза эндопротеиназой Glu-C. Применение данного фермента позволило получить важные для нашего исследования регистрируемые фрагменты петлевых участков.

Смесь rIL-4 и 125I-GM1-зонда 30 в PBS (10 нмоль/10 нмоль/0.5 мл) инкубировали 1 ч при 37оС, фотолизовали, высаживали белок ультрацентрифугированием и подвергали протеолизу эндопротеиназой Glu-C. Полученные фрагменты разделяли с помощью ВЭЖХ, отбирали фракции характеризующиеся высоким поглощением амидной связи и радиоактивностью (до 200имп/мин) одновременно, и подвергали их MS-MALDI-анализу.

Работа проведена совместно с сотрудниками лаборатории межклеточных взаимодействий отдела иммунологии (см. сноску 11) и группы масс-спектрометрии ИБХ РАН под руководством д.ф.-м.н. В.А. Олейникова.

В результате пришивки Dcp-зонд образует производное, содержащее циклопентадиенкарбонильный остаток («cp»). В условиях MS MALDI молекула Dcp-GM1 реагирует с матрицей и расщепляется по амидной связи («cp»– остаток Sia) или по гликозидной связи Sia2-3Gal. Расчеты ожидаемого увеличения масс пептидов приведены в Табл. 3. С учетом данных MS MALDI про- Масса, Да Фрагмент Таблица 3. Массы фрагментов GM1-зонда 30, ожи«cp» + H+ даемых в составе комплексов пептид – фрагмент «cp» + Na+ 1зонда (фрагментация в процессе MS MALDI).

«cp» + K+ 1Sia + H+ 3Sia + Na+ 3теолитических фрагментов rIL-4, были рассчитаны Sia + K+ 3Sia-O + H+ 357 массы ожидаемых пиков меченых пептидов. ОтсутSia-O + Na+ 3ствие в MS фрагментов, содержащих церамидную Sia-O + K+ 3часть подтверждается отсутствием парных пиков, отличающихся на 28 Да (зонд 30 содержит две формы сфингозинового основания, отличающие длиной на два метилена, Схема 10). Был выявлен ряд меченых пептидов (в том числе, приведенные в Табл. 4): 1-8 (KCDITLQE), 122128 (KYSKCSS), 19-25 (QKTLCTE), 41-42 (KE), 103-109 (ANQSTLE) и 110113 (NFLE). По данным РСА (Muller T., 1995), эти фрагменты IL-4 содержат а.о., экспонированные в раствор, и находятся в неупорядоченных петлевых участках цепи (за исключением фрагмента 41-42, образующего начало спирали, и 103-109 – содержащего короткую -структуру 106-108).

Анализ локализации фрагментов 19-25 и 103-113 на модели простран- ственной структуры молекулы rIL-4 показал, что они располагаются на двух Расчет, MS, m/z, Отнесение Да Да Таблица 4. Сравнение расчетных 913.41 - (19-25) + («cp» + H+) и экспериментальных масс сши935.39 937.17 + («cp» + Na+) вок пептидный фрагмент IL-4 – 951.37 953.24 + («cp» + К+) фрагмент зонда GM1 30.

853.38 854.93 (103-109) + («cp» + H+) 875.36 876.87 + («cp» + Na+) 891.34 892.86 + («cp» + K+) антипараллельных петлях, сбли862.27 - (110-113) + (Sia + H+) женных в пространстве. Очевид884.25 887.17 + (Sia + Na+) 901.23 903.27 + (Sia + K+) но, эти фрагменты образуют со878.27 881.06 + (Sia-O + H+) ставной сайт-ловушку для взаи900.25 903.27 + (Sia-O + Na+) 916.23 919.28 + (Sia-O + K+) модействия с олигосахаридной частью молекулы ганглиозида. Участки 1-8 и 122-128 – N- и C-концевые, то есть наиболее доступные для неспецифического взаимодействия, а фрагмент 41-42 находится в начале -спирали, которая формирует жесткий каркас, малодоступный для связывания.

9. Идентификация субъединиц F0-сектора митохондриальной H+-АТР- азы, контактирующих с липидами мембраны Синтез и гидролиз АТР, сопряженные с транслокацией протонов через мембрану по градиенту электрохимического потенциала (Н+), осуществляется ферментом F1F0-ATP-азой (Н+-АТР-аза F-типа). Несмотря на некоторые отличия в субъединичном составе и каталитических характеристиках, F1F0ATP-азы митохондрий, бактерий и хлоропластов близки по строению и механизму действия. Структурно и функционально их подразделяют на интегрированный в мембрану F0-сектор, осуществляющий перенос протонов, и периферический каталитический F1-сектор, несущий центры синтеза и гидролиза АТР. Пространственная структура фермента напоминает гриб: F1-комплекс составляет сферическую глобулу «шляпки», от нее отходит «ножка», состоящая из субъединиц F1- и F0-комплекса. Фермент митохондрий (КФ 3.6.1.34) содержит более 15 типов субъединиц; F1-АТР-аза хорошо изучена (РСА, Abrahams J.P., 1994). Строение сектора F0 менее изучено. Считается, что в митохондриях млекопитающих он состоит минимум из 10 субъединиц (a, b, c, d, e, f, g, F6, A6L и OSCP), стехиометрия и топография которых полностью не ясны. В наиболее популярной ко времени нашей работы модели субъединицы а и b расположены снаружи кольца с12-олигомера (Engelbrecht S., 1997).

Для идентификации субъединиц сектора F0, контактирующих с липидами внутренней мембраны митохондрий, мы применили [14С]РС-зонд 9 и (125I)PC-зонд 23 в модельной системе – протеолипосомах из смесей димиристоил-РС – дипальмитоил-РС –зонд, 1 : 0.81 : 0.20.0025, и F1F0-комплекса митохондрий сердца быка (белок–липид, 1 : 4 по массе).14 Протеолипосомы получали методом диализа смеси компонентов с дезоксихолатом; реконструированный фермент сохранял активность. Однозначные результаты при анализе продуктов PAL методом SDS-PAGE не были получены; не удалось иденти Работы проведены Л.Г. Зайцевой в ИБХ РАН и на кафедре биоорганической химии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова под руководством к.х.н. Т.В. Овчинниковой и к.х.н. В.А. Гринкевича (Дисс. на соискание уч. ст. к.х.н., 2000).

фицировать субъединицы, которые при делипидизировании протеолипосом экстрагировались вместе с липидами. Поэтому мы применили MS MALDI – метод, который до нас не использовался для анализа состава полисубъединичных мембранных белковых комплексов и липид-белковых аддуктов15.

В спектре F1F0-ATP-азы, как стандарта (Рис. 8А), почти все субъединицы присутствуют в виде молекулярных ионов: пики с m/z 5662, 7975, 8233, 8972, 9328, 10267, 11344, 15129, 18626, 20947, 24765, 30194, 33155, 51622, 55203 с учетом точности метода (0.5 % для М 10-56 кДа) можно соотнести с молекулярными ионами субъединиц (М 5651 Да), A6L (7964), e (8189), F(8958), A1 (9582), f (10209), g (11328), (15065), d (18603), OSCP (20967), a/b, (30141), T (32836), (51595), (55161), соответственно. Кроме того, некоторые субъединицы в условиях получения данного MS образуют двухзарядные Рис. 8. МS MALDI белкового осадка модифицированной в протеолипосомах II типа Н+-АТРазы митохондрий сердца быка (Б) и стандарта (А). * – субъединица с «растрепанным» N-концевым участком;Т – ADP/ATP-транслокатор.

(m/z 27685, 25851, 12380 и 3834 – -, -, a-/b- и с-субъединицы) и трехзарядный (m/z 17253, -субъединица) ионы. Разрешающая способность прибора (Vision 2000, Thermo BioAnalysis, США) не позволила зафиксировать субъе Работа проведена сотрудниками группы масс-спектрометрии ИБХ РАН Н.Б. Поляковым и М.И. Титовым под руководством д.х.н. С.Е. Есипова.

диницы а (М 24815 Да с учетом N-концевого формилирования) и b (М 246Да) раздельно: они дают усредненный пик с m/z 24765. Субъединица с дает кластерный ион [М + K]+ (m/z 7649). Причем она никогда не наблюдалась без катионов (К+, Na+), что подтверждается и в других работах (Griffiths D., 1996).

Протеолипосомы I типа получали на основе димиристоил-РС – пальмитоил/олеоил-РС, 1:1; II тип содержал также нерадиоактивный аналог РС-зонда 9 (10% от РС). Важно, что в MS зонда есть пики молекулярных ионов с m/z 812.5 (Z1, 72%; см. схему 3, n=1) и m/z 841 (Z2, 28%; n=3). Оба типа протеолипосом облучали и делипидизировали смесью CHCl3–МеОН, 1:2. Собирали отдельно белковый осадок, водную и органическую фазы; их лиофилизовали и растворяли в 75% НСООН, затем обессоливали гель-хроматографией и анализировали MS MALDI.

В MS белкового осадка протеолипосом I типа присутствовали пики мо- лекулярных ионов субъединиц , f, g, , d, OSCP, , , , a/b и кластерных ионов [M + K]+ – c и f. Пик с m/z ~12400 может быть наложением пиков [a]2+ и [b]2+. Сравнение спектров стандарта и белкового осадка показало значительное уменьшение содержания субъединиц с и F6. Спектр водной фракции содержал, в основном, фактор F6. В MS органического экстракта (Рис. 9A) были найдены пики, соответствующие [а]+, [а]2+, [c + K]+и [c + 2K]2+ (m/z 24825, 12416, 7650 и 3838). Пик с m/z 15353, вероятно, относится к -субъединице.

Анализировали продукты фотомечения Н+-АТРазы в протеолипосомах II типа. В MS белкового осадка (Рис. 8Б) присутствует полный набор пиков, характерных для этой фракции немодифицированного фермента. Появились и новые пики, отсутствующие в стандарте (Рис. 8А). Пик 2 с m/z 8297 можно объяснить присоединением зонда к субъединице с (m/z 7608), хотя приращение массы составляет ~690 Да, а не ожидаемые 785 (Z1-28) или 813 (Z2-28).

Очевидно, в растворе 75% НСООН, где готовят образцы для MS MALDI, фосфоэфирная связь гидролизуется и ковалентно связанный PC теряет остаток фосфохолина (166 Да), превращаясь в диглицерид. Тогда приращение массы для зонда Z1 – 620, а для Z2 – 648 Да, что с учетом ошибки измерения и детектирования с-субъединицы только в виде кластерных ионов, хорошо согласуется с полученным результатом и доказывает непосредственный контакт олигомера с-субъединицы с липидным бислоем. Появление плохо разрешенных пиков 3 в районе 13348 m/z, а также отсутствие пика [a]2+/[b]2+ позволяет сделать вывод о множественной модификации субъединиц а или b и, следовательно, их контакте с липидами мембраны.

В MS органического экстракта (Рис. 9Б) не были идентифицированы пики [a]+ и [a]2+ (субъединица b не экстрагируется). Очевидно, а-субъединица промодифицировалась практически полностью, причем множественность сшивок подтверждается пиками с m/z 13701 (4, Рис. 9Б) и 13348 (3, Рис. 8Б).

Появились пики 2 и 3 (m/z 8302 и 8959, Рис. 9Б), соответствующие (с потерей фосфохолина) пришивке одной или двух молекул зонда к субъединице с. Приведенные спектры (Рис. 8 и 9), позволяют рассчитать, что немодифицирован- ными осталось ~15% всего количества с-субъединиц, то есть 2 из 12-ти.

Рис. 9. МS MALDI хлороформ-метанольных фракций модифицированной (Б) и немодифицированной (А) Н+-АТРазы митохондрий сердца быка в протеолипосомах типа II и I, соответственно.

Из значения m/z 13348 (Рис. 8Б) следует, что стехиометрия продукта сшивки РС-зонд/а-субъединица 3:1. Субъединица а присутствует в F1F0комплексе в одной копии, причем основная часть ее молекулы погружена в липидный бислой, и как предполагается, образует 6-7 трансмембранных спиральных тяжей. Субъединица а выполняет как бы роль статора для ротора, образованного 12 с-субъединицами (Fearnley I.M., 1986). Наши результаты показывают, что этот статор – компактное образование, экранирующее от контактов с липидами довольно незначительную часть ротора с12-олигомера.

10. Поиск лектинов на поверхности опухолевых клеток Клетки опухолей экспонируют на своей поверхности лектины, специфические углевод-связывающие белки, которые на нормальных клетках отсутствуют или экспрессируются в малой степени (Gabius H.-J., 1988). Это явление было предложено использовать для доставки носителей лекарств к опухолям (Monsigny M., 1988). Углеводные лиганды имеют невысокое сродство к лектинам (Kd ~1 мM), но оно резко возрастает при переходе к олиго- или поливалентным (с множеством углеводных остатков) гликоконъюгатам за счет формирования многоточечных контактов с лектинами, как это происходит в природе. Липосомы как носители лекарств особенно подходят для оснащения их липидного бислоя углеводными лигандами, которые за счет латеральной диффузии стягиваются и подстраиваются под структурированные на поверхности клетки молекулы лектина (Zalipsky S., 1996). Мы использовали липосомы со встроенными в мембрану липофильными гликоконъюгатами для доставки липидных пролекарств к злокачественным клеткам in vitro и in vivo и показали перспективность такого подхода [20]. Специфичность лектинов опухолевых клеток определяли с помощью флуоресцентных углеводных зондов.Внутриклеточный транспорт лекарственных липосом и эффективность действия доставленного препарата зависят от механизма их рецепции клетками. В нашем случае, липосомы, вероятно, связываются с мембранными лектинами. Мы решили выявить эти рецепторы с помощью PAL и с этой целью разработали синтез неогликолипидных зондов (38-41, Схема 11), предназначенных для встраивания в липидный бислой липосом. Расположение Dcpметки в непосредственной близости от остатка углевода позволяет полностью сохранить его структуру. Детерминанты трисахарид A (Аtri) 38, сиалилLewisX (SiaLeX) 39 и сульфат-LewisА (SuLeA) 40 определены нами для клеток меланомы М3 и лейкоза HL-60, соответственно. Зонд 41, несущий неактивный пентаол, предназначен для контроля неспецифического связывания.

Проведена серия PAL-экспериментов с клетками и 200-нм-липосомами состава: яичный РС – фосфатидилинозит – (125I)зонд 38-41, 8:1:0.5-1 (мольн.).

Для детектирования связывания с рецепторами на поверхности, клетки инкубировали с липосомами 5-10 мин при 20оС; заметное накопление фосфолипи- Углеводные флуоресцентные зонды – конъюгаты моно- и олигосахаридов с флуоресцеин-меченым полиакриламидом – и 3-аминопропилгликозиды синтезированы в лаборатории химии углеводов ИБХ РАН (зав. лабораторией проф. Н.В. Бовин).

O O а б,в O OH O Cl HO O Cl O n n O O n = 9 -COO O O OH ROH O O n COO O г ж,г д e RONp ROH RNH COOH RNH COOH RNH COONp Гликозид 34 35 O NH NH2 NH Boc O NHO или O аминоглюцит NFuc1-Gal1- O NH GalNAc1-трисахарид А Neu5Ac2-3Gal1-4GlcNAc- O NH FucO O OOCC17HH OH N O OH O O n - OH CHO H3C O O O HO OH O OOCC17HOHOH NH O O HO O O O HN полиэтиленгликольный OH OH OHO O спейсер мембранный CHNH я корь cиалил-LewisX O O Fuc1-O GlcNAc1- O NH HSO3-3Gal1-необходим для эффективного Nвзаимодействия углевода с cульфат-LewisА рецептором на поверхности OH OH OH клетки-мишени OH OH NH аминоглюцит Схема 11. а) SOCl2/Na2CO3; б) rac-1,2-диолеоилглицерин, 0.1 экв; в) вода;

г) CF3COONp/Py; д) -Вос-лизин, TEA, DMSO; е) TFA; ж) DcpOCH2COONp 26.

дов липосом в цитоплазме начинается через 30 мин инкубации при 37оС [26].

На Рис. 10а представлены электрофореграммы и авторадиограммы белков клеток М3 после инкубации с Аtri-липосомами. Соответствующие профили радиоактивного счета приведены на Рис. 10б. Основной уровень PAL – в зоне самых легких (14-15 кДа) и массовых белков. Еще один пик приходится на слабую полосу при ~18 кДа (профиль 1, Рис. 10б). Инкубации в присутствии свободного углевода, в прямой зависимости от его количества, привели к явному снижению уровней PAL (Рис. 10а,2А,3A; Рис. 10б, профили 2,3). Наиболее выражен эффект ингибирования для 18-кДа-зоны (Рис. 10б).

Рис. 10. PAL белков клеток М3 Аtri-липосомами (зонд 38). 12.5% SDS-PAGE после однократного делипидизирования (CНCl3–MeOH, 1:3); а – электрофореграммы (слева) и авторадиограммы: 1 и 1А – инкубации клеток с липосомами 5 мин, 2 и 2А – то же в присутствии 10 экв свободного трисахарида А, 3 и 3А – то же в присутствии 100 экв.; б – профили радиоактивности электрофореграмм, соответствующие а. Cтрелки слева и внизу – стандарты Sigma.

PAL в мембранных системах неизбежно сопровождается большим количеством липид-липидных кросс-сшивок, которые захватываются денатурированными белками при делипидизировании и даже в условиях SDS-PAGE продолжают ими удерживаться. После дополнительной экстракции (CНCl3– MeOH, 1:3) стало очевидным, что уровень PAL в области 18 кДа при 5-мининкубации с клетками – наибольший (Рис. 11б, профиль 1). Избыток аминоглюцита не подавлял PAL 18 кДа-белка (Рис. 11а,3,3А; ср. Рис. 10а,1А,2А,3А).

Уловить момент образования лиганд-рецепторного комплекса в условиях стационарного (steady-state) фотолиза невозможно, что приводит к усиле- Рис. 11. PAL белков клеток М3 Аtri-липосомами (зонд 38). 13.5% SDS-PAGE после двухкратного делипидизирования; а – электрофореграммы (слева) и авторадиограммы: 1 и 1А –инкубация клеток с липосомами 5 мин, 2 и 2А – то же 30 мин, 3 и 3А – то же 5 мин в присутствии 500 экв аминоглюцита; ЦМ – электрофореграмма белков фракции цитоплазматических мембран клеток М3; б – профили радиоактивности электрофореграмм, соответствующие а.

нию неспецифического PAL. Его проверяли с помощью зонда 41. Кроме зоны 14-15 кДа, основные пики – ~28 и 34 кДа (профиль 1, Рис. 12). Следовательно, PAL в этих зонах Аtri-зондом 38 (Рис. 10 и 11) является неспецифическим.

Рис. 12. PAL белков клеток Млипосомами с контрольным зондом 41: 1 – инкубация 10 мин; 2 – после фотолиза липосом с зондом 41 в отсутствие клеток, с последующим совместным делипидизированием с разрушенными SDS клетками; 13.5% SDS-PAGE.

Для контроля фоновой радиоактивности дисперсии липосом облучали, разрушали SDS, а затем смешивали с разрушенными SDS клетками и дважды делипидизировали. Распределение радиоактивности после SDS-PAGE (Рис.

12, профиль 2) свидетельствует, что пик в зоне ~15 кДа действительно объясняется трудностью отделения белков от липофильных молекул.

На Рис. 13 и 14 представлены профили радиоактивности белков после PAL клеток М3 SiaLeX-липосомами и клеток HL-60 SuLeA-липосомами, соответственно. По сравнению с Аtri-липосомами (Рис. 10 и 11), картины мечения усложнились, и основные пики смещены в сторону более высоких масс. Однако ряд пиков можно вычесть: область фона – 14-15 кДа; пики неспецифического мечения ~28 и 34 кДа для клеток М3 (Рис. 12) и ~19, 21, 28 и 31 кДа клеток HL-60 (данные не приведены). Для клеток М3 и Аtri-зонда 38 главным меченным оказался минорный белок с массой ~18 кДа, в случае SiaLeX-зонда 39 – белки ~43, ~60, ~64 и ~80 кДа, а для клеток HL-60 и зонда SuLeA 40 – белки ~36, ~43, ~48, ~54, ~66 и область 75-85 кДа. Так как возрастающие концентрации свободных углеводов подавляют PAL (Рис. 10 и 13, профили 2,3;

Рис. 14, профиль 2), мы полагаем, что оно отражает специфические взаимо- Рис. 13. PAL клеток МSiaLeX-липосомами (зонд 39): 1 – инкубация мин; 2 – то же в присутствии 10 экв. свободного SiaLeX; 3 – то же в присутствии 100 экв.; 4 – инкубация 30 мин; 13.5% SDS-PAGE.

действия. Более длительные инкубации во всех случаях (Рис. 11а,2А; Рис. 11б профиль 2; Рис. 13, профиль 4; Рис. 14, профиль 3) изменяют профили мечения, поскольку зонды уже взаимодействуют с внутриклеточными белками.

Белки, связывающие зонды, обнаруживаются в плазматических мембра- нах клеток при SDS-PAGE (для М3 – Рис. 11а,ЦМ). Их можно соотнести с известными лектинами млекопитающих. Найденный на клетках М3 рецептор Atri-липосом с массой ~18 кДа может относиться к семейству галектинов – Рис. 14. PAL клеток HL-SuLeA-липосомами (зонд 40): 1 – инкубация 10 мин;

2 – то же в присутствии экв. свободного SuLeA; 3 – инкубация 30 мин; 13.5% SDS-PAGE.

лектинов экстрацеллюлярного матрикса, специфически связывающих -галактозиды; идентифицировано 14 галектинов с массами от 14 до 36 кДа (Gabius H.-J., 2004). Вероятно, что пик зоны ~75-85 кДа в профиле PAL SuLeA-липосомами белков клеток лейкоза HL-60, сохраняющий свою интенсивность при разных временах инкубаций (Рис. 14, профили 1 и 3), относится к семейству селектинов. Эти лектины специфичны к фукозилированным/сульфатированным эпитопам и после связывания с лигандами не подвергаются эндоцитозу (Gabius H.-J., 1997). Масса L-селектина лимфоцитов – 74 кДа.

Отметим, что публикаций о применении фотоаффинных углеводных зондов пока мало. Например, с помощью PAL авторы (Hashimoto M., 2001) искали транспортер глюкозы на поверхности клетки и перед детектированием выделяли его из сложной смеси клеточных белков с помощью иммунопреципитации, то есть было известно, какой именно рецептор надо искать.

Наши результаты позволяют сделать вывод, что на поверхности опухолевых клеток экспонированы рецепторы, которые опосредуют взаимодействие с липосомами, оснащенными углеводными детерминантами.

ВЫВОДЫ 1. Впервые детально исследованы фотохимические свойства диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной (Dcp) группы. Показано, что она является высокоэффективной карбен-генерирующей меткой, превосходящей по ряду параметров, в том числе, компактности и реакционной способности при возбуждении актиничным светом, известные и широко применяемые фотофоры. Существенно, что фотолиз этой группы проходит в мягких условиях, не повреждающих белки и нуклеиновые кислоты. Высокая реакционная способность особенно важна при зондировании мембранных систем, обогащенных неактивированными СН-связями.

2. Обнаружена способность Dcp-группы подвергаться прямому иодированию в условиях окислительного процесса, при этом фотохимические свойства сохраняются. Указанное качество превращает Dcp-метку в высокоэффективный и удобный в применении фотофор, поскольку позволяет проводить синтез холодных зондов с последующим введением высокоактивного радиоизотопа 125I в готовую молекулу зонда непосредственно перед применением в биологической системе. Положение изотопа в фотофоре делает более надежным анализ продуктов фотомечения. Эффективность применения радиоиодированного Dcp-фотофора для зондирования мембранных систем подтверждена с помощью фосфатидилхолинового зонда на хорошо изученной биологической модели – вирионе гриппа.

3. Предложен новый основный катализатор – 4-аминопиридин – для проведения реакции О-ацилирования в условиях карбодиимидного синтеза в среде органических растворителей. Применение 4-аминопиридина особенно эффективно в синтезах фосфо- и гликолипидов и позволяет существенно увеличить выход при ацилировании вторичного гидроксила глицеридного остатка, что имеет принципиальное значение при получении микромолярных количеств радиоактивномеченых или дорогостоящих соединений.

4. Разработаны синтезы новых 14С-меченых фосфатидилхолиновых зондов, содержащих Dcp-группу при концевом атоме углерода ацильных остатков в sn-2 положении на различном расстоянии от полярной головной группы. Зонды предназначены для мембранных исследований на различной глубине погружения в липидный бислой.

5. Разработан синтез нового фосфатидилхолинового зонда, несущего в sn-положении алифатическую кислоту, содержащую при -углероде Dcpфотофор, присоединенный через сложноэфирную связь, лабильную в щелочной среде, что облегчает анализ продуктов фотомечения. Кислота служит синтоном при получении различных липидных зондов, предназначенных для изучения неполярной области мембран.

6. Разработаны синтезы новых ганглиозидных зондов на основе лизоганглиозида GM1, несущих Dcp-фотофор, присоединенный через сложноэфирную связь, в церамидном остатке на различном расстоянии от олигосахаридной части молекулы. Синтез оптимизирован для субмикромолярных количеств.

7. С помощью 14С-меченых фосфолипидных зондов исследована топография цитохрома Р450 2В4 в мембране. Результаты хорошо коррелируют с данными расчетов конформационного анализа, а также подтверждаются более поздними публикациями других исследователей, применивших независимые методы.

8. С помощью 125I-меченых ганглиозидных зондов исследовано взаимодействие субъединиц рецепторов интерлейкинов-2 и -4 с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах (клетки линии СTLL-2). Полученные данные важны для понимания механизма сборки рецепторов и проведения сигнала.

9. В рамках изучения молекулярных механизмов иммуносупрессии ганглиозидами, определены сайты связывания интерлейкина-4 с 125I-меченым GM1зондом – новым аналогом GM1, несущим Dcp-фотофор вместо ацетила в остатке сиаловой кислоты. Показано, что ганглиозид взаимодействует с фрагментами 19-25 (QKTLCTE) и 103-113 (ANQSTLENFLE).

10. С помощью фосфатидилхолинового зонда идентифицированы субъединицы субкомплекса F0 митохондриальной H+-АТР-азы, контактирующие с липидами мембраны.

11. С целью изучения механизма взаимодействия липосом, оснащенных углеводными детерминантами (адресных липосом), с опухолевыми клетками разработан метод синтеза фотоаффинных неогликолипидных зондов, предназначенных для встраивания в липидный бислой липосом.

12. Фотоаффинное зондирование показало, что взаимодействие адресных липосом с опухолевыми клетками опосредовано рецепторами, экспонированными на поверхности исследованных клеток; некоторые из этих рецепторов могут быть отнесены к известным лектинам клеток млекопитающих.

Список работ, опубликованных по материалам диссертацииОбзор 1. Водовозова Е.Л.. Метод фотоаффинного мечения и его применение в структурно-биологических исследованиях. Биохимия 2007, 72 (1), 5-26.

Статьи 2. Водовозова Е.Л., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Синтез фотореактивных фосфатидилхолинов и сфингомиелинов с различным расстоянием между меткой и полярной группировкой. Биоорган. химия 1984, 10 (12), 1688-1694.

3. Водовозова Е.Л., Шевченко В.П., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Синтез фотореактивных фосфолипидов с высоким уровнем тритиевой метки. Биоорган.

химия 1984, 10 (12), 1698-1699.

4. Молотковский Юл.Г., Маневич Е.М., Водовозова Е.Л., Букринская А.Г., Бергельсон Л.Д. Изучение молекулярной организации мембраны вируса гриппа с помощью фотореактивных и флуоресцентных фосфолипидных зондов. Биол.

мембраны 1985, 2 (6), 566-574.

5. Bukrinskaya A.G., Molotkovsky J.G., Vodovozova E.L., Manevich Y.M., Bergelson L.D. The molecular organization of the influenza virus surface. Studies using photoreactive and fluorescent labeled phospholipids probes. Biochim. Biophys. Acta 1987, 897, 285-292.

6. Slepushkin V.A., Starov A.I., Bukrinskaya A.G., Imbs A.B., Martynova M.A., Kogtev L.S., Vodovozova E.L., Timofeeva N.G., Molotkovsky J.G., Bergelson L.D. Interaction of influenza virus with gangliosides and liposomes containing gangliosides. Eur.

J. Biochem. 1988, 173, 599-605.

7. Мартынова М.А., Маневич Е.М., Водовозова Е.Л., Музя Г.И., Безуглов В.В., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Взаимодействие простагландинов с липопротеинами низкой плотности крови человека. Биохимия 1988, 53 (5), 721-727.

8. Martynova M.A, Manevich Ye.M., Vodovozova E.L., Muzya G.I., Molotkovsky Jul.G., Bergelson L.D.. The interaction of prostaglandins with human plasma lowdensity lipoproteins. Biochim. Biophys. Acta 1988, 963, 302-310.

9. Uvarov V.Yu., Sotnichenko A.I., Vodovozova E.L., Kolesanova E.F., Stier A., Krueger V., Archakov A.I. Determination of membrane-bound fragments of cytochrome P-450 2B4. Eur. J. Biochem. 1994, 222, 483-489.

10. Vodovozova E.L., Molotkovsky J.G. A novel catalyst for O-acylation in lipid chemistry. Tetrahedron Lett. 1994, 35 (12), 1933-1936; ibid. Correction, 35 (44), 8062.

11. Павлова Ю.Б., Водовозова Е.Л., Молотковский Юл.Г. Синтез фотореактивного диглицерида – лиганда протеинкиназы С. Биоорган. химия 1994, 20 (6), 691-696.

12. Водовозова Е.Л., Михалев И.И., Ржанинова А.А., Гараев М.М., Молотковский Юл.Г. Новый оксааналог миристиновой кислоты, подавляющий репликацию вируса иммунодефицита человека. Биоорган. химия 1995, 21 (9), 691-696.

В журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации, опубликовано 27 статей.

13. Водовозова Е.Л., Павлова Ю.Б., Полушкина М.А., Ржанинова А.А., Гараев М.М., Молотковский Юл.Г. Новые фосфолипиды – ингибиторы вируса иммунодефицита человека. Синтез и антивирусная активность. Биоорган. химия 1996, 22 (6), 451-457.

14. Водовозова Е.Л., Никольский П.Ю., Михалев И.И., Молотковский Юл.Г. Липидные производные сарколизина, метотрексата и рубомицина. Биоорган. химия 1996, 22 (7), 548-556.

15. Козлов А.М., Корчагина Е.Ю., Водовозова Е.Л., Бовин Н.В., Молотковский Юл.Г., Сыркин А.Б. Усиление противоопухолевой активности сарколизина путем превращения его в липидное производное и включения в мембрану липосом, содержащих углеводный вектор. Бюлл. экспер. биол. мед. 1997, 123 (4), 439-441.

16. Moiseeva E.V., Vodovozova E.L., Mikhalyov I.I., Molotkovsky J.G. Testing of liposomal formulations of DL-melphalan and rubomycin lipid derivatives on new breast cancer mouse model. Mouse Genome 1997, 95, 895-897.

17. Водовозова Е.Л., Цибизова Е.В., Молотковский Юл.Г. Иодирование диазоциклопентадиен-2-карбонильной группы. Биоорган. химия 1998, 24 (4), 316-318.

18. Водовозова Е.Л., Хайдуков С.В., Гаенко Г.П., Бондарчук Т.И., Михалев И.И., Гречишникова И.В., Молотковский Юл.Г. Транспортировка цитотоксических липосом к злокачественным клеткам с помощью углеводных детерминант. Биоорган. химия 1998, 24 (10), 760-767.

19. Vodovozova E.L., Gayenko G.P., Razinkov V.I., Korchagina E.Y., Bovin N.V., Molotkovsky J.G. Saccharide-assisted delivery of cytotoxic liposomes to human malignant cells. Biochem. Mol. Biol. Int. 1998, 44 (3), 543-553.

20. Vodovozova E.L., Moiseeva E.V., Grechko G.K., Gayenko G.P., Nifant’ev N.E., Bovin N.V. Molotkovsky J.G. Antitumour activity of cytotoxic liposomes equipped with selectin ligand SiaLeX, in a mouse mammary adenocarcinoma model. Eur. J. Cancer 2000, 36 (7), 942-949.

21. Зайцева Л.Г., Овчинникова Т.В., Водовозова Е.Л., Молотковский Юл.Г., Поляков Н.Б., Есипов С.Е., Гринкевич В.А. Изучение строения протон-транслоцирующей части ATP-синтазы в матриксе митохондрий. Вестник МГУ, Серия 2, Химия 2000, 41 (6), 370-374.

22. Vodovozova E.L., Tsibizova E.V., Molotkovsky J.G. One-step iodination of the diazocyclopentadien-2-ylcarbonyl group – a new and convenient preparation of effective radiolabelled photoaffinity probes. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 (Org. Biomol.

Chem. from 2003) 2001, No. 18, 2221-2228.

23. Цибизова Е.В., Водовозова Е.Л., Михалев И.И., Молотковский Юл.Г. Синтез фотореактивных зондов на основе ганглиозида GM1. Биоорган. химия 2002, 28 (2), 173-179.

24. Зайцева Л.Г., Овчинникова Т.В., Водовозова Е.Л., Молотковский Юл.Г., Поляков Н.Б., Титов М.И., Есипов С.Е., Гринкевич В.А. Н+-ATP-аза митохондрий:

идентификация субъединиц субкомплекса F0, контактирующих с липидами мембраны. Биоорган. химия 2002, 28 (5), 411-425.

25. Водовозова Е.Л., Пазынина Г.В., Тузиков А.Б., Гречишникова И.В., Молотковский Юл.Г. Синтез фотореактивных неогликолипидных зондов – инструментов для изучения мембранных лектинов, Биоорган. химия, 2004, 30 (2), 174-181.

26. Водовозова Е.Л., Назарова А.И., Феофанов А.В., Холоденко Р.В., Пазынина Г.В., Гаенко Г.П., Бовин Н.В., Молотковский Юл.Г. Взаимодействие липосом, несущих углеводные детерминанты, с клетками меланомы. Биол. мембраны 2004, (1), 53-64.

27. Водовозова Е.Л., Евдокимов Д.В., Молотковский Юл.Г. Синтез липидного производного противоопухолевого препарата метотрексата. Биоорган. химия 2004, 30 (6), 663-665.

28. Водовозова Е.Л., Гордиенко А.В., Гаенко Г.П., Пазынина Г.В., Бовин Н.В., Молотковский Юл.Г. Обнаружение лектинов опухолевых клеток с помощью фотоаффинного мечения. Биол. мембраны 2005, 22 (4), 308-321.

29. Холоденко И.В., Водовозова Е.Л., Молотковский Юл.Г., Холоденко Р.В., Василенко Р.Н., Михалев И.И., Молотковская И.М. Взаимодействие различных субъединиц рецептора к интерлейкинам-2 и -4 с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах. Биол. мембраны 2006, 23 (1), 27-33.

30. Водовозова Е.Л., Кузнецова Н.Р., Гаенко Г.П., Молотковский Юл.Г. Липосомы с диглицеридным конъюгатом метотрексата: активность в культуре метотрексатрезистентных клеток лейкемии. Биоорган. химия, 2007, 33 (4), 470-473.

31. Водовозова Е.Л., Гаенко Г.П., Бобрикова Е.С., Пазынина Г.В., Молотковский Юл.Г. Диглицеридное производное метотрексата: синтез и цитотоксическая активность в составе адресных липосом. Хим.-Фарм. журн. 2007, 41 (6), 10-14.

Опубликованные тезисы докладов и стендовых сообщений на конференциях 32. Uvarov V.Yu., Degtyarenko K.N., Sotnichenko A.I., Vodovozova E.L., Molotkovsky J.G., Bergelson L.D., Archakov A.I., Stier A., Kruger V. The spatial organization of cytochrome P-450LM2 in membrane. Cytochrome P-450: biochemistry and biophysics. 7th International Conference, Moscow. 28 Jul. – 2 Aug. 1991, Proceedings, INCO – TNC, Joint Stock Company, 1992, P. 739-743.

33. Vodovozova E.L., Pavlova Yu.B., Polushkina M.N., Rzhaninova A.A., Garaev M.M., Molotkovsky J.G. New antiviral phospholipids: synthesis and anti-HIV activity. Third Int. Symp. on Bioorg. Chem. Dagomys, Russia. 17-23 Sept. 1995, Abstr. P. 125.

34. Водовозова Е.Л., Хайдуков С.В., Гаенко Г.П., Михалев И.И., Гречишникова И.В., Молотковский Ю.Г. Направленная доставка липидных противоопухолевых препаратов. VI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, СПб, 23-мая 1998, Сб. рефер. № 4. С. 26-27.

35. Водовозова Е.Л., Цибизова Е.В., Молотковский Ю.Г. Новый метод получения фотореактивных зондов: введение диазоциклопентадиен-2-карбонильной группировки с последующим иодированием. IV Чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова, Москва-Пущино, 2-12 ноября 1998, Тезисы докладов.

С. 11.

36. Vodovozova E.L., Moiseeva E.V., Grechko G.K., Gayenko G.P., Bovin N.V., Molotkovsky J.G. Antitumor effect of cytotoxic liposomes equipped with carbohydrate ligand in mouse mammary adenocarcinoma. Symposium on Lipid and Surfactant Dispersion Systems, Moscow, 26-29 Sept. 1999, Proceedings. P. 269-270.

37. Zaitseva L.G., Ovchinnikova T.V., Vodovozova E.L., Molotkovsky J.G., Polyakov N.B., Esipov S.E., Grinkevich V.A. The investigation of the structure of the protontranslocating portion of mitochondrial ATP synthase. Int. Conference “Biocatalysis2000: fundamentals and applications”, Moscow, 10-15 June 2000, Abstr. P. 94.

38. Zaitseva L.G., Ovchinnikova T.V., Vodovozova E.L., Molotkovsky J.G., Polyakov N.B., Esipov S.E., Grinkevich V.A. Structural studies on the proton-translocating portion of mitochondrial ATP synthase. 18th Int. Congress of Biochemistry and Molecular Biology, Birmingham, UK, 16-20 July 2000, Abstr. P. 179.

39. Водовозова Е.Л., Моисеева Е.В., Гаенко Г.П., Бовин Н.В., Молотковский Ю.Г.

Противоопухолевая активность цитотоксических липосом, несущих специфические углеводные детерминанты. V Чтения, посвященные памяти академика Ю.А.

Овчинникова «Биоорганика-2000», Москва-Пущино, 13-20 ноября 2000, Тезисы докладов. С. 46-47.

40. Водовозова Е.Л., Моисеева Е.В., Гаенко Г.П., Бовин Н.В., Молотковский Ю.Г.

Адресная доставка противоопухолевых препаратов с помощью липосом, несущих специфические углеводные детерминанты. I Международный Конгресс:

Новые медицинские технологии, СПб, 8-12 июля 2001, Тезисы докладов. С. 165166.

41. Цибизова Е.В., Водовозова Е.Л., Михалев И.И., Молотковский Ю.Г. Диазоциклопентадиен-2-карбонильная группа – фотореактивная метка для получения высокоэффективных фотоаффинных зондов. XIV Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 11-15 февраля 2002, Тезисы докладов и стендовых сообщений. С. 12.

42. Водовозова Е.Л., Козлов А.М., Гаенко Г.П., Сапрыкина Н.С., Моисеева Е.В., Бовин Н.В., Молотковский Ю.Г.. Новая система адресной доставки противоопухолевых препаратов - цитотоксические липосомы, несущие специфические углеводные детерминанты. Всеросс. научно-практ. конф. «Отечеств. противоопухол.

препараты» М. 20–22 марта 2003 г. Росс. Биотерапевт. Ж. 2003. Т. 2. С. 18.

43. Vodovozova E.L., Nazarova A.I., Feofanov A.V., Kholodenko R.V., Pazynina G.V., Gaenko G.P., Bovin N.V., Molotkovsky J.G. Interaction of liposomes bearing carbohydrate determinants with melanoma cells. 1st EUFEPS Conf. On Optimising Drug Delivery and Formulation: New Challenges in Drug Delivery. Versailles, France, Sep.

29–Oct. 1, 2003. Abstr. PO-69, Р. 159.

44. Холоденко И.В., Водовозова Е.Л., Холоденко Р.В., Молотковская И.М. Взаимодействие ганглиозида GM2 с субъединицами рецептора IL-2. VII Чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова, М. 4–7 октября 2004 г. Тезисы докладов и стендовых сообщений. С. 50.

45. Molotkovsky J., Molotkovskaya I., Vodovozova Е. Photoaffine glycolipid analogues bearing diazocyclopentadien-2-ylcarbonyl group, and their application in biological studies. Lecture at the XVIII Int. Symposium on Glycoconjugates, Sep. 4–9, 2005, Florence, Italy. Glycoconjugate J. 2005, 22, N 4-6, L052, Р. 178.

46. Molotkovskaya I., Oleynikov V., Kholodenko I., Vodovozova E. Ganglioside binding sites in interleukin-4 molecule: a photoaffinity study. Poster at the XVIII Int. Symposium on Glycoconjugates, Sept. 4–9, 2005, Florence, Italy. Glycoconjugate J. 2005, 22, N 4-6, P124, Р. 281.

47. Vodovozova E., Gordienko A., Gaenko G., Tuzikov A., Bovin N., Molotkovsky J. The search for the tumor cell lectins with the help of photoaffinity neoglycolipid probes.

Poster at the XVIII Int. Symposium on Glycoconjugates, Sept. 4–9, 2005, Florence, Italy. Glycoconjugate J. 2005, 22, N 4-6, P125, Р. 282.

48. Moiseeva E., Vodovozova E., Chaadaeva A., Tuzikov A., Bovin N., Den Otter W.,.

Molotkovsky J. Liposomal formulations of merphalan lipophilic prodrug equipped with SiaLeX-determinant cause prolong therapeutic effect on spontaneous mammary cancer. Session lecture at the 2nd EUFEPS/APGI Conference on Optimising Drug Delivery and Formulation: Evaluation of Drug Delivery Systems Issues and Perspectives.

Versailles, France, Nov. 20-23, 2005. Abstr. Р. 42-43.

49. Водовозова Е.Л., Моисеева Е.В., Гаенко Г.П., Бовин Н.В., Молотковский Юл.Г.

Противоопухолевые адресные липосомы на основе липофильных производных лекарств и углеводов. Медбиотек-2. 2-я Междунар. научно-практ. конф. «Перспективы развития биотехнологии в России». Пущино, 1-2 дек. 2005 г. Мат.

конф. С. 12-13.

50. Водовозова Е.Л., Бовин Н.В., Моисеева Е.В., Гаенко Г.П., Молотковский Ю.Г.

Противоопухолевые липосомы на основе липофильных производных лекарств и углеводов. VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова, М.

25-27 окт. 2006 г. Тезисы докладов и стендовых сообщений. С. 27-28.

51. Кузнецова Н.Р., Кандыба А.Г., Гаенко Г.П., Водовозова Е.Л. Изучение стабильности липосом, содержащих диглицеридное производное противоопухолевого препарата метотрексата. XIХ зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» М. 7-10 февраля 2007 г. Тезисы докладов и стендовых сообщений. С. 49.

52. Водовозова Е.Л., Кузнецова Н.Р., Гаенко Г.П., Молотковский Юл.Г.. Липосомы с липидным конъюгатом метотрексата: стабильность при хранении и активность в культуре метотрексат-резистентных клеток лейкемии человека. VI Всеросс. научно-практ. конф. «Отечеств. противоопухол. препараты» М. 24–26 марта 2007 г.

Росс. Биотерапевт. Ж. 2007. Т. 6. С. 72-73.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.