WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ВЕРХОТУРОВ

Василий Владимирович




ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

В ЗЕРНОВКАХ ЯЧМЕНЯ И ПШЕНИЦЫ ПРИ ИХ ХРАНЕНИИ, ПРОРАСТАНИИ И ПЕРЕРАБОТКЕ





03.00.12 Физиология и биохимия растений


Автореферат

диссертация на соискание ученой степени

доктора биологических наук





















Москва 2008 г.

Работа выполнена в Якутской государственной сельскохозяйственной академии и Иркутском государственном техническом университете

Научный консультант:  доктор биологических наук,

  профессор

  В.В. Рогожин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор Н.Н. Новиков

  доктор биологических наук,

  профессор С.Ф. Измайлов

  доктор технических наук,

  профессор Г.П. Карпиленко

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений

  и микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится "16" декабря 2008 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.08 по защите диссертаций на соискание степени доктора биологических наук при ФГОУ ВПО "Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева" по адресу: 127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 49

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ФГОУ ВПО "Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева"

Автореферат разослан "___"  __________ 2008 г.

Автореферат размещен на сайте ВАК www.vak.gov.ru

Ученый секретарь

диссертационного совета 

С.Л. Белопухов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Способность семян находиться в состоянии покоя является важным приспособительным механизмом, позволяющим человеку в определенных условиях длительно хранить семена сельскохозяйственных растений (Николаева, 1999). В то же время наличие покоя у семян весьма затрудняет культивирование многих пищевых, кормовых, технических и других полезных растений, а также осложняет работы в ботанических садах по созданию коллекций растений и интродукции перспективных для хозяйства видов и т.д. Свежеубранные зерновые культуры почти всегда прорастают плохо, поскольку в них велик процент зародышей, неспособных к прорастанию. Наибольшую энергию прорастания зерновки получают в процессе дозревания, которое в зависимости от свойств сорта, условий роста и хранения может длиться многие недели (Трисвятский, 1985). Вся цепь процессов, происходящих в семенах при дозревании, прорастании и превращении их в новое растение постоянно находится в поле зрения физиологов растений (Хавкин, 1982; Николаева, 2001). 

Прорастание семян сопровождается активацией генома и различных физиолого-биохимических процессов (Зауралов, Лукаткин, 1997; Обручева и др., 1999). Энергетическое жизнеобеспечение клеток зародыша, выходящего из покоя, поддерживается достаточно сложным комплексом митохондриальных окислительно-восстановительных реакций (Робертси, 1982; Обручева, 2001). С повышением метаболических процессов в клетках прорастающих семян наблюдается образование активных форм кислорода, защита от которых осуществляется за счет использования высокоактивной антиоксидантной системы в составе низко- и высокомолекулярных соединений (Кения, Лукаш, 1993). Действие компонентов системы антиоксидантной защиты в основном сводится к подавлению образования свободных радикалов, поддержанию нормального уровня свободно-радикальных процессов и перекисного окисления липидов в тканях (Мерзляк, 1989).

Активные формы кислорода выполняют в клетках важные сигнальные функции не только при стрессе, но и в обычных условиях произрастания растений (Аверьянов, 1999; Тарчевский, 2000). Стрессовые воздействия (низкая температура, ультрафиолет, химические соединения и др.), применяемые для прерывания покоя и повышения всхожести семян, могут быть инициаторами окислительных процессов, таких как перекисное окисление липидов. В тоже время публикации, отражающие роль анти- и прооксидантного баланса при прорастании семян встречаются крайне редко. Наконец, остается открытым вопрос о взаимной регуляции анти- и прооксидантной системы, а также перспективы использования данного механизма в сельскохозяйственной практике и перерабатывающей промышленности.

Субстратами пероксидазы могут быть фитогормоны, цитохром с, НАДФН, триозы, аскорбат, флавоноиды и др. (Садвакасова, Кунаева, 1987; Рогожин, Верхотуров, 2004). Поскольку активность пероксидазы и метаболизм гормональных и негормональных соединений тесно взаимосвязаны, то повышение активности фермента должно отражаться в изменении метаболизма его субстратов. Динамика роста научной литературы, посвященной активным формам кислорода, антиоксидантной системы, окислительным реакциям и их участием, говорит о стремительно растущем к ним интересе физиологов и биохимиков.

Цель работы состояла в изучении роли анти- и прооксидантной системы при хранении, прорастании и переработке зерновых культур, установлении закономерностей проявления ее активности на действие физических и химических факторов, а также исследовании перспективы применения антиоксидантов в сельском хозяйстве и солодовенном производстве. Для достижения цели были поставлены следую­щие задачи:

  1. Исследовать окислительные процессы и антиоксидантный статус зерновок злаковых культур при различных условиях хранения.
  2. Определить активность и каталитические свойства некоторых оксидоредуктаз при хранении и прорастании зерновок пшеницы.
  3. Проследить за изменением активности антиоксидантной системы и интенсивности перекисного окисления липидов при набухании и прорастании зерновок.
  4. Изучить влияние химических и физических факторов на окислительные процессы и антиоксидантный статус семян и проростков.
  5. Предложить механизм окисления низкомолекулярных антиоксидантов с участием пероксидазы и исследовать влияние регуляторов на каталитические свойства фермента.
  6. Исследовать влияние экзогенных анти- и прооксидантов на прорастание и всхожесть зерновок пшеницы.
  7. Исследовать влияние технологического режима проращивания ячменя на антиоксидантный статус и качество светлого пивоваренного солода.
  8. Определить содержание низкомолекулярных антиоксидантов в отходах солодовенного производства и предложить перспективы их использования при солодоращении ячменя.

Защищаемые положения.

  • Длительное хранение семян, а также их хранение при неблагоприятных условиях, способствует накоплению продуктов ПОЛ и снижению активности антиоксидантной системы. Поэтому показатели состояния про- и антиоксидантной системы  могут быть использованы как критерий оценки жизнеспособности семян в условиях хранения и переработки. Низкая активность окислительных процессов и высокое содержание низкомолекулярных антиоксидантов в зерновках является одним из биохимических механизмов, обеспечивающих жизнеспособность семян при длительном хранения.
  • Перекисное окисление липидов является показателем активации кислородных метаболитов, участвует в запуске программы прорастания семян и активации антиоксидантной системы.
  • Низкомолекулярные антиоксиданты способны регулировать активность пероксидазы растений в условиях in vitro и in vivo. Взаимное влияние низкомолекулярных антиоксидантов и высокомолекулярного антиоксидантного фермента – пероксидазы является одним из регуляторных механизмов прорастания семян растений.
  • Низкомолекулярные экзогенные анти- и прооксиданты являются эффективными регуляторами прорастания зерновок злаковых культур. Участие низкомолекулярных антиоксидантов в механизме покоя семян обусловлено ингибированием фермента антиоксидантной защиты – пероксидазы, что подтверждается в экспериментах in vitro и in vivo. Понижение активности фермента высокими концентрациями антиоксидантов способствует углублению покоя семян, а активация пероксидазы – ускоренному их выходу из состояния гипобиоза и быстрому прорастанию.

Научная новизна. Показано участие компонентов антиоксидантной системы в регуляции биохимических процессов при хранении и прорастании семян растений. Установлено, что стресс-факторы (температура, ультрафиолет, химические соединения), способствуют стимуляции прорастания семян, через активацию перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы. Результаты проведенных исследований дают возможность рассматривать ПОЛ как один из пусковых механизмов активации программы прорастания семян. Знания механизмов активации биохимических процессов прорастания семян позволяют разработать новые методы, повышающие всхожесть семян и устойчивость растений к действию неблагоприятных факторов окружающей среды. 

Впервые изучены механизмы индивидуального и совместного пероксидазного окисления низкомолекулярных антиоксидантов. Определены каталитические константы реакций и предложены механизмы взаимной регуляции пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов, реализуемые в биологической системе. Установлено, что в реакциях индивидуального и совместного окисления в действии пероксидазы проявляются сложные регуляторные механизмы, обеспечивающие протекание каталитического процесса. Фермент, не проявляющий избирательность по отношению к природе окисляемого субстрата в реакциях индивидуального окисления, приобретает избирательность в реакциях совместного окисления.

Впервые в производственных условиях исследована активность антиоксидантной системы и интенсивность перекисного окисления липидов в зерновках ячменя при производстве светлого пивоваренного солода. Предложено использовать показатели активности антиоксидантной системы для оценки протекания окислительных процессов при производстве пивоваренного солода.

Практическая значимость работы. Диссертационная работа выполнена в рамках тематики НИР кафедры пищевой технологии ИрГТУ "Техническая биохимия, биотехнология и химия биологически активных веществ" (госбюджетная тема №378). Исследования были поддержаны грантом Министерства образования и науки РФ “Биохимия процессов, протекающих при хранении и переработке растительного сырья” (код ГРНТИ 62.09.37).

Показатель состояния анти- и прооксидантной системы может быть использован как дополнительный критерий оценки качества при хранении и солодоращении зернового сырья. Замачивание семян в растворах низкомолекулярных антиоксидантов, приводит к повышению всхожести и устойчивости проростка к неблагоприятным факторам среды. Полученные данные позволят предложить наиболее оптимальное время замачивания семян в растворах регуляторов, которое по результатам наших исследований приходится на первые четыре часа набухания. Полученные результаты могут быть рекомендованы для практического использования в сельскохозяйственном производстве для увеличения всхожести и сопротивляемости семян к неблагоприятным факторам.

Результаты, посвященные изучению влияния низкомолекулярных антиоксидантов на солодоращение пивоваренного ячменя, могут быть использованы при разработке технологии применения этих регуляторов в солодовенном производстве. Исследования, посвященные определению содержания низкомолекулярных антиоксидантов в отходах пивоваренного и солодовенного производства, могут быть полезны для разработки технологии использования отходов в регуляции биотехнологических процессов при солодоращении зернового сырья.

Материалы используются для проведения занятий по курсам “Физиология и биохимия растений”, “Биохимия”, “Прикладная энзимология”, и "Биотехнология переработки растительного сырья" для студентов технологического и сельскохозяйственного профиля, обучающихся в ИрГТУ и ЯГСХА.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждались на научно-практической конференции "Физиология, биохимия и экология растений" (Якутск, 1997, 1998); на V-ой Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1999); на ежегодных семинарах СИФИБР СО РАН (Иркутск, 1999, 2000); на республиканской научно-практической конференции "Научное сопровождение образовательного процесса агровуза" (Якутск, 2001); на научно-практических конференциях "Региональные проблемы сельскохозяйственного производства" (Якутск, 2001), "Проблемные вопросы Восточно-Сибирского региона" (Иркутск, 2001), "Перспективы развития технологии, экологии и автоматизации пищевых производств" (Иркутск, 2004), “Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания” (Иркутск, 2006, 2007); на Всероссийской научной конференции “Биологически активные добавки и здоровое питание” (Улан-Удэ, 2001); на V съезде общества физиологов растений “Физиология растений – основа фитобиотехнологии” (Пенза, 2003 г); на Международной научно-практической конференции “Прогрессивные технологии развития” (Тамбов, 2004); Всероссийской конференции “Пищевые технологии” (Казань, 2004), на VIII Международной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004); на Всероссийской научно-технической конференции “Молодые ученые - Сибири” (Улан-Удэ, 2003); на 2-й Международной научно-практической конференции “Составляющие научно-технического прогресса” (Тамбов, 2006); на смотре-конкурсе НИР работа на тему "Ресурсосберегающие технологии в производстве пива" удостоена дипломом (Иркутск, 2006); на V-ой Международной научно-практической конференции “Современные тенденции развития АПК в России” (Красноярск, 2007).

Достоверность и обоснованность научных положений и выводов обеспечены проведенным объемом лабораторных исследований; профессионализмом проведения измерений на современном оборудовании; подтверждены сходимостью расчетных и экспериментально полученных результатов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано более 40 печатная работа, в том числе 17 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов докторских диссертаций, а также 2 монографии (в соавторстве) и 1 учебное пособие.

Объем и структура работы. Диссертационная работа представляет собой рукопись, изложенную на 360 страницах машинописного текста, включает 44 таблиц, 73 рисунков, а также список цитируемой литературы из 452 наименований. Диссертация состоит из введения, десяти глав, заключения, выводов, рекомендаций производству, списка использованной литературы и приложения.

Личное участие автора. Личный вклад соискателя заключается в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке, интерпретации и публикации полученных результатов.

Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность научному консультанту проф. В.В. Рогожину за профессиональное и доброжелательное руководство; с.н.с. Т.Т. Курилюк, к.б.н., Т.В. Рогожиной, В.Ю. Гребенщикову, Г.В. Пинигиной, В.К. Франтенко, О.В. Соколовой – за помощь и ценные советы, высказанные в процессе обсуждения диссертационной работы. Автор искренне благодарит сотрудников ОАО "БПК", ЯГСХА, ИрГТУ, ИГСХА и СИФИБР СО РАН за всестороннюю помощь и поддержку, оказанные при подготовке диссертации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили семена пшеницы сорта Омская 12, Скороспелка, Приленская 19, Якутянка 224 (Республика Саха-Якутия), ячмень сорта Гонар (Кировская  и Белгородская обл.), Сигнал, Соболек, Кедр (Алтайский край), Ача, Одесский 100, Одесский 115, Неван, Зазерский 85 (Иркутская обл.), Дворан (Тамбовская и Оренбургская обл.), а также семена дикорастущих растений (Республика Саха-Якутия). Технологические свойства ячменя исследовали по общепринятым методикам: отбор проб – ГОСТ 13586.3-83, запах и цвет – ГОСТ 10967-75, влажность – ГОСТ 13586.5-85, примеси и крупность – ГОСТ 13586.2-81, жизнеспособность – ГОСТ 12039-82, способность прорастать – ГОСТ 10968-88, вредители – ГОСТ 13586.4-83, белок – ГОСТ 10846-74, натура – ГОСТ 10840-64, стекловидность – ГОСТ 10987-76, пленчатость – ГОСТ 10843-76, масса 1000 зерен – ГОСТ 10842-89, экстрактивность – ГОСТ 12136-77 и др. Технологические свойства светлого солода исследовали, используя классические методы по ГОСТ 5060-86 (Мальцев, 1972; Косминский, 2000). Исследования проводили на базе ЯГСХА, ИрГТУ, ИрГСХА и АО "Байкальская пивоваренная компания".

Количество супероксида определяли спектрофотометрически при 480 нм по окислению адреналина в адренохром (Misra, Fridovich, 1972). Содержание малонового диальдегида исследовали по реакции с тиобарбитуровой кислотой при = 532 нм (Владимиров, Арчаков, 1972; Рогожин, 1999). Активность глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы определяли при 340 нм по начальной скорости изменению абсорбции НАДФH (Smith et al., 1989; Рогожин, 1996); алкогольдегидрогеназы регистрировали по скорости окисления этанола и образования НАДН при = 340 нм = 6,22 мМ-1см-1 (Рогожин, 1999); полифенолоксидазы проводили по окислению пирокатехина (Ермаков, 1987); пероксидазы по начальной скорости окисления о-дианизидина перекисью водорода при = 460 нм = 30 мМ-1см-1 (Лебедева и др., 1977); каталазы по уменьшению поглощения = 240 нм, = 42,3 М-1 см-1 (Цагарели, Пруидзе, 1990); супероксиддисмутазы по ингибированию окисления адреналина супероксид-радикалом при 347 нм (Сирота, 1999).

Определяли активность амилолитических (Плешков, 1976) и протеолитических ферментов (Ермаков, 1987). Содержание антиоксидантов определяли по реакции с о-фенентролином (Ермаков, 1987; Рогожин, 1996); аскорбиновой кислоты по восстановлению К3[Fe(CN)6] при = 700 нм (Ермаков, Максимов, 1978); стероидных гликозидов по реакции с пикриловой кислотой (Ермаков, 1987). Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с учетом критериев Стьюдента и Фишера по методике, описанной в руководстве (Лакин, 1990). Разницу считали достоверной при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Антиоксидантная система и окислительные процессы при хранении семян растений

1.1. Влияние влажностно-температурного стресса на перекисное окисление липидов и антиоксидантную систему зерновок ячменя

Самосогревание - порочный процесс повышения температуры зерновой массы, приводящий к утрате семенных, продовольственных, кормовых и технических достоинств зерна (Трисвятский, 1985). Проследили за изменениями антиоксидантной системы и интенсивности перекисного окисления липидов в семенах ячменя, подвергнутых действию повышен­ных температур и влажности. Показано, что уже после трех часов экспозиции наблюдалось снижение всхожести (на 5-8%) и повышение концентрации продуктов перекисного окисления липидов (на 18-20%). Свободные радикалы, образующиеся в результате стрессового воздействия, способны повреждать фитогормоны, белки, нуклеиновые кислоты и другие соединения (Барабой, 1981; Мерзляк, 1989; Зенков, Меньшикова, 1993), поэтому продолжительное влажностно-температурное воздействие приводит к существенному накоплению продуктов ПОЛ и полной потере всхожести семян.

Компенсаторная активация АО системы проявлялась в своеобразной динамике и зависела от продолжительности воздействия неблагоприятных факторов. В первые 12 ч экспозиции активируются антиоксидантные ферменты, что указывает на образование АФК в семенах, подвергнутых влажностно-температурному воздействию. Активность СОД повышалась в течение восьми часов набухания с последующим падением. Максимальная активность КАТ наблюдалась после 12 ч набухания семян. Активность пероксидазы максимально возрастала к 12 ч набухания. В ходе исследований установлено, что в результате действия стрессирующих факторов, отмечается  снижение активности антиоксидантной системы, коррелирующей с понижением всхожести зерновок. При этом наблюдается увеличение активности кислых и щелочных протеаз у исследуемых сортов на 6,3 % и 4,7 %, соответственно. Повышение активности протеолитических ферментов зерна под воздействием стресса может быть следствием нарушения целостности мембран и выхода протеаз в цитоплазму клетки.

Таким образом, самосогревание вызывает в клетке усиление свободно-радикальных процессов и смещение равновесия в сторону активации ПОЛ. Активация ПОЛ представляет собой один из первых неспецифических звеньев в общей стресс-реакции организма и может инициировать включение других механизмов защиты. Длительное воздействие стресс-фактора приводит к снижению активности антиоксидантной системы и падению всхожести семян на фоне возрастания окислительных процессов. Поэтому состояние антиоксидантно-прооксидантного равновесия можно рассматривать как показатель жизнеспособности семян и устойчивости их к условиям окружающей среды.

1.2. Влияние условий хранения на активность антиоксидантной системы и физиолого-биохимические процессы зерна

Показано, что у семян, заложенных на хранение в естественных условиях с низкой влажностью (до 14 %), сохранялись достаточно высокие показатели качества на фоне небольших колебаний значений активности окислительных и антиоксидантных процессов. У зерновок, заложенных на хранение с высокой влажностью (18-20 %) в 1,3-1,8 раза снижаются посевные качества. Повышенная влажность зерновой массы и температурный стресс способствуют активации окислительных процессов, приводящих к накоплению продуктов ПОЛ. Продолжительное хранение приводит к резкому снижению активности супероксиддисмутазы и каталазы, а также повышению концентрации продуктов ПОЛ. Пероксидаза сохраняет свою активность на протяжении всего времени хранения.

Следует отметить, что зерновки с влажностью 24 % почти полностью утратили посевные качества (энергия прорастания - 8%, всхожесть - 12-16 %). Интересно, что повышение активности антиоксидантной системы и интенсивности ПОЛ коррелировало с повышением всхожести и энергии прорастания семян после двухмесячного хранения. Резкое падение всхожести наблюдалось на фоне понижения активности антиоксидантной системы и интенсивности перекисного окисления липидов (табл. 1).

На основании полученных данных можно заключить, что одним из физиолого-биохимических механизмов, определяющих жизнеспособность и сохранность зерна, является активность окислительных и антиоксидантных процессов. Высокая температура и повышенная влажность зерна способствуют активации свободно-радикальных процессов и ПОЛ, приводящих к понижению жизнеспособности и качества семян.

Таблица 1 - Изменение активности антиоксидантных ферментов при хранении ячменя сорта Ача в естественных условиях

Дата

Влажность зерна при закладке на хранение, %

14

18

24

СОД

КАТ

ПО

ГР

СОД

КАТ

ПО

ГР

СОД

КАТ

ПО

ГР

1.10

2,7

0,51

3,7

0,31

3,3

0,72

7,2

0,33

5,3

0,71

14,3

0,41

1.11

1,5

0,33

2,3

0,11

4,2

0,55

4,4

0,24

4,7

0,75

8,11

0,15

1.12

1,2

0,41

1,1

0,14

1,4

0,34

1,2

0,22

2,2

0,41

1,51

0,12

1.01

1,5

0,12

1,2

0,08

0,7

0,14

1,4

0,18

1,5

0,12

0,22

0,11

1.02

0,8

0,24

0,7

0,05

0,3

0,15

1,1

0,14

0,5

0,22

0,15

0,04

1.03

0,5

0,41

0,8

0,08

0,5

0,11

0,7

0,11

0,7

0,13

0,30

0,01

1.04

0,7

0,38

1,1

0,11

0,2

0,23

0,5

0,14

0,1

0,41

0,14

0

1.05

1,0

1,0

0,8

0,15

0,3

0,31

1,1

0,05

0,1

0,24

0,11

0

Примечание: супероксиддисмутаза (СОД), ед.акт; каталаза (КАТ), мМ/мин г; пероксидаза (ПО), мкМ/мин г; глутатионредуктаза (ГР), мкМ/мин г.

В следующей серии экспериментов изучили влияние температурных условий на физиолого-биохимические показатели семян. Зерновки, хранившиеся при 4-5 и 19-22 °С в течение трех лет, успешно прорастали и формировали морфологически нормальные проростки. Концентрация продуктов ПОЛ несколько повышалась в течение шести месяцев низкотемпературного хранения, что указывает на участие окислительных процессов в послеуборочном дозревании семян. Динамика содержания низкомолекулярных антиоксидантов имела колебательный характер.

Семена, подвергнутые ускоренному старению при 37 °С, формировали меньшее количество сильных проростков, которые были гетерогенны по морфологическим показателям. Посевные качества, содержание продуктов ПОЛ и активность антиоксидантной системы ускоренно состарившихся семян определяли с интервалом в две недели в течение шести месяцев. В течение четырех месяцев хранения при 37 °С наблюдается повышение концентрации продуктов ПОЛ. Длительное пребывание в условиях искусственного старения приводит к снижению концентрации МДА и низкомолекулярных антиоксидантов. Таким образом, под действием температурного стресса в клетках зародыша происходят необратимые физиолого-биохимические изменения, приводящие к нарушению роста и развития проростка.

В течение четырех месяцев ускоренного старения активность протеолитических ферментов колебательно повышалась во всех исследуемых сортах. Причем возрастание активности протеаз коррелировало со снижением содержания белка и всхожести. После шести месяцев хранения снижается активность протеолитических ферментов в сортах Дворан и Гонар. В остальных исследуемых сортах ячменя активность протеаз снижается незначительно. 

Причиной этих изменений могут быть катаболические процессы, протекающие в семенах при старении, в результате чего происходит нарушение гомеостаза клеток и выход протеаз в свободное состояние. Активность амилолитических ферментов при хранении ячменя характеризовалась повышением в период полуторамесячного ускоренного старения. Снижение активности после двух месяцев хранения при повышенной температуре обусловлено инактивацией ферментов в условиях нарастающего стресса и действием протеолитических ферментов. Полученные данные указывают на существенную взаимосвязь между состоянием антиоксидантной системы и жизнеспособностью семян.

1.3. Изменение антиоксидантного статуса и окислительные процессы

при длительном хранении зерна в естественных условиях

Установлено, что ПО и ПФО - ферменты, играющие важную роль в метаболизме и способные выполнять роль оксидаз терминального окисления, несколько снижаются в процессе хранения (табл. 2). АДГ - фермент, катализирующий обратимое окисление этанола в ацетоальдегид. Равновесие реакции в физиологических значениях рН смещено в сторону образования этанола, который участвует в различных физиолого-биохимических процессах устойчивости семян к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды. Накопление этанола в клетках зародыша способствует поддержанию жизнеспособности и длительному сохранению всхожести семян.

Таблица 2 – Изменение физиолого-биохимических показателей при хранении ячменя в естественных условиях Гонар

Срок хранения, годы

Жизне-способность, %

Всхо-жесть, %

Активность ферментов

АДГ, мкМ/мин г.с.в.

Г6ФДГ, мкМ/мин г.с.в.

ПО, мкМ/мин г.с.в.

ПФО, усл.ед. /мин г.с.в.

1

99±1

97±2

4,57±0,3

1,55±0,1

2,05±0,2

0,17±0,02

3

90±2

84±3

2,06±0,2

1,02±0,1

1,74±0,1

0,08±0,003

5

63±4

44±2

1,21±0,1

0,38±0,1

0,55±0,04

0,02±0,001

Снижение активности Г6ФДГ указывает на нарушение функционирования основного метаболического пути, участвующего в поддержании жизнеспособности семян при хранении (Робертси, Смит, 1982). Таким образом, понижение жизнеспособности семян коррелировало с уменьшением активности АДГ и Г6ФДГ, а снижение активности ПО и ПФО – с понижением всхожести.

Из таблицы 3 видно, что длительное хранение ячменя в естественных условиях склада приводит к снижению всхожести и активности антиоксидантной системы защиты зерна. Содержание продуктов ПОЛ повышалось в течение 3 лет хранения ячменя в естественных условиях. Понижение концентрации продуктов ПОЛ и низкомолекулярных АО коррелировало с резкой потерей жизнеспособности (до 52 %) и всхожести (до 46 %) семян.

Таблица 3 - Изменение активности антиоксидантной системы и интенсивности перекисного окисления липидов при хранении ячменя сорта Кедр

Срок хранения, годы

АО, мкг/г с.в

СОД, ед.акт

КАТ, мМ/мин г.с.в.

ГР, мкМ/мин г.с.в.

ПОЛ, мкМ / г.с.в.

1

104,1±5

6,4±0,3

0,5±0,02

0,8±0,04

0,075±0,005

3

88,3±4

3,5±0,2

0,3±0,01

0,5±0,02

0,123±0,01

5

64,5±2

3,0±0,2

0,1±0,01

0,1±0,01

0,053±0,004

Таким образом, универсальной причиной старения служит образование активных кислородных метаболитов и свободно-радикальное окисление липидов мембран, белков, нуклеиновых кислот. Результатом метаболических изменений при естественном старе­нии семян является утрата ими жизнеспособно­сти. В качестве основных звеньев, ответственных за сохранение жизнеспособности семян, могут выступать окислительные и антиоксидантные процессы.

2. Влияние внешних факторов на антиоксидантную систему и окислительные процессы при прорастании семян растений

2.1. Активность оксидоредуктаз при набухании и прорастании семян

Из таблицы 4 видно, что в первые 12-24 ч набухания, активируются как дегидрогеназы, так и оксидазы. Возможно, это объясняется тем, что выход из состояния покоя, сопровождается активацией биосинтетических процессов, для осуществления которых необходима активация дыхания.

Таблица 4 – Активность оксидоредуктаз при набухании пивоваренного ячменя Гонар (Кировская область)

Время набухания, ч

АДГ, мкМ/мин г.с.в.

Г6ФДГ, мкМ/мин г.с.в.

ПО, мкМ/мин г.с.в.

ПФО, ед. /мин г.с.в.

0

6,3±1,8

0,063±0,003

1,42±0,45

0,16±0,01

12

4,2±0,7

0,18±0,01

5,8±0,75

0,17±0,01

24

5,7±1,3

1,39±0,13

4,7±0,61

0,21±0,02

36

6,6±1,4

0,98±0,07

6,2±1,4

0,20±0,02

48

4,7±1,1

0,82±0,05

6,4±1,4

0,24±0,03

Известно, что именно работа ПФП существенно важна для выхода семян из состояния покоя (Робертси, Смит, 1982). Ограничивающим скорость звеньев ПФП является реокисление НАДФН. Наиболее вероятным механизмом ускоренного окисления НАДФН можно предложить совместное окисление кофермента с другими субстратами (Лебедева, Угарова, 1996).

Снижение на более поздних стадиях замачивания (36-48 ч) активности дегидрогеназ и увеличение на их фоне активности пероксидазы и полифенолоксидазы объясняется преобладанием в семенах аэробных процессов.

Нами изучена активность окислительных ферментов в зародыше, щитке и эндосперме в течение 24 ч набухания ячменя. Выход из покоя семян обусловлен интенсивностью биосинтетических процессов, прежде всего, в зародыше и щитке, поэтому наибольшая активность изучаемых нами дегидрогеназ и оксидаз, наблюдается именно в них.

Активность оксидазных ферментов – пероксидазы и полифенолоксидазы возрастала в течение всего времени проращивания (табл. 5). Повышение активности пероксидазы свидетельствует о том, что фермент может участвовать в пусковых механизмов прорастания семян, инициируя реакции свободно-радикального окисления, которые через активацию ПОЛ могут способствовать возрастанию дыхательной процессов митохондрий (Рогожин, 2000). Следует отметить, что активность окислительных ферментов в корнях гораздо выше, чем в зерновке.

Активность АДГ колебательно снижалась в течение всего времени прорастания ячменя, с кратковременным подъемом активности в корнях на 4 сутки. Снижение активности АДГ при прорастании объясняется ингибированием фермента молекулами АТФ, концентрация которых повышается за счет активации аэробного биологического окисления (Рогожин, 2000). Активность Г6ФДГ резко возрастала в корнях на 3 сутки, а затем постепенно снижалась.

Таблица 5 – Активность оксидоредуктаз при проращивании ячменя Гонар

Проращи-вание, сут.

АДГ,

мкМ/мин г с.в.

Г6ФДГ, мкМ/мин г с.в.

ПО,

мкМ/мин г с.в.

ПФО, отн.ед.акт./мин

зерно

корни

зерно

корни

зерно

корни

зерно

корни

1

2

3

4

5

6

7

8

3,4±0,2

2,23±0,2

0,91±0,1

0,14±0,003

0,21±0,02

0,36±0,03

0,15±0,01

0,05±0,001

-

3,21±0,2

2,77±0,2

3,07±0,3

1,02±0,1

1,61±0,1

1,84±0,1

1,83±0,1

1,31±0,1

0,07±0,01

0,08±0,01

0,26±0,02

0,32±0,02

0,38±0,03

0,12±0,004

0,30±0,01

-

4,22±1,1

5,39±1,5

2,36±0,2

2,28±0,2

1,52±0,1

1,84±0,1

2,31±0,2

13,2±2,0

13,8±2,0

23,1±3,2

17,5±3,0

21,7±3,1

17,2±2,4

17,4±2,2

24,3±3,1

-

193,3±8,4

251,2±12,1

258,7±12,2

247,0±13,1

241,1±12,0

272,4±15,2

281,0±15,4

0,28±0,03

0,33±0,02

0,26±0,01

0,22±0,01

0,18±0,02

0,35±0,03

0,10±0,01

0,15±0,01

-

6,3±1,4

6,7±1,5

8,4±1,8

16,8±2,2

15,1±2,0

16,7±2,1

17,6±2,2

Таким образом, при запуске процессов прорастания необходима активация как анаэробных, так и аэробных процессов. Путем правильного регулирования условий проращивания можно в определенных пределах управлять процессами переключения дегидрогеназных реакций на оксидазные.

2.2. Окислительные процессы и активность антиоксидантной системы при набухании и прорастании семян

В течение всего времени набухания, постепенно повышается содержание в ячмене МДА и низкомолекулярных АО (табл. 6). Возрастание концентрации низкомолекулярных АО в прорастающих зерновках объясняется активацией гидролитических реакций, обеспечивающих зародыш пластичным материалом и энергией. Активность каталазы и пероксидазы постепенно возрастает в течение всего периода замачивания, что объясняется участием их в окислении энергетических соединений и ингибиторов роста, накопление которых наблюдается во время покоя семян. Пик активности СОД приходит на 12 ч замачивания с последующим колебательным падением. Снижение активности глутатионредуктазы можно объяснить тем, что для катализа этому ферменту необходим кофермент НАДФН, содержание которого снижется при возрастании аэробных процессов. Нами изучена активность антиоксидантных ферментов, содержание низкомолекулярных АО и МДА в зародыше, щитке и эндосперме в течение первых 24 ч набухания ячменя. Активность СОД, КАТ и ПО в процессе набухания колебательно возрастает. Причем высокая активность ферментов и содержание АО наблюдается в зародыше и щитке. Пик наибольшей активности приходится на 12-16 ч замачивания. Следует отметить, что активность глутатионредуктазы резко возрастает в первые 8 ч, а затем постепенно идет на снижение.

Таблица 6 - Окислительные процессы и антиоксидантный статус ячменя сорта Сигнал (Алтайский край) при замачивании

Время набухания, ч

МДА,

мкМ/

г с.в.

АО,

мкг/

г с.в.

СОД,

ед.акт./

г с.в.

ПО,

мкМ/

мин. г с.в.

ГР,

мкМ/

мин г с.в.

0

0,104±0,01

131,4±5,2

1,0±0,1

11,3±3,4

0,4±0,03

2

0,092±0,01

107,5±4,4

2,1±0,2

13,3±3,0

0,8±0,01

6

0,110±0,01

155,3±5,3

3,4±0,2

12,0±3,0

1,1±0,01

12

0,102±0,01

201,7±5,6

4,4±0,3

17,5±4,1

1,3±0,01

18

0,123±0,02

190,5±5,1

8,5±0,4

17,8±4,0

2,0±0,02

24

0,120±0,02

240,2±6,2

8,8±0,4

22,3±5,0

2,1±0,02

Физико-химические свойства мембран могут оказывать существенное влияние на протекание метаболических процессов (Владимиров, Арчаков, 1972; Мерзляк, 1989). Хотя поглощение воды и служит сигналом к организации митохондрий, самого по себе поглощения воды для активации окислительных процессов недостаточно. В сухих семенах отсутствует окислительное фосфорилирование, но существуют митохондрии, для активации работы которых необходимы физико-химические изменения в мембранах (Khan, 1982). Возможно, что абсолютная необходимость АФК и антиоксидантной системы для жизнедеятельности семян объясняются образованием при их реакциях электронно-возбужденных состояний - триггеров всех последующих биоэнергетических процессов. Колебательный режим таких реакций может обусловливать ритмичное протекание биохимических процессов более высокого уровня. Резкое повышение содержание МДА в зародыше и щитке можно объяснить возрастанием окислительных процессов и дыхания в зерне при достижении необходимой влажности. По-видимому, процессы ПОЛ запускают у покоящихся организмов основные процессы жизнедеятельности.

Повышение концентрации низкомолекулярных АО на 12 ч набухания объясняется выходом из депо низкомолекулярных растворимых соединений, а также гидролизом белков и полисахаридов, продукты которых обладают антиоксидантными свойствами (Тарчевский, 2001). Из результатов видно, что проращивание сопровождается постепенным возрастанием ПОЛ в зерне и корнях (табл. 7). Концентрация низкомолекулярных АО постепенно снижается в зерне в течение всего времени проращивания. Динамика активности СОД в корнях и зерне постепенно повышается в течение четырех суток ращения. Причем более высокие показатели активности ферментов отмечались в корнях. Каталаза содержится в ячмене в незначительном количестве, но быстро накапливается при проращивании, причем скорость накоп­ления явно зависит от длительности проращивания. Активность КАТ возрастает меньше по сравнению с активностью ПО, так как сродство фермента к малым концентрациям Н2О2 ниже, чем у пероксидазы (Саундерс, 1988). Указанные ферменты принадлежат к дыхательному комплексу растений, поэтому повышение их активности в прорастающем ячмене обусловлено также возрастанием дыхания.

Таблица 7 – Состояние антиоксидантной системы и интенсивность перекисного окисления липидов в процессе прорастания ячменя сорта Сигнал

Прорастание, сут.

МДА, мкМ/г с.в.

АО, мкг/г с.в.

СОД, ед.акт./г с.в.

ПО, мкМ/мин. г с.в.

КАТ, мМ/мин г с.в.

ГР, мкМ/мин г с.в.

зерно

корни

зерно

корни

зерно

корни

зерно

корни

зерно

корни

зерно

корни

1

2

3

4

5

6

7

8

0,043

0,048

0,069

0,074

0,033

0,088

0,091

0,113

-

0,767

0,539

0,742

0,673

0,406

0,699

0,603

315,2

274,0

255,4

199,8

186,5

161,3

171,6

198,7

-

356,7

825,1

905,2

451,2

412,3

657,8

610,1

15

18

20

35

30

32

31

33

-

30

47

50

48

64

67

70

13,2

23,8

17,8

21,7

17,2

17,4

20,4

21,1

-

201,6

194,5

229,8

136,4

184,5

227,1

265,6

0,15

0,17

0,18

0,21

0,18

0,23

0,24

0,30

-

0,36

0,38

0,60

0,47

0,67

0,72

0,81

1,5

1,2

0,7

0,8

0,5

0,4

0,2

0,1

-

2,3

1,1

0,4

0,5

0,2

0,1

0,2

Увеличение активности ПО может быть вызвано накоплением соединений, являющихся субстратами фермента, индуцирующих его синтез. Однако высокие концентрации субстратов пероксидазы могут ингибировать фермент (Рогожин, 2004), способствуя, таким образом, увеличению концентрации Н2О2 в клетках. Возможно, этим и объясняется падение активности фермента на 3 и 6-е сутки проращивания. Постепенное снижение активности ГР в зерне и корнях можно объяснить преобладанием аэробных процессов над анаэробными, в результате чего, снижается концентрация НАДФН в клетке.

Таким образом, контроль над уровнем ПОЛ во время набухания и прорастания семян ячменя осуществляется с помощью низко- и высокомолекулярных антиоксидантов. Понижение свободно-радикальных процессов в семенах возможно за счет образования большого количества антиоксидантов, концентрация которых при этом возрастает в несколько раз, особенно в зародыше семян ячменя. Выявленные закономерности являются проявлением адаптационных компенсаторных механизмов, использование которых позволяет регулировать физиолого-биохимические процессы в семенах при прорастании.

2.3. Влияние температуры на активность антиоксидантной системы и окислительные процессы

2.3.1 Активность, каталитические свойства пероксидазы и содержание антиоксидантов при прорастании семян пшеницы

Изучена динамика активности ПО и содержание АО в семенах пшеницы в течение 24 ч набухания при 5 С (I группа) и 23 С (II группа). Процесс набухания семян сопровождается колебательным возрастанием активности фермента. Обращает на себя внимание тот факт, что резкое повышение активности фермента в семенах, подвергнутых температурному стрессу, наблюдается на 8, 18 и 24 ч набухания. Пероксидаза – стрессовый фермент растений, который участвует в метаболических процессах, происходящих во время покоя семян и в период их активного прорастания. Поэтому своеобразные колебательные всплески активности фермента обусловлены проявлением компенсаторных механизмов в условиях низкой положительной температуры.

Для выяснения локализации и участия компонентов антиоксидантной системы в процессах прорастания определено содержание продуктов ПОЛ, низкомолекулярных АО и активность ПО в различных органах семян (табл. 8). Видно, что активность ПО и содержание АО в зародыше у семян I группы было выше в 1,5 раза. У этих же семян в процессе набухания повышается активность пероксидазы в эндосперме и оболочке в 1,5 и 1,8 раза соответственно.

Субстратами ПО могут быть фитогормоны и фенольные ингибиторы роста, поэтому фермент имеет большое значение в регуляции состава биологически активных веществ в клетках растений. Окисление БАВ ферментом способствует активации ростовых процессов в условиях стресса.

В покоящихся семенах дыхание крайне ослаблено, отмечаются изменения в составе жирных кислот и функционально активных веществ мембран митохондриальной системы (Николаева, 1999; Робертси, Смит, 1982), за счет которых обеспечивается разобщение механизмов окислительного фосфорилирования при сохранении активности окислительных процессов (Скулачев, 1996). При активизации дыхания, поступивший кислород ускоряет пусковые механизмы процессов ПОЛ, поэтому наибольшее содержание продуктов ПОЛ отмечается в активно метаболизирущих органах – зародыше и щитке.


Таблица 8 – Активность антиоксидантной системы и интенсивность перекисного окисления липидов в органах семян пшеницы сорта Омская 12 после 24 ч замачивания зерен при разных температурах

Орган

ПО, мкМ/мин г.с.м.

ПОЛ, нМ/ г.с.м.

АО, мкг/г.с.м.

Температура, С

5

23

5

23

5

23

Сухое зерно

3,70±0,21

3,60±0,25

25,3±1,8

21,8±1,1

85,2±3,2

88,3±3,8

Оболочка семени

0,44±0,03

0,25±0,02

23,4±1,5

25,5±1,6

160,7±12,1

176,2±13,4

Эндосперм

0,42±0,03

0,28±0,03

19,6±1,2

20,7±1,3

133,3±6,5

124,3±11,3

Щиток

22,2±0,12

21,7±0,11

55,6±2,3

71,6±3,4

256,4±15,2

256,4±18,8

Зародыш

59,3±0,45

39,0±0,32

95,3±5,4

117,4±8,5

398,4±24,7

285,7±21,5

По-видимому, повышение всхожести при низкотемпературном замачивании семян обусловлено тем, что ведущим звеном этой системы являются процессы ПОЛ, запускающие у покоящихся организмов основные процессы жизнедеятельности. Таким образом, набухание и прорастание семян сопровождается активированием ПОЛ, изменением в концентрации АО и повышением активности ПО.

Изучение влияния температуры на кинетические и структурные свойства ферментов позволит понять молекулярную природу приспособления организма к меняющимся факторам окружающей среды.

Показано, что различия в величинах Кm по о-дианизидину пероксидазы проростков пшеницы (надземная часть и корни), а также Vm проростков пшеницы семян I (5 С) и II групп (23 С) незначительны. Основные изменения наблюдаются у Кm по аскорбиновой кислоте пероксидазы корней пшеницы зерен I и II групп. Величины Кm зерен I группы выше в 1,5-2 раза, по сравнению с зернами II группы. Значения Vm по ОДН и по АК пероксидазы корней пшеницы зерен I группы в 1,5-2 раза выше, чем корней пшеницы зерен II группы. Тогда как Km no AK пероксидазы корней пшеницы зерен II группы в 2-7 раз ниже, чем у ПО надземной части проростков этой же группы.

Пероксидаза обладает широкой субстратной специфичностью, поэтому катализ определяется сродством его к субстрату. Разные субстраты конкурируют между собой за фермент, и можно ожидать, что изменение каталитических характеристик приведет к накоплению или быстрому окислению биологически активных веществ. Таким образом, результаты исследования показали, что изменение не только активности, но и каталитических свойств ПО в семенах является одним из механизмов регуляции процесса прорастания. Наблюдаемое in vivo взаимное влияние между антиоксидантами и пероксидазой обусловлено тем, что низкомолекулярные антиоксиданты являются субстратами пероксидазы.

2.3.2. Роль пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов в защите проростков от окислительного стресса

Поскольку ПО и АО входят в единую систему защиты растений от окислительного стресса, изучено их участие в регулировании уровня ПОЛ на 3-5 сутки роста проростков пшеницы. Показано, что в надземной части проростков пшеницы уровень АО понижается на 4-5 сутки в 1,4-1,5 раза, при повышении активности пероксидазы в 1,8 раза. В этот период контроль над уровнем ПОЛ в побегах резко снижается, что проявляется в возрастании содержания МДА в 1,5 раза. В корнях проростков пшеницы на 4-й день прорастания уровень ПОЛ возрастает в 1,5 раза, при этом содержание АО и активность пероксидазы понижаются в 2,4 и 1,2 раза соответственно.

Таким образом, контроль за уровнем ПОЛ в проростках пшеницы осуществляют как низкомолекулярные антиоксиданты, так и пероксидаза. При этом ведущая роль в регулировании ПОЛ в надземной части преимущественно принадлежит низкомолекулярным антиоксидантам, где за счет активного фотосинтеза идет их накопление. В корнях эта функция возложена на пероксидазу, высокая активность которой обеспечивает поддержание определенного уровня ПОЛ.

Активность ПО в проростках пшеницы, семена которых замачивали при 5 С и 23 С, проявлялась в своеобразной динамике и зависела от природы исследуемых частей пшеницы. Отмечался линейный рост активности пероксидазы в зерне с небольшим опережением у зерен II группы. Зависимости активности пероксидазы надземной части проростков пшеницы имели вид "качелей" с постепенным снижением в первые 3-4 дня, а затем повышением к 7-му дню прорастания проростков. Причем более высокие показатели активности пероксидазы были у семян II группы. В корнях семян II группы в первые 2-3 дня понижалась активность пероксидазы и только на 7-ой день отмечался ее рост. Зависимость активности ПО у корней семян I группы принимала вид затухающих колебаний с возрастанием активности на 3-й и 6-й день и понижением к седьмому дню прорастания корней до нормы. Причем активность ПО в корнях семян I группы была 1,5-2,5 раза выше, чем у корней семян II группы. Мотивацией к повышению активности пероксидазы является проявление компенсаторных антиоксидантных механизмов, направленных на предотвращение развития окислительного повреждения тканей, вызванных воздействием низких температур.

Таким образом, антиоксиданты и пероксидаза входят в единую систему антиоксидантной защиты растений, где выполняют строго специализированные функции. Пероксидаза, являясь окислительно-восстановительным ферментом, контролирует уровень перекиси водорода и антиоксидантов в семенах и проростках пшеницы, а АО накапливаясь в тканях, участвуют в реакциях подавления образования свободных радикалов, кроме этого могут регулировать активность пероксидазы, осуществляя общий контроль за деятельностью системы антиоксидантной защиты.

2.4. Биохимические процессы и антиоксидантный статус при различных режимах аэрации

При производстве пивоваренного солода все большей популярностью пользуется анаэробное солодоращение, которое имеет ряд преимуществ: снижается расход питательных веществ на дыхание и рост, сокращается время солодоращения при достаточном накоплении ферментов, резко активируется пуллуланаза, улучшаются технологические свойства солода и др. (Карпенко и др., 2000).

Изменение активности оксидоредуктаз при солодоращении ячменя представлены в таблице 10. Активность оксидазных ферментов возрастала в течение всего времени проращивания. Следует отметить, что активность окислительных ферментов в солодовых гусарах гораздо выше, чем в зерне. Наибольший пик ПОЛ наблюдается на 6-7 сутки солодоращения.

Известно, что из-за нарушения метаболических систем, сахара в анаэробных условиях не могут полноценно использоваться в качестве энергетических соединений (Чиркова, 2002). Возрастание концентрации низкомолекулярных АО в конце солодоращения обусловлено образованием в процессе гидролиза восстанавливающих углеводов, обладающих антиоксидантными свойствами. 

Активность ПФО незначительно возрастает в условиях начинающейся гипоксии. В изменении активности пероксидазы наблюдается резкий скачок после первых суток пребывания в гипоксии. Длительное нахождение солода в анаэробных условиях приводит к снижению активности как антиоксидантных ферментов, так и активности терминальных оксидаз на фоне накопления продуктов перекисного окисления липидов.

Таблица 9  - Изменение антиоксидантного статуса и интенсивности перекисного окисления липидов при аэробном (Аэр) и анаэробном (Ана) солодоращении ячменя сорта Дворан

Про-раста-ние, сутки

МДА,

мкМ/г с.в.

АО,

мкг/г.с.в.

СОД,

ед.акт./г.с.в.

ПО,

мкМ/мин

г.с.в.

ГР,

мкМ/мин

г.с.в.

Аэр

Ана

Аэр

Ана

Аэр

Ана

Аэр

Ана

Аэр

Ана

Зерновка

1

2

3

4

5

6

7

8

0,064

0,113

0,144

0,101

0,256

0,271

0,247

0,277

-

-

-

0,180

0,311

0,404

0,370

0,303

175,2

216,1

268,5

376,1

455,4

612,7

546,2

410,2

-

-

-

275,4

544,1

503,2

550,7

455,3

11,3

16,6

18,1

20,0

21,3

20,1

21,3

22,5

-

-

-

23,4

25,4

24,6

24,0

21,7

17,6

21,0

26,2

23,6

35,5

46,4

57,1

46,7

-

-

-

33,2

47,6

34,5

39,3

34,0

0,8

1,7

1,0

0,7

0,7

0,4

0,4

0,1

-

-

-

1,5

1,6

1,0

0,6

0,2

Солодовые ростки

3

4

5

6

7

8

0,173

0,177

0,221

0,238

0,260

0,301

-

0,220

0,404

0,487

0,511

0,573

176,1

153,7

110,0

57,2

54,5

51,7

-

93,2

44,4

40,5

31,1

33,4

38

55

60

57

54

61

-

74

70

48

46

23

167,5

194,4

207,2

261,3

240,1

237,1

-

277,4

303,4

322,1

304,6

260,6

1,4

1,0

0,7

0,4

0,4

0,3

-

2,1

0,4

0,1

0,2

0,1

Активность АДГ колебательно снижалась в течение всего времени прорастания ячменя в аэробных условиях, с кратковременным подъемом активности в солодовых ростках на 4 сутки. Активность Г6ФДГ резко возрастала в гусарах на 3 сутки, а затем постепенно снижалась. Активность дегидрогеназ в течение первых двух суток нахождения в условиях гипоксии постепенно возрастала. Равновесие алкогольдегидрогеназной активности в первые двое суток анаэробиоза сдвинуто в сторону образования этанола, который может служить в условиях стресса энергетическим субстратом для клеток, регулировать интенсивность ПОЛ и проницаемость клеточных мембран. Известно, что для поддержания высокой скорости гликолиза необходимо непрерывное реокисление восстанавливающихся в ходе гликолтического процесса коферментов. В условиях гипоксии, когда электрон-транспортная сеть митохондрий отключена, окисление НАДН может происходить в конечных реакциях спиртового брожения. Следовательно, сдвиг равновесия реакции в сторону образования эндогенного этанола является одним из механизмов реактивности системы на стресс.

Своеобразная динамика падения активности оксидаз и дегидрогеназ указывает на разобщение метаболических процессов при длительной гипоксии из-за накопления продуктов анаэробного окисления веществ и перекисного окисления липидов.

При гипоксии повышается значение низкомолекулярных АО, чья избыточность и относительная свобода миграции в клеточной и тканевой среде выступает на передний план (Мерзляк, 1989). Показано, что в первые сутки анаэробного солодоращения снижение концентрации низкомолекулярных АО сопровождалось накоплением продуктов ПОЛ. Максимальное содержание АО наблюдается на 6-7 сутки солодоращения. Продолжительное анаэробное солодоращение приводит к разобщению окислительных процессов, снижению антиоксидантной активности и накоплению продуктов ПОЛ. 

2.5. Влияние ультрафиолетового облучения на перекисное окисление липидов и активность антиоксидантной системы

В последние годы предприняты многочисленные попытки, позволяющие выяс­нить метаболическую основу покоя семян и выхода из него, в связи с этим был предложен ряд теорий, из которых все большее при­знание получают те, в которых рассматриваются окислительные процессы, такие, как гликолиз, ЦТК, ПФП. Правда, остается неяс­ным вопрос о природе активации этих процессов, а также о механизмах их блокировки при покое семян (Робертси, Смит, 1982).

Нами показано, что всхожесть семян ячменя зависит не только от продолжительности УФ облучения, но и от степени набухания семян. Кратковременное облучение ячменя в первые часы набухания приводит к повышению всхожести семян. УФ облучение после 12 ч набухания семян не способствует достоверному повышению всхожести. Обращает на себя внимание тот факт, что длительное облучение после 24 ч замачивания приводит к резкому снижению всхожести семян.

Для объяснения биохимического механизма активации прорастания семян ячменя была изучена активность оксидоредуктаз в различных частях, принимающих непосредственное участие в биохимических процессах активации метаболизма. Установлено, что малые дозы облучения могут изменять периодичность возрастания активности ферментов со сдвигом экстремумов на более раннее время. Кратковременное облучение семян в течение 15 мин после двухчасового набухания приводит к резкому повышению активности оксидоредуктаз в зародыше и щитке.

Именно работа анаэробного биохимического окисления важна для выхода семян из состояния покоя. Поэтому активация Г6ФДГ и АДГ в набухающих семенах после кратковременного облучения указывает на то, что УФ провоцирует запуск окислительных процессов на более ранних этапах набухания, способствуя выходу семян из состояния покоя. Высокая активность ПО указывает на возможность участия фермента в окислении коферментов, способствуя, таким образом, протеканию ферментативного процесса с участием дегидрогеназ (Лебедева, Угарова, 1997).  Следует отметить, что воздействие УФ на более поздних этапах набухания, когда влажность уже достигла необходимого уровня, в результате чего активировались различные классы ферментов, приводит к снижению всхожести из-за инактивации ферментов семян с последующим их протеолизом (Арчаков, Мохосоев, 1989).

Нами были отобраны сухие семена, облученные в течение двух и десяти часов. В качестве контроля использовали семена, не подвергавшиеся УФ облучению. Показано, что после УФ облучения в процессе набухания в семенах отмечается резкое возрастание содержание МДА, приводящее к компенсаторному накоплению низкомолекулярных АО. Так, поле двухчасового облучения в набухающих семенах резко повышается концентрация МДА с последующим снижением к 24 ч. Несколько иная динамика ПОЛ наблюдается в семенах, подвергнутых облучению в течение десяти часов. Интересно отметить, что длительное облучение семян приводит к интенсивной пероксидации липидов в период их набухания.

На основании наших результатов можно сделать вывод о том, что длительное и сильное стрессовое воздействие может привести к понижению всхожести или к полной потере жизнеспособности, тогда как кратковременное облучение активирует окислительные процессы на более ранних стадиях набухания, способствуя запуску программы прорастания семян.

3. Низкомолекулярные антиоксиданты - субстраты и регуляторы активности пероксидазы

3.1. Низкомолекулярные антиоксиданты субстраты растительных пероксидаз

В работе показано, что аскорбиновая кислота является медленно окисляемым субстратом, в стационарных условиях начальная скорость пероксидазного окисления подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Интересно, что пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты может сопровождаться активированием ПО при ее концентрации (22-220 мкМ) и ингибированием фермента при концентрации АК (264-352 мкМ). Эффект активирования и ингибирования отмечался при всех изученных значениях рН (4,0-8,0).

Пероксидазное окисление АК зависит от числа молекул субстрата, взаимодействующих с окисленными формами фермента (Е1 и Е2). При связывании двух и более молекул АК наблюдается активирование фермента. Однако связывание нескольких (6-9) молекул АК ингибирует пероксидазу. Связывание одной молекулы АК с Е1 достаточно прочное, поскольку Кm1 составляет 6,1-11,5 мкМ, что соизмеримо с величинами констант связывания быстро окисляемого субстрата ПО о-дианизидина, у которого Кm при рН 3,7-7,0 составляет 11-20 мкМ. Дополнительное связывание других молекул АК в 40-50 раз хуже. Причем Кm связывания субстрата с окисленными формами фермента мало зависит от рН. Если с ферментом связываются более одной молекулы субстрата, то последующее каталитическое превращение АК улучшается. Количество связавшихся молекул, ингибирующих фермент, зависит от рН.

Следует отметить, что при окислении медленно окисляемых субстратов, таких как аскорбиновая кислота, в пероксидазных реакциях заложен сложный регуляторный механизм, имеющий биологическое значение. При связывании двух молекул АК процесс пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты будет ускоряться, а избыток аскорбиновой кислоты понижает каталитическую активность фермента. По-видимому, данный регуляторный механизм обеспечивает выполнение избирательной антиоксидантной функции пероксидазы в растениях.

В зависимости от концентрации фенольные соединения оказывают либо ингибирующее, либо стимулирующее действие на рост и длительность покоя. Нами изучено индивидуальное пероксидазное окисление гидрохинона - классического фенольного антиоксиданта в широком диапазоне рН и концентраций. Показано, что реакция пероксидазного окисления гидрохинона характеризуется высокими kсat, (1220-2225 с-1), что позволяет отнести этот субстрат к группе быстро окисляемых субстратов ПО, таких как ОДН, у которого kсat при рН 3,7-7,0 составляет 625-3540 с-1. Величина Кm для гидрохинона достаточно низкая и составляет 150-650 мкМ в зависимости от рН, что по величине соизмеримо с константой Михаэлиса для ферроцианида калия. Однако это в 10 раз хуже, чем Кm у ОДН. Кm и kсat, пероксидазного окисления гидрохинона мало зависят от рН. Оптимум каталитической активности фермента приходится на рН 4,5-5,5. Связывание 2-3 молекул субстрата с фермент-субстратным комплексом ингибирует ПО. Количество молекул гидрохинона, ингибирующих фермент, зависит от рН, что возможно, вызвано изменениями в протяженности субстратсвязывающего участка активного центра фермента, уменьшающегося в кислых рН. Индивидуальное окисление гидрохинона происходит без образования фермент-субстратного комплекса с полуокисленным субстратом. Данный механизм может наблюдаться в растениях для окисления различных регуляторов роста.

3.2. Совместное окисление антиоксидантов регуляторный механизм с участием пероксидазы растений

При совместном окислении АК и ГХ, осуществляется упорядоченный процесс окисления субстратов, который определяет преимущественное окисление медленно окисляемого субстрата. Очередность задается тем, что связывание АК с окисленными формами ПО на два порядка лучше, чем гидрохинона.

Предварительное связывание АК в активном центре фермента улучшает в 28-420 раз последующее связывание молекул гидрохинона. Однако, связавшись, гидрохинон не оказывает влияние на связывание второй молекулы АК, что выражается в неконкурентном типе активирования. Присутствие гидрохинона в активном центре фермента способствует ускорению окисления молекул АК в 4-41 раз. Особенно этот эффект проявляется при рН 5,5-7,0. Оптимум активирования приходится на рН 6-7. Если в реакциях индивидуального окисления АК фермент ингибируется при рН 6-7 6-9 молекулами субстрата, то в реакциях совместного окисления АК и ГХ ингибирование ПО возможно двумя молекулами аскорбиновой кислоты.

Катализ для данного фермента определяется сродством его к субстрату (Chance, 1949), поэтому разные субстраты конкурируют между собой за фермент, и можно ожидать, что изменение каталитических характеристик приведет к накоплению или быстрому окислению биологически активных веществ. Поскольку глубина покоя зависит от концентрации ингибиторов роста и низкомолекулярных антиоксидантов, активность ПО оказывает непосредственное влияние на продолжительность этого физиологического состояния.

3.3. Антиоксиданты регуляторы активности пероксидазы растений

Интерес к механизму действия ПО вызван еще и тем, что значительное накопление фенольных антиоксидантов в период покоя, а также под действием стрессовых факторов, приводит к активации окисления ИУК с участием ПО и к торможению роста. В процессе оксидазного окисления ИУК образуются супероксид анион-радикал и катион-радикал ИУК, последний в кислой среде декарбоксилируется, превращаясь в радикал скатола (Gazarian et al, 1996; Савицкий и др., 1998). Предложено, что ПО способна одновременно связывать как перекись скатола, так и молекулу ИУК (Савицкий и др., 1998).

Исследование влияния ИУК на реакции пероксидазного окисления АК позволило установить, что ауксин ингибирует фермент по конкурентному типу при связывании в активном центре фермента одной молекулы аскорбиновой кислоты. В реакциях пероксидазного окисления АК с участием двух и более молекул субстрата ИУК проявляла неконкурентный характер ингибирования. Связывание ИУК с пероксидазой в реакциях конкурентного ингибирования достаточно прочное и составляет 5,4-20,5 мкМ. В реакциях неконкурентного ингибирования ИУК связывается с пероксидазой в 3,2-10,2 раза лучше, чем связывание второй молекулы АК. При этом величины констант ингибирования в реакциях неконкурентного ингибирования при рН 4,5-7,0 для ИУК равны 27,3-34,6 мкМ. Известно, что в области связывания ароматических субстратов могут располагаться аминокислотные остатки: Arg 38, Phe 142 и 143 (Савицкий и др., 1998). При этом место связывания ИУК может находиться в структуре субдомена ауксин-связывающего участка вблизи Тгр 117, который может принимать участие в связывании ИУК пероксидазами растений (Аммосова и др., 1997).

Таким образом, используя ИУК можно предположить, что участком связывания АК является дистальная область активного центра. Связывание ИУК в этой области при низких концентрациях субстрата создает конкуренцию за участок связывания, проявляемую в реакциях пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты, когда в активном центре фермента связывается, по крайней мере, одна молекула субстрата. При связывании двух и более молекул аскорбиновой кислоты с пероксидазой наблюдается ускорение реакции окисления АК, что, вызвано кооперативными взаимодействиями между участками связывания этих двух молекул субстрата.

Изучение реакций совместного пероксидазного окисления ОДН, гидрохинона и ферроцианида калия в присутствии ИУК позволило установить, что ауксин ингибирует ПО в реакции окисления ОДН по конкурентному типу. В реакциях окисления гидрохинона при кислых значениях рН проявлялся неконкурентный характер ингибирования, переходящий при рН>6,5 в смешанный тип. Присутствие ауксина не влияло на пероксидазное окисление ФК.

Конкурентный тип ингибирования реакции пероксидазного окисления о-дианизидина ИУК позволяет предположить, что ОДН и ИУК связываются в одном и том же месте активного центра фермента. При этом связывание ИУК препятствует как связыванию, так и превращению ОДН, тогда как по отношению к гидрохинону тип ингибирования несколько другой. ИУК и гидрохинон связываются в различных местах активного центра, однако, если ИУК связывалась на поверхности фермента, то дальнейшее превращение гидрохинона становится невозможным.

Физиологический механизм торможения прорастания зародыша связан с высоким содержанием ИУК и ингибиторов роста. ИУК может регулировать пероксидазное окисление медленно окисляемого субстрата, имея специфичный участок связывания в составе дистального домена активного центра ПО. По-видимому, избирательность типов ингибирования пероксидазы ИУК обусловлена специализированностью ауксина служить оксидазным субстратом фермента. ИУК может изменять направленность реакций пероксидазы с одного типа на другой, меняя специфичность фермента с пероксидазного на оксидазный, превращая фермент в высокоспецифичную оксигеназу, генерирующую свободные радикалы, необходимость в которых может возникать у растений в процессе развития. Ауксин может выполнять роль "триггера" в реакциях окисления, катализируемых пероксидазой. Реализация действия ИУК, возможно, проявляется при выходе семян из состояния вынужденного покоя. В этот период в семенах резко возрастает активность ПО, которая способна активировать процессы прорастания. Возможным механизмом действия фермента в этих процессах может быть его способность к генерированию свободных радикалов, необходимых для активизации механизмов прорастания.

В экспериментах подробно был изучен механизм влияния низкомолекулярных регуляторов (салициловой кислоты, витамина К, кверцетин, стероидных глкозидов) на окисление антиоксидантов – субстратов пероксидазы. Сложность механизмов пероксидазного окисления субстратов позволяет предположить, что область активного центра фермента разделена на участки, в которых могут упорядоченно связываться и превращаться субстраты. Связывание в регуляторном участке оказывает влияние на протекание каталитического процесса. Последовательное связывание субстратов в этих участках создает условия для управления ферментативным процессом, основанном на принципе корпоративного взаимодействия субстратов.

Фермент является показателем протекания аэробных метаболических процессов в семенах, а его активность увеличивается при их прорастании. Понижение активности ПО служит критерием углубления покоя семян. Поэтому низкомолекулярные АО в высоких концентрациях понижая активность ПО, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижении всхожести. Низкие концентрации субстратов ПО при их совместном присутствии способны активировать фермент, увеличивая скорость протекания аэробных метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть.

4. Влияние анти- и прооксидантов на всхожесть и физиолого-биохимические процессы семян

4.1. Влияние низкомолекулярных антиоксидантов на всхожесть и физиологические процессы семян пшеницы

Нами изучено влияние на всхожесть семян антиоксидантов различных по строению, являющихся субстратами гемсодержащей пероксидазы. Обладая разным механизмом действия, они в малых концентрациях активировали прорастание семян, а в больших - понижали их всхожесть. При этом проявлялась индивидуальная чувствительность семян пшеницы к используемым соединениям. Низкие концентрации строфантина, аскорбиновой кислоты, норадреналина, салицилата натрия, хлорпромазина и этанола повышали всхожесть семян пшеницы на 15-20%. Тогда как высокие концентрации исследуемых соединений наоборот понижали их всхожесть.

В зависимости от строения антиоксиданты могут регулировать протекание метаболических процессов, активировать или ингибировать различные ферменты, влиять на проницаемость мембран клеток. Нет сомнений в том, что наряду с участием в ингибировании действия свободных радикалов, антиоксиданты как соединения, относящиеся к различным классам химических веществ, могут по-разному оказывать существенное влияние на рост и развитие растений.

4.2. Действие аскорбиновой кислоты и гидрохинона на физиолого-биохимические процессы семян

Набухание семян в течение 24 ч в растворах АК и ГХ различных концентраций приводит к понижению их всхожести при одновременном уменьшении активности пероксидазы, которая коррелирует с возрастанием содержания в семенах пшеницы АК и ГХ. Установлена положительная корреляция между всхожестью семян и активностью ПО, которая находится в обратной зависимости от содержания АО в семенах пшеницы. Высокие экзогенные концентрации АК и ГХ могут ингибировать пероксидазу семян пшеницы, понижая их всхожесть.

Действие высоких концентраций АК и ГХ выражается в снижении всхожести семян пшеницы на 8-15%. Замачивание семян в 1 М растворе АК приводило к понижению активности пероксидазы в корнях и надземной части на 2-е сутки прорастания до 30 и 23%, на 3-и - 55 и 45%, на 4-е - 55 и 70%, а на 6-е - 62 и 87% соответственно. Набухание семян пшеницы в растворах 50 мМ гидрохинона снижало активность пероксидазы в корнях и надземной части проростков на 2-е сутки прорастания до 15 и 10%, на 3-и - 20 и 17%, на 4-е -27 и 19%, а на 6-е - 45 и 42% соответственно. Тогда как набухание семян пшеницы в растворах низких концентраций АК и ГХ практически не влияло на активность пероксидазы в семенах.

Пероксидаза, алкогольдегидрогеназа и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа играют важную роль в покое и прорастании семян пшеницы. В прорастающих семенах активность пероксидазы возрастает, а активность АДГ снижается. У непроросших семян активность АДГ повышается в 2,5-5,5 раза, при понижении активности пероксидазы в 2,8-3,5 раза по сравнению с прорастающими семенами. Высокая разница в величинах активности ферментов указывает на разную степень их участия в механизмах прорастания семян пшеницы. Показано, что независимо от концентрации используемых антиоксидантов активность АДГ и Г6ФДГ в семенах практически не изменялась после 24 ч замачивания их в растворах АК и ГХ.

Выполненные исследования по изучению эндогенного содержания АК в сухих и набухших семенах подтверждают участие аскорбиновой кислоты в регулировании покоя. Показано, что АК в непроросших семенах пшеницы на протяжении всего срока прорастания сохраняется на высоком уровне, что в 1,5-1,8 раз выше, чем в сухих семенах. Отмечается явная тенденция к понижению содержания АК в проклюнувшихся семенах и в проростках пшеницы по сравнению с уровнем этого антиоксиданта в непроросших семенах. На четвертые сутки прорастания в надземной части и корнях проростков пшеницы уровень АК понижается в 4 раза. Эти изменения в содержании АК могут служить подтверждением участия эндогенных антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян пшеницы.

Таким образом, понижение активности пероксидазы высокими концентрациями АО способствует углублению покоя семян, а активирование фермента - ускоренному их выходу из состояния покоя и быстрому прорастанию. Насыщая зерно регуляторами, можно добиваться повышения посевных качеств, а также сопротивляемости семян и растений к экзогенным неблагоприятным факторам. Обработка семян пшеницы биологически активными веществами в течение первых двух часов будет способствовать повышению их всхожести.

4.3. Влияние растительного гликозида на всхожесть и физиологические процессы семян

Замачивание и проращивание семян проводили в растворах строфантина 0,025 - 250 мкг/мл. Из опытов следует, что строфантин может избирательно влиять на всхожесть и рост вегетативной массы проростков. Высокие концентрации строфантина оказывают сильное угнетающее действие на всхожесть семян овса и караганы независимо от условий замачивания и проращивания. Тогда как эти же концентрации строфантина на семена ячменя Неван и пшеницы сортов Скороспелка и Якутянка 224 оказывают стимулирующее действие.

Малые дозы строфантина (2,5-0,025 мкг/мл) на семена всех видов оказывали преимущественно стимулирующее действие, повышая всхожесть на 15-30% и увеличивая вегетативную массу проростков. Причем следует отметить, что как ингибирующий, так и активирующий эффекты строфантина проявляются особенно сильно при предварительном замачивании семян в растворе. Для семян овса и караганы при замачивании и проращивании в растворе строфантина отмечается ингибирующий эффект, который аддитивно возрастает, если эти два действия производятся последовательно. Активация всхожести семян малыми дозами строфантина наблюдалась, в основном, если семена проращивались в растворе.

Таким образом, действие строфантина в отношении семян специфично и избирательно в зависимости от вида растения. Накопление СГ в семенах ячменя и пшеницы может активировать скорость протекания метаболических процессов, способствуя выходу их из состояния гипобиоза. Для семян овса и караганы такое повышение гликозидов наоборот приводит к снижению уровня метаболизма и углублению покоя.

4.4. Участие аскорбиновой кислоты и растительных гликозидов в формировании гипобиотического состояния семян

Установлено, что содержание СГ и АК в семенах различных растений сильно колеблется. Резкое понижение стероидных гликозидов в семенах зимой, когда наблюдается углубление состояние гипобиоза, при незначительном понижении аскорбиновой кислоты, может свидетельствовать о различной их роли. Аскорбиновая кислота является сырьевым соединением клеток, то есть расходуется во время протекания метаболических процессов, сильное понижение ее концентрации в семенах может привести к снижению окислительно-восстановительного потенциала гипобиотической системы, вследствие чего семенам будет трудно выйти из покоя весной и это способствует углублению вынужденного покоя. Гликозиды вместе с фитогормонами служат регуляторными веществами, влияющими на процессы деления и роста клеток. Понижение их концентрации будет способствовать углублению покоя. Действие гликозидов осуществляется через рецепторы клеток, поэтому при выходе из вынужденного покоя семенам достаточно малых концентраций этих соединений. Значительное понижение концентрации СГ в семенах зимой является необходимым условием поддержания покоя.

Проведенное изучение содержания аскорбиновой кислоты и гликозидов у различных видов растений позволило установить, что содержание аскорбиновой кислоты в различных частях растений распределяется равномерно. Гликозиды, в основном накапливаются в плодах, листьях, цветках и очень незначительно в корневой системе. Неравномерное распределение этих функционально активных соединений в различных органах растений вызвано их несколько различной биологической ролью. По-видимому, стероидные гликозиды преимущественно выполняют регуляторную роль, поэтому их накопление происходит в активно вегетируюших частях растения. Аскорбиновая кислота распределяется равномерно, выполняя функцию пластического материала.

Таким образом, возрастание содержания СГ всегда отмечается при активации ростовых процессов в семенах, а их понижение связано с углублением гипобиотического состояния. Высокое содержание АК в покоящихся семенах обусловлено их низкой метаболической активностью.

4.5. Влияние перекиси водорода на всхожесть и физиолого-биохимические процессы семян

Перекись водорода – один из регуляторов, применяемых для обеззараживания и стимуляции прорастания семян высших растений. Сам факт того, что основным местом продукции АФК в семенах являются митохондрии (Мерзляк, 1989), указывает на взаимосвязь свободно-радикальных процессов с процессами дыхания и прорастания семян.

Наибольший процент проросших семян отмечен при 24 ч замачивании в 1%-ном растворе перекиси водорода. Известно, что динамика проникновения воды и растворенных в ней веществ имеет колебательный характер, поэтому мы проследили зависимость всхожести семян от продолжительности замачивания их в 1%-ом растворе перекиси водорода. Наибольший процент проросших семян был отмечен при замачивании их в течение первых шести часов.

Таблица 10 - Изменение антиоксидантно-прооксидантного статуса в зародышах при замачивании семян ячменя сорта Одесский 115 в перекиси водорода

Набуха-ние, ч

Супероксид, мкМ/г

МДА,

мкМ/г

АО,

мкг/г

СОД,

ед.акт./г

КАТ,

мМ/мин . г

ПО,

мкМ/мин . г

I

II

I

II

I

II

I

II

I

II

I

II

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

24

0,055

0,064

1,70

3,44

3,21

3,57

4,13

5,22

5,71

6,00

6,23

0,17

2,14

3,25

5,31

5,52

6,11

5,72

6,42

6,64

6,51

6,72

0,035

0,067

0,071

0,075

0,073

0,078

0,086

0,084

0,095

0,111

0,141

0,040

0,077

0,082

0,083

0,091

0,084

0,097

0,100

0,121

0,120

0,144

85,2

92,4

98,1

120,4

118,1

157,5

183,4

180,1

187,5

202,7

221,4

80,4

88,5

115,3

165,1

171,5

173,4

180,4

175,7

182,7

201,6

210,2

1,2

1,5

2,0

1,8

1,5

2,8

3,2

3,0

4,5

6,2

8,5

1,4

2,2

3,6

2,0

2,7

4,0

4,2

5,1

5,6

7,0

7,7

0,22

0,30

0,32

0,28

0,35

0,46

0,40

0,57

0,72

1,23

1,48

0,41

0,48

0,51

0,57

0,50

0,61

0,65

0,76

1,13

1,61

2,30

24,5

22,3

47,2

42,5

47,4

49,2

51,0

57,3

60,0

57,5

65,2

31,2

41,3

38,1

35,4

46,3

51,2

55,2

60,0

58,1

62,2

60,4

Примечание: I – замачивание семян проводили в воде; II – в 1%-ом растворе перекиси водорода.

Резкое возрастание количества супероксида  в зародыше отмечено в первые 8 ч набухания в растворе перекиси водорода (табл. 10). Затем его содержание повышалось незначительно. Возможно, сдерживающим элементом оказывались низкомолекулярные антиоксиданты, концентрация которых возрастала по мере активации гидролитических ферментов. Динамика содержания супероксида в первые часы замачивания коррелирует с увеличением концентрации МДА и активацией антиоксидантных ферментов.

По-видимому, усиление генерации АФК и активации ПОЛ - один из механизмов активации метаболических процессов при выходе семян из покоя. Кроме того, АФК обладают способностью изменять проницаемость и физико-химические свойства мембран, что способствует более эффективному проникновению воды и вымыванию ингибиторов роста. Интересно отметить, что повышение продукции супероксида коррелирует с достижением необходимой влажности зародыша, когда активируются оксидазные окислительные процессы, выступающие дополнительным источником АФК.

Высокая активность СОД отмечена только после 12 ч набухания. Можно предположить, что низкая активность СОД в первые часы набухания, приводящая к активации окислительных процессов с участием АФК, объясняется недостаточной оводненностью зародыша. Повышение активности каталазы в первые часы набухания в растворе перекиси водорода приводило к дополнительному снабжению зародыша кислородом, образующимся в ходе реакции. Возрастание активности ПО обусловлено ее участием в процессах пероксидазного окисления ингибиторов роста. Возможно, участие перекиси и пероксидазы в совместном окислении ингибиторов и дыхательных коферментов - один из механизмов активации биохимических процессов при прорастании семян растений.

При изучении динамики активности основного фермента пентозофосфатного пути - Г6ФДГ, для которого необходим кофермент НАДФ+, оказалось, что замачивание семян в Н2О2 приводит к изменению периодичности возрастания его активности в зародыше со сдвигом экстремумов в более раннее время. Колебательное снижение активности Г6ФДГ после 8 ч набухания объясняется повышением аэрации зародыша и активацией митохондриальных ферментов.

В последние годы появились экспериментальные данные, указывающие на положительные функции АФК, в том числе сигнальную роль в контроле апоптоза (Бакиева и др., 2001), а также защитную в условиях биотического и абиотического стресса (Аверьянов, 1991). АФК являются мощным вторичным мессенджером регуляции дифференцировки пластид и аппарата Гольджи, клеточной дифференцировки, роста и развития растений (Шорнинг и др., 2000; Минибаева, 2004). Таким образом, активные формы кислорода, обладающие высокой энергетической способностью и свободно мигрирующие в клетке, принимают непосредственное участие в начальных этапах прорастания семян, находящихся в физиологическом покое. Активации окислительных процессов при набухании семян, приводящих к образованию активных кислородных метаболитов, дает возможность выявить механизм участия анти- и прооксидантной системы при прорастании семян растений.

5. Перспективы применения антиоксидантов в производстве солода

5.1. Антиоксиданты как показатель оценки качества зерна и биохимических процессов при производстве солода

Нами исследовано содержание низкомолекулярных антиоксидантов и продуктов перекисного окисления липидов в зерновках ячменя, отвечающего требованиям ГОСТ 5060-86, и ячменя с низкой способностью прорастать (табл. 11).

Установлено, что семена непроросшие в течение всего периода солодоращения, имели низкую активность пероксидазы и высокое содержание низкомолекулярных АО. Небольшое снижение концентрации АО в непроросших семенах можно объяснить их частичным вымыванием и расходованием на окислительные процессы. Содержание МДА в прорастающих семенах значительно выше, чем в непроросшем ячмене. Следует отметить, что непроросшие семена проявляли положительную реакцию при исследовании их на жизнеспособность тетразолево-топографическим методом. В непроросших семенах дыхание крайне ослаблено, отмечались изменения в составе жирных кислот и функционально активных веществ мембран митохондриальной системы (Соболев, Жданова, 1982), за счет которых обеспечивается разобщение механизмов окислительного фосфорилирования, при сохранении активности окислительных процессов (Скулачев, 1996).

Снижение концентрации низкомолекулярных АО на начальных этапах набухания указывает на то, что АО используются семенами в качестве запасного пула, позволяющего сдерживать свободно-радикальные процессы на физиологическом уровне. Сравнивая значения ПОЛ и АО в прорастающих семенах ячменя видно, что при активации метаболизма и ростовых процессов повышается уровень продуктов перекисного окисления липидов и низкомолекулярных антиоксидантов. Набухание и прорастание семян сопровождается активированием ПОЛ, изменением в составе антиоксидантов и повышением активности пероксидазы. Повышение концентрации низкомолекулярных АО на 2 и 4 сутки прорастания объясняется активацией гидролитических процессов, выступающих в качестве поставщиков пластичного материала и соединений-антиоксидантов.

Таблица 11 – Состояние антиоксидантной системы и интенсивность перекисного окисления липидов в ячмене с различной всхожестью Одесский 115

Солодора-щение, сут

Непроросшие

Проросшие

МДА, мкМ/г с.в.

АО,

мкг/г с.в.

ПО, мкМ/мин г с.в.

МДА, мкМ/г с.в.

АО,

мкг/г с.в.

ПО, мкМ/мин г с.в.

1

0,057±0,02

227±5,6

1,3±0,2

0,171±0,01

182,1±8,1

12,8±1,0

2

0,060±0,03

230±5,1

2,4±0,1

0,184±0,02

208,3±10,1

25,4±1,2

3

0,061±0,02

202±6,2

2,1±0,1

0,153±0,01

207,6±10,0

32,4±1,3

4

0,053±0,01

200±3,4

2,5±0,2

0,177±0,01

212,4±9,4

17,0±1,1

5

0,065±0,02

185±3,2

1,8±0,1

0,164±0,02

201,6±6,7

28,2±2,1

6

0,066±0,02

166±2,8

3,1±0,3

0,185±0,01

194,1±6,7

32,1±2,3

7

0,061±0,01

133±3,7

3,3±0,1

0,201±0,03

154,2±5,6

35,4±3,0

В прорастающих семенах происходит переключение дегидрогеназных реакций на аэробные, которые могут осуществляться с помощью эндогенных функционально активных веществ. Следует выделить ряд особенностей в проявлении активности пероксидазы в покоящихся и прорастающих семенах. Так, например, в зерновках, обладающих высокой способностью к прорастанию, выявляется высокая активность ПО, коррелирующая с уровнем их жизнеспособности. Низкая активность фермента свидетельствует о понижении жизнеспособности и всхожести семян.

Среди технологических методов оценки качества сырья и готовой продукции биохимические методы имеют приоритетное значение потому, что они позволяют выявить изменения до того, как происходят морфологические и даже функциональны нарушения. Таким образом, активность антиоксидантной системы может быть использована как дополнительный критерий оценки качества зерна.

5.2. Изменение активности антиоксидантной системы и процессов перекисного окисления липидов при производстве светлого пивоваренного солода

В производственных условиях проводили замачивание зерна в непрерывном потоке воды и воздуха. Следует отметить, что низкая температура замачивания (14 °С), а также снабжение кислородом, приводит к возрастанию окислительных процессов в клетке и образованию продуктов ПОЛ. Содержание МДА при набухании возрастает в первые 24 ч замачивания, а затем постепенно снижается. Пик повышения концентрации низкомолекулярных антиоксидантов в ячмене приходится на 36 часов набухания. Во-первых, это обусловлено растворением фенольных ингибиторов роста; во-вторых, активацией гидролитических процессов, в ходе которых образуются аминокислоты и углеводы, обладающие антиоксидантными свойствами. 

Активность СОД постепенно повышается в течение всего времени набухания ячменя. Динамика активности ферментов, утилизирующих перекись водорода, - КАТ и ПО постепенно возрастает в течение всего периода замачивания. Возможно, возрастание активности этих ферментов обусловлено участием в окислении энергетических соединений и ингибиторов роста, накопление которых наблюдается во время покоя семян. Возрастание активности ГР и последующее постепенное ее снижение в процессе замачивания объясняется тем, что для катализа этому ферменту необходим кофермент НАДФН, содержание которого снижется при возрастании аэробных процессов. 

Проращивание ячменя проводили в ящичной солодовне, используя для перемешивания ковшовый ворошитель. При солодоращении ячменя содержание МДА в зерновке резко возрастает на 5-е и 8-е сутки проращивания. С целью снижения потерь на дыхание и ростовые процессы солодоращение ведут при слабом освещении, пониженной температуре и высокой влажности. Из этого можно заключить, что замедленный рост и отсутствие освещения не способствует образованию низкомолекулярных АО с участием фотосинтетического аппарата проростка. Поэтому возрастание в зерновке концентрации низкомолекулярных АО на 2-3-е и в гусарах на 4-е сутки с постепенным снижением, объясняется накоплением низкомолекулярных соединений, образующихся в процессе биодеградации белков, полисахаридов и липидов (Тарчевский, 1992).

Динамика активности СОД в гусарах и зерновке постепенно повышается в первые 4 дня. Причем более высокие показатели активности ферментов отмечались в гусарах. Каталаза содержится в ячмене в незначительном количестве, но быстро накапливается при проращивании, причем скорость накоп­ления явно зависит от длительности солодоращения. Активность КАТ возрастает меньше по сравнению с активностью пероксидазы, так как сродство фермента к малым концентрациям перекиси водорода ниже, чем у пероксидазы (Андреева, 1988). Постепенное снижение активности ГР в зерновке и гусарах можно объяснить преобладанием аэробных процессов над анаэробными, в процессе чего, снижается концентрация НАДФН в клетке.

Сушку проводили в производственных условиях по режиму ЛСХА. Показано, что на начальных этапах сушки наблюдается возрастание активности антиоксидантных ферментов с последующим ее снижением (табл. 12). Следует отметить, что ферменты обладают различной термоустойчивостью. Наибольшая активность при сушке сохраняется у ПО, в молекуле которой находятся два иона кальция, придающие ей стабильность (Угарова, Лебедева, 1996). Инактивация ГР начинается уже при 55 °С. Возможно, это обусловлено тем, что в активном центре данного фермента содержатся SH-группы, окисление которых приводит к инактивации (Smith, 1989). При сравнении динамики накопления низкомолекулярных АО и МДА обращает на себя внимание тот факт, что при подсушивании наблюдается снижение концентрации МДА на фоне возрастания концентрации антиоксидантов. Возможно, повышение концентрации антиоксидантов обусловлено активацией гидролитических ферментов, в результате чего образуются соединения, обладающие антиоксидантной активностью.

Таблица 12 – Активность антиоксидантной системы и содержание продуктов перекисного окисления липидов при сушке солода

Температура, ° С

СОД, ед.акт./г

КАТ,

мМ/мин г

ПО, мкМ/мин. г

ГР, мкМ/мин г

АО, мкг/г

МДА, мкМ/г

18

31±3,2

0,38±0,02

45,1±2,1

0,55±0,03

350,4±11

0,19±0,01

55

34±3,0

0,44±0,02

83,3±3,3

0,07±0,001

410,1±10

0,17±0,01

80

30±3,0

0,18±0,01

72,7±5,1

0

400,8±12

0,23±0,02

85

0

0

36,2±4,0

0

122,2±8,1

0,24±0,02

Свежий солод, поступающий из сушки, обычно не используется сразу в пивоваренном производстве, так как имеет влажность, недостаточную для эффективного дробления. При хранении солода происходят физические и химические изменения, облегчающие его последующую переработку. Кроме того, часть ферментов еще не восстановилась после тепловой обработки.

Нами установлено, что в первые четыре месяца хранения содержание антиоксидантов возрастает на 12-16 % по сравнению с исходным значением. Повышение концентрации АО при хранении солода обусловлено впитыванием влаги из окружающей среды и небольшой активацией гидролитических ферментов. Хранение солода в течение десяти месяцев не приводило к существенным изменениям концентрации. Достоверное понижение содержания антиоксидантов на 27-34 % наблюдалось после годичного хранения солода. Проведенные исследования указывают на то, что анти- и прооксидантное равновесие является биохимическим показателем технологического процесса производства пивоваренного солода.

5.3. Содержание антиоксидантов в отходах солодовенного производства и перспективы их использования

Наибольшее содержание антиоксидантов наблюдается в солодовых ростках (225,2 мкг/г) и хмелевой дробине (307,4 мкг/г). Высокое содержание антиоксидантов в ростках объясняется их сложным химическим составом, включающим в себя аминокислоты, фенольные соединения и витамины, которые входят в группу природных антиоксидантов. Следует также отметить, что при проращивании активируются синтетические процессы, приводящие к образованию разнообразных соединений, обладающих антиоксидантной активностью.

Результаты эксперимента указывают на то, что замачивание ячменя в течение первых 6-8 ч в экстрактах солодовых ростков приводит к повышению способности прорастать. Проведенные исследования показали, что замачивание зерна в экстрактах в первые 6-8 ч набухания повышают активность дегидрогеназ в 1.2, пероксидазу – 1.3 раза по сравнению с контролем. Наблюдаемое повышение всхожести и активности дыхательных ферментов объясняется тем, что биологически активные вещества солодовых ростов активируют метаболические процессы на начальных этапах набухания зерна, выступая в качестве природных стимуляторов роста. Таким образом, использование экстрактов из солодовых ростков позволит снизить производственные потери сухих веществ, а также сократить время проращивания пивоваренного ячменя.

ВЫВОДЫ

  1. Гипобиотическое состояние семян в условиях естественного хранения сопровождается низкой активностью окислительных процессов и антиоксидантной системы. Длительное хранение семян зерновых культур приводит к снижению жизнеспособности, всхожести и активности оксидоредуктаз на фоне повышения продуктов перекисного окисления липидов. Естественное старение семян сопровождается снижением активности антиоксидантной системы.
  2. Неблагоприятные условия хранения способствуют накоплению продуктов перекисного окисления липидов и активации антиоксидантной системы защиты. Снижение жизнеспособности и всхожести семян коррелирует с понижением активности антиоксидантной системы и накоплением продуктов перекисного окисления липидов.
  3. Набухание и прорастание семян зерновых культур сопровождается активацией анаэробных дегидрогеназ и ферментов антиоксидантной системы на фоне накопления продуктов перекисного окисления липидов. Содержание низкомолекулярных антиоксидантов в непроросших семенах на протяжении всего срока прорастания сохранялось на достаточно высоком уровне на фоне низкой активности окислительных процессов. При этом пероксидаза необходима для сохранения жизнеспособности семян и инициирования процессов прорастания. Низкая активность фермента у непроросших семян, остающихся в покое, не изменяется, в то время как в прорастающих семенах наблюдается возрастание активности фермента.
  4. Окислительный стресс в процессе замачивания приводит к активации перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы защиты в зародыше и щитке. Кратковременное воздействие стресс-фактора в процессе набухания приводит к повышению всхожести семян зерновых культур.
  5. При прорастании контроль над уровнем ПОЛ в надземной части преимущественно выполняют низкомолекулярные антиоксиданты, а в корнях эта функция возложена на ферменты антиоксидантной защиты. Одним из молекулярных механизмов реакции семян и проростков на действие факторов окружающей среды является изменение каталитических характеристик стрессового фермента - пероксидазы.
  6. Аскорбиновая кислота является медленно окисляемым субстратом, пероксидазное окисление которой в концентрации 22-220 мкМ сопровождается активированием, а в концентрации 264-352 мкМ ингибированием фермента. Эффект активирования и ингибирования отмечался при всех изученных значениях рН (4,0-8,0). При связывании в активном центре двух и более молекул аскорбиновой кислоты активирует фермента, а связывание 6-9 молекул ингибирует пероксидазу. Количество связавшихся молекул, ингибирующих фермент, зависит от рН. Гидрохинон неконкурентно активирует пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты, ускоряя ферментативную реакцию в 4-41 раз. В реакциях совместного пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона ингибирование пероксидазы возможно двумя молекулами аскорбиновой кислоты. Данный регуляторный механизм обеспечивает выполнение избирательной антиоксидантной функции пероксидазы в растениях.
  7. Гидрохинона является быстро окисляемым субстратом пероксидазы (kсat 1220-2225 с-1). Оптимум каталитической активности фермента приходится на рН 4,5-5,5. Связывание 2-3 молекул гидрохинона с фермент-субстратным комплексом ингибирует пероксидазу. Количество молекул гидрохинона, ингибирующих фермент, зависит от рН, что обусловлено изменениями в протяженности субстратсвязывающего участка активного центра фермента, уменьшающегося в кислых рН. Данный механизм может наблюдаться в растениях при окислении различных регуляторов роста. Подробно изучен механизм и определены каталитические константы регуляции активности гемсодержащей пероксидазы растений биологически активными веществами. Предложен механизм участия пероксидазного катализа в покое и прорастании семян, а также в условиях окислительного стресса. Пероксидаза контролирует уровень перекиси и антиоксидантов в растениях; антиоксиданты в малых концентрациях способны повышать активность пероксидазы в реакциях совместного окисления, в высоких – снижать активность фермента, связываясь в активном центре.
  8. Индолил-3-уксусая кислота регулирует пероксидазное окисление субстратов, имея специфический участок связывания в составе дистального домена активного центра фермента. ИУК способна изменять направленность реакции пероксидазы, превращая фермент в высокоспецифическую оксигеназу, генерирующую свободные радикалы, необходимость которых возникает у растений в процессе развития. Углеводы в концентрациях 0,011-0,88 М снижают активность и термостабильность гемсодержащей пероксидазы растений.
  9. Биологически активные вещества в малых концентрациях активировали прорастание семян на 15-20%, а в больших - понижали их всхожесть до 3-11%, при этом проявлялась индивидуальная чувствительность семян зерновых культур к используемым соединениям. Высокие концентрации регуляторов и антиоксидантов могут понижать активность пероксидазы и за счет этого регулировать продолжительность гипобиотического состояния семян зерновых культур.
  10. Одним из физиолого-биохимических механизмов повышения всхожести при воздействии на семена физических и химических факторов является активация окислительных процессов на начальных этапах набухания зерновок с последующим повышением реактивности антиоксидантной системы.
  11. Технологический режим замачивания и солодоращения ячменя влияет на протекание окислительных процессов и активность антиоксидантной системы. Антиоксидантный статус и интенсивность перекисного окисления липидов могут быть использованы как критерий оценки качества зерна и солода.
  12. Отходы солодовенного и пивоваренного производства являются перспективным источником природных биологически активных веществ и могут быть использованы в качестве регуляторов биотехнологических процессов при солодоращении. Наибольшее содержание низкомолекулярных антиоксидантов наблюдалось в хмелевом экстракте и солодовых ростках, которые в перспективе можно использовать для снижения окислительных процессов при солодоращении пивоваренного ячменя.

Рекомендации производству

  1. Низкомолекулярные антиоксиданты - эффективные регуляторы прорастания семян, использование которых позволяет повысить всхожесть, а также сопротивляемость семян и проростков к факторам внешней среды. Полученные данные позволяют предложить наиболее оптимальное время замачивания семян в растворах БАВ, которое по результатам наших исследований приходится на первые четыре часа замачивания.
  2. Предложена принципиальная схема использования отходов солодовенного и пивоваренного производства как доступного источника биологически активных веществ, применение которых позволит регулировать солодоращение и окислительные процессы при производстве солода.

Основные публикации по теме диссертации

  1. Верхотуров В.В. Перекисное окисление липидов и применение антиоксидантов для повышения устойчивости растений к температурному стрессу // Материалы Республиканской научно-практическая конференция. - Якутск: Изд-во ЯГСХА, 2001.-с.70-71.
  2. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Аскорбиновая кислота как медленно окисляемый субстрат пероксидазы // Биохимия. - 1997. - Т.62. - №12. - С. 1686-1690.
  3. Рогожин В.В., Курилюк Т.Т., Верхотуров В.В., Колесова Т.К. Роль пероксидазы и антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян // V-ой Международная конференция "Регуляторы роста и развития растений". - М.: Изд-во ТСХА, 1999. - с. 89-90.
  4. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Влияние антиоксидантов (дигоксина, кверцетина и аскорбиновой кислоты) на каталитические свойства пероксидазы // Биохимия. - 1998. - Т.63. - № 6. - С. 63-68.
  5. Верхотуров В.В., Пинигина Г.В., Соколова О.В. Физиологические проявления действия окислительного стресса у проростков пшеницы // Сборник трудов “Проблемные вопросы Восточно-Сибирского региона”. - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2001.- с.109-111.
  6. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного пероксидазного окисления гидрохинона и о-дианизидина в присутствии пероксидазы // Биохимия.-1998.-Т.63.-№ 12.-С.107-112.
  7. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Влияние температуры, ультрафиолетового излучения и функционально активных веществ на всхожесть семян пшеницы // Известия ТСХА.-1999.-№ 3.-с.105-124.
  8. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного окисления аскорбиновой кислоты и ферроцианида калия перекисью водорода в присутствии пероксидазы // Биоорганическая химия. - 1999.-Т.25.-№ 1.-С.70-73.
  9. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Изменение антиоксидантной системы ячменя при анаэробном солодоращении // Доклады Российской академии с/х наук.-2004.-№ 6.-с.53-55.
  10. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Механизм совместного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона в присутствии пероксидазы // Биоорганическая химия.-1999.-Т.25.-№ 5.-С.377-382.
  11. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Антиоксидантная система в прорастании семян пшеницы // Известия РАН. Сер. биол.-2001.-№ 2.-с.165-173.
  12. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Всхожесть семян мягкой пшеницы под влиянием антиоксидантов // Сельскохозяйственная биология.-2001.-№ 3.-с.73-78.
  13. Верхотуров В.В. Антиоксиданты как регуляторы роста растений // Республиканская научно-практическая конференция. - Якутск: Изд-во ЯГСХА. - 2001.-с.72-73.
  14. Верхотуров В.В., Рогожин В.В. Особенности механизма действия пероксидазы // Сборник трудов химико-технологического факультета “Проблемные вопросы Восточно-Сибирского региона”. - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2001.-с.114-117.
  15. Верхотуров В.В., Соколова О.В., Пинигина Г.В., Рогожин В.В. Действие низкой температуры на состояние антиоксидантной системы проростков пшеницы // Сборник трудов химико-технологического факультета “Проблемные вопросы Восточно-Сибирского региона ”. - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2001.-с.111-114.
  16. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Содержание антиоксидантов в растениях Сибири // Всероссийская научная конференция “Биологически активные добавки и здоровое питание”. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2001.-с.23.
  17. Верхотуров В.В., Пинигина Г.В. Роль низкомолекулярных антиоксидантов и пероксидазы в механизме прорастания семян пшеницы // Сборник научных трудов “Научное сопровождение образовательного процесса агровуза”, Якутск: Изд-во ЯГСХА, 2001.-с.42-43.
  18. Рогожина Т.В., Верхотуров В.В. Влияние моно- и олигосахаридов на активность и стабильность пероксидазы // Сборник научных трудов “Научное сопровождение образовательного процесса агровуза”. - Якутск: Изд-во ЯГСХА, 2001.-с.47.
  19. Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Рогожина Т.В. Пероксидазный катализ многокомпонентных систем (монография).- Изд-во “Сахаиздат”, Якутск, 2003. - 166 с.
  20. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Состояние антиоксидантной системы ячменя при замачивании и солодоращении // Хранение и переработка сельхозсырья.-2003.-№ 9.-с.26-30.
  21. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Изменение антиоксидантного статуса ячменя при производстве пивоваренного солода // Известия ВУЗов. Пищевая технология.-2004.-№ 5-6.-с.30-34.
  22. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Активность некоторых оксидоредуктаз при хранении и солодоращении ячменя // Вестник Российской академии с/х наук.-2004.-№ 2.-с.82-84.
  23. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Изменение активности оксидоредуктаз при производстве светлого пивоваренного солода // Всероссийская научно-техническая конференция “Молодые ученые - Сибири”. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ. 2003.-с.21.
  24. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Характеристика пивоваренных сортов ячменя, выращенных в Восточной Сибири // Сборник трудов Межрегиональной конференции молодых ученых “Пищевые технологии”.- Казань: Изд-во КГТУ. 2004.-с.140-141.
  25. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Окислительные процессы и антиоксидантная система при анаэробном солодоращении ячменя // Хранение и переработка сельхозсырья.-2004.-№ 8.-с.9-12.
  26. Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Рогожина Т.В. Пероксидаза: строение и механизм действия (монография). - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2004. - 200 с.
  27. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Антиоксиданты как критерий оценки качества зерна и солода // Сборник трудов Международной научно-практической конференции “Прогрессивные технологии развития”. - Тамбов: Изд-во ТГТУ, 2004. - с.176-177.
  28. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Перекись водорода как регулятор прорастания ячменя // Сборник материалов научно-практической конференции “Перспективы развития технологии, экологии и автоматизации химических и пищевых производств”. - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2006.-с.98-100.
  29. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Содержание антиоксидантов в отходах солодовенного и пивоваренного производства // Сборник трудов 2-й Международной научно-практической конференции “Составляющие научно-технического прогресса”, Тамбов: Изд-во ТГТУ, 2006.-с.212-215.
  30. Верхотуров В.В. Прикладная энзимология (Учебное пособие). - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2006. – 56 с.
  31. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Антиоксидантная система и окислительные процессы при хранении и солодоращении пивоваренного ячменя // Сборник материалов научно-практической конференции “Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания”.- Иркутск: Изд-во ИрГТУ,.2006.-с.16-18.
  32. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Содержание антиоксидантов в отходах солодовенного и пивоваренного производства и перспективы их использования при получении солода // Экология и промышленность России. – 2006. -№ 10.- с. 15-17.
  33. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Влияние ультрафиолетового облучения на активность оксидоредуктаз ячменя // Зерновые хозяйство. – 2006.-№ 7.-с.22-24.
  34. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Использование природных антиоксидантов для продления сроков хранения растительных масел // Сборник материалов научно-практической конференции “Региональные проблемы сельскохозяйственного производства”. - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2001.-с.71-72.
  35. Верхотуров В.В. Изменение антиоксидантного статуса и перекисное окисление липидов в зерновках ячменя при хранении // Сборник материалов V международной научно-практической конференции ученых Сибирского федерального округа “Современные тенденции развития АПК в России”. - Красноярск: Изд-во КрасГАУ, 2007.-с.375-378.
  36. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Влияние искусственного старения на жизнеспособность семян ячменя // Зерновые хозяйство. – 2007. - № 1. - с.31-32.
  37. Верхотуров В.В. Особенности протекания эколого-биохимических механизмов при хранении зерновых культур // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции “Пищевые технологии”. - Казань: Изд-во КГТУ, 2007.-с.45-48.
  38. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Влияние перекиси водорода на анти- и прооксидантный статус семян ячменя при прорастании // Доклады Российской академии с/х наук.-2008.-№ 1.-с.11-13.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.