WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

РЫКОВА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

ЭКЗОГЕННЫЕ И СЕКРЕТИРУЕМЫЕ КЛЕТКАМИ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С КОМПОНЕНТАМИ КРОВИ В НОРМЕ И ПРИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

03.00.04 – биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Новосибирск – 2009

Работа ституте химической биологии и фунд а выполнена в Инс даментальной медицины СО Р РАН.

Научный доктор хим адемик РАН, й консультант: мических наук, ака профессор Власов Валентин Викторович Официа : ологических наук, профессор альные оппоненты: доктор био Меркулова на а Татьяна Ивановн доктор био ологических наук, профессор Ильичев А евич Александр Алексее доктор био ологических наук Кудаева О а Ольга Тимофеевна Ведущая ГУ Научно кий институт я организация: о-исследовательск онкологии го центра и Томского научног СО РАМН

Защита диссертации состо «___» ____ _____ часов оится _______ 2009 г. в _ на засед онного совета Д дании диссертацио 03.045.01 при Институ ологии и фундамен уте химической био нтальной медицины СО РАН по адрес осибирск, пр-кт ак. Лаврентьева, су: 630090, г. Ново С диссе о иблиотеке Институ химической ертацией можно ознакомиться в би ута биологии и фундаменталь О РАН ьной медицины СО Автореф _ _________ 2009 г.

ферат разослан «___» ___________

Ученый секретарь диссерт а, тационного совета кандида к, доцент Коваль В. В.

ат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Феномен внеклеточных нуклеиновых кислот (внНК), обнаруженный вначале в культуральной среде эукариотических клеток, является универсальным для многоклеточных организмов.

Высокомолекулярные внНК могут появляться во внеклеточном пространстве как при разрушении умерших клеток, так и путем активной секреции в процессе их жизнедеятельности. Несмотря на отсутствие прямых свидетельств о функциональной роли существующих в организме внНК, накопленные к настоящему моменту экспериментальные данные свидетельствуют в пользу их биологической значимости.

ВнНК могут перемещаться между соседними клетками и на дальние расстояния, достигая отдаленных органов и тканей посредставом флоэмного тока у растений и через кровь у животных. В норме внНК присутствуют в плазме крови в невысокой концентрации и в такой форме, которая препятствует их распознаванию как «сигналов опасности» со стороны иммунной системы. Это позволяет предполагать, что в организме существует система метаболизма, направленная на эффективную утилизацию внНК эндогенного происхождения. Нарушения функционирования компонентов этой системы, снижающие эффективность деградации и выведения внНК, вызывают развитие таких патологических состояний, как воспаление и аутоиммунные реакции. Например, предполагают, что пусковым фактором системной красной волчанки (СКВ) могут быть эдогенные внДНК, появляющиеся в результате некротического или нестандартного апоптотического разрушения клеток, которые вызывают ответ иммунной системы (Napirei et al., 2006). В связи с этим изучение механизмов деградации и распределения внНК в крови необходимо для понимания их роли в норме и при патологиях.

Иммунный ответ на НК вирусов и бактерий возникает для защиты многоклеточного организма от чужеродной генетической информации.

Иммуностимулирующая активность CG-содержащих последовательностей ДНК была обнаружена в экспериментах по лечению опухолей с помощью бактериальной ДНК и как побочный эффект при использовании антисмысловых олигонуклеотидов in vivo (Krieg, et al., 2002). Поэтому важной задачей является изучение взаимодействия внДНК с белками плазмы и клеток крови, которые могут опосредовать влияние внДНК на иммунную систему организма. Удобным инструментом для исследования взаимодействия внДНК с биополимерами крови являются реакционноспособные производные олигонуклеотидов, которые позволяют выявлять образующиеся комплексы как in vitro, так и при введении ДНК in vivo (Челобанов и соавт., 2006).

Было показано, что при развитии онкологических заболеваний происходит увеличение количества циркулирующих в плазме внДНК, однако причины, механизмы и последствия этого явления остаются до сих пор неизвестными (Fleischhacker and Schmidt, 2007). В плазме крови раковых больных были обнаружены внДНК, которые характеризовались изменениями, идентичными изменениям ДНК опухоли (Anker, et al., 2003).

Поэтому возникло предположение, что ДНК из клеток опухоли, попадая через кровь в другие органы и ткани, могут проникать в здоровые клетки, трансформировать их и приводить к образованию ближних и удаленных метастазов (теория «генометастазов») (Garcia-Olmo et al., 2005). В настоящее время ведутся исследования передачи опухолевых сигальных молекул между клетками через экзосомы, содержащие мРНК, микроРНК и белки ангиогенеза (Valadi et al., 2007). Накоплены свидетельства о том, что при развитии опухолевых заболеваний происходят изменения в составе циркулирующих в плазме микроРНК, которые предположительно могут играть роль в ингибировании иммунного ответа при раке (Ichim et al., 2008).

Сравнительные исследования внДНК и внРНК крови у здоровых людей и у пациентов с онкологическими заболеваниями разной тяжести необходимы для получения новых знаний о механизмах развития опухолей, а также о клеточном гомеостазе в норме.

Целью настоящей работы являлось выявление факторов, влияющих на метаболизм, распределение в крови и биологические эффекты экзогенных и эндогенных внДНК, определение и количественная оценка эндогенных НК крови в онкогенезе, установление диагностической и прогностической значимости их анализа.

В ходе исследования решались следующие основные задачи:

1. Определение устойчивости экзогенных ДНК и их прозводных в крови, выявление их взаимодействий с белками плазмы и клеток крови in vivo методом аффинной модификации.

2. Исследование стимулирующих эффектов ДНК, содержащих CG- и G- богатые участки, на пролиферацию лимфоцитов in vitro.

3. Выявление и количественный анализ эндогенных внДНК и внРНК, присутствующих в плазме и на поверхности клеток крови людей в норме и при онкологических заболеваниях.

4. Установление диагностической значимости количественного анализа внРНК и копийности опухоль-ассоциированных РНК в крови больных опухолями молочной железы.

5. Анализ паттерна метилирования опухоль-ассоциированных генов во фракциях внДНК крови больных раком желудка и молочной железы.

Научная новизна и практическая ценность работы. Выполнено первое комплексное исследование взаимодействий экзогенных и секретируемых в организме человека внеклеточных нуклеиновых кислот с компонентами крови. Определены факторы, влияющие на метаболизм и утилизацию экзогенных ДНК-олигомеров in vivo. Выявлено формирование комплексов ДНК с белками плазмы, в составе которых ДНК-олигомеры частично защищены от деполимеризации. Впервые показано, что эритроциты участвуют в связывании коротких продуктов гидролиза ДНК.

Получены новые данные о взаимодействии ДНК с белками лейкоцитов, которые могут принимать участие в иммуностимулирующем действии ДНК.

Полученные результаты являются принципиально значимыми для разработки новых терапевтических препаратов на основе ДНК, способных селективно влиять на экспрессию целевых генов и не вызывающих нежелательных побочных эффектов in vivo (например, неспецифическую активацию иммунной системы).

В результате проведенного анализа внДНК и внРНК впервые обнаружены не только в плазме, но и на поверхности клеток крови.

Получены новые знания об изменениях, происходящих в составе и количестве внНК во фракциях крови на разных стадиях онкологических заболеваний, которые расширяют современные представления о молекулярных основах патогенеза опухолей и открывают перспективы для поиска новых подходов к их лечению. Результаты работы вносят существенный вклад в решение одной из острейших проблем современности, а именно в разработку методов малоинвазивной первичной диагностики, стадирования и прогноза развития опухолей различной этиологии.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликована 21 статья. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: The 23-d FEBS Meeting (Basal, Switzerland, June 1995), XIII International round table ”Nucleosides, Nucleotides and their Biological Applications” (Montpellier, France, September 1998), III Съезд иммунологов и аллергологов СНГ (Сочи, Россия, Сентябрь 2000), The Third international conference “Radioisotopes and Their Applications” (Tashkent, Uzbeckistan, October 2002), Научная конференция “Фундаментальные науки медицине” (Москва, Россия, Ноябрь 2002), The International conference “Biology and Biochemistry of Extracellular Nucleic Acids” (Novosibirsk, Russia, June 2003), Научная конференция «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, Россия, Декабрь 2003), International conference on chemical biology (Novosibirsk, Russia, July 2005), Российская научно-практическая конференция «Новые диагностические и лечебные технологии в онкологии» (Томск, Россия, Сентябрь 2003), International conference “Circulating nucleic acids in plasma and serum and serum proteomics” (Santa Monica, California, USA, November 2003), Российская научнопрактическая конференция «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, Россия, Сентябрь 2004), Российская научно-практическая конференция «Новые технологии в онкологической практике» (Барнаул, Россия, июнь 2005), IV, V International Conference on Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum, (London, UK, September 2005, Moscow, Russia, August 2007), International workshop “Biosphere Origin and Evolution” (Novosibirsk, Russia, June 2005), Конференция по фундаментальной онкологии «Петровские чтения – 2005, 2006, 2007» (Санкт-Петербург, Россия, Апрель 2005, 2006, 2007), RussianAmerican conference “Biotechnology and oncology 2005” (St.Peterburg, Russia, June 2005), I, II, III, IV International Conference «Basic Science for Biotechnology and Medicine» (Novosibirsk, Russia, September 2005, 2006, 2007, 2008), Российская научнопрактическая конференция «Актуальные вопросы экспериментальный и клинической онкологии» (Томск, Россия, июнь 2006 и 2008), IX, Х, ХI Российский онкологический конгресс (Москва, Россия, ноябрь 2005, 2006, 2007), Международная конференция «Физико-химическая биология» (Новосибирск, Россия, август 2006), 31th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies «Molecules in Health and Disease» (Istanbul, Turkey, June 2006), II Молодежный медицинский конгресс «СанктПетербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, Россия, 2007), IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, Май 2008).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 284 страницах машинописного текста, состоит из введения, десяти глав, выводов, списка цитированной литературы (412 ссылок) и содержит рисунков и 48 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выявление факторов, влияющих на накопление, распределение и устойчивость экзогенных ДНК в крови В работе был проведен анализ фармакокинетики экзогенных синтетических ДНК олигомеров в крови, а также методом аффинной модификации были получены данные о взаимодействии ДНК с белковыми и клеточными составляющими крови in vivo.

1.1. Стабильность и распределение производных олигонуклеотидов в крови in vivo Поскольку было известно, что фосфодиэфирные ДНК с высокой скоростью деградируют в плазме крови in vivo, в работе были использованы производные как фосфодиэфирных ДНК олигомеров, так и их аналогов, предположительно устойчивых к нуклеазам, несущие алкилирующую группировку 4-[(N-2-хлорэтил-N-метил)-амино] бензиламина (ClR) на 5`CIR[X] = фосфате (рис. 1). Производные олигонуклеотидов Б и В, синтез O которых был проведен на основе CH N CH 2 NH исходного олигонуклеотида P O X CI CH 2 CH Tp(TpCp)6, были любезно O - предоставлены Н.В.

Амирхановым, сотрудником лаборатории химии нуклеиновых кислот НИБХ СО РАН.

X = TpGpApCpCpCpTpCpTpTpCpCpCpApTpT - OH А Рис. 1. Структура олигонуклеотидов, O использованных в работе: А – р(N)16, фосфодиэфирный олигонуклеотид, - Tp(TpCp) T - O - P - O Б Б – р(N)14sme, производное олигонуклеотида, содержащее 3’S pSMe группировку, В – p(N)14sTsT, Me химерный фосфодиэфирный олигонуклеотид, содержащий межнуклеотидные фосфоротиоатные O O группы на 3’- конце.

В Tp(TpCp) T - O - P - O - T - O - P - O - T - OH Мышам линии BALB/c S - S - внутрибрюшинно вводили в дозе 0.5 мг/кг алкилирующие производные олигонуклеотидов А, Б и В, меченые P по 5’-концу. Через определенные промежутки времени производили забор крови и получали отдельные фракции центрифугированием. ДНК олигомеры, выделенные из фракций крови осаждением при помощи 2% перхлората лития, анализировали электрофорезом (20% ПААГ, 8М мочевина) с последующей радиоавтографией.

В сыворотке крови уже через 20 мин после введения были выявлены только 6-, 7- и 8-звенные продукты деградации 5'-защищенных фосфодиэфирных олигонуклеотидных производных ClRp(N)16 и р(N)14sme, причем 3’-рSМе группа не приводит к существенному возрастанию устойчивости р(N)14sme производного к действию фосфодиэстераз сыворотки крови (рис. 2).

Рис 2. Анализ продуктов метаболизма ДНК олигомеров в сыворотке крови. 1 – маркерные олигонуклеотиды, 2 – 4 – ClRp(N)14sme через 20 мин, 40 мин и 1.5 ч после введения, 5 – 10 – ClRp(N)14sTsT через 20 мин, 40 мин, 1.5, 3, 9 и ч после введения, 11 – 13 – ClRp(E)16 через мин, 40 мин и 1,5 ч после введения.

Недеградированный химерный ДНК олигомер СlRp(N)14sTsT и 3, 4, 7, 10, 13 и 14-звенные продукты его частичной деградации выявлялись в сыворотке в течение 24 часов от момента введения.

Таким образом, присутствие двух межнуклеотидных фосфоротиоатных групп на 3'-конце химерных ДНК олигомеров препятствует их разрушению под действием 3'-экзонуклеаз крови и других тканей. Эти результаты свидетельствуют о перспективности разработки ген-направленных препаратов на основе таких частично модифицированных производных ДНК, которые так же устойчивы, как их полные фосфоротиоатные аналоги, но не вызывают побочных эффектов in vivo. В отличие от сыворотки крови, в эритроцитах при введении каждого из трех ДНК олигомеров обнаружены только низкомолекулярные продукты деградации олигонуклеотидов: моно-, ди-, три- и тетрануклеотиды (рис. 3).

Рис. 3. Анализ продуктов метаболизма ДНК олигомеров в эритроцитах крови:

1 – 5 – ClRр(N)14sme через 20 мин, 40 мин, 1.5, 3, 9 и 24 ч после введения, 6 – 11 – ClRp(N)14sTsT через 20 мин, 40 мин, 1.5, 3, 9 и ч после введения, 12 – 16 – ClRp(N)16 через мин, 40 мин, 1.5, 3, 9 и 24 ч после введения, 17 – маркерные ДНК олигомеры,18 – продукты деградации ClRp(N)16 до и после обработки хлорной кислотой (через 3 ч после введения).

Гидролиз кислотолабильной фосфамидной связи обработкой 5% HClOприводил к увеличению электрофоретической подвижности динуклеотида эритроцитарной фракции (18, 19, рис. 3). Это свидетельствует о том, что олигонуклеотиды, экстрагированные из эритроцитов, являются продуктами деградации исходных 5'-фосфамидных производных, а не результатом включения меченого фосфата при синтезе de novo. Отсутствие в сыворотке низкомолекулярных ДНК олигомеров, выявленных в эритроцитарной фракции, позволяет предположить, что эритроциты избирательно накапливают короткие продукты деградации ДНК. Это предположение подтвердили результаты экспериментов in vitro, которые показали снижение уровня связывания в ряду АТР, p(TT), p(GATC), р(N)16 (рис. 4).

Рис. 4. Накопление ДНК олигомеров и АТР эритроцитами in vitro:

эритроциты инкубировали в среде ДМЕМ в концентрации 107 и 108 клеток/мл и инкубировали с Pмечеными АТР и олигонуклеотидами (в концентрации 5мкМ) при температуре 37ОС в течение 3 ч.

Эритроциты удерживают 95% тетрануклеотида [32Р]p(GATC) в течение 2-х часов в отличие от других эукариотических клеток, которые за то же время экскретируют до 70% захваченных олигонуклеотидов. Таким образом, эритроциты не участвуют в метаболизме исходных ДНК олигомеров, однако избирательно накапливают короткие продукты их деградации, происходящей в сыворотке крови или в других тканях.

График изменения количества 32Р-меченых продуктов олигомерных ДНК в сыворотке крови в зависимости от времени представлен двухфазной кривой, которая характеризуется вначале быстрым уменьшением концентрации ДНК олигомеров со временем полувыведения (Т1/2) равным 30 мин, а затем медленным снижением концентрации со временем полувыведения (Т1/2) равным 48-50 ч (рис. 5). Интересно, что значения Т1/2 и Т1/2 в сыворотке не зависят от стабильности использованных в работе производных олигомерных ДНК и согласуются с данными других работ по распределению в крови более стабильных полностью модифицированных фосфоротиоатных олигонуклеотидов (Iversen et al., 1993).

В отличие от сыворотки в эритроцитах происходит накопление Pмеченых ДНК олигомеров и продуктов их деградации, причем более интенсивно в случае стабильных аналогов, особенно ClRp(N)14sTsT (рис. 5).

Через 20 мин после введения всех олигонуклеотидов 95 % Р-меченого материала содержится в сыворотке, а через 24 ч радиоактивность эритроцитов составляет 25% и 80% от суммарной радиоактивности крови после введения р(N)16 и р(N)14sТsТ соответственно. В результате накопления продуктов деградации олигонуклеотидов эритроцитами временная зависимость суммарной радиоактивности крови (см. рис. 5) в значительной степени отличается от временной зависимости радиоактивности сыворотки.

Рис. 5. Зависимость от времени содержания радиоактивного материала в лейкоцитах, эритроцитах, сыворотке и в цельной крови в расчете на 1 мл крови после внутрибрюшинного введения мышам BALB/c 32P-меченых алкилирующих производных олигонуклеотидов в дозе 0.5 мг/кг:

…. ….

ClRp(N)16 ( ------ ------ ); ClRp(N)14sme ( - - - - - - ); ClRp(N)14sTsT ( ).

Через 1.5 ч после введения производных ClRр(N)14sТsТ и ClRр(N)14sme наблюдается рост суммарной радиоактивности крови, тогда как снижение концентрации ClRр(N)16 в цельной крови происходит медленнее, чем в сыворотке (Т1/2 = 76-82 ч). В отличие от производных, использованных в работе, по данным (Agrawal et al., 1995) при введении более стабильных полностью модифицированных фосфоротиоатных аналогов радиоактивность сыворотки крови была в 2.5-3 раза выше, чем радиоактивность эритроцитов, что подтверждает наши результаты о связывании эритроцитами только коротких продуктов деградации ДНК.

В лейкоцитах наблюдается накопление радиоактивных продуктов со временем. Суммарная радиоактивность лейкоцитов составляет 5-8% и 2.5% от суммарной радиоактивности эритроцитов через 20 мин и 24 ч после введения олигонуклеотидов соответственно. Поскольку в 1 мл крови лейкоцитов в 1000 раз меньше, чем эритроцитов, единичный лейкоцит связывает больше олигомеров и продуктов их деградации, чем единичный эритроцит.

1.2. Взаимодействия олигонуклеотидов с белками сыворотки крови Первоначально для выявления белков, взаимодействующих с ДНК, инкубировали in vitro сыворотку крови человека с Р-меченым алкилирующим производным ClRp(N )16. Анализ продуктов реакции модификации SDS-диск электрофорезом в градиентном (10-20%) ПААГ с последующей радиоавтографией показал, что происходит образование ковалентных аддуктов олигомерных ДНК с альбумином и иммуноглобулинами (IgM и IgG) (рис. 6, А).

Для того, чтобы охарактеризовать прочность ДНК-белковых комплексов, был проведен анализ зависимости степени модификации этих белков от концентрации реакционноспособного производного ClR[32Р]р( N )16 на очищенных препаратах альбумина, IgG и IgM (рис. 6, Б). Степень модификации белка вычисляли, исходя из данных об интенсивности радиоактивной метки (в имп/мин) во фрагментах геля, содержавших аддукты ДНК-белок. Полученные данные позволили оценить константы диссоциации (Кd) комплексов, которые составляли 4 мкМ для IgM, 6 мкМ IgG и 20 мкМ для альбумина (Якубов и соавт., 1992).

Для исследования специфичности связывания основных белков сыворотки крови с ДНК, была проведена их аффинная модификация алкилирующим производным ClR[32Р]р( N )16 в присутствии соединений, способных конкурировать с ним за сайты связывания (табл. 1).

[СlRр(N)16] Рис. 6. Модификация белков сыворотки крови ClR[32Р]р(N)16.

А: 1 – IgG, 2 – IgM, 3 – альбумин инкубировали с ClR[32Р]р(N)16 (15 мкМ); 4-7 – сыворотку крови человека инкубировали с ClR[32Р]р(N)16 в концентрации 1.25, 2.5, 5 и 10 мкМ при 37о, 45 мин.

Б: График зависимости модификации белков крови от концентрации (мкМ) реагента СlRр(N)16.

Сродство ДНК олигомеров к альбумину, IgG и IgM не зависит от последовательности нуклеотидов, поскольку 16- и 15-звенные ДНК олигомеры различной последовательности характеризуются сходными константами диссоциации комплексов (табл. 1). Эффективность связывания пиримидин-богатых фрагментов ДНК со всеми исследованными белками возрастает с увеличением длины олигонуклеотида.

При замене фосфодиэфирных связей на фосфоротиоатные сродство аналогов ДНК ко всем исследованным белкам сыворотки возрастает практически в 10 раз. Полианионы различной структуры эффективно ингибируют аффинную модификацию белков (см. табл. 1). Эти данные свидетельствуют об участии фосфатного остова ДНК в формировании комплексов с участками взаимодействия основных связывающих белков сыворотки.

Таблица 1. Значения констант диссоциации (Kd) комплексов альбумина (А), IgG и IgM с ДНК олигомерами, высокомолекулярной ДНК и полианионами Олигонуклеотид*, соединение длина Kd, мкМ IgM IgG А p(TT) 2 80 120 2p(GATC) 4 80 115 2p(CCTCTC) 6 55 110 2p(TTTGTTCT) 8 42 75 p(TCTTTTGTT) 10 30 75 1p(TCCCTCCCTCTTATT) 15 15 30 p(T)16 16 15 30 p(TGACCCTCTTCCCATT) 16 15 30 p(CTTTCTTTTCCTCTCGCT) 18 12 24 p(sTsGsAsCsCsCsTsCsTsTsCsCsCsAsTsT)** 16 2 3 1.p(sC)28** 28 1 1.5 Двуцепочечная ДНК 12 15 Одноцепочечная ДНК 3 5 гепарин 16 17 Декстран сульфат 10 6 Трипановый синий - 8 0.Активный красный - 20 1.* - в работе были использованы только дезоксирибоолигонуклеотиды ** - фосфоротиоатные аналоги олигонуклеотидов, s обозначает межнуклеотидную фосфоротиоатную группу Рис. 7. Анализ продуктов модификации белков сыворотки и клеток крови мышей линии BALB/c после в/б введения 0.5 мг/кг P-меченого ClRp(N)16: SDSдискэлектрофорез в градиентном (10-20%) ПААГ, радиоавтограф.

1,4,7,10,13 – белки сыворотки через 40 мин, 1.5, 3, 9, 24 ч после введения, 2,5,8,11,14 – белки лейкоцитов через 40 мин, 1.5, 3, 9, 24 ч после введения, 3,6,9,12,15 – белки эритроцитов через 40 мин, 1.5, 3, 9, 24 ч после введения ClR[32Р]р( N )16.

При использовании в экспериментах in vivo алкилирующих производных ClR[32Р]р( N )16 и ClR[32Р]р(N)14sТsТ было показано появление ковалентных ДНК-белковых аддуктов в плазме крови, которые по данным электрофоретического анализа соответствовали тяжелой цепи иммуноглобулина класса G и сывороточному альбумину (рис. 7).

Идентификация именно этих белков, образовавших ковалентные аддукты, была подтверждена методом иммунодиффузии сыворотки крови мыши против антисыворотки, специфичной к белкам сыворотки крови мыши и антител, специфичных к иммуноглобулину G мыши, с последующей радиоавтографией.

В работе было показано влияние формирования ДНК-белковых комплексов на сохранность ДНК олигомеров в крови. Для этого после разделения белков электрофорезом ДНК олигомеры элюировали из фрагментов геля, содержащих ковалентные аддукты ДНК-белки, путем разрушения кислотолабильной связи обработкой 5% HClO4.

Рис. 8. Анализ олигомерных ДНК, ассоциированных с белками сыворотки крови через 24 ч после в/б инъекции ClR[32Р]р( N )16 (0.5 мг/кг). Электрофорез (20% ПААГ; 8М мочевина), радиоавтограф.

1- маркерный 16-звенный олигонуклеотид 2- ДНК олигомеры, ассоциированные с белками сыворотки 3- маркерный 10-звенный олигонуклеотид 4- маркерные олигонуклеотиды.

Анализ полученных продуктов показал, что в составе ковалентных аддуктов ДНК-белок происходит неполная деполимеризация 16-звенных олигонуклеотидов с образованием 7-8-звенных фрагментов (рис. 8).

После введения мышам ClR[32Р]р( N )16 и ClR[32Р]р(N)14sТsТ в мембранной фракции лейкоцитов была выявлена аффинная модифицикация белка с мол. массой 72 кДа по данным SDS-дискэлектрофореза (рис. 7). В эритроцитарной фракции ДНКсвязывающих белков не было обнаружено. Анализ полученных данных позволил сделать предположение, что выявленный белок лейкоцитов относится к семейству иммуноглобулиновых рецепторов.

2. Стимулирующее действие ДНК, содержащих CG- и G-богатые участки, на пролиферацию лимфоцитов в культуре Интенсивное исследование стимулирующих свойств ДНК на иммунитет ведется с конца 1980-х гг., когда группой Ямамото была выявлена противоопухолевая активность бактериальной ДНК (Yamamoto et al., 1989).

Впервые сиквенс-специфичность митогенного действия для гексамерных CG- содержащих участков была показана Кригом и соавторами (Krieg et al., 1995).

В настоящей работе было показано стимулирующее действие ДНК плазмиды pUC19 на пролиферацию лимфоцитов селезенки мышей линии CBA in vitro. В дальнейшем при изучении свойств ДНК этой плазмиды ее иммуностимулирующее действие было связано с входящими в ее состав CG- содержащими участками (Raz et al., 1996). Иммуностимулирующие эффекты ДНК изучали при культивировании лимфоцитов селезенки мышей в течение 72 ч. Пролиферативный ответ определяли по включению клетками [3H] тимидина ([3H]Т) после инкубации с ним в течение последних 18 ч. Интенсивность пролиферативного ответа на ДНК увеличивалась при возрастании ее концентрации начиная от 50 нг/мл с выходом на плато при 50 мкг/мл (рис. 9).

Рис. 9. Зависимость пролиферации лимфоцитов селезенки от концентрации ДНК:

В культуральную среду добавляли ДНК плазмиды pUC19 (ДНК), ДНК, обработанную ДНКазой (ДНК + ДНКаза), ДНК и олигонуклеотид p(TGACCCTCTTCCCATT ) (p(N)16).

Полученные данные о концентрационной зависимости согласовались с результатами работы Мессина и соавторов по стимуляции лимфоцитов селезенки мышей линии ВАLB/с под действием суммарной ДНК E.coli (Messina et al., 1991).

Митогенный эффект был вызван именно полинуклеотидным материалом, поскольку ДНК, предварительно обработанная ДНКазой, не вызывала стимуляции пролиферации лимфоцитов (рис. 9).

Рис. 10. Влияние полиэтиленимина (ПЭИ) на пролиферацию лимфоцитов под действием CG-содержащей ДНК и олигонуклеотида (GAAGGGAGGA)p:

лимфоциты культивировали в присутствии плазмидной ДНК (0.5 мкг/лунку), олигонуклеотида (мкг/лунку), или в присутствии комплексов этих соединений с ПЭИ.

КонА (1 мкг/мл) и ЛПС (2.мкг/мл) добавляли к лимфоцитам одновременно с ДНК и олигонуклеотидом.

Кроме того, добавление в культуральную среду олигонуклеотида p(N)16, не имеющего активирующего влияния на лимфоциты, также приводило к ингибированию действия ДНК. В настоящей работе было выявлено стимулирующее действие G-богатой гексамерной последовательности GAAGGGAGGA.

Включение [3H]Т лимфоцитами под действием этого олигонуклеотида в концентрации 10 мкг/мл составляло более 20% от включения [3H]Т под действием плазмидной ДНК (10 мкг/мл), 70% от включения [3H]Т под действием бактериального липополисахарида (ЛПС) и 44% от включения [3H]Т под действием конканавалина А (Кон А) (рис. 10). Обработка олигонуклеотидов ДНКазой приводила к исчезновению стимулирующего влияния на лимфоциты.

Для выявления клеточных мишеней ДНК в суммарной культуре лимфоцитов было исследовано комитогенное влияние плазмидной ДНК и нескольких известных митогенов на их пролиферацию (рис. 11). Для выявления синергичного влияния митогены были использованы в субоптимальных концентрациях. Результаты настоящей работы совпадают с данными о влиянии бактериальной ДНК на В-клетки, которое не зависит от Т-лимфоцитов (Krieg et al., 2003). Митогенный активатор Т-лимфоцитов КонА аддитивно усиливает эффект плазмидной ДНК, что свидетельствует о независимой активации Т- и В-клеточной пролиферации в культуре лимфоцитов. В присутствии активатора В-клеточной пролиферации ЛПС активирующее влияние ДНК усиливается, однако совместное действие несколько меньше суммы двух независимых эффектов. Вероятно, ДНК и ЛПС стимулируют различные, но перекрывающиеся субпопуляции Влимфоцитов.

Рис. 11. Костимулирующее действие плазмидной ДНК и митогенов: Лимфоциты селезенки культивировали в присутствии плазмидной ДНК (0.5 мкг/мл), ФМА (нг/мл), Кон А (0.2 мкг/мл), ЛПС (2.5 мкг/мл) и без митогенов (контроль).

Синергичное влияние на поликлональную стимуляцию лимфоцитов было обнаружено при совместном использовании плазмидной ДНК и форболового эфира ФМА, которое может быть результатом того, что их активирующее влияние на клетки опосредуется через различные сигнальные механизмы. В отличие от многих митогенов, действие которых опосредовано через поверхностные рецепторы клетки, форболовые эфиры активируют сигнальные пути, минуя рецепторные взаимодействия, за счет связывания и активации протеинкиназы С (PKC) (Li et al., 1991). Данные о синергичности действия ФМА и ДНК позволили сделать предположение о рецептор-опосредованном влиянии ДНК.

В настоящей работе показано снижение активирующего действия на пролиферацию лимфоцитов СG- и G-богатых ДНК при их использовании в комплексах с полиэтиленимином (ПЭИ), который увеличивает доставку ДНК в эукариотические клетки (см. рис. 10). Этот факт явился еще одним косвенным подтверждением участия рецепторов в стимулирующем действии ДНК. Поскольку добавление комплексов ПЭИ с ДНК не снижало жизнеспособность лимфоцитов и не влияло на пролиферацию под действием ЛПС и КонА, снижение активации пролиферации под действием ДНК не было связано с цитотоксичностью ПЭИ. Эти результаты были подтверждены недавно другими исследованиями. В составе комплексов с ПЭИ CG-содержащая плазмидная ДНК не вызывала увеличения синтеза ИЛ-12 в сыворотке при в/в введении мышам (de Wolf et al., 2008). При этом комплексы ДНК с липосомами DOTAP приводили к усилению стимуляции синтеза ИЛ-12. Было также показано ингибирующее влияние положительно заряженных желатиновых наночастиц на стимулирующее действие CGсодержащих олигомерных ДНК на секрецию ИЛ-6 В-клетками человека в культуре (Zwiorek et al., 2008).

Таблица 2. Влияние анти-Ig антител и их Fab-фрагментов на активацию пролиферации клеток селезенки под действием плазмидной ДНК Митогены Включение [3H] тимидина (имп/мин х103) Контроль Анти-Ig Fab (Fab)Контроль 2.6 ± 0.2 1.9 ± 0.2 2.0 ± 0.1 11.5 ± 2.ДНК 10 мкг/мл 51.5 ± 7.2 16.5 ± 1.3 26.0 ± 3.2 39.0 ± 5.ДНК 1 мкг/мл 41.0 ± 4.5 9.0 ± 1.1 11.0 ± 1.4 27.0 ± 2.ДНК 0.1 мкг/мл 15.0 ± 1.5 4.5 ± 3.9 2.8 ± 0.4 13.0 ± 1.ЛПС 2.5 мкг/мл 42.0 ± 5.1 20.0 ± 3.5 35.0 ± 4.2 38 ± 3.Примечание: Кроличьи поликлональные антитела против Ig мыши, их моновалентные Fab- и бивалентные (Fab)2-фрагменты (все в концентрации 50 мкг/мл) добавляли к лимфоцитам одновременно с митогенами Поскольку в настоящей работе обнаружено взаимодействие ДНК с Ig сыворотки крови, одним из посредников активирующего влияния ДНК, как можно было предполагать, являлись поверхностные Ig рецепторы Влимфоцитов (BCR). В связи с этим было исследовано влияние нестимулирующих пролиферацию анти-Ig антител на активирующее влияние плазмидной ДНК. Оказалось, что в присутствии кроличьих антител против Ig мыши стимулирующее действие плазмидной ДНК на включение [3H]Т В-лимфоцитами селезенки снижается в 3-5 раз (табл. 2). Поскольку анти-Ig антитела кролика ингибируют стимулирующее действие ЛПС, было исследовано и выявлено также значительное ингибирование пролиферативного эффекта под действием моновалентных Fab-фрагментов анти-Ig антител (см. табл. 2), которые не оказывают ингибирующего влияния на действие ЛПС. Бивалентные (Fab)2-фрагменты оказывают стимулирующее действие на В-клеточную пролиферацию, однако подавляют действие ДНК, хотя и не так существенно, как моновалентные Fab-фрагменты. Неполное ( на 40-50% ) ингибирование Fab-фрагментами анти-Ig антител стимуляции пролиферации лимфоцитов под действием ДНК в высокой концентрации ( от 10 мкг/мл и более ) свидетельствует о том, что существуют различные пути активации пролиферации лимфоцитов под действием ДНК.

Данные о важной роли Toll-like receptor 9 (TLR9), экспрессированных в эндоплазматическом ретикулуме, в активирующем действии СG – богатых ДНК на индукцию Т-независимого ответа В-лимфоцитов и дендритных клеток были опубликованы впервые в 2000 г. (Hemmi et al., 2000). В дальнейших исследованиях было показано, что СG-содержащие ДНК захватываются клетками путем эндоцитоза, взаимодействуют с TLR9 и активируют соответствующие им сигнальные пути (Bauer et al., 2008).

Однако, накоплены также экспериментальные данные, которые свидетельствуют о существовании независимых от TLR9 путей активации Влимфоцитов (Wagner and Bauer, 2006). Следует отметить, что у больных СКВ при поглощении иммунных комплексов дендритными клетками FcRопосредованным путем, происходит стимуляция продукции интерферонов типа, которая только частично зависит от активации TLR9 (Boule et al., 2004).

Активация В-клеток под действием иммунных комплексов, содержащих ДНК, происходит за счет вовлечения как TLR, так и IgM рецепторов (Leadbetter et al., 2002). Группой Крига было показано, что в зависимости от зрелости Вклеточной субпопуляции СG-содержащие ДНК либо усиливают, либо подавляют активирующий сигнал, опосредованный В-клеточными рецепторами (Yi et al., 2003). Таким образом, можно предполагать наличие нескольких путей рецептор-опосредованного стимулирующего действия СGсодержащих ДНК.

3. Концентрации и распределение внНК в крови Интенсивные исследования в области внНК в последние годы связаны с перспективами разработки методов диагностики различных заболеваний на основе анализа внДНК и внРНК крови. Все проводившиеся ранее исследования были посвящены только внДНК и внРНК, присутствующим в плазме, хотя половину объема крови составляют клеточные элементы, на поверхности которых присутствуют белки, способные связывать внНК (Bennett et al., 1987). Было также известно, что внДНК могут связываться с фосфолипидами липосом и клеточных мембран через двухвалентные катионы металлов (Беляев и соавт., 1988). В данной работе было впервые показано присутствие внНК, связанных с поверхностью клеток крови, и выявлены особенности распределения внНК во фракциях крови в норме и при онкологических заболеваниях.

Данная работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288).

На проведение работ с клиническим материалом было получено разрешение этического комитета ИХБФМ СО РАН. Образцы крови получали от здоровых людей и пациентов с опухолями различной этиологии, стабилизировали ЭДТА и обрабатывали, как показано на рис. 12.

Для элюции внНК, связанных с поверхностью форменных элементов крови через ионные мостики, клетки обрабатывали ФБ, содержащим хелатирующий агент (ФБ-ЭДТА). Для разрушения комплексов поверхностных белков с нуклеиновыми кислотами и нуклеопротеиновыми комплексами клетки обрабатывали 0.125 % раствором трипсина. Отсутствие лизиса клеток при такой обработке контролировали, оценивая их жизнеспособность при помощи окрашивания трипановым синим.

Концентрации внНК в образцах плазмы крови и клеточных элюатах были определены методом детекции комплексов флуоресцентных красителей Hoechst 33258 и SYBR Green II с очищенными ДНК и РНК, выделенными на модифицированных силикатных сорбентах.

Рис. 12. Схема обработки образцов крови: Кровь собирали в пробирку, содержащую фосфатный буфер с ЭДTA и разделяли на плазму и клетки. Клетки крови отмывали фосфатным буфером с 5 мМ ЭДТА (ФБ-ЭДТА элюат), а затем 0.125 % раствором трипсина (трипсиновый элюат).

Использованные в работе методы выделения нуклеиновых кислот из биологических жидкостей позволяли с эффективностью 92 % и 86 % выделять как высоко-, так и низкомолекулярные ДНК и РНК соответственно (от 100 п.н. до 20 т.п.н.) (Лактионов П.П., Тамкович С.Н., Симонов П.А., Рыкова Е.Ю., Власов В.В.

Патенты на изобретение №2232768; №2232810). Минимальный уровень детекции внДНК и внРНК в крови составлял для плазмы 8 нг/мл, для ФБ-ЭДТА элюата – 40 нг/мл и для трипсинового элюата – 20 нг/мл крови.

Обработка данных проводилась с использованием методов статистического анализа при помощи программ MedCalc и Statistica 6.

3.1. внДНК в крови здоровых людей Контрольную группу составили 30 человек без выявленных патологий – доноров отделения переливания крови ЦКБ СО РАН г. Новосибирска.

Измерение концентрации внДНК в крови здоровых доноров было проведено сотрудниками ГКБ ИХБФМ СО РАН О.Е.Брызгуновой и С.Н.Тамкович (Tamkovich et al., 2005).

Концентрация внДНК в плазме здоровых людей варьировала от 0 до нг/мл и в среднем составляла 10 нг/мл. Концентрация внДНК плазмы здоровых мужчин (среднее значение 13 нг/мл) достоверно не отличалась от концентрации внДНК плазмы здоровых женщин (8 нг/мл) (t-критерий, p=0.1) (рис. 13). Полученные значения согласуются с данными исследователей, определявших концентрацию внДНК в плазме крови другими методами (Wu et al., 2002, Fleischhacker and Schmidt, 2007).

У большинства обследованных как в норме, так и при патологиях, более 50% внДНК, связанной с поверхностью клеток крови, находится в трипсиновой фракции (у 63% здоровых доноров, 83% больных раком желудка и 81% больных раком легких). Эти значения согласуются с результатами, полученными в настоящей работе при определении количества внДНК, связанных с поверхностью культивируемых первичных эндотелиоцитов человека HUVEC. Оказалось, что более значительное количество внДНК находится в трипсиновом элюате с их поверхности (1нг/млн клеток), по сравнению с ФБ-ЭДТА элюатом (20 нг/млн клеток). На рис. 13 и далее представлены данные о концентрации внДНК плазмы и внДНК, связанных с клеточной поверхностью, которые определены как сумма значений для внДНК, выделенных из ФБ-ЭДТА и трипсинового элюатов по отдельности.

Рис. 13. Концентрация внДНК плазмы (Плазма) и внДНК, связанных с поверхностью клеток крови (Клетки) у здоровых людей.

В данной работе впервые было показано, что в крови клинически здоровых людей основная часть (в среднем 97% и 98% для мужчин и женщин) внДНК связана с поверхностью форменных элементов крови (см. рис. 13).

Достоверной корреляции между концентрацией внДНК, связанных с клеточной поверхностью, и количеством форменных элементов крови (лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов) по критерию Спирмена не обнаружено.

Оказалось, что концентрация связанных с поверхностью клеток внДНК достоверно выше у мужчин (среднее значение 703 нг/мл), чем у женщин (429 нг/мл) при сравнении выборок по критерию Манна-Уитни (p=0.04) (табл.

5). Полученные данные о таких различиях у здоровых людей предполагали, что при сравнительном исследовании уровня внДНК при патологиях необходимо учитывать пол пациента.

3.2. внДНК в крови больных раком легких Исследуемую группу составили 42 мужчины, больных раком легких, первично поступивших в Областной онкологический диспансер г. Томска, в возрасте от 46 до 79 лет. В контрольную группу вошли мужчины без выявленных патологий, сопоставимые по возрасту. Больные находились на T1-4NХ,0-2M0-1 стадии заболевания. Наличие метастазов в лимфатических узлах было подтверждено у 63 % больных, отдаленных у 10% больных. По гистологической классификации (классификации ВОЗ) 24% составила аденокарцинома, 61% плоскоклеточная карцинома, 10% мелкоклеточный рак и 5% железистый рак легкого. Низко-дифференцированные опухоли составляли 39%, умеренно-дифференцированные 53% и высокодифференцированные 8%. По клинико-анатомической классификации, центральный рост опухоли наблюдался в 61% случаев, периферический – в 39%.

Концентрации внДНК в плазме крови у больных раком легких составляла в среднем 13 нг/мл и не отличается от концентрации в плазме крови здоровых мужчин (13 нг/мл) (рис. 14). Результаты соответствовали данным работ по определению внДНК плазмы при раке легких другими методами (Herrera et al., 2005, Belinsky et al., 2005). В данной работе было выявлено статистически достоверное уменьшение количества внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, у больных раком легких по сравнению со здоровыми мужчинами (критерий Манна – Уитни, р<0.01, табл.

3).

Рис. 14. Концентрации внДНК плазмы (Плазма) и внДНК, связанных с поверхностью форменных элементов крови (Клетки) здоровых мужчин (Норма) и больных раком легких (Рак легких).

Для оценки значимости этого параметра для диагностирования больных раком легких определяли чувствительность и специфичность теста.

При определении порогового уровня внДНК, связанной с клеточной поверхностью, как 4нг/мл, чувствительность анализа составляет 76%, специфичность – 86%.

Следует отметить, что уже на ранних стадиях рака легкого (Т1-Т2) пациенты характеризуются снижением концентрации внеклеточной ДНК, связанной с клеточной поверхностью.

Было показано снижение концентраций внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, по мере увеличения тяжести заболевания. В группе пациентов с распространенным опухолевым процессом этот параметр был достоверно ниже, чем в группе пациентов с умеренно распространенным процессом (критерий Манна – Уитни, р<0.05) (табл. 3).

После оперативного лечения были сформированы две группы – пациенты с ремиссией или стабилизацией и пациенты с прогрессирующей болезнью (см. табл. 3). При определении в качестве порогового уровня для внДНК, связанной с поверхностью клеток крови, концентрации 84 нг/мл, пациенты, не отвечающие на терапию, выявляются с чувствительностью 94% и специфичностью 50%.

Таким образом, было показано, что данный параметр может служить дополнительным критерием прогнозирования течения болезни.

Определение стандартных клинико-патологических характеристик позволяет выявить пациентов с прогнозом прогрессирования болезни с такой же чувствительностью и специфичностью (94% и 56% соответственно).

Таблица 3. Концентрации внДНК, связанных с поверхностью клеток крови здоровых людей и больных раком легких Группа обследованных Связанные с Достоверповерхностью клеток ность внДНК различий Здоровые мужчины 703 (М 715, Д 190 - P<0.1520) Больные раком легких 118 (М 46, Д 6 - 1250) Больные с умереннно 263 (М 101, Д 22 - 1250) P=0.0распространенным процессомБольные с распространенным 55 (М 44, Д 6 - 319) процессомБольные с ремиссией и 207 (М 189, Д 15 - 1250) P=0.0стабилизацией Больные с прогрессией 54 (М 46, Д 6 - 319) заболевания Примечание: Представлены средние значения, медиана (М), диапазон (Д), достоверность различий определяли по тесту Манна – Уитни а – I –II стадия опухоли, отсутствие метастазов, умеренная дифференцировка клеток, центральный рост опухоли б - III –IV стадия опухоли, наличие метастазов, низкий уровень дифференцировки клеток, периферический рост опухоли 3.3. внДНК в крови больных раком желудка В исследование было включено 30 первично обратившихся больных раком желудка (РЖ) в возрасте 46-78 лет T1-4NХ,0-3MХ,0-1. Контрольную группу составляли доноры, сопоставимые по возрасту. Наличие метастазов в лимфатических узлах было подтверждено у 37% больных, отдаленных метастазов у 23% больных. По гистологическому типу (классификации ВОЗ) у 60% больных морфологически был подтвержден диагноз аденокарцинома разной степени дифференцировки, у 25% больных – недифференцированный рак, у 15% больных – перстневидноклеточный рак.

Формирование группы осуществлялось после постановки диагноза на основании клинического, морфологического, эндоскопического, рентгенологического обследования и по результатам оперативного вмешательства.

Суммарная концентрация внДНК, связанных с клеточной поверхностью, выделенных из ФБ-ЭДТА и трипсинового элюата, у больных раком желудка составила в среднем 547 нг/мл и достоверно не отличалась между мужчинами и женщинами (критерий Манна – Уитни, p>0.05) (табл. 4). По сравнению со здоровыми мужчинами у больных раком желудка мужчин отмечалось снижение концентрации внДНК, связанных с клеточной поверхностью (см. табл. 4, критерий Манна – Уитни, p=0.04). У больных РЖ женщин показано отсутствие достоверных отличий концентрации внДНК, связанных с клеточной поверхностью, по сравнению с группой клинически здоровых женщин (табл. 4, критерий Манна – Уитни, p>0.05). У больных раком желудка концентрация внДНК в плазме крови варьировала от 8 до 537 нг/мл, и в среднем составляла 99 нг/мл крови. Концентрация внДНК в плазме больных мужчин достоверно не отличалась от концентрации ДНК в плазме больных женщин (критерий Манна – Уитни, p>0.05) (табл. 4). Данное исследование показало, что по сравнению с клинически здоровыми людьми у больных раком желудка концентрация внДНК в плазме была достоверно выше (критерий Манна – Уитни, p=0.001).

Таблица 4. Концентрации (нг/мл) внДНК в крови клинически здоровых людей и больных раком желудка Группа Пол внДНК плазмы Связанные с поверхность обследованных клеток внДНК Муж. 13 (М 14, Д 0-25) 703 (М 715, Д 190-1520) Здоровые Жен. 8 (М 6, Д 0-28) 429 (М 354, Д 121-871) Муж. 116 (М 64, Д 8-527) 442 (М 457, Д 14-1464) Больные РЖ Жен. 77 (М 63, Д 10-1946) 685 (М 523, Д 74-1855) Примечание: Представлены средние значения, медиана (М), диапазон (Д) Для оценки информативности показателя концентрации внДНК плазмы при раке желудка был использован ROC-анализ (площадь под графиком составляла 0.906). При выборе порогового значения концентрации внДНК плазмы 25 нг/мл, больных раком желудка можно отличить от клинической нормы с чувствительностью 77% и специфичностью 97%.

В подгруппах больных РЖ, сформированных по распространенности онкологического процесса, было обнаружено, что среднее значение концентрации внДНК плазмы у больных с неблагоприятными факторами прогноза (146 нг/мл) было достоверно выше, чем в подгруппе с благоприятным прогнозом (72 нг/мл) (критерий Манна – Уитни, p=0.04) (табл. 5).

При анализе корреляций концентрации внДНК в плазме больных раком желудка с клинико-патологическими параметрами опухоли (TNM, гистологический тип опухоли) достоверное повышение концентрации внДНК плазмы (критерий Манна – Уитни, p=0.049) было обнаружено в группе больных с отдаленными метастазами по сравнению с группой, в которой они отсутствуют (155 нг/мл и 79 нг/мл, соответственно), а также при перстневидноклеточном типе опухоли по сравнению с аденокарциномой (критерий Манна – Уитни, р=0.03) и недифференцированным раком (критерий Манна – Уитни, р=0.04) (см. табл. 5).

Достоверных корреляций между концентрацией внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, и распространенностью процесса при раке желудка выявлено не было. Таким образом, у больных раком желудка концентрация внДНК плазмы была достоверно выше клинической нормы и возрастала по мере распространенности онкологического процесса.

Таблица 5. Зависимость концентрации (нг/мл) внДНК в крови больных раком желудка от распространенности онкологического процесса Подгруппа больных раком внДНК плазмы Связанные с желудка поверхностью клеток внДНК Больные с благоприятным 72 (М 43, Д 8-297) 545 (М 457, Д 62-1855) прогнозом Больные с неблагоприятным 146 (М 128, Д 10-527) 562 (М 594, Д 74-1464) прогнозом Больные с метастазами в 155 (М 100, Д 30-527) 550 (М 544, Д 131-1464) регионарные лимфоузлы (M1,X) Больные без метастазов (M0) 79 (М 45 Д 8-297) 552 (М 468, Д 62-1855) Больные с аденокарциномой 71 (М 38, Д 10-278) 431 (М 344, Д 62-1464) Больные с 90 (М 56, Д 8-297) 724 (М 493, Д 124-1855) недифференцированным типом рака Больные с 204 (М 159, Д 71-527) 623 (М 608, Д 114-1101) перстневидноклеточным типом рака Примечание: Представлены средние значения, медиана (М), диапазон (Д) - Подгруппу больных с благоприятным прогнозом составили пациенты I-IIIa стадии онкологического процесса и с морфологически подтвержденными аденокарциномой разной степени дифференцировки и недифференцированным типами рака - В подгруппу больных с неблагоприятным прогнозом вошли пациенты IIIб-IV стадии заболевания и с морфологически подтвержденным перстневидноклеточным типом рака В отличие от больных раком желудка, у пациентов при раке легкого не выявлено изменений внДНК плазмы, тогда как наблюдалось достоверное снижение количества внДНК, связанных с поверхностью клеток, по сравнению с нормой, которое было ассоциировано с неблагоприятным прогнозом заболевания. Выявленные изменения концентраций и распределения внДНК крови являлись характерными для опухолей исследованной локализации, а именно, легких и желудка, и отличались от обнаруженных ранее изменений, происходивших при опухолях молочной железы. Например, у женщин, больных раком молочной железы наблюдались достоверное снижение количества внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, что не было выявлено у женщин, больных раком желудка (Laktionov et al, 2004).

Полученные в настоящей работе результаты делают очевидной перспективность дальнейших исследований на «группах риска» по онкологическим заболеваниям и группах пациентов, прошедших лечение, которые необходимы для оценки значимости данных о распределении внДНК в крови с целью использования их в качестве дополнительных параметров при выявлении опухолей, их стадировании и для мониторинга рецидивов болезни.

Причины изменения распределения внДНК в крови больных опухолевыми патологиями остаются практически невыясненными. Согласно данным настоящей и других работ, внДНК могут гидролизоваться ДНКгидролизующими ферментами крови (эндонуклеазами, фосфодиэстеразами) (Барановский и соавт., 2004). Проведенные недавно исследования выявили корреляцию повышения уровня внДНК плазмы крови и понижения ДНКазной активности в плазме крови при раке предстательной железы и желудка по сравнению с нормой (Tamkovich et al., 2006). Можно предполагать, что одной из причин снижения нуклеазной активности плазмы при развитии опухолей является повышение концентрации ингибиторов дезоксирибонуклеаз в крови (Ramandanis et al., 1982).

В настоящей работе показано, что внДНК связаны с клетками крови за счет формирования комплексов с поверхностными белками. Поэтому одним из факторов, влияющих на количество связанных с клетками внДНК, может быть активность протеаз плазмы крови. Известно, что протеазы играют важную роль в опухолевом процессе, обеспечивая лизис компонентов внеклеточного матрикса, что обеспечивает быстрый рост опухоли, ее инвазию и метастазирование (Клишко и соавт., 2003). Повышенная активность специфических протеаз может приводить к деградации нуклеопротеиновых комплексов и отделению их от поверхности клеток (Matrisian et al., 2003). Дальнейшее распределение внДНК в плазме крови, их метаболизм и секреция определяются действием целого комплекса факторов, которые являются либо общими, либо специфическими при развитии опухолей различной локализации.

4. Количество и распределение в крови внРНК Данные о концентрации внРНК в плазме в норме и при патологиях характеризуются высокой вариабельностью значений (Fleischhacker and Schmidt, 2007). Метод количественной ОТ-ПЦР является чувствительным и специфичным для определения копийности специфических мРНК, однако их содержание может значительно варьировать в общем количестве внРНК молекул крови. Причинами являются изменения экспрессии генов в клетках, а также влияние многих факторов, обеспечивающих метаболизм и утилизацию в организме внРНК. В данной работе количество внРНК крови было определено различными методами и проведен корреляционный анализ полученных данных.

4.1.Анализ суммарных внРНК методом флуоресценции 4.1.1. внРНК в крови клинически здоровых людей Образцы крови 15 здоровых мужчин и 15 здоровых женщин были получены из ЦКБ СО РАН г. Новосибирска. Концентрацию общего количества внРНК определяли в плазме и ФБ-ЭДТА и трипсиновом элюатах с клеточной поверхности методом анализа флуоресценции комплексов выделенных РНК с красителем SYBR Green II.

Концентрации внРНК в плазме здоровых людей варьировали от 0 до нг/мл крови. У клинически здоровых мужчин и женщин в плазме крови концентрации внРНК достоверно не различаются и составляют в среднем и 3 нг/мл крови (t-критерий, р=0.13) (рис. 15). Следует отметить, что, как и в случае внДНК, внРНК в норме оказались преимущественно связанными с поверхностью форменных элементов – в среднем 97% и 90% от общего количества внРНК крови для мужчин и женщин, соответственно.

Рис. 15. Концентрации внРНК плазмы (Плазма) и внРНК, связанных с поверхностью клеток крови (Клетки) здоровых людей.

Было показано, что суммарные концентрации внРНК, связанных с клеточной поверхностью, у здоровых мужчин достоверно выше, чем у женщин и составляют в среднем 262 нг/мл и нг/мл крови (t-критерий, р <0.001). Выявленные нами различия между здоровыми мужчинами и женщинами по суммарной концентрации внРНК крови учитывались в дальнейших исследованиях при формировании контрольных групп.

4.1.2. внРНК крови больных опухолями молочной железы Образцы крови были получены от 20 здоровых женщин, 13 больных доброкачественными (фиброаденома) опухолями и 20 больных раком молочной железы (МЖ), первично обратившихся в Областной онкологический диспансер г. Новосибирска. Больные раком молочной железы находились на T1-4NХ,0-2M0 стадии заболевания (классификация TNM). Больные 1-2 стадии составляли 85%, больные с выявленными метастазами в регионарные лимфоузлы составляли 80%, отдаленных метастазов у всех больных выявлено не было. В табл. 6 представлены средние значения концентраций внРНК, определенных флуоресцентным методом.

Было показано отсутствие достоверных отличий концентраций внРНК между здоровыми женщинами и больными раком молочной железы при сравнении их как в плазме (критерий Манна – Уитни, р = 0.212), так и во внРНК, связанных с клеточной поверхностью (критерий Манна – Уитни, р = 0.356). Статистически значимое отличие было выявлено только при сравнении концентрации внРНК в плазме у больных фиброаденомой и больных раком молочной железы (критерий Манна – Уитни, р<0.05), тогда как концентрации внРНК на поверхности клеток крови в этих группах не различаются (критерий Манна – Уитни, р>0.05). Таким образом, при опухолях молочной железы анализ концентраций внРНК крови методом флуоресценции не имеет диагностической значимости.

Таблица 6. Концентрации (нг/мл) внРНК в крови у здоровых женщин и у больных опухолями молочной железы Группа обследованных внРНК плазмы внРНК, связанные с поверхностью клеток Здоровые женщины 3.3 (М 2, Д 1 - 11) 39 (М 26, Д 15 - 127) Больные фиброаденомой 5.7 (М 3.4, Д 2 - 19) 53 (М 41, Д 11 - 142) молочной железы Больные раком молочной 1.9 (М 1.4, Д 0 - 7) 47 (М 28, Д 4 - 248) железы Примечание: Представлены средние значения, медиана (М), диапазон (Д) 4.1.3. внРНК крови больных раком легких Группу больных раком легких составили 25 мужчин, первично обратившихся в Областной онкологический диспансер г. Томска, возрастом от 46 до 74 лет. Контрольную группу составили 12 мужчин, сопоставимых по возрасту. Больные находились на T1-4NХ,0-2M0-1 стадии заболевания (классификация TNM).

Таблица 7. Концентрации (нг/мл) внРНК в крови у здоровых мужчин и у больных раком легких Группа обследованных внРНК плазмы внРНК, связанные с поверхностью клеток Клинически здоровые мужчины 5.3 (М 4, Д 0-17) 270 (М 262, Д 148-432) Больные раком легких 7.7 (М 4, Д 0-32) 335 (М 242, Д 29-1266) Больные со стабилизацией или 6 (М 3, Д 1-9) 205 (М 216, Д 29-378) регрессией болезни Больные с прогрессией болезни 9 (М 6.5, Д 0-32) 408 (М 245, Д 104-1266) Примечание: Представлены средние значения, медиана (М), диапазон (Д) У больных раком легких по сравнению со здоровыми мужчинами не было выявлено статистически значимых отличий по концентрациям внРНК в плазме и внРНК, связанных с клеточной поверхностью (критерий Манна – Уитни, р>0.05) (табл. 7). Было выявлено также отсутствие достоверной ассоциации повышенного уровня внРНК на клеточной поверхности с прогрессией рака легких (205 нг/мл и 408 нг/мл, критерий Манна – Уитни, р= 0.141). Таким образом, при раке легких определение концентраций внРНК, находящихся в плазме и связанных с поверхностью форменных элементов крови, при помощи флуоресцентного метода не имеет значимости для прогнозирования течения заболевания.

В работе получены данные о том, что внРНК, связанные с поверхностью клеток, составляла не менее 90% от общего количества циркулирующей внРНК как в норме, так и при раке легких и молочной железы. Можно было предполагать, что использование этих внРНК возможно для разработки диагностики на основе анализа опухоль-ассоциированных мРНК.

4.2. Анализ РНК различных генов во внРНК крови Для получения фундаментальных знаний о закономерностях секреции и метаболизма внРНК в крови необходим детальный анализ количества и распределения по фракциям крови РНК разных генов и выявление корреляций между ними. Сравнение их в норме и при заболеваниях может иметь значение для практической медицины поскольку поможет выбрать опухоль-ассоциированные маркеры и надежные внутренние стандарты.

4.2.1. Анализ мРНК генов маммаглобина и -актина во внРНК крови Одним из кандидатов на роль специфичного маркера, ассоциированного с опухолями молочной железы, является мРНК гена, кодирующего белок маммаглобин (МГ). По литературным данным, детекция мРНК МГ в тканях опухолей молочной железы достигала 81%, тогда как частота выявления мРНК маммаглобина в плазме крови составляла 54% (Min et al., 1998).

Рис. 16. Анализ продуктов ОТ-ПЦР мРНК -актина (1, 3, 5, 7, 9, 11) и мРНК маммаглобина (2, 4. 6, 8, 10, 12): Электрофорез в нативном 6% ПААГ.

Использовали внРНК, выделенные из плазмы крови (3, 4), ФБ-ЭДТА элюата с поверхности эритроцитов (5, 6), ФБЭДТА элюата с поверхности лейкоцитов (7, 8), трипсинового элюата с поверхности эритроцитов (9, 10), трипсинового элюата с поверхности лейкоцитов (11, 12), отрицательный контроль (1, 2), маркеры длины дцДНК на основе pUC19/Kzo9I (13).

Были проанализированы образцы крови 15 больных раком молочной железы в возрасте от 34 до 65 лет и 8 здоровых женщин, сопоставимых по возрасту. Больные раком молочной железы находились на T1-4NХ,0-2Mстадии заболевания (классификация TNM).

Для выявления мРНК МГ методом качественной ОТ-ПЦР были использованы внРНК, выделенные из всех фракций, получающихся после обработки цельной крови: плазмы и элюатов с поверхности предварительно разделенных эритроцитов и лейкоцитов. Для контроля выделения внРНК, использовали ОТ-ПЦР на мРНК -актина. Данные двух анализов продуктов ОТ-ПЦР мРНК маммаглобина и -актина в РНК из фракций крови приведены на рис. 16.

Было показано, что для увеличения чувствительности анализа мРНК МГ методом качественной ОТ-ПЦР следует использовать суммарные внРНК крови. мРНК МГ детектировалась с чувствительностью 60% в плазме крови, тогда как при использовании суммарных внРНК чувствительность анализа возрастала до 73%. При этом мРНК МГ не детектировалась у здоровых женщин, что говорило о 100% специфичности анализа маркера в суммарных внРНК крови. Присутствие фрагментов РНК, которые выявляются методом ОТ-ПЦР, вероятно, свидетельствует о том, что внРНК в плазме и на клеточной поверхности находятся в составе комплексов, которые предотвращают быструю деградацию молекул под действием РНКгидролизующих ферментов крови.

Прямое подтверждение этому получено в исследованиях Нег и соавторов, показавших ассоциацию молекул мРНК гена GAPDH в плазме с микро-частицами, которые не проходят через 0.2 мкм фильтры и осаждаются при высокоскоростном центрифугировании плазмы (Ng et al, 2003). Известно, что секретируемые клетками в культуре внРНК входят в состав нуклеопротеиновых комплексов, комплексов с липидами, протеолипидами, фосфолипидами и белками. Однако неясно, является ли состав таких комплексов в крови универсальным для РНК различных генов.

Можно предполагать, внРНК присутствуют в циркуляции в разных формах, что вероятно влияет на их деградацию, выведение из кровотока, распределение в крови и по другим тканям, что в итоге определяет уровень их копийности в крови.

4.2.2. Копийность 18S рРНК и мРНК GAPDH во внРНК крови Были проанализированы 18S рРНК и мРНК GAPDH в тех же образцах внРНК здоровых женщин и пациенток с патологиями молочной железы, в которых была ранее определена концентрация внРНК методом флуоресценции (как описано в п. 4.1.1). Измерение количества копий мРНК GAPDH и 18S рРНК проводили методом количественного ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентно меченых Taqman зондов (наборы фирмы Eurogentec, Бельгия).

Согласно полученным данным, что копийность мРНК GAPDH не может быть использована в качестве стабильного внутреннего стандарта при анализе внРНК крови. Копийность мРНК GAPDH в крови характеризовалась очень высокой вариабельностью, особенно в группе пациенток при злокачественных опухолях, где разброс числовых значений достигал трех порядков (рис. 17). Возможно, с этим связано отсутствие достоверных различий между клинически здоровыми женщинами и больными раком молочной железы при анализе копийности мРНК GAPDH в плазме и суммарного количества их в крови (критерий Манна – Уитни, p= 0.155 и 0.096). Количество копий 18S рРНК, определяемое во внРНК крови, характеризовалось существенно меньшей вариабельностью по сравнению с мРНК GAPDH (рис. 18).

Рис. 17. Копийность мРНК GAPDH во внРНК плазмы (Плазма) и внРНК, связанных с поверхностью клеток (Клетки) фракциях крови у здоровых женщин (Норма), у больных фиброаденомой (Фиброаденома) и раком молочной железы (Рак МЖ).

Было выявлено достоверное повышение количества копий 18S рРНК в плазме крови и на поверхности клеток у больных при раке молочной железы по сравнению с клинически здоровыми женщинами и по сравнению с пациентками с диагнозом фиброаденома (критерий Манна – Уитни, P<0.01) (данные представлены в сводной табл. 10).

Рис. 18. Копийность 18S рРНК во внРНК плазмы (Плазма) и внРНК, связанных с поверхностью клеток (Клетки) фракциях крови у здоровых женщин (Норма), больных фиброаденомой (Фиброаденома) и раком молочной железы (Рак МЖ).

Следовательно, при опухолях молочной железы возможно использование 18S рРНК в качестве маркера, позволяющего не только отличить норму от патологии, но и дифференцировать злокачественные и доброкачественные новообразования.

Как и в случае мРНК GAPDH, во всех исследованных группах более значительная часть 18S рРНК в крови была связана с поверхностью клеток, чем было найдено в плазме, а именно 75, 63 и 64% (табл. 8).

Следует отметить, что при измерении внРНК методом флуоресценции, процент связанной с клеточной поверхностью внРНК был выше, чем при измерении мРНК GAPDH и 18S рРНК и составлял 90, 85 и 94% в исследованных группах (см. табл. 8). Этот факт позволял предполагать существование индивидуальных особенностей циркуляции специфических РНК в общем пуле внРНК молекул.

Кроме того, не были выявлены корреляции между концентрациями общей внРНК, определенной по флуоресценции, и копийностью РНК генов «домашнего хозяйства» (мРНК GAPDH и 18S рРНК) в крови клинически здоровых женщин (табл. 9).

Таблица 8. Относительное распределение внРНК между свободно циркулирующей в плазме и связанной с поверхностью клеток крови Группа обследованных внРНК* мРНК 18S мРНК мРНК GAPDH рРНК Ki-67 RASSFЗдоровые 90±24 79±28 75±27 82±23 73±Больные 85±12 71±24 63±36 84±20 86±фиброаденомой молочной железы Больные раком молочной 94±19 75±21 64±25 76±24 70±железы Примечание: Представлены средние значения и стандартные отклонения относительных количеств (%) внРНК, связанных с клеточной поверхностью * - концентрация внРНК, измеренная методом флуоресценции комплексов РНК с красителем SYBR Green II Полученные данные дают возможность предположить, что факторы, определяющие появление и распределение в крови рибосомных РНК и матричных РНК, не являются универсальными и приводят к наблюдаемым различиям.

Таблица 9. Корреляции между концентрациями 18S рРНК и мРНК GAPDH и внРНК, определенной методом флуоресценции комплексов с SYBR Green II Общая внРНК Здоровые женщины Больные раком молочной (детекция методом железы флуоресценции) 18S рРНК мРНК гена 18S рРНК мРНК гена GAPDH GAPDH внРНК плазмы нет* нет нет нет Связанная с нет нет 0.001 0.0клеточной поверхностью внРНК Суммарная внРНК нет нет 0.022 нет крови Примечание: Обработка данных проводилась при помощи теста ранговой корреляции Спирмена, представлены значения р * - нет – отсутствие корреляции, р>0,Интересно отметить, что у больных раком молочной железы суммарное количество внРНК крови по данным флуоресценции коррелирует только с суммарным количеством 18S рРНК и не коррелирует с мРНК GAPDH. Одним из объяснений полученных данных может быть различная защищенность молекул 18S рРНК и мРНК GAPDH от гидролиза в связи с их существованием в составе различных комплексов.

4.2.3. Копийность опухоль-ассоциированных мРНК генов RASSF8 и ki-67 во внРНК крови В качестве перспективных онкомаркеров при раке молочной железы были выбраны мРНК гена RASSF8, который гиперэкспрессирован в клетках MCF-7 и гена ki-67, который является давно известным маркером опухолевого роста и характеризует активную пролиферацию клеток (Schlossen et al., 2000). Анализ копийности мРНК ki-67 и RASSF8 проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентно меченых Taqman зондов (работа выполнена совместно с сотрудниками Института молекулярной медицины г. Любека, Германия).

Таблица 10. Достоверность различий копийности внРНК между группами здоровых женщин, больных фиброаденомой и раком молочной железы Отличия между GAPDH 18S рРНК Ki-67 RASSFгруппами внРНК в плазме 0.155 0.0001 0.009 0.0здоровые/рак внРНК суммарная 0.096 0.000002 0.003 0.0здоровые/рак внРНК в плазме 0.001 0.0001 0.002 0.00фиброаденома/рак внРНК суммарная 0.0002 0.0001 0.001 0.0фиброаденома/рак Примечание: Сравнение двух независимых выборок проведено по критерию Манна – Уитни (представлены значения р) Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что у пациенток со злокачественными опухолями достоверно возрастает количество опухоль- ассоциированных мРНК RASSF8 и Ki-67 по сравнению с группой клинически здоровых женщин и пациенток с фиброаденомой во внРНК плазмы и в суммарных внРНК крови (табл. 10).

Таблица 11. Чувствительность и специфичность анализа копийности мРНК RASSF8, кi-67 и 18S рРНК при сравнении больных при раке МЖ с группой без злокачественных опухолей.

Характеристики анализа мРНК мРНК кi-67 18S рРНК RASSFПороговый уровень (коп/мл 3000 47000 2150плазмы) Чувствительность теста (%) 73 73 (95%CI) (49.8- 89.2) (49.8- 89.2) (59.7- 94.7) Специфичность теста (%) (95%CI) 74 80 (53.7 - 88.8) (62.1- 91.3) 76.3- 98.0) Площадь под графиком (AUC) 0.74 0.78 0.(0.60- 0.85) 0.64 - 0.87) (0.72 - 0.92) Примечание: Чувствительность и специфичность определяли методом ROCанализа Была проведена оценка значимости анализа копийности 18S pРНК, мРНК генов RASSF8 и Ki-67 во внРНК плазмы крови для дифференцировки дорокачественных и злокачественных опухолей молочной железы (табл. 11).

Согласно данным ROC-анализа, определение копийности выбранных РНК позволяло не только отличить норму от патологии, но и дифференцировать злокачественные и доброкачественные новообразования с высокой чувствительностью и специфичностью.

5. Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии во внДНК крови при онкологических заболеваниях 5.1. Выявление метилированных форм генов HIC-1, RAR2, RASSF1A и сyclin D2 во внДНК крови Аберрантное метилирование промоторных областей генов опухолевой супрессии HIC-1, RAR2, RASSF1A и сyclin D2 определяли методом качественной метил-специфичной ПЦР (МС-ПЦР) во внДНК, выделенных из фракций крови больных с опухолями молочной железы и клинически здоровых женщин. Чувствительность МС-ПЦР, использованных в работе, позволяла выявлять один аберрантно метилированный аллель ДНК в присутствии 1000 неметилированных.

Рис. 19. Анализ продуктов МС-ПЦР, специфичной к метилированной (М) и неметилированной (U) формам генов RASSF1A, RAR2 и HIC-1 методом электрофореза, окраска бромистым этидием. внДНК, выделяли из плазмы крови (плазма), из фракций, элюированных с поверхности эритроцитов (Эр) и лейкоцитов (Лей) при помощи ФБ-ЭДТА (ФБ) и раствора трипсина (Трип). Для контроля на метилированные формы генов использовали ДНК клеток линии КВ, на неметилированные формы – ДНК лейкоцитов в норме (Лей норма).

На рис. 19 представлены данные о выявлении аберрантно метилированных форм трех генов опухолевой супрессии RASSF1A, HIC-1 и RAR2 во внДНК крови у пациентки со злокачественной опухолью молочной железы. Видно, что во всех фракциях внДНК присутствовали продукты реакции, специфичной к неметилированным формам генов, которые происходили из клеток здоровых тканей. В некоторых фракциях внДНК были выявлены опухоль-ассоциированные гиперметилированные формы генов в сопоставимых количествах. У больных с опухолями молочной железы аберрантно метилированные формы каждого из трех генов с более высокой частотой выявлялись во фракциях внДНК, связанных с клеточной поверхностью, по сравнению с внДНК плазмы (табл. 11). Это наблюдение оказалось достаточно неожиданным, поскольку согласно полученным ранее данным количество внДНК, связанной с поверхностью клеток при злокачественных опухолях молочной железы, существенно снижается по сравнению с этим показателем в норме (Laktionov et al., 2004)). Можно предполагать, что причиной этого является более высокий уровень сорбции именно гиперметилированной внДНК на клетках крови, однако данное предположение можно подтвердить только количественным анализом.

В данной работе не было выявлено достоверных различий в распределении аберрантно метилированных генов во фракциях внДНК, элюированных с поверхности лейкоцитов и эритроцитов, равно как и в ФБЭДТА и трипсиновом элюате.

Таблица 12. Частота встречаемости (%) аберрантно метилированных генов RASSF1A, RAR2 и HIC-1 в различных фракциях внДНК крови у здоровых женщин и пациенток с опухолями молочной железы внДНК внДНК на ВнДНК на внДНК внДНК Группа Ген в эритроцитах лейкоцитах на в плазме ФБ- трип ФБ- трип клетках крови HIC-1* 55 35 45 70 45 90 Больные RASSF1А 15 35 0 35 30 65 раком RAR 15 5 25 20 15 60 МЖ RASSF1А/RAR** 30 Больные HIC-1 40 27 73 67 53 93 с фибро- RASSF1А 7 27 33 40 27 53 аденомой RAR 13 0 7 0 13 20 МЖ RASSF1А /RAR 13 HIC-1 0 10 10 50 20 50 Здоровые RASSF1A 0 0 0 0 0 0 женщины RAR 0 0 0 0 0 0 RASSF1A/ RAR 0 * частота встречаемости аберрантно метилированных аллелей каждого из генов ** частота встречаемости аберрантно метилированных аллелей по крайней мере одного из двух генов Частота встречаемости аберрантно метилированных аллелей была выше во фракции внДНК, связанных с поверхностью лейкоцитов, чем во фракции внДНК, элюированных с эритроцитов (табл. 12), что согласуется с полученными в работе данными, согласно которым с поверхностью отдельного лейкоцита связано, по крайней мере, в 100 раз больше внДНК, чем с поверхностью отдельного эритроцита.

Метилирование промотора гена HIC-1 в ДНК крови в районе, выбранном для анализа, как оказалось, не является специфичным только для опухолей, поскольку выявляется у 50% клинически здоровых женщин.

Метилированная форма гена RASSF1A выявляется с одинаковой частотой (60%) в элюатах с поверхности клеток больных РМЖ и фиброаденомой МЖ.

В отличие от RASSF1A, метилированная форма гена RAR2 в три раза чаще встречается у пациентов со злокачественными опухолями МЖ, чем у больных с фиброаденомой во фракциях внДНК, связанной с клетками: 60% при раке и 20% при фиброаденоме МЖ (табл. 12).

Таким образом, было показано, что внДНК, связанные с поверхностью клеток крови, может быть использована наряду с внДНК плазмы крови для повышения чувствительности МС-ПЦР анализа метилированных генов в крови. Анализ суммарных внДНК крови приводил к выявлению метилированных форм одного из генов RAR2 и RASSF1A с частотой 90% в крови больных раком молочной железы, 60% в крови пациентов с фиброаденомой и характеризовался 100% специфичностью (табл. 12).

Однако такой анализ не давал возможности дифференцировать опухоли МЖ различной этиологии.

По данным других исследований, метилирование гена cyclin Dвыявлено в тканях опухоли в 57% случаев заболевших раком молочной железы и не было обнаружено при других патологиях МЖ (Lewis, et al., 2003). Поэтому в работе был проведен анализ метилирование гена cyclin D2 во внДНК тех же образцов, в которых анализировали другие гены. Было показано, что у больных фиброаденомой метилированные формы гена не выявлялись в плазме, но обнаруживались как в ФБ-ЭДТА, так и в трипсиновых элюатах с поверхности лейкоцитов.

Таблица 13. Частота встречаемости (%) аберрантно метилированных форм генов RASSF1A, cyclin D2 и RAR2 во внДНК крови в норме и при опухолях молочной железы Больные раком МЖ Больные с Здоровые женщины фиброаденомой МЖ внДНК Суммарные внДНК Суммарные внДНК Суммарные плазмы внДНК плазмы внДНК плазмы внДНК RASSF1A, 60 95 13 87 0 RAR2, сyclin DRASSF1A, 30 90 13 60 0 RARRASSF1A, 50 95 6 80 0 cyclinDRAR2, 50 85 13 60 0 cyclinDПри анализе суммарной внДНК крови метилирование промоторной области гена cyclin D2 обнаруживалось у 70% больных раком молочной железы и у 33% пациенток с фиброаденомой. У здоровых женщин метилированная форма гена не выявлялась.

Анализ метилированных форм трех генов RASSF1A, cyclin D2 и RAR2, приводит к выявлению 95% злокачественных опухолей молочной железы и 87% доброкачественных опухолей при использовании суммарной внДНК крови (табл. 13). Согласно результатам других исследований в ДНК, выделенных из тканей карциномы МЖ, аберрантно метилированные формы одного из трех генов RAR2, RASSF1A и cyclin D2 выявлялись в 96% случаев, а при доброкачественных патологиях МЖ частота метилирования этих генов снижалась до 43% (Pu et al., 2003). В данной работе была показана 60% частота выявления метилированных маркеров при доброкачественных изменениях МЖ, что может быть связано с исследованием только пациентов с фиброаденомой МЖ, исключая цистоэпителиому, фиброзно-кистозную мастопатию и другие доброкачественные патологии МЖ.

5.2. Скрининг метилированных форм RAR2 и cyclin D2 во внДНК Для определения применимости анализа метилированных форм генов cyclin D2 и RAR2 как потенциальных маркеров онкологических заболеваний молочной железы, было проведено рандомизированное обследование женщин, наблюдающихся в женских консультациях Советского района г. Новосибирска. Определение маркеров проводилось «вслепую» методом МС-ПЦР с использованием суммарной внДНК крови.

Было обследовано 76 женщин в возрасте от 24 до 75 лет, средний возраст пациенток составил 50,4 года.

В контрольной группе из 25 клинически здоровых женщин только у одной (4%) было обнаружено метилирование гена cyclin D2. У 10 из 24 (42%) пациенток с диагнозом фиброаденома МЖ было зафиксировано аберрантное метилирование одного из исследованных генов. Более низкая встречаемость метилированных маркеров – в 8 случаях из 24 (33%) наблюдалась у пациенток с другими доброкачественными патологиями МЖ, диагностированными как различные формы мастопатии, однако различия не являются статистически достоверными (критерий Фишера, р>0.05). В результате проведенного исследования обнаружена более низкая частота выявления метилированных форм генов cyclin D2 и RAR2 у больных доброкачественной опухолью – фиброаденомой молочной железы, чем показано ранее (42% и 60% соответственно). Одно из возможных объяснений состоит в том, что большинство женщин из «группы риска» не имели цитологического подтверждения диагноза, в отличие от первого исследования, когда диагноз был сделан на основе гистологических анализов биопсийных проб.

Таким образом, группа пациенток с доброкачественными патологиями МЖ являлась неоднородной по наличию во внДНК крови маркеров опухолевого процесса, которые могут оказаться важными прогностическими факторами. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований для оценки эффективности выявления эпигенентических изменений генов сyclin D2 и RAR2 в качестве прогностических критериев при опухолях МЖ.

5.3. Выявление метилированных форм генов p15, MGMT и hMLHво внДНК В работе были проанализированы метилированные формы промоторных областей генов опухолевой супрессии p15, MGMT и hMLH1 во внДНК плазмы и связан с клеточной поверхностью в крови 30 больных К нных раком желудка и 30 клин находились на T1нически здоровых людей. Больные н NХ,0-2M0-1 стадии заболе кация TNM).

M евания (классифик Метилированные формы данных генов со значительно более высокой ф о частот встречаются в ДНК ткани опу и внДНК плазмы при раке той ухоли желуд й частотой у здоро 20).

дка и с наименьшей овых людей (рис. Рис. 20. Диапазон частоты встречаемости метилиро ованых форм генов p15, MGM hMLH1 в ткани MT, слизистой желудка в норме и в опух ткани при холевой раке желудка по литерату урным данным.

Согласн полученным но данным (рис. 21), в группе больных раком желуд аберрантное метилирование ген p15 выявлено в 50% случаев, в дка м на в группе людей без диагностированны патологий в 23% случаев.

е д ых Метил а ных лированная форма гена hMLH1 при анализе суммарн внДНК крови встреч ьных и у 17% здоро чалась у 27% боль овых людей.

Рис. 21. Анали продуктов МСиз ПЦР, спе ецифичной к метилированным м (М) формам генов p15, hMLH1, MGMT методом электрофореза, о окраска бромистым этидием. отрица ательный контроль без ДНК (1) отрицательный ), контроль (ДН лейкоцитов НК человека) (2), положительный контроль (ДН лейкоцитов, НК обработанная метилтрансферазой м SssI) (3), внДНК выделенные из К, элюатов с по оверхности клеток крови (4), марке длины дцДНК еры (5).

Частот встречаемости метилированной формы гена MGM в суммарных та MT внДНК крови составляла 67% у онкологических больных и 43% у здоровых К доноров. Данные о частоте выявлени метилированных форм генов ч ия опухол p T в крови больных раком желудка и левой супрессии p15, hMLH1, MGMT клинич юдей представлены чески здоровых лю ы на рис. 22.

Ча встречаемости метилирован форм трех генов во внДНК астота нных плазмы оказалась знач ем чаемости в ткани чительно ниже, че частота встреч опухол дка. При анализе суммарных внДНК как в плазме, так ли при раке желуд с и связ с поверхн клеток, час выявления метилированных занных ностью стота форм генов в наш эксперимента существенно возрастала и ших ах соответс атам едований, посвященных анализу ствовала результа других иссле ДНК опу Sato et al., 2006).

ухолевых тканей (S Таки образом, исп марных ( им пользование сумм внДНК (объединенные фракции ТА и трипсинового элюатов) значител и плазмы, ФБ-ЭДТ льно повышало чувствит ии ых тельность детекци метилированны формы генов MGMT, p15 и hMLH1. При определении статуса метилиро ования генов MGMT, p15 и hMLHв суммарной внДНК крови влялся с чувствите и рак желудка выяв ельностью 80% и специ. ялась ифичностью 33%. Низкая специфичность определя высокой частотой детекции аберрантного метилиро гена MGMT у клинически й ования T здоровы нализ метилирова ых людей (43%). Ан ания этого участка гена является, по-видимому, мало персп зработки первично диагностики пективным для раз ой рака жел лудка.

Рис. 22. Част выявления тота метилированных форм генов х опухолевой супрессии p15, hMLH1, MGMT в крови больных в раком желудка и здоровых а доноров.

Ком мбинированное определение аберрантно метилированны аллелей ых генов р15 и hMLH1 в суммарных внДНК крови в позволило дифференциро овать рак желудка по сравнению с клиниче вствительностью 63% и специфично еской нормой с чув 6 остью 63%. При анализе ния метилирования е частоты выявлен я генов опухолевой супрессии на разных этапах развития опухоли было об бнаружено, что у 71% больных раком желудка, находящ на Т2 ста детектирует изменение ж щихся адии, тся статуса метилирования од ледуемых генов. Метилированная дного из трех иссл форма одного из трех генов была выявле среди больных не имеющих о ена х, метастазы в регионарные лимфатические узлы в 67% слу и у 75% е учаев, больных без отдаленн метастазов. Была выявлен тенденция х ных на увеличе ечаемости метили ения частоты встре ированной формы одного из трех генов с прогрессией опух а, холевого процесса однако достоверных различий обнаруж не было. Та образом, абе ирование генов жено аким еррантное метили опухоле рактерно для всех исследованных ст евой супрессии хар тадий развития опухоли.

В работе было проведено сра ительности и авнение чувстви специфи анализов эпигенетических и белковых марке Для этого ичности еров.

был опр уровень белковых маркеров РЭА, СА 19.9, СА 72.4 в крови ределен б С тех же больных раком же и здоровых людей, у которы исследовали б елудка х ых профиль метилирования генов. Согласно полученным данным метод, ь о д основан на определен уровня белков маркеров в пл больных нный нии вых лазме РЖ, хар сокой остью нако рактеризуется выс специфично (100%), одн даже при комбини едовании маркер СА 19.9, СА 72.4 его ированном иссле ров чувствит деление РЭА в ко тельность не превышает 30%. Опред омбинации с СА 19.9 и СА 72.4 не пов чувствител но лишь ведет к потере и вышает льность, ь специф фичности до 85% (рис. 23).

Рис. 23. Часто встречаемости ота повышенного уровня белковых маркеров СА 72.4, СА 19.9, РЭА у больных рако желудка и ом клинически здор ровых людей.

Таким образом, проведение сравнительного анализа показало, что п чувствительно ость метода, основанного на определении частоты встречаемости опухоль-а ассоциированных белковых маркеров, существенно ниже по сравнению с анализом ДНКмаркеров. Следует отме ерных корреляций между наличием етить, что достове аберрантного метилиро генов опух супресси MGMT, p15 и ования холевой ии hMLH1 и повышенным уровнем белковых С у х маркеров РЭА, СА 19.9 и СА 72.в кро больных раком желудка на обнаружено не было. Это ови ами свидет ом, ют тельствует о то что данные параметры имею независимое значен при развити рака желудка и отражают разные стороны ние ии а р патоге енеза.

ЗАКЛЮ ЮЧЕНИЕ Р денного исследова ственный вклад в Результаты провед ания вносят сущес предст ых процессах, леж оддержания таких тавления о базовы жащих в основе по концен и форм внНК в крови мле орые нтрации в екопитающих, кото в норме не привод к неспецифич активации иммунной систем В настоящем дят ческой мы.

исслед показано что белки плаз и клеток кро участвуют в довании о, змы ови процессах быстрого ме илизации экзогенных фрагментов етаболизма и ути ДНК. Полученные резул я с данными о скорости выведения П льтаты согласуются из кро ируемых клетками организма (Lo et a ови внДНК, секрети al., 1999, To et al., 2003). Деградация олигомерных ДНК 3’-экзонуклеаза плазмы и о К ами накопл образующи коротких оли роцитах ление ихся игомеров в эритр в норме могут препятствовать локальному увеличению концентрации в крови и других тканях олиго-, мононуклеотидов и продуктов их метаболизма х и (нукле е очевая кислота), ко являются еозиды, свободные основания и мо оторые «сигна опасности» актвирующими иммунные клет (Ishii, 2008).

алами », тки Результаты настоящей работы свидете ьзу й ельствуют в поль высказанных ранее предположений о том, что восп кции палительные реак и развитие аутоим званы ми ммунного ответа могут быть выз нарушениям метаболизма нуклеи apirei et al., 2003).

иновых кислот (Na В едовании показано ДНК-олигомеры и В настоящем иссле о, что экзогенные Д продукты их метаболи in vivo фо ексы изма ормируют компле с белками сыворотки крови, причем прочность образующихся комплексов увеличивается при замене фосфодиэфирных связей на фосфоротиоатные.

Были выявлены существенные различия фармакокинетики между фосфодиэфирными олигонуклеотидами и химерными фосфодиэфирными олигонуклеотидами, содержащими две фосфоротиоатные группы на 3’конце молекулы. Полученные результаты свидетельствуют о влиянии химических модификаций ДНК-олигомеров на их биологические свойства, что согласуется с данными других исследований. Например, при использовании фосфоротиоатных аналогов CG-богатых олигонуклеотидов кроме целевого действия на иммунную систему были выявлены нежелательные побочные эфффекты, такие как активация гемопоэза, приводящая к значительному увеличению селезенки у мышей (Sparwasser et al., 1999).

В настоящей работе показано, что на биологические эффекты, вызываемые ДНК in vivo, кроме химических модификаций, влияет образование комплексов с полимерами поликатионной природы. ДНК и олигонуклеотиды в комплексах с полиэтиленимином оказывали существенно меньший стимулирующий эффект на пролиферацию клеток селезенки. Эти результаты позднее были подтверждены данными других исследователей, которые свидетельствуют об отсутствии стимулирующего действия комплексов плазмидных ДНК с полиэтиленимином на синтез ИЛ-in vivo (de Wolf et al., 2008). Полученные в настоящей работе результаты вносят существенный вклад в развитие представлений о механизмах взаимодействий экзогенных ДНК с клетками иммунной системы, что необходимо для разработки подходов, позволяющих модулировать их иммуностимулирующее действие. Эти знания позволят конструировать высокоэффективные ген-направленные терапевтические препараты, лишенные неблагоприятных побочных эффектов.

В настоящей работе впервые обнаружено, что внНК, присутствуют не только в плазме, но и на поверхности клеток крови. Выявлены их достоверные количественные и качественные изменения уже на ранних стадиях развития опухолей разной локализации и этиологии. Эти результаты имеют фундаментальное значение, поскольку позволяют пролить свет на практически неисследованный вопрос об их роли в патологических процессах. Следует подчеркнуть также важное практическое значение полученных данных, поскольку до сих пор известны очень немногие параметры биохимического состава крови, которые достоверно изменяются при раке на ранних стадиях.

В настояще время нет прямых свидетельств в пользу предположения об участии внДНК опухолевых клеток в формировании метастазов в отдаленных органах (Garcia-Olmo et al., 2005). Оно возникло в связи с тем, что был обнаружен фагоцитоз апоптотических телец клетками в культуре, который приводил к проникновению ДНК опухолевых клеток в нормальные клетки (Bergdsmegh et al., 2006). В пользу этой гипотезы свидетельствуют выявленные в настоящей работе данные о наличии корреляции увеличения концентрации внДНК в плазме крови с тяжестью заболевания при раке желудка. Другими исследователями была также выявлена корреляция внДНК сыворотки крови и колоректальными метастазами из печени (Thijssen et al., 2002).

Другой предполагаемый способ передачи опухолевых сигнальных молекул состоит в поглощении клетками микрочастиц, называемых экзосомами, содержащими мРНК, микроРНК и белки ангиогенеза (Valadi et al., 2007). Показано, что при трансформации клеток микрочастицами, содержащими мРНК репортерного гена, происходит трансляция соответствующего белка (Skog et al., 2008). В настоящем исследовании получены данные о присутствии опухоль-ассоцированных внДНК и внРНК на поверхности лейкоцитов крови, которые позволяют предполагать их участие в формировании метастазов. Известно, что лимфоцитарные и моноцитарные клеточные элементы обладают способностью мигрировать из кровеносных сосудов в межклеточное пространство и обратно практически во всех органах и тканях. Таким образом, они могут становиться переносчиками связанных с их поверхностью ДНК опухолевых клеток на большие расстояния и приводить к трансформации других тканей.

Полученные знания имеют несомненное практическое значение, поскольку определяют пути разработки принципиально новых подходов к терапии рака. Исследования последних лет убедительно показали достоверное снижение метастазирования в модели опухолей у мышей при терапии их ДНК-гидролизующими ферментами (Шкляева и соавт., 2008).

До сих пор остается открытым вопрос о том, почему не развивается адекватная иммунная анти-опухолевая реакция при раке. Более того, иммунная система организма находится в супрессированном состоянии, что связывают с действием факторов, индуцирующих апоптоз Т-лимфоцитов, например, Fas-лиганд (Kim et al., 2005). В связи с новыми открытиями в области циркулирующих микрочастиц, была выдвинута гипотеза о супрессирующем влиянии на иммунитет микроРНК, входящих в состав опухолевых экзосом (Ichim et al., 2008). За последние два года показано, что уровень некоторых опухоль-ассоциированных микроРНК в плазме крови существенно возрастает при лимфомах, опухолях простаты и яичников (Mitchell et al., 2008, Taylor et al., 2008). Важным результатом данной работы является обнаружение достоверного увеличения количества мРНК опухолевых клеток в плазме и на поверхности лейкоцитов крови онкологических больных по сравнению с нормой, что свидетельствует о перспективности дальнейших исследований роли свободных и связанных с клетками внРНК крови в патогенезе рака.

ВЫВОДЫ Настоящая работа представляет собой первое комплексное исследование взаимодействий экзогенных и секретируемых в организме человека внеклеточных нуклеиновых кислот с компонентами крови. Впервые определены факторы, приводящие к поддержанию в крови равновесной концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот, и получены принципиально новые данные, доказывающие значимость определения состава и количества внНК крови для диагностики онкологических заболеваний.

1. Впервые методом аффинной модификации in vivo определены факторы, влияющие на накопление и устойчивость экзогенных нуклеиновых кислот в крови.

Обнаружено, что низкомолекулярные продукты деградации ДНКолигомеров (моно-, ди-, три- и тетрануклеотиды) избирательно накапливаются в эритроцитах крови.

Показано, что олигомерные фрагменты ДНК связываются в организме с белками сыворотки (иммуноглобулинами и альбумином) и с белком мембраны лейкоцитов крови. Эффективность связывания пиримидинбогатых фрагментов ДНК с белками сыворотки крови возрастает с увеличением длины ДНК-олигомеров, а также при замене фосфодиэфирных связей на фосфоротиоатные.

Впервые показано, что в составе ковалентных аддуктов ДНК-белок происходит деполимеризация ДНК с образованием 7-8-звенных фрагментов.

2. Впервые показано, что стимулирующее действие ДНК, содержащих CG- и G-богатые участки, на пролиферацию лимфоцитов в культуре происходит рецептор-опосредованным путем.

Обнаружено ингибирование стимуляции пролиферации лимфоцитов под действием CG-содержащих ДНК моновалентными Fab-фрагментами анти-Ig антител.

3. В результате проведенного анализа концентраций и распределения внНК в крови в норме и при онкологических заболеваниях впервые обнаружено значительное количество внДНК и внРНК на поверхности клеток крови, связанных за счет ионных взаимодействий с мембраной и путем формирования комплексов с белками клеточной поверхности.

Выявлены характерные изменения количества внДНК, связанных с поверхностью клеток и находящихся в плазме крови: при раке легких наблюдается уменьшение количества внДНК на поверхности клеток, при раке желудка возрастает концентрация внДНК в плазме. Впервые показана взаимосвязь выявленных изменений со стадией опухолевого процесса.

Установлено, что анализ концентрации внДНК в плазме и на поверхности клеток крови может служить эффективным диагностическим фактором при выявлении опухолевого процесса и определении тяжести заболевания.

4. В результате определения концентраций внРНК во фракциях крови здоровых женщин и больных с опухолями молочной железы установлено, что анализ копийности 18S pРНК и опухоль-ассоциированных мРНК генов RASSF8 и Ki-67 во внРНК может служить эффективным диагностическим критерием для дифференцировки опухолей молочной железы различной этиологии.

5. Проведенное комплексное исследование статуса метилирования опухоль-ассоциированных генов во фракциях внДНК крови больных раком желудка и молочной железы впервые показало присутствие аберрантно метилированных аллелей генов опухолевой супрессии во внДНК, связанных с клеточной поверхностью.

Установлено, что анализ метилированных маркеров во внДНК, связанных с клеточной поверхностью, повышает чувствительность детекции больных с опухолями желудка и молочной железы по сравнению анализом только внДНК плазмы.

Обнаружено, что изменение статуса метилирования хотя бы одного одного из трех генов RASSF1A, сyclin D2 и RAR2 во внДНК крови с высокой точностью позволяет выявить больных с опухолями молочной железы разной этиологии.

Показано, что аберрантно метилированные формы генов опухолевой супрессии p15 и hMLH1 выявляются в суммарных внДНК крови с достоверно одинаковой частотой на всех стадиях рака желудка, что свидетельствует о перспективности использования такого анализа для ранней диагностики.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Vlassov V.V., Yakubov L.A., Karamyshev V.N., Pautova L.V., Rykova EY, Nechaeva M.V. In vivo pharmacokinetics of oligonucleotides following administration by different routes. // Delivery strategies for antisense oligonucleotide therapeutics. /S.

Akhtar (ed.). - CRC Press. - 1995. - P. 71-83.

2. Паутова Л. В., Рыкова Е. Ю., Лактионов П. П., Власов В. В. Исследование взаимодействий полиреактивных антител с нуклеиновыми кислотами при помощи алкилирующих производных олигонуклеотидов. // Молекуляр. биология.

- 1996. - Т. 30. - С. 941-950.

3. Лактионов П.П., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Участие поверхностных иммуноглобулинов в активации лимфоцитов плазмидной ДНК. // Молекуляр.

биология. - 1997. - Т. 30. - С. 506-514.

4. Rykova E.Y., Laktionov P.P., Vlassov V.V. Polyethylenimine masks mitogenic effect of DNA. // Nucleosides and Nucleotides. - 1997. - Vol. 16. - P. 1883-1891.

5. Rykova E.Y., Laktionov P.P., Vlassov V.V. Activation of spleen lymphocytes by plasmid DNA. // Vaccine. - 1999. - Vol. 17 - P. 1193-1200.

6. Лактионов П.П., Брыксин А.В., Рыкова Е.Ю., Амирханов Н.В., Власов В.В.

Исследование фармакокинетики и стабильности в крови in vivo фосфодиэфирных и модифицированных производных олигонуклеотидов. // Вопр. мед. химии. - 1999. - Т. 45. - С. 206-215.

7. Лактионов П.П., Брыксин А.В., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Исследование олигонуклеотид-белковых взаимодействий в крови in vivo. // Бюл. экспер. мед. - 1999. - Т.127. - С. 654-657.

8. Tosquellas G., Bryksin A., Alvarez K., Morvan F., Vasseur J.J., Rayner B., Rykova E., Laktionov P., Vlassov V., Imbach J.L. Prooligonucleotides exhibit less serumprotein binding than phosphodiester and phosphorothioate oligonucleotides. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. - 2000. - Vol. 19 - P. 995-1003.

9. Рыкова Е.Ю., Лактионов П.П., Власов В.В. Активирующее влияние ДНК на иммунную систему. // Успехи современной биологии. - 2001. - Т. 121. - С. 160-171.

10. Morozkin E.S., Laktionov P.P., Rykova E.Y., Vlassov V.V. Fluorometric quantification of RNA and DNA in solutions containing both nucleic acids. // Anal.

Biochem. - 2003. - Vol. 322. - P. 48-50.

11. Rykova E.Y., Laktionov P.P., Skvortsova T.E., Starikov A.V., Kuznetsova N.P., Vlassov V.V. Extracellular DNA in Breast Cancer: Cell-Surface–Bound, Tumor-Derived Extracellular DNA in Blood of Patients with Breast Cancer and Nonmalignant Tumors.

// Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2004. - Vol. 1022. - P. 217-221.

12. Morozkin E.S., Laktionov P.P., Rykova E.Y., Vlassov V.V. Extracellular Nucleic Acids in Cultures of Long-Term Cultivated Eukaryotic Cells. // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2004. - Vol. 1022 - P. 244-250.

13. Rykova E.Y., Skvortsova T.E., Laktionov P.P., Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E., Starikov A.V., Kuznetsova N.P., Kolomiets S.A., Sevostianova N.V., Vlassov VV.

Investigation of tumor-derived extracellular DNA in blood of cancer patients by methylation-specific PCR. // Nucleosides, nucleotides & Nucleic Acids. – 2004. - Vol.

23. - P. 855-859.

14. Skvortsova T.E., Rykova E.Y., Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E., Starikov A.V., Kuznetsova N.P., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Cell-Free and Cell-Bound Circulating DNA in Breast Tumors: DNA Quantification and Analysis of Tumor-Related Gene Methylation. // British J. Cancer. - 2006. - Vol. 94. - P. 1492-1495.

15. Rykova E.Y., Bryzgunova O.E., Skvortsova T.E., Tamkovich S.N., Senin I.S., Laktionov P.P., Zshakiel G., Vlassov V.V. Concentrations of Circulating RNA from Healthy Donors and Cancer Patients Estimated by Different Methods.//Ann. N. Y.

Acad. Sci. - 2006. - Vol. 1075. – P. 328-333.

16. Vlassov V.V., Laktionov P.P., Rykova E.Y. Extracellular nucleic acids. // BioEssays - 2007. - Vol. 29. - P. 654-667.

17. Рыкова Е.Ю., Скворцова Т.Э., Хоффман А.-Л., Тамкович С.Н., Стариков А.В., Брызгунова О.Е., Пермякова В.И., Варнеке Е., Шакиель Г., Власов В.В., Лактионов П.П. Циркулирующие внеклеточные ДНК и РНК крови в диагностике онкопатологий молочной железы. // Биомед. химия. - 2008. - Т. 54. - С. 94-103.

18. Rykova E.Y., Tsvetovskaya G.A., Sergeeva G.I., Vlassov V.V., Laktionov P.P.

Methylation-based analysis of circulating DNA for breast tumors screening. // Ann. N.

Y. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 1137. - P. 232-236.

19. Kolesnikova E.V, Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E., Shelestyuk P.I., Permyakova V.I., Vlassov V.V., Tuzikov S.A., Laktionov P.P, Rykova E.Y. Circulating DNA in the blood of gastric cancer patients. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 1137. - P. 226232.

20. Морозкин Е.С., Сильников В.Н., Рыкова Е.Ю., Власов В.В., Лактионов П.П.

Внеклеточная ДНК культуре первичных и трансформированных клеток, инфицированных и неинфицированных микоплазмой. // Бюл. экспер. мед. - 2009.

- Т. 147. - С. 67-70.

21. Елистратова Е.В., Лактионов П.П., Шелестюк П.И., Тузиков С.А., Власов В.В., Рыкова Е.Ю. Иммунохимические и молекулярно-генетические маркеры в диагностике рака желудка. // Биомед. химия. - 2009. - Т. 55. - С. 15-20.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.