WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

БУРКОВА Наталья Владимировна

  Эффекты малообъемной перфузии крови, активированной гемосорбентами

14.03.03 патологическая физиология

03.03.01 физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

2010

Работа выполнена в ФМБА ФГУП «Научно-исследовательский институт промышленной и морской медицины», г. Санкт-Петербург

Научные консультанты:  доктор медицинских наук

Кузнецов Сергей Иванович

доктор медицинских наук  профессор

Довгуша Виталий Васильевич

Официальные оппоненты:  доктор биологических наук профессор

Кокряков Владимир Николаевич 

доктор биологических наук профессор

  Пушкарев Юрий Петрович

  доктор медицинских наук  профессор

  Гуревич Константин Яковлевич

  Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия  им. С.М. Кирова» МО РФ

Защита состоится «____» ___________2010г. в___часов на заседании специализированного ученого совета Д 001.022.02 по защите кандидатских и докторских диссертаций при Учреждении Российской Академии наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН

Автореферат разослан  «___»__________ 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук П.А. Дыбан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность работы. Среди методов физико-химической коррекции гомеостаза при различных видах патологии важная роль принадлежит эфферентной терапии. Эфферентные технологии позволяют извлекать из крови экзогенные и эндогенные токсины, моделировать внутри и вне организма естественные процессы его очищения или существенно дополнять их в случае нарушения функций детоксицирующих систем организма [Лопухин Ю.М. и др., 1995; Шилов В.Н., Сергиенко В.И., 1997; Картель Н.Т., 1998; Чаленко В.В. и др., 1990, 1999; Ветров В.В., 1999, 2003; Костюченко А.Л., 2003;  Беляков Н.А. и др., 2000; Петросян Э.А., 2002, 2004; Гуревич К.Я. и др., 2004; Петросян Н.Э., 2009; Fiedler R. еt al., 2001].

В настоящее время доказана высокая эффективность гемосорбции как метода активного удаления из крови различных токсических продуктов путем контакта крови с сорбентом вне организма. Гемосорбция применяется при экзотоксикозах [Лужников Е.А.,1998; Михальчук М.А. и др., 2001; Henderson J.H. et al., 2001; Tasdemir H. et al., 2002; Degim T. et al., 2004], эндотоксикозах [Мишин В.Ю., 1998; Ponikvar R. et al., 2003; Jalan R. et al., 2004], хронических окклюзиях нижних конечностей [Перепелица В.Н., 2007], аутоиммунных и аллергических заболеваниях [Кузнецов В.П. и др., 2002], болезнях, связанных с нарушением обмена веществ [Шилов В.Н. и др., 2000], нервно-психических заболеваниях [Давыдов А.Т. и др., 2002; Дмитриева Т.Б. и др., 2003].

Установлено, что гемосорбционная процедура изменяет окислительно-восстановительный потенциал периферической крови, стимулирует клеточное и гуморальное звено иммунитета, оптимизирует микроциркуляцию и другие системы организма [Кручинский Н.Г. и др., 1997; Абубакирова А.М. и др., 1997; Яременко О.Б. и др., 2002; Demirkiran O. et al., 2003].

При всей очевидности положительных эффектов гемосорбции как метода коррекции гомеостаза при различных видах патологии механизмы, опосредующие их, остаются во многом неясными.

Как известно, метод гемосорбции основан на двух принципах – адсорбции, которая определяется силами молекулярного сцепления и обусловлена образованием связей различной природы между токсическими продуктами и сорбентом, и контактной активации крови. Опыт эфферентной терапии показал, что гемосорбенты связывают и удаляют из кровотока определенные, в том числе токсические, соединения в соответствии с их емкостными характеристиками [Мельник Г.В. и др., 1998; Солдатов  А.И., 2001; Ветров В.В., 1999, 2003].

Однако, реакция организма на удаление сорбируемого продукта при гемосорбции неоднозначна. Показано, что содержание удаляемого эндогенного вещества после гемосорбционной процедуры может быстро восстанавливаться и даже превышать исходные значения, но лечебный эффект при этом сохраняется длительное время. Оказалось, что в некоторых случаях корреляция между количеством удаленной субстанции, рассматриваемой как патогенный фактор, и положительным эффектом сорбционной процедуры отсутствует [Чучалин А.Г. и др., 1984; Деденко И.К. и др., 1998; Воинов В.А., 1999; Бельских А.Н. и др., 2001; Давыдов А.Т. и др., 2002].

При гемосорбции происходит активация  клеточных элементов крови  как непосредственно при их контакте с поверхностью гранул сорбента, так и  опосредованно через воздействие гуморальных факторов. При взаимодействии крови с сорбционной поверхностью активируются практически все гуморальные и клеточные системы крови с передачей информации на клетки и межклеточную среду организма. Эти процессы разввертываются за короткий промежуток времени и носят транзиторный характер [Кузнецов С.И., 1998, 2001, 2005, 2006].

С этих позиций логично предположить, что местные и системные механизмы повышения резистентности организма при различных видах патологии можно инициировать перфузией через сорбенты малого объема крови, а выраженность активации гуморальных и клеточных систем крови будет определяться физико-химическими свойствами твердофазных препаратов с одной стороны, и реакцией клеток и систем организма – с другой.

Представляется, что для  достижения наибольшего лечебного эффекта  активированную контактным способом кровь целесообразно направлять непосредственно в регион, где расположены патологически измененные органы и ткани. Оптимальной для этого формой терапии может быть применение малообъёмной гемоперфузии. 

Цель исследования – изучение функциональных изменений компонентов крови при контакте с гемосорбентами и оценка эффектов малообъемной гемоперфузии сосудистого региона при различных видах патологии. 

Задачи исследования:

1. Изучить особенности клеточного состава крови при малообъемной гемоперфузии (50 мл) различной длительности через углеродный сорбент СКТ-6А-ВЧ и Агарозу-4Б in vitro.

2. Провести комплексный анализ реакций органного и тканевого кровотока на проведение гемоперфузии без сорбента и через различные по химической структуре гемосорбенты (СКТ-6А-ВЧ и Агароза-4Б) в эксперименте.

3.  Разработать методику малообъемной гемоперфузии и варианты ее применения у людей с различными видами патологии.

4. Изучить динамику изменения концентраций нитратов и нитритов в венозной крови, метаболитов арахидоновой кислоты, а также показателей удельной хемилюминесценции у пациентов с различными  видами патологии до и в течение 30 мин после малообъемной гемоперфузии.

5. Определить динамику концентраций цитокинов плазмы крови у больных с критической ишемией нижних конечностей и воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти до и после малообъемной гемоперфузии.

6. Определить концентрации лактоферрина и миелопероксидазы в плазме венозной крови до и после малообъемной гемоперфузии у пациентов с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти.

7. Провести анализ результатов применения малообъемной гемоперфузии в клинике и оценить степень эффективности использования данного метода при разных видах патологии.

Научная новизна. В результате экспериментально-клинических исследований впервые получены данные, которые позволяют оценить роль активации крови при малообъемной гемоперфузии через гемосорбенты в комплексной терапии пациентов с различными видами патологии.

Экспериментально доказано, что при перфузии малого объема крови (50 мл) через колонку с углеродным гемосорбентом происходят изменение клеточного состава, увеличение удельной хемилюминесценции крови, а также активация лейкоцитов, степень которой зависит от химической природы гемосорбента.

Анализ регионарного кровотока показал, что малообъемная гемоперфузия через гемосорбенты (СКТ-6А-ВЧ, Агароза-4Б) сосудистого региона задней конечности лабораторных крыс приводит к увеличению доли сердечного выброса, адресованной тканям перфузируемой конечности, и повышению в ней интенсивности микроциркуляции.

Установлено, что усиление регионарного кровотока при малообъемной гемоперфузии пораженной конечности у людей сочетается с увеличением суммарной концентрации нитратов и нитритов в венозной крови, а также с повышением концентраций эйкозаноидов, обладающих вазодилятаторными свойствами. При использовании малообъемной гемоперфузии у пациентов с термическими поражениями конечностей снижается микробная обсемененность раневой поверхности. Регионарная малообъемная гемоперфузия у пациентов с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями конечностей вызывает повышение концентраций лактоферрина и миелопероксидазы, а также увеличение содержания противовоспалительных и уменьшение провоспалительных цитокинов в венозной крови.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные в исследовании теоретические и практические данные расширяют представления о возможных эффектах активации клеток крови при проведении перфузии через гемосорбенты. Комплексная оценка эффектов малообъемной гемоперфузии в эксперименте и  клинике позволяет рассматривать активацию клеточных элементов крови при контакте с гемосорбентами как фактор, оказывающий терапевтический эффект при использовании традиционных методов эфферентной терапии. Теоретически обоснована целесообразность проведения малообъемной гемоперфузии для профилактики и коррекции микроциркуляторных нарушений при различных видах патологии.

Разработаны гемоконтактное устройство и оригинальные способы проведения малообъемной гемоперфузии сосудистых регионов людей при различных видах патологии. Доказано, что способ малообъемной гемоперфузии может быть использован в схемах терапии критической ишемии  и термических травм нижних конечностей, а также воспалительных и гнойно-некротических заболеваний пальцев и кисти.

Включение регионарной малообъемной гемоперфузии через углеродный гемосорбент в комплекс стандартной терапии больных с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти приводит к сокращению времени пребывания пациентов в стационаре. Использование целевой малообъемной гемоперфузии в комплексной терапии больных с критической ишемией нижних конечностей приводит к снижению числа высоких ампутаций и уменьшению  летальности в отдаленные сроки.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При контакте  крови с углеродным гемосорбентом СКТ-6А-ВЧ in vitro происходит изменение клеточного состава, увеличение удельной хемилюминесценции крови, а также активация лейкоцитов, степень которой зависит от химической природы используемого гемосорбента (СКТ-6А-ВЧ и Агароза-4Б).

2. При малообъемной гемоперфузии задней конечности крыс с использованием углеродного сорбента СКТ-6А-ВЧ или Агарозы-4Б наблюдаются усиление кровоснабжения перфузируемой конечности и тенденция к его увеличению в контралатеральной области.

3. Усиление регионарного кровотока при малообъемной гемоперфузии пораженной конечности у людей сочетается с увеличением суммарной концентрации нитратов и нитритов, а также с повышением концентраций метаболитов арахидоновой кислоты за счет преимущественного увеличения содержания эйкозаноидов, обладающих вазодилятационными свойствами.

       4. Применение малообъемной гемоперфузии у пациентов с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями конечностей приводит к усилению удельной хемилюминесценции оттекающей от пораженного региона крови, увеличению концентраций лактоферрина и миелопероксидазы, а также к изменению соотношения цитокинов в плазме крови – увеличению концентрации противовоспалительных (ИЛ-10) и уменьшению содержания провоспалительных (ИЛ-1, ИФН-, ФНО- ИЛ-8) цитокинов.

5. Применение курса (4 процедуры) малообъемной гемоперфузии через СКТ-6А-ВЧ в комплексе со стандартной терапией приводит к коррекции гемодинамических нарушений в перфузируемом сосудистом регионе, улучшению ближайших и отдаленных результатов лечения больных с критической ишемией и термическими травмами нижних конечностей, а также воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти.

Личный вклад автора. Личное участие автора выразилось в определении основной идеи исследования, выработке методов его выполнения, непосредственном участии при выполнении экспериментального раздела, разработке на уровне изобретений способов малообъемной гемоперфузии и проведении комплексной оценки возможных механизмов их лечебного эффекта при различных видах патологии. Проведена статистическая обработка и анализ полученных результатов исследования.

Апробация работы. Международная конференция «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2001; Конференция «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», СПб., 2001; Конференция «Актуальные проблемы комбустиологии, реаниматологии и экстремальной медицины» Саранск, 2001; III Всероссийская конференция «Гомеостаз и инфекционный процесс, Сочи, 2002; Международный Конгресс хирургов, Петрозаводск, 2002; Международная конференция «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге, 2002; Научно-практическая конференция «Клиническая эндокринология – достижения и перспективы», СПб., 2003; Юбилейная конференция ВМА «Актуальные проблемы хирургии сердца и сосудов, СПб., 2003; IV научно-практическая конференция хирургов СЗ России, Петрозаводск, 2003; Конференция «Механизмы типовых патологических процессов», СПб., 2003;  Всероссийская конференция с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге – 2003»; XXXVI Научная конференция “Оптимизация больничной среды средствами новых технологий», СПб., 2004; Научная конференция «Методы исследования регионарного кровообращения и микроциркуляции в клинике», СПб., 2004; Научная конференция «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», СПб., 2004; Научная конференция «Актуальные проблемы прикладной анатомии, оперативной и клинической хирургии», СПб., 2004; VIII Всероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2004; I Съезд амбулаторных хирургов, 2004; IX Всероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2005; I Съезд физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», Сочи, 2005; Юбилейная международная конференция «Современные проблемы науки и образования», Москва, 2005; X Всероссийский научный форум с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии», 2006; I научно-практическая конференция ФМБА России «Актуальные вопросы профпатологии», Северодвинск, 2007; XI Всероссийский форум с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии», 2007; Международная научная конференция РАЕ, Москва, 2007; Объединенный иммунологический форум, СПб., 2008; II Съезд физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», Кишинев, 2008; Пятый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2009.

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы внедрены: в научные исследования ФГУП НИИ промышленной и морской медицины (Санкт-Петербург), в учебный процесс кафедры общей хирургии СПб ГМА им. И.И.Мечникова, в лечебный и преподавательский процесс С-Пб Государственного НИИ скорой помощи им. И.И.Джанелидзе, в клиническую практику хирургического отделения больницы г. Переяславль-Залесский, а также в лечебный процесс С-Пб Центра по лечению хирургических инфекций (Городская больница №14), отделения гнойной остеологии 20-2 Городской больницы Петра Великого, 3 хирургического отделения Городской больницы №3 (Санкт-Петербург).

Публикации:  По материалам диссертации опубликовано 76 научных работ, в том числе 8 работ в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 285 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, из 4-х глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Библиография включает 417 источников, из которых 265 отечественных и 152 зарубежных. Работа иллюстрирована  11  рисунками и  48 таблицами.

Материал и методы исследования

Природа гемоконтактных препаратов

– СКТ-6А-ВЧ – угольный поливалентный, деминерализованный и дополнительно очищенный сорбент с диаметром гранул 0,5–1,0 мм (СПбМАПО).

– Агароза-4Б – четырехпроцентная поперечносшитая гранулированная крупнозернистая агароза с диаметром гранул 0,4–1,0 мм (НИИ химии АНЭР).

Эксперименты in vitro

Эксперименты in vitro выполнены с использованием проб крови здоровых доноров. Соотношение крови и гемосорбента в гемоконтактной колонке – 4:1. В колонки забирали кровь, пропуская через сорбент, и устанавливали в ротационное устройство, осуществлявшее вращение проб с постоянной скоростью. Общее время контакта крови с гемосорбентом составляло 120 мин. Через определенные промежутки времени проводили забор проб крови (пропуская через сорбент) для регистрации исследуемых показателей.

Оценка миграционной активности лейкоцитов

Постановку реакции на спонтанную миграцию осуществляли в 5 канальных капиллярах по методу А.Г.Артемовой (1973).

Лизосомально-катионный тест

Фиксацию и окраску мазков крови проводили согласно методическим рекомендациям “Лизосомально-катионный тест” [Пигаревский В.Е., 1979].

Метод люминолзависимой хемилюминесценции

Исследования спонтанной и индуцированной хемилюминесценции проводили методом люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) (LKB-Wallac 1251, Швеция). В качестве индуктора использовали опсонизированный зимозан.

Исследование клеточного состава крови

Анализ количества клеточных элементов проводили на гемоцитометре  Hemoscreen-13.

  Эксперименты на животных

Эксперименты выполнены на 360 нелинейных белых крысах-самцах массой 180–200 г («Рапполово» РАМН).

  Оценка параметров системного кровообращения

Системное артериальное давление измеряли в подвздошной артерии ртутным манометром перед началом гемоперфузии и после ее окончания.

  Оценка регионарного распределения сердечного выброса

Для оценки регионарных перераспределений фракции сердечного выброса использовали макроагрегаты сывороточного альбумина (МАА) диаметром 10–30 мкм, меченые 131I (г. Обнинск), активностью 10 мкКu [Ковалев О.А., 1983; Rudolph A.M., Heymann V.F., 1967].

  Оценка регионарной микроциркуляции

Оценку регионарных изменений микроциркуляторной части сосудистого русла проводили с помощью регистрации распределения в тканях и органах водорастворимого 86RbCl [Ковалев О.А., 1977; Sapirstein L.A., 1967].





Радиоактивность каждой пробы подсчитывали в течение 100 с помощью радиометрической установки и пересчетного прибора ПСО-2-2УМ. Относительные изменения фракции сердечного выброса и сосудистой проницаемости в каждой пробе рассчитывали с помощью показателя % счета в пробе, нормированного по % массы органа (% радиоактивности/% массы органа).

Проведение малообъемной гемоперфузии у животных

Эффективность малообъемной гемоперфузии региона оценивали по реакции сердечно-сосудистой системы через 15 и 30 мин от начала процедуры. В качестве контроля I рассматривали животных, фиксированных на станке в течение 30 мин. Крысам II контрольной и опытных групп (I и II) катетеризировали бедренную артерию через общую сонную артерию и перфузировали регион без сорбента – контроль II или с сорбентом (0,3мл) – опыт. В опыте I использовали угольный сорбент СКТ-6А-ВЧ, а в опыте II –Агарозу-4Б. Из бассейна бедренной артерии забирали 1 мл крови (7% ОЦК), пропуская ее через сорбент, и сразу возвращали  в циркулирующую кровь. Положение катетера в бедренной артерии контролировали при вскрытии животного. Регистрировали показатели регионарного кровообращения перфузируемой и неперфузируемой конечности животного.

Метод малообъемной гемоперфузии и его варианты

               Метод целевой малообъемной гемоперфузии

Метод целевой малообъёмной гемоперфузии (ЦМОГ) (Патент РФ №2210391, 2003; Патент РФ № 2233178, 2004) заключается в пункции артерии (бедренной) пораженной  конечности,  заборе крови в специальную колонку, содержащую гемоконтактный препарат (СКТ-6А-ВЧ), активации крови путём ротации колонки и возврате активированной аутокрови через ту же пункционную иглу. Процедура занимает 3–5 мин. Объём перфузируемой крови – до 50 мл. Курс лечения включает 3–4 процедуры ЦМОГ с интервалом 1–2 дня.

Метод регионарной малообъемной гемоперфузии

Метод регионарной малообъемной гемоперфузии (РМОГ) (Патент РФ №2282466, 2006) – модификация метода ЦМОГ в венозном варианте: на плечо пораженной конечности накладывают жгут, пунктируют локтевую вену и по коммуникационной системе медленно забирают кровь в колонку с гемоконтактным препаратом, активируя путем ротации. Через 1–2 мин кровь из колонки медленно вводят обратно в вену. Второй жгут накладывают на нижнюю часть предплечья, а первый жгут снимают. Через 20 мин второй жгут также удаляют. Процедура длится 3–5 мин. Курс лечения включает 3–4 процедуры РМОГ с интервалом 1–2 дня.

Набор для проведения малообъемной гемоперфузии (Патент на полезную модель РФ №33869, 2003).

Использование малообъемной гемоперфузии в клинике

Применение целевой малообъемной гемоперфузии у больных с критической ишемией нижних конечностей

Анализ результатов применения метода  ЦМОГ проводили совместно с хирургами отделения сердечно-сосудистой хирургии СПб НИИСП им. И.И.Джанелидзе за период с 1999 по 2005гг. В исследования включен 131 пациент, находившийся на обследовании и лечении. Все пациенты были разделены на основную и контрольную группу. Длительность заболевания в обеих группах составила 4,8 ± 1,09 года, возраст – от 35 до 83 лет. Критериями включения в группы исследования стали облитерирующие заболевания артерий нижних конечностей в стадии критической ишемии.

Пациентам основной группы (56 больных) проводили курс целевой малообъемной гемоперфузии (ЦМОГ). В контрольную группу вошли 75 больных с критической ишемией нижних конечностей (КИНК) на фоне облитерирующего атеросклероза сосудов нижних конечностей, сахарного диабета, эндартериита, которые получали лишь «базисную» терапию.

Применение целевой малообъемной гемоперфузии у больных с

термической травмой нижних конечностей

Анализ результатов применения метода ЦМОГ проводили совместно с хирургами межрегионального Центра термических поражений СПб НИИ СП им. И.И. Джанелидзе за период с 1999 по 2005гг. Курс ЦМОГ проведен 60 больным с термическими поражениями нижних конечностей с площадью глубоких ожогов до 10%. В группу обследованных вошли мужчины в возрасте от 25 до 60 лет. Процедура ЦМОГ проводили в разные сроки после получения травмы. Для оценки биоцидного эффекта ЦМОГ на раневой процесс исследовали клинические, бактериологические и лабораторные показатели. Оценивали микробную обсемененность раны методом количественного учета, брали отпечатки на стекла для цитологических исследований раневого отделяемого.

Применение регионарной малообъемной гемоперфузии у больных с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти

Анализ результатов применения метода ЦМОГ проводили совместно с хирургами Центра по лечению хирургических инфекций (Городская больница №14, СПб) за период с 2003 по 2009 гг. Проанализированы клинические данные 440 больных с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти, получавших специализированное лечение. 80 больным были проведены курсы РМОГ на фоне стандартной для каждого патологического состояния терапии. Клинический эффект курса РМОГ оценивали по критериям: 1) субъективная оценка больного, включающая в себя болевой синдром, улучшение или ухудшение самочувствия; 2) объективная оценка местного процесса – скорость очищения раны, скорость формирования грануляций и стихания острых воспалительных явлений.

Лабораторные методы исследования

Биохимический анализ крови выполняли на многопрофильном анализаторе «Stat Profile Ultra» (США).

Исследование флуоресценции плазмы крови проводили на анализаторе "СТЭМ" (ГОИ им. С.И.Вавилова, Россия).

Определение нитратов и нитритов в плазме крови

Определение данного показателя проводили в пробах плазмы крови (2 мл), полученной до и через 30 мин после процедуры ЦМОГ, методом Грисса.

  Исследование уровня цитокинов в крови

Определение концентрации цитокинов проводили с помощью тест-систем (НИИОЧБ, СПб) «сэндвич»-методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

Цитологическое исследования

Приготовление мазков выполняли по методу М.Ф. Катаева (1970). Проводили качественную (по стадиям раневого процесса) и количественную (процентное соотношение клеток, основанное на подсчете 400 клеток в различных полях зрения из разных участков мазка) оценку [Титова М.И. и др., 2000].

      Метод определения веществ низкой и средней молекулярной массы

Использовали метод определения веществ низкой и средней молекулярной массы в плазме крови и на эритроцитах, разработанный М.Я.Малаховой и др. (1987, 1995). Исследования образцов проводили на спектрофотометре СФ-121. Результаты выражали в условных единицах.

Определение концентраций  лактоферрина и миелопероксидазы

  в плазме крови

Концентрации ЛФ и МП определяли с посмощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Использовали наборы для ИФА (СПб ИЭМРАМН), а также наборы фирмы «Вектор-Бест» (Новосибирск), по прилагаемым инструкциям к которым проводили данное исследование.

Определение концентрации эйкозаноидов в плазме крови

Концентрацию эйкозаноидов регистрировали в плазме венозной крови больных с помощью иммуноферментного анализа (наборы фирмы «Amersham», Великобритания), согласно прилагаемым инструкциям.

Неинвазивные методы оценки регионарного кровотока

Метод многоточечной термометрии нижних конечностей

Для измерения температуры использовали многоточечный измеритель температуры со специально сконструированными датчиками. [Крецер И.В. и др., 2004].

  Оценка эффективности использования метода малообъемной  гемоперфузии при разных видах патологии

Эффективность использования метода малообъемной гемоперфузии в клинике оценивали совместно с врачами отделения сердечно-сосудистой хирургии СПб НИИСП им. И.И.Джанелидзе. Ближайшие результаты лечения оценивали по времени, в течение которого пациентам с критической ишемией нижних конечностей удавалось сохранить пораженную конечность, и  отдаленные – по уровню летальности в течение 5 лет после лечения.

Статистическая обработка полученных данных

Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента с помощью стандартного пакета прикладных программ Statistica for Windows v.6.0. Статистически  достоверными считали различия при  p<0,05.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для анализа особенностей клеточного состава крови при малообъемной гемоперфузии различной длительности через углеродный сорбент СКТ-6А-ВЧ in vitro исследовали основные популяции клеток крови – эритроциты, лейкоциты и тромбоциты. Определяли количество клеток в исходных пробах крови (до контакта), через 5 мин и каждые 20 мин в течение 120 мин. Результаты исследования представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Динамика количества клеточных элементов  крови при контакте

с СКТ-6А-ВЧ in vitro

Время забора крови

Эритроциты, 10 12/л

Лейкоциты, 10 9/л

  Тромбоциты,109/л

До контакта

  5,01 ± 0,43

5,51 ± 0,64

305 ± 45

5 мин

4,82  ± 0,37 

4,36 ± 0,29

280 ± 37 

20 мин

4,50 ± 0,47

3,43 ± 0,44*

218 ± 26

40 мин

4,43 ± 0,72

3,30 ± 0,37*

  188 ± 24*

60 мин

4,36 ± 0,53

  2,56 ± 0,33*

  168 ± 30*

80 мин

4,24 ± 0,28 

2,75 ± 0,14*

167 ± 28*

100 мин

4,38 ± 0,49 

2,00 ± 0,21*

  160 ± 26*

120 мин

4,17 ± 0,43 

1,78 ± 0,24*

153 ± 21*

        Примечание: n = 16.

*­ Различия достоверны по сравнению с группой «до контакта» (p<0,05). 

В течение всего времени контакта крови с углеродным гемосорбентом СКН-6А-ВЧ количество эритроцитов  снизилось на 1/5, что может быть обусловлено разведением крови на колонке за счет ее свободного объема.

Количество лейкоцитов достоверно снижалось на 38% через 20 мин, а тромбоцитов на ту же величину – после 40 мин контакта.

20-минутный контакт крови in vitro с углеродным сорбентом СКТ-6А-ВЧ менял лейкоцитарную формулу крови (табл.2). Процент полиморфноядерных лейкоцитов уменьшался на 32%, а мононуклеаров увеличивался на 67%.

Таблица 2.

Изменение процентного соотношения субпопуляций лейкоцитов при контакте с СКТ-6А-ВЧ in vitro (в %)

Время регистрации показателя (мин)

ПЯЛ

МОН

до контакта

67,7 ± 3,03

32,3 ± 2,26

5

57,7 ± 1,56*

  42,3 ± 1,37*

20

  46,2 ± 1,98*

53,8 ± 2,31 *

40

43,3 ± 2,41

56,7 ± 1,28

60

43,0 ± 2,53

57,0 ± 3,12

80

39,0 ± 2,71

61,0 ± 2,16

100

  29,0 ± 1,34*

71,0 ± 1,63 *

120

27,4 ± 2,52

72,6 ± 2,43

Примечание: n =18.

*­Различия достоверны по сравнению с предыдущим временем исследования (p<0,05). 

Уменьшение количества лейкоцитов и тромбоцитов может быть обусловлено как незначительным разрушением клеточных элементов при контакте крови с СКТ-6А-ВЧ и включением в формирующиеся на поверхности тромбоцитарные и фибриновые тромбы, так и адгезией лейкоцитов на поверхности гемосорбента.

Контакт клеточных элементов крови с твердофазным гемоконтактным препаратом индуцирует хемилюминесцентный ответ лейкоцитов периферической крови. Через 20 мин контакта крови с гемосорбентом СКТ-6А-ВЧ происходило увеличение удельной спонтанной и индуцированной хемилюминесценции, уровень которой максимально превышал исходные значения в 100 мин пробах в 7,8 и 4,3 раза соответственно (табл.3). 

Таблица  3.

Изменение спонтанной и индуцированной хемилюминесценции крови здоровых волонтеров при контакте крови с СКТ-6А-ВЧ (в усл.ед.)

ХЛ

Время взаимодействия (мин)

До контакта

  20

40

  60

80

100

  120

Спонтан.

3,2 ± 0,53

4,4 ± 0,42

*

7,2 ± 0,37

12,2 ± 0,58

*

15,8 ± 0,56

*

  25,1 ± 0,26

*

19,4 ±0,38

  *

Индуцир.

6,0 ± 0,48 **

8,4 ± 0,31

** *

7,9 ±0,25

13,0 ± 0,67

*

16,0 ± 0,43

*

26,0 ±  0,30

*

19,4 ±0,62

*

Разность

2,8

1,0

0,9

0,8

0,2

0,9

  0

  Примечание: И–С – разность между показателями индуцированной и спонтанной ХЛ в пробе;  n =20.

  *  Различия достоверны по сравнению с предыдущей пробой (p<0,05).

** Различия достоверны между спонтанной и индуцированной реакцией (p<0,05).

Динамика интенсивности флуоресценции в исследуемых образцах плазмы, зависящая от концентрации продуктов перекисного окисления, была противоположной (табл.4).

Таблица 4.

Изменение флуоресценции плазмы доноров в динамике контакта крови

с СКТ-6А-ВЧ (усл.ед.)

Показатель

флуоресцен-ции (усл.ед)

Время регистрации показателя (мин)

До контакта

20

40

60

80

100

120

M ± m

9,38± 0,92

  6,63 ±0,91

  *

5,63±0,71*

4,88±0,81*

4,38±0,73*

5,29±0,52*

4,57±0,76

*

Примечание: n=20.

*  Различия достоверны по сравнению с  группой «до контакта» (p<0,05).

Через 40 мин контакта  крови с СКН-6А-ВЧ интенсивность флуоресценции плазмы снижалась на 40%, а через 100 мин – на 44% по сравнению с исходными значениями. Уменьшение процессов перекисного окисления в плазме можно объяснить реализацией сорбционных свойств СКТ-6А-ВЧ.

Сравнительная оценка показателей суммарного содержания внутриклеточных катионных белков в лизосомах нейтрофильных гранулоцитов крови при гемоконтактной процедуре  с использованием  СКТ-6А-ВЧ и Агарозы-4Б представлена в табл.5.

Таблица 5.

Содержание внутриклеточных катионных белков нейтрофильных гранулоцитов крови (СЦК)

Время

Гемоконтактный препарат

уголь СКТ-6А-ВЧ

Агароза-4Б

До контакта

  1,50 ± 0,045

Через 5 мин

2,00 ± 0,025*

2,75 ± 0,032*

Через 30 мин

2,75 ± 0,020*

3,00 ± 0,018*

Примечание: СЦК – средний цитохимический коэффициент;  n = 27.

* Различия достоверны по сравнению с пробой до контакта (p<0,05).

Выраженность активации нейтрофилов различна в зависимости от физико-химических свойств гемосорбентов. Через 5 мин контакта крови с СКТ-6А-ВЧ содержание катионных белков в лизосомах нейтрофильных гранулоцитов  по СЦК увеличивалось на 33%, а с Агарозой-4Б ­– на 83%.

Спонтанная миграция лейкоцитов через 5 мин контакта крови с СКТ-6А-ВЧ и Агарозой-4Б снижалась на 60% и 24% соответственно (табл. 6).

  Таблица 6.

Изменение спонтанной миграции лейкоцитов in vitro (мм2)

Время

Гемоконтактный препарат

Уголь СКТ-6А-ВЧ

Агароза-4Б

До контакта

  1,40 ± 0,221  100%

Через 5 мин

0,58 ± 0,171 * 41,0%

1,06 ± 0,263  75,7%

  Через 30 мин

  0,68 ± 0,262  48,6%

1,10 ± 0,210  78,6%

Примечание: n= 20.

* Различия достоверны по сравнению с пробой до контакта (p<0,05). 

Таким образом, при контакте крови с углеродным гемосорбентом СКТ-6А-ВЧ in vitro происходит изменение клеточного состава, увеличение удельной хемилюминесценции крови, а также активация лейкоцитов, степень которой зависит от химической природы используемого гемосорбента (СКТ-6А-ВЧ и Агароза-4Б).

Влияние регионарной малообъемной гемоперфузии на микроциркуляцию и кровоток в тканях задней конечности изучали на лабораторных крысах. Микроциркуляцию и распределение фракции сердечного выброса в перфузируемом регионе оценивали по захвату тканями 86Rb и МАА131I. Захват 86RbCl происходит в функционирующих капиллярах. МАА131I распределяются в органах и тканях пропорционально фракции сердечного выброса, адресованной конкретному органу или ткани. Поэтому увеличение концентрации МАА131I в сочетании с усилением захвата Rb86 свидетельствует об усилении не только местного кровотока, но и интенсивности циркуляции по капиллярам.

Показано, что гемоперфузия района бедренной артерии через углеродный сорбент СКТ-6А-ВЧ и Агарозу-4Б вызывала увеличение фракции сердечного выброса (МАА131I) в перфузируемой конечности в 1,5 раза. Реакция микроциркуляторного русла (86Rb) была схожей (табл 7). Необходимо отметить, что изменения значений фракции сердечного выброса и интенсивности микроциркуляции в интактной конечности свидетельствовали о тенденции к содружественному усилению кровотока в контралатеральной области. Регионарный гемодинамический ответ не зависел от химической структуры гемосорбента.

Таким образом, при гемоперфузии задней конечности с использованием углеродного гемосорбента СКТ-6А-ВЧ и Агарозы-4Б тканевой кровоток возрастал, а в контралатеральной области – имел тенденцию к увеличению. Регионарная малообъемная перфузия крови без сорбента не влияла на кровоток в задних конечностях.

Таблица 7.

Реакция микроциркуляторного русла

(86Rb, %активности/%массы, M±m)

Контроль I

До гемоперфузии

ЗАДНИЕ КОНЕЧНОСТИ

1. Кожа

неперфузируемая

перфузируемая

0,26 ± 0,01

0,27 ± 0,02

2. Мышцы бедер

0,30 ± 0,02

0,31 ± 0,02

3. Мышцы и кости

0,34 ± 0,02

0,36 ± 0,03

Контроль II

Гемоперфузия без сорбента (15 мин)

ЗАДНИЕ КОНЕЧНОСТИ

1. Кожа

неперфузируемая

перфузируемая

0,29 ± 0,03

0,31 ± 0,02

2. Мышцы бедер

0,36 ± 0,02

0,39 ± 0,03

3. Мышцы и кости

0,42 ± 0,02

0,44 ± 0,02

Контроль II

Гемоперфузия без сорбента (30 мин)

ЗАДНИЕ КОНЕЧНОСТИ

1. Кожа

неперфузируемая

перфузируемая

0,31 ± 0,02

0,33 ± 0,03

2. Мышцы бедер

0,41 ± 0,03

0,43 ± 0,02

3. Мышцы и кости

0,43 ± 0,02

0,43 ± 0,01

Опыт I

  Гемоперфузия с СКТ-6А-ВЧ (15 мин)

ЗАДНИЕ КОНЕЧНОСТИ

1. Кожа

неперфузируемая

перфузируемая

0,40 ± 0,04

0,48 ± 0,02 * ** ***

2. Мышцы бедер

0,49 ± 0,03

0,56 ± 0,02 * ** ***

3. Мышцы и кости

0,40 ± 0,03

0,60 ± 0,03 * ** ***

Опыт I

Гемоперфузия с СКТ-6А-ВЧ (30 мин)

ЗАДНИЕ КОНЕЧНОСТИ

1. Кожа

неперфузируемая

перфузируемая

0,30 ± 0,02

0,44 ± 0,02 * ** ***

2. Мышцы бедер

0,47 ± 0,03 *

0,52 ± 0,02 * ** ***

3. Мышцы и кости

0,35 ± 0,03

0,57 ± 0,03 * ** ***

Опыт II

Гемоперфузия с Агарозой - 4Б (15 мин)

ЗАДНИЕ КОНЕЧНОСТИ

1. Кожа

неперфузируемая

перфузируемая

0,32 ± 0,04

0,39 ± 0,02 * ** ***

2. Мышцы бедер

0,46 ± 0,01 *

0,48 ± 0,02 * ** ***

3. Мышцы и кости

0,40 ± 0,02

0,56 ± 0,02 * ** ***

Опыт II

Гемоперфузия с Агарозой - 4Б (30 мин)

ЗАДНИЕ КОНЕЧНОСТИ

1. Кожа

неперфузируемая

перфузируемая

0,29 ± 0,02

0,37 ± 0,01 * ** ***

2. Мышцы бедер

0,35 ± 0,03

0,45 ± 0,02 * ** ***

3. Мышцы и кости

0,40 ± 0,02

0,52 ± 0,02 * ** ***

Примечание: n=30.
* Различия достоверны по отношению к контролю I (p< 0,05).

** Различия  достоверны по отношению к контролю II (p< 0,05). 

*** Различия достоверны между показателями в перфузируемой и неперфузируемой конечностях (p< 0,05).

С учетом комплексной оценки результатов исследований in vitro и экспериментов на животных разработана методика малообъемной гемоперфузии и варианты ее применения у людей с различными видами патологии.

Метод целевой малообъёмной гемоперфузии  (ЦМОГ) применяли на фоне «стандартной» терапии у больных с критической ишемией нижних конечностей.  Курс лечения включал 3–4 процедуры ЦМОГ с интервалом 1–2 дня. Проводили сравнительный анализ групп по всем основным клиническим и лабораторным показателям до и после лечения. Следует отметить, что уже после первого сеанса ЦМОГ у 80% больных значительно уменьшились боли покоя, подобного в контрольной группе не отмечалось.

Исследование кровотока пораженной конечности показало, что после курса ЦМОГ кровоснабжение тканей ишемизированного сосудистого региона возрастало. По результатам ультразвуковой допплерографии в основной группе после курса ЦМОГ линейная скорость дистального кровотока увеличилась на 77%, величина лодыжечно-плечевого индекса по сравнению с исходными значениями возросла на 45%. В контрольной группе подобной динамики регионарного кровотока выявлено не было (табл.8).

Таблица 8.

Гемодинамические показатели по данным ультразвуковой допплерографии

Показатели

измерения

Норма

До лечения (ЦМОГ),

M ± m

После лечения (ЦМОГ),

M1 ± m1

ЦМОГ

Контроль

ЦМОГ

Контроль

Vs (см/с)

  27,9 – 57,9

11, 6 ± 0,06

n=21

12,4 ± 3,71

n=12

20,5 ± 2,43*

n=21

  18,3 ± 2,89

n=12

ЛПИ (усл.ед.)

0,9 – 1,2

0,31 ± 0,02

n=36

  0,29 ± 0,01

n=51

0,45 ± 0,02*

n=36

0,35 ± 0,04 n=51

Примечание: Vs – линейная скорость дистального кровотока больной конечности. 

ЛПИ – лодыжечно-плечевой индекс.

*  Различия достоверны по сравнению с показателями до лечения (р<0,05).

На графике (Рис.2) представлена динамика повышения температуры кожи пораженной и контралатеральной конечностей после целевой малообъемной гемоперфузии. Констатировано, что через 30 мин после процедуры температура кожи стопы ишемизированной конечности повышалась на 0,250С, в то время как температура интактной – снижалась на 0,50С. 

Рис. 1. Динамика изменений температуры нижних конечностей

после  гемоперфузии.

  I – перфузируемая конечность;

II – интактная конечность;

  с – стопа;

  b –  бедро.

На уровне бедра температурная реакция пораженной и контралатеральной конечностей отличалась. Увеличение температуры кожи бедра в перфузируемой конечности сочеталось с тенденцией к повышению температуры противоположной конечности.

Исследование возможных механизмов, опосредующих усиление кровотока в тканях после малообъемной гемоперфузии, показало, что через 30 мин после процедуры в венозной крови пациентов суммарная концентрация нитратов и нитритов увеличивалась на 67% (табл.9).

Таблица 9

Содержание нитратов и нитритов в плазме крови перфузированной конечности до и после процедуры (усл. ед)

Определяемые соединения

Колонка

  Артерия

  Вена

Вена-1

Нитраты и нитриты

18,9 ± 2,07, n=28

24,7 ± 2,41, n=28

29,8 ± 2,51, n=28

44,3 ± 3,23*, n=26

Примечание: Вена – проба до ЦМОГ.

Вена-1 – проба через 30 мин после  ЦМОГ.

* Различия достоверны по сравнению с пробой Вена, (p<0,05).

На рис.3. представлена динамика концентраций метаболитов арахидоновой кислоты в течение типового курса регионарной малообъемной гемоперфузии у больных с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти. Регионарную малообъемную гемоперфузию проводили под жгутом через локтевую вену. Регистрировали вазоконстрикторы: тромбоксан В2 (Thr B2) и пул лейкотриенов С4/D4/E4  (Leuk С4/D4/E4); вазодилятаторы: простагландин Е2 (PGE2) и простациклин (6-кето-PGF1) (рис. 3) .

Общая концентрация всех исследованных метаболитов арахидоновой кислоты после курса РМОГ (4 процедуры) увеличилась в 1,5 раза, причем 2/3 приходилось на долю простациклина (6ketoPGF1), обладающего выраженными сосудорасширяющими свойствами и антиагрегантными эффектами.

Таким образом, применение малообъемной гемоперфузии у пациентов с критической ишемией и гнойно-некротическими заболеваниями конечностей приводила к улучшению тканевого кровотока и микроциркуляции в перфузируемом сосудистом регионе. Увеличение регионарного кровотока сочеталось с активацией индуцибельной NO-синтазы (возрастание концентраций нитратов и нитритов), а также с повышением концентрации  метаболитов арахидоновой кислоты за счет преимущественного увеличения содержания эйкозаноидов, обладающих сосудорасширяющим эффектом. 

Рис.2. Динамика концентраций метаболитов

арахидоновой  кислоты (в %)

При исследовании динамики спонтанной и индуцированной хемилюминесценции крови у больных с критической ишемией нижних конечностей до и после малообъемной гемоперфузии показано, что контакт крови с сорбентом увеличивал величину этих показателей в гемоконтактной колонке в 2 раза. Введение в артерию крови, активированной гемоконтактной процедурой, не меняло значений индуцированной хемилюминесценции оттекающей от пораженного региона крови, но приводило к увеличению спонтанной хемилюминесценции на 25%.

 

  *

       **

Рис.3. Удельная хемилюминесценци крови больных с критической ишемией нижних конечностей до и после ЦМОГ (усл.ед)

Примечание: Колонка – пробы крови с гемоконтактной колонки

  Артерия – пробы крови из бедренной артерии до ЦМОГ

  Вена – пробы крови из бедренной вены до ЦМОГ

  Вена–1 – пробы крови из бедренной вены через 30 мин после ЦМОГ

  * Различия достоверны между (p<0,05).

  ** Различия достоверны между пробами Вена и Вена-1 (р<0,05).

После первой процедуры целевой малообъемной гемоперфузии происходило повышение антиоксидантных свойств крови за счет активации глутатион-опосредованных редокс-систем эритроцитов и снижением концентрации малонового диальдегида в плазме венозной крови (табл.10).

Таблица 10.

  Изменение активности основных редокс-систем организма  после целевой  малообъемной гемоперфузии у больных с термической травмой нижних конечностей

Показатели

Единица

измерения

Норма

n=20

1-я процедура

3 процедура

До,

бедр. вена

Через 1 час, бедр.вена

Через1сут локт. вена

  До,

бедр. вена

Через 1 час, бедр.вена

Через 1 сут локт. вена

  Каталаза

  эритроцитов

мкмоль/

мклг Hb

26,71 ± 1,51

45,1± 6,19*

n=20

46,6 ± 6,89

n=18

47,3 ± 2,98

n=13

20,1± 7,41

n=12

24,3 ± 4,76

n=12

22,0 ± 4,18

n=12

  СОД эритроцитов

  усл.ед./

мклг Hb

0,75 ± 0,065

0,60 ± 0,09

n=16

0,60 ± 0,13

n=14

0,94 ± 0,17

n=12

0,70 ± 0,08

n=12

0,82 ± 0,13

n=12

0,95 ± 0,04*

n=12 ** ***

  Глутатионперокси-

даза эритроцитов

мкмоль/

мклг Hb

4,10 ± 0,01

3,61± 0,516

n=18

3,99 ± 0,843

n=16

4,44 ± 0,040

n=13

4,06±0,370

n=12

3,77 ± 0,729

n=12

2,33 ± 0,885

n=12

Глутатионредуктаза эритроцитов

мкмоль/

  мклг Hb

25,35 ± 12,65

200,2 ±31,37*

n=18

225,4 ± 34,99

n=16

138 ± 37,70

n=13

104,6 ±  5,83

n=12

126,6 ± 22,40

n=12

134,7 ± 14,57

n=12

  Глутатионтрансфе-

  раза эритроцитов

мкмоль/

мклг Hb

85,35 ± 8,93

41,61 ± 8,07*

n=19

54,7 ± 10,77

n=16

84,5 ± 5,40 **

n=13

106,0±7,47

n=12

100,4±5,98

n=12

  98,5 ± 7,37**

n=12

  Глутатион восст. в

цельной крови

ммоль/л

1,37±0,090

1,21± 0,085

n=20

1,24 ± 0,107

n=18

0,96 ± 0,119

n=13

1,36 ± 0,062

n=12

1,30 ± 0,064

n =12

1,31± 0 ,048

n=12

  Малоновый

диальдегид в

плазме крови

мкмоль/л

6,45±0,22

9,20 ± 0,951*

n=19

8,69 ±1,090

n=16

6,70 ± 0,682 **

n=13

9,020±0,106

n=12

8,99 ±1,475

n=12

6,71 ± 0,410

n=12 ** ***

  *  Различия достоверны по сравнению с нормой (p< 0,05).

**  Различия достоверны по сравнению с пробой до 1-й процедуры (p< 0,05).

*** Различия достоверны по сравнению с пробой до 3-й процедуры (p<0,05). 

Анализ динамики содержания провоспалительных цитокинов – ИЛ-1, ФНО-, ИФН-, ИЛ-8 и противовоспалительного цитокина  ИЛ-10 проводили в пробах крови из локтевой вены до начала применения  ЦМОГ у больных с критической ишемией нижних конечностей и после завершения данного курса (табл.11).

Таблица 11

Динамика концентраций цитокинов при целевой малообъемной гемоперфузии

Показатели

ИЛ-1 (пг/мл)

ФНО- (пг/мл)

Спонанная

  Индуцированная

Сыворотка

Спонанная

Индуцированная

Сыворотка

Норма

0-50

1000-5000

30-50

0-50

500-1500

30-50

До лечения

267,8 ± 39,30

  n=18

  1215,8 ±122,44

n=18

  47,4 ± 11,82

n=18

546,3 ± 17,92

n=18

1852,8 ± 32,09

n=18

67,1 ± 4,53

n=18

  После

лечения

219,1 ± 2,21

n=19

625,2 ± 114,71*

n=18

32,5 ± 10,36

n=19

265,8 ± 25,02*

n=18

805,8 ± 65,62*

n=19

72,5 ± 3,57

n=19

Продолжение  таблицы 11

Показатели

ИФН- (пг/мл)

ИЛ-10 (пг/мл)

ИЛ-8 (пг/мл)

Спонтан.

Индуцир.

Сыворотка

Спонтан.

Индуцир.

Сыворотка

Сыворотка

Норма

30-50

1000-5000

0-50

0-50

1000-5000

0-50

0-50

До лечения

  130,6 ± 21,91

n=18

962,4 ± 57,49

n=18

96,9 ± 2,66

n=18

529,1 ± 74,07

n=18

621,3 ± 32,09

n=18

  7,0 ± 0,91

n=18

3,9 ± 0,89

n=10

После

лечения

78,1 ±18,69

n=19

  381,6 ±41,42*

n=18

23,6 ± 2,62*

n=19

413,3 ± 52,02*

n=19

663,7± 48,02*

n=19

14,4 ± 1,90

n=19

3,3 ±1,31

n=10

 

* Различия достоверны по сравнению с показателями до ЦМОГ(p<0,05)

После курса целевой малообъемной гемоперфузии у больных с критической ишемией нижних конечностей отмечали общую тенденцию к снижению концентрации провоспалительных цитокинов, регистрируемых в сыворотке  венозной крови: ИЛ-8 – 1,2 раза; ИЛ-1 – в 1,5 раза;  ИФН- – в 4 раза.  Концентрация противовоспалительного цитокина ИЛ-10 увеличилась в 2 раза.  Применение регионарной малообъемной гемоперфузии у пациентов у больных с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти вызывало схожие изменения содержания цитокинов в сыворотке крови, а также приводило к увеличению концентрации лактоферрина и миелопероксидазы (Табл.12).

Таблица 12

Динамика концентраций лактоферрина и миелопероксидазы  при регионарной малообъемной гемоперфузии

Маркеры, нг/мл

Пробы крови

До процедуры

С колонки

20 мин после процедуры

80 мин после процедуры

Лактоферрин

669 ± 35,6

1218 ± 38,0*

1015 ± 41,7* **

311 ± 24,4* **

Миелопероксидаза

138 ± 17,7

249 ± 23,4*

238 ± 18,5*

188 ± 11,2 **

  Примечание: n = 177.

* Различия достоверны по сравнению с показателями до процедуры (p<0,05).

  ** Различия достоверны по сравнению с пробами «с колонки» (p<0,05);

Повышенный уровень концентраций лактоферрина и миелопероксидазы на 52% и 72% соответственно сохранялся в отграниченном жгутом регионе кисти в течение 20 мин. После снятия жгута происходило резкое усиление гемоциркуляции и падение концентраций ЛФ и МПО в оттекающей от пораженного региона крови.

Сравнительный анализ результатов традиционного лечения больных с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти и пациентов, в схему терапии которых включали курс малообъемной гемоперфузии, показал, что применение этой процедуры сочеталось с сокращением сроков пребывания пациентов в стационаре в среднем на 3,7 ± 0,64 койко-дня и снижением числа осложнений с 29,6% до 7,7% (табл.13).

Таблица 13

Продолжительность лечения пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями пальцев и кисти в разных группах (койко-день)

Нозологические формы

Контроль А (n= 269)

Контроль Б (повторные операции, n= 81)

РМОГ (n= 57)

n

Койко-день

n

Койко-день

n

Койко-день

ПАНАРИЦИЙ

Сухожильный

27

13,6 ± 0,28

9

15,4 ± 0,86

5

11,1 ± 1,02**

Костный

35

13,5 ± 0,25

8

11,1± 0,33

12

9,7 ± 0,57* **

Костно-суставной

38

13,9 ± 0,23

16

13,1 ± 0,51

9

10,3 ± 0,64* **

Пандактилит

38

22,7 ± 0,21

27

22,5 ± 0,29

23

17,2 ± 0,33* **

Флегмона кисти

91

10,6 ± 0,16

21

11,7 ± 0,38

8

7,3 ± 0,96* **

 

  *  Различия достоверны по сравнению с контролем  А (p<0,05).

  * * Различия достоверны по сравнению с контролем  Б  (p<0,05).

Анализ отдаленных результатов проведения процедуры малообъемной гемоперфузии показал, что в контрольной группе больных с критической ишемией нижних конечностей в сроки до 6 месяцев от момента выписки  процент высоких ампутаций составил 67,5%, а в основной  группе пациентов, в схему терапии которой включали курс целевой малообъемной гемоперфузии, – 34,14% (рис. 5).

         *

*

                               основная группа

Рис. 4. Сохранность пораженной конечности пациентов основной и

контрольной  групп в отдаленные сроки наблюдения

Сравнительный анализ причин смерти и летальности в более отдаленные сроки данных групп показал, что уровень летальности в группе пациентов, которым на фоне традиционного лечения проводили курс малообъемной гемоперфузии, уменьшился на 14,6% (табл.15).

Таблица 15.

Причины смерти пациентов и уровень летальности в отдаленные сроки наблюдения

Причины  и сроки  летальных исходов

Опытная группа

(n = 41)

Контрольная группа

(n = 44)

Острый инфаркт миокарда

1

5

Сердечно-сосудистая недостаточность

5

6

  Легочно-сердечная недостаточность

1

  Острое нарушение мозгового кровообращения

1

1

Сепсис на почве гангрены

2

Всего

8 (19,5%)

15 (34,1%)

Через 1 год

1

12

Через 2 года

3

3

Через 3 года

3

Через 4 года

1

Таким образом, процедура малообъемной гемоперфузии через СКТ-6А-ВЧ улучшает ближайшие и отдаленные результаты лечения больных с критической ишемией и термическими травмами нижних конечностей, а также воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти.

Выводы

  1. Кратковременный (5 мин) контакт крови с углеродным сорбентом СКТ-6А-ВЧ in vitro приводит к снижению количества лейкоцитов и тромбоцитов, но не влияет на количество эритроцитов в перфузируемой крови.
  2. 20-ти минутный контакт крови с углеродным сорбентом СКТ-6А-ВЧ in vitro приводит к увеличению удельной спонтанной и индуцированной хемилюминесценции, уровень которой максимально превышает исходные значения в 100-мин  пробах в 7,8 и 4,3 раза соответственно.
  3. Интенсивность флуоресценции плазмы крови, зависящая от концентрации продуктов перекисного окисления, снижается  на 40% после 40 минутного контакта крови с углеродным сорбентом СКТ-6А-ВЧ in vitro.
  4. Средний цитохимический коэффициент, отражающий содержание катионных белков в лизосомах нейтрофильных гранулоцитов, увеличивается на 33% после кратковременного (5 мин) контакта крови с углеродным сорбентом СКТ-6А-ВЧ in vitro, а после контакта с Агарозой-4Б – на 83%.
  5. Скорость спонтанной миграции лейкоцитов после 5 минутного контакта крови с углеродным сорбентом СКТ-6А-ВЧ in vitro снижается на 60%, а после контакта с Агарозой-4Б – на 24%.
  6. Фракция сердечного выброса (131IМАА) и интенсивность микроциркуляции (86Rb) при малообъемной гемоперфузии (7% ОЦК) бедренной артерии крыс в течение 1–2 мин увеличиваются в 1,5 раза независимо от химической структуры гемосорбента (СКТ-6А-ВЧ и Агароза-4Б).
  7. Линейная скорость периферического кровотока, величина лодыжечно-плечевого индекса и индекса микроциркуляции в пораженных тканях ишемизированной конечности пациентов с критической ишемией и термической травмой нижних конечностей увеличиваются после применения процедуры малообъемной гемоперфузии.
  8. После применения процедуры малообъемной гемоперфузии пораженной конечности пациентов констатировано повышение (p<0,05) удельной хемилюминесценции на 25%, суммарной концентрации нитратов и нитритов на 67%, содержания лактоферрина и миелопероксидазы на 52% и 72%  в венозной крови соответственно.
  9. После курса регионарной малообъемной гемоперфузии (4 процедуры) в плазме крови пациентов с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти происходит увеличение суммарной концентрации метаболитов арахидоновой кислоты (простагландин Е2, простациклин, тромбоксан А2, лейкотриены С4/D4/E4) в 1,5 раза с преобладанием содержания эйкозаноидов (простагландин Е2, простациклин), обладающих  вазодилятационными свойствами.
  10. При малообъемной гемоперфузии (1%ОЦК) пораженной конечности у больных с критической ишемией нижних конечностей,  воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти  происходит снижение концентрации провоспалительных  (ИЛ-8; ИЛ-1;  ИФН-) и  увеличение концентрации противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10) в сыворотке крови, оттекающей от перфузируемого региона.
  11. Применение метода малообъемной гемоперфузии в комплексной терапии больных с критической ишемией нижних конечностей приводит к снижению количества высоких ампутаций с 67,5% до 34,1% в течение 6 месяцев после лечения, уменьшению летальности в отдаленные сроки на 14,6% и сокращению времени пребывания  пациентов с воспалительными и гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти в стационаре на 3,8 койко-дня.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Твердофазная контактная гемомодуляция. Реакция крови больных с термическими поражениями на контакт с угольным гемосорбентом СКТ-6А-ВЧ в стендовых условиях / С.И. Кузнецов,  Н.В. Буркова, Ю.А. Эйсмонт и др. // Эфферентная терапия.– 2001.– Т.7, №1.– С.52–59.

2. Хемилюминесценция лейкоцитов доноров и больных с ожогами при контакте их крови с угольным сорбентом СКТ-6А ВЧ in vitro / Н.В. Буркова, Ю.А. Эйсмонт, А.В. Соломенников и др. // Медицинская иммунология.– 2001.– Т.3, №2 .– С.306–307.

3. Использование принципа твердофазной контактной гемомодуляции при лечении заболеваний сосудов нижних конечностей / С.И. Кузнецов,  Н.В. Буркова, С.П. Нохрин и др. // Клиническая иммунология.– 2002.– Т.4, №2.– С.352.

4. Использование гемоперфузии через сорбенты для коррекции органного и тканевого кровотока / С.И. Кузнецов, Н.В. Буркова, Ю.А. Эйсмонт и др. // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. – 2003.– №3(7).– С.63–69.

5. Способ улучшения кровоснабжения тканей активированными гуморальными и клеточными элементами крови / С.И. Кузнецов,  Н.В. Буркова, Ю.А. Эйсмонт и др. // Патент РФ №2203098.– 2003.

6. Способ лечения ожоговых ран / С.И. Кузнецов, П.А. Канаев,  Н.В. Буркова и др. // Патент РФ№ 2210391.– 2003.

7. Гемоконтактное устройство и набор для проведения целевой малообъемной гемоперфузии / С.И. Кузнецов,  Н.В. Буркова, Ю.А. Эйсмонт, А.И. Тюкавин // Патент на полезную модель № 33869.– 2003.

8. Лечение критической ишемии нижних конечностей методом целевой малообъемной гемоперфузии / С.Ф. Багненко, А.А. Курыгин, В.А.  Киселев,  С.П. Нохрин,  С.И. Кузнецов,  Б.И. Джурко, И.В. Крецер,  Н.В. Буркова и др. // Методические рекомендации. –  2003.– 7 с.

9. Механизмы развития контактной активации крови в стендовых условиях / С.И. Кузнецов,  Н.В. Буркова,  Г.М. Знаменский и др. // Медицинский академический журнал. – 2003.– Т.3, №3 (прилож.4).– С.91–92.

10. Метод целевой малообъемной гемоперфузии в комплексном лечении больных с критической ишемией нижних конечностей / С.И. Кузнецов, С.П. Нохрин, Н.В. Буркова и др. // Медицинский академический журнал. – 2003.– Т.3, №2 (прилож.3).– С.170-171.

11. Влияние целевой малообъемной гемоперфузии на течение ожоговых ран / С.И. Кузнецов, Г.М. Знаменский, Н.В. Буркова и др. // Медицинский академический журнал.– 2003.– Т.3, №3 (прилож.4).– С.129–130.

12. Кислородзависимая биоцидная система нейтрофильных лейкоцитов при гемоперфузии через сорбенты медицинского назначения / С.И. Кузнецов,  Н.В. Буркова, Ю.А. Эйсмонт, О.Ю. Янковский // Медицинский академический журнал. – 2003.– Т.3, №3 (прилож.4).– С.62–63.

13. Активные производные кислорода, генерируемые нейтрофильными лейкоцитами при контакте крови с гемосорбентами медицинского назначения / О.Ю. Янковский, Н.В. Буркова,  С.И. Кузнецов, Ю.А. Эйсмонт // Медицинская иммунология. – 2003.– Т.5, №3–4.– С.410–411.

14. Применение целевой малообъемной гемоперфузии в комплексном лечении больных с критической ишемией нижних конечностей / С.И. Кузнецов, С.П. Нохрин, Н.В. Буркова и др.// Бюл. НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН.– 2003.– Т.4, №11– С.136.

15. Использование метода целевой малообъемной гемоперфузии для лечения больных с критической ишемией нижних конечностей и высоким хирургическим риском / С.П. Нохрин, С.И. Кузнецов, Н.В. Буркова и др. // Ангиология и сосудистая хирургия. – 2004.– №2.– С.214–215.

16. Способ лечения больных с критической ишемией нижних конечностей / С.И. Кузнецов,  Н.В. Буркова, С.П. Нохрин и др. // Патент РФ № 2233178.– 2004.

17. Влияние регионарной малообъемной гемоперфузии на клеточные элементы венозной крови/ Б.Е. Бутько, Н.В. Буркова, Ю.А. Эйсмонт Ю.А. и др. // Медицинская иммунология. – 2004.– Т.6, №3–5.– С.396-397.

18.Регионарное изменение окислительно-восстановительных процессов у ожоговых больных при целевой малообъемной гемоперфузии пораженной конечности / Г.М. Знаменский, И.В. Шлык, Ю.А. Эйсмонт, Н.В. Буркова и др. // Медицинская иммунология. – 2004.– Т.6, №3–5.– С.399–400.

19. Лечение гнойно-воспалительных заболеваний пальцев и кисти методом регионарной малообъемной гемоперфузии / С.И. Кузнецов, А.В. Конычев, Н.В. Буркова и др. // Медицинская иммунология. – 2004.– Т.6, №3–5.– С.452.

20.  Регионарная малообъемная гемоперфузия при лечении больных  с гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти / Б.Е. Бутько, Н.В. Буркова, Ю.А. Эйсмонт и др. // Амбулаторная хирургия. – 2004.– №4(16).– С.29–30.

21. Опыт применения лейкоцитарных фильтров в лечении больных с критической ишемией нижних конечностей / В.В. Сорока, С.П. Нохрин, С.И. Кузнецов, Н.В. Буркова и др. // Бюл. НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН.– М., 2005.– Т.6, №5– С.150.

22. Лечение гнойно-некротических заболеваний пальцев и кисти малообъемной гемоперфузией / С.И. Кузнецов, А.В. Конычев, Н.В. Буркова и др. // Амбулаторная хирургия. – 2005.– 3(19).– С.18–20.

23. Спонтанная миграция лейкоцитов крови больных гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти различной степени тяжести и ее реакция на малообъемную гемоперфузию / Б.Е. Бутько, Н.В. Буркова, Ю.А. Эйсмонт и др. // Медицинская иммунология.– 2005.– Т.7,  №2–3.– С.241.

24. Изменение пула «средних молекул» в процессе  и после регионарной малообъемной гемоперфузии у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями пальцев и кисти / Ю.А. Эйсмонт, Н.В. Буркова, Б.Е. Бутько и др. // Медицинская иммунология.– 2005.– Т.6,  №2–3.– С.285–286.

25. Индукция NO-синтазной активности компонентов цитокиновой сети при малообъемной гемоперфузии / Г.М.Знаменский, С.В.Яковлев, Ю.А.Эйсмонт, Н.В.Буркова и др. // Медицинская иммунология.– 2005.– Т.7,  №2–3.– С.300–301.

26. Цитокиновый профиль больных с критической ишемией нижних конечностей до и после малообъемной гемоперфузии / С.В.Яковлев, С.П. Нохрин, Н.В.Буркова и др. // // Медицинская иммунология.– 2005.– Т.7,  №2–3.– С.335.

27. Влияние гемосорбента СКТ-6А-ВЧ на клеточные популяции крови у больных с гнойно-некротическими заболеваниями пальцев и кисти / Б.Е. Бутько, Н.В. Буркова, Ю.А. Эйсмонт Ю.А. и др. // Хлопинские чтения. Оптимизация больничной среды средствами новых технологий: XXXVIII Науч. конф. – СПб.– 2004.– С.230–232.

28. Способ лечения воспалительных и гнойно-некротических заболеваний пальцев и кисти / С.И. Кузнецов, А.В. Конычев, Н.В. Буркова и др.// Патент №2282466.– 2006.

29. Влияние малообъемной гемоперфузии на основные редокс-циклы системы антиоксидантной защиты у больных с термическими поражениями нижних конечностей / Г.М. Знаменский, Н.В. Буркова, Ю.А. Эйсмонт и др. // Медицинская иммунология.– 2006.– Т.8, №2–3.– С.397.

30. Реакция цитокиновой сети больных с критической ишемией нижних конечностей на некоторые виды лечебного воздействия / С.И. Кузнецов, С.П. Нохрин, Н.В. Буркова и др. // Медицинская иммунология. – 2006.– Т.8, №2–3.– С.394–395.

31.Твердофазная контактная гемомодуляция в комплексном лечении облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей / С.И. Кузнецов, С.П. Нохрин, Н.В. Буркова и др. // Эфферентная терапия. – 2006. – Т.12, №2. – С. 36–42.

32. Немедикаментозная иммунокоррекция при персистирующей подмышечной лимфаденопатии / Н.В. Буркова, А.В. Конычев, С.И. Кузнецов и др. // Медицинская иммунология. – 2007.– Т.9, №2–3.– С.344–345.

33. Буркова Н.В. Динамика антиоксидантной активности крови при лечении термических поражений нижних конечностей / Н.В. Буркова,  Г.М. Знаменский, С.И. Кузнецов // Медицина экстремальных ситуаций. – М., 2007.– №1(19).– С.21–26.

34. Новые подходы и технологии в разрешении старых проблем при воспалительных и гнойно-некротических заболеваниях пальцев и кисти / С.И. Кузнецов, А.В. Конычев, Н.В. Буркова, Б.Е. Бутько // Амбулаторная хирургия. Стационарозамещающие технологии – 2007.– №2(26).– С.10–17.

35. Влияние малообъемной гемоперфузии на уровень провоспалительных цитокинов у больных с гнойно-некротической патологией пальцев и кисти / Н.В. Буркова,  Д.Г. Рутенбург, А.Б. Иваненко и др. // Российский иммунологический журнал. – 2008.– Т.2(11), №2–3.– С190.

36. Ростовой фактор TGF-1 и эйкозаноиды при контактной гемомодуляции in vitro / С.И. Кузнецов, А.В. Конычев, Н.В. Буркова и др. // Медицинская иммунология. – 2009.– Т.11, №4–5.– С.459.

37. Цитокины и эйкозаноиды при контактной гемомодуляции in vitro/ Н.В. Буркова,  А.В. Конычев, Д.Г. Рутенбург и др. // Медицинская иммунология. – 2009.– Т.11, №4–5.– С.480.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.