WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

__________________________________________________________________

На правах рукописи

ХАСАЕВА Фатимат Машировна

ДЕГРАДАЦИЯ ПИРИДИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЯМИ РОДОВ ARTHROBACTER И RHODOCOCCUS

Специальности  03.02.03 – микробиология

03.01.06 – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва, 2010 г.

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического и в лаборатории масс-спектрального анализа химического факультетов МГУ им. М.В. Ломоносова

Научные консультанты:  доктор биологических наук, профессор

Нетрусов Александр Иванович

  доктор химических наук, профессор

  Лебедев Альберт Тарасович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Эль- Регистан Галина Ивановна

доктор биологических наук

Солянникова Инна Петровна

доктор биологических наук, профессор

Градова Нина Борисовна

Ведущая организация: Российский государственный университет нефти и газа

им. И.М. Губкина

Защита состоится 14 декабря 2010 года в 15 часов 30 мин на заседании Диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы дом 1, МГУ, корпус 12, биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан 12 ноября 2010 г

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Пискункова Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время практически все природные среды подвергаются антропогенным воздействиям. Интенсивное развитие химической промышленности привело к тому, что в биосферу постоянно и в возрастающих количествах поступают вещества-загрязнители. Попадая в окружающую среду, они широко распространяются в природных ландшафтах, циркулируют в трофических цепях и накапливаются в организмах животных и человека. Это серьезно угрожает здоровью, и даже жизни всех живых существ, включая человека, повреждая клетки и вызывая мутации, ведущие к развитию злокачественных процессов или наследственных заболеваний. Особую опасность для природных экосистем представляют сточные воды коксохимических, нефтеперерабатывающих, фармацевтических и других предприятий химической промышленности. Они содержат токсичные и канцерогенные органические вещества первого и второго классов опасности, составляющие наиболее многочисленную группу (от 60% - 80% контролируемых веществ), интервал допустимых концентраций которых составляет от 10-4 – 10-7 мг/л. В течение года в природные резервуары поступает до 100 тыс различных химических соединений, 60 млн т синтетических материалов и до 5 млн т пестицидов [Кузнецов, Градова, 2006].

Учитывая распространенность, токсичность и устойчивость ксенобиотиков различных классов, для изучения процессов их деградации были выбраны азотсодержащие ароматические арены, к которым относятся пиридин и его производные [Rogers et al., 1985].

Санитарным законодательством предельно-допустимая концентрация (ПДК) для пиридина в питьевой воде установлена на уровне 0,2 мг/л, пиколинов и лутидинов 0,05мг/л, паров в воздухе 0,0015 мг/л [ГН 2.1.5.2280-07, 2007], а для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение – 0,01 и 0,001 мг/л, соответственно [Перечень рыбохозяйственных нормативов, 1999]. Такие значения ПДК предполагают глубокую очистку сточных вод. На данный момент предложены различные физико-химические способы очистки: адсорбция [Akita, 1993; Sabah, 2002], адсорбция с электросорбцией [Niu, 2002], озонирование [Stern, 1997], ионный обмен [Алиева, 1987], но ни один из современных методов химической очистки не может считаться ни экономичным, ни эффективным. Биологический метод очистки обладает рядом несомненных достоинств, к числу которых относится его экологичность: в процессе биологической очистки не образуется чуждых природной среде соединений и происходит деструкция органических загрязнений до СО2 и Н2О [Лохова, 2009].

Современный уровень развития общества, промышленного производства, экологическое состояние окружающей среды обусловили повышение требований к качеству сточных вод, сбрасываемых в водные объекты, а традиционные технологии биологической очистки в аэротенках уже не позволяют достичь необходимой степени очистки.Одним из наиболее эффективных и очевидных способов увеличения окислительной мощности и улучшения ряда технологических показателей традиционных биологических очистных сооружений является применение иммобилизации биомассы на нерастворимых в воде материалах [Демаков и др., 2009].

В связи с этим первостепенное значение приобретает разработка микробио-логических способов очистки, предусматривающая поиск эффективных микро-организмов-деструкторов, всестороннее их изучение, подбор оптимальных способов хранения, обеспечивающих сохранение, как жизнеспособности, так и ферментативной активности, исследование путей и химических превращений ксенобиотиков и дальнейшее использование этих микроорганизмов в процессах очистки промышленных сточных вод и биоремидиации почв.

Состояние вопроса. К началу настоящей работы было известно, что первичной реакцией метаболизма бензольного кольца является его гидроксилирование с образованием диоксисоединений [Арчаков, 1983; Leslie, 1985; Кулинский, 1999; Соляникова, 2007]. Последующее раскрытие кольца может проходить по одному из известных типов окислительного его расщепления: орто-, мета- и расщепление по пути гентизиновой кислоты.

В отличие от бензольного, реакции раскрытия пиридинового кольца не имеют однозначной интерпретации. Это, с одной стороны, обусловлено тем, что пиридин является электронодефицитным соединением, поскольку замена в кольце бензола одного атома углерода более электроотрицательным атомом азота приводит к резкому перераспределению электронной плотности в ядре так, что в положениях 2- и 4- электронная плотность понижена [Гранберг,1973, Пожарский,1986]. В результате наряду с повышенной основностью пиридина (за счет свободной пары электронов азота), его электрофильность резко подавлена, а нуклеофильные реагенты атакуют - и - положения в ядре. Таким образом, нуклеофильная атака, например, введение ОН-группы, становится более легкой по сравнению с электрофильным замещением (Джилкрист, 1996). С другой стороны, до сих пор не удалось получить бактериальные бесклеточные экстракты, способные трансформировать молекулу пиридина: отсюда многие стадии его деградации остаются неизученными.

Немногочисленные данные о микробном метаболизме пиридина и алкилпиридинов свидетельствуют о различающихся процессах их разложения

Такие штаммы бактерий как Brevibacterium sp. [Shukla, 1973]; Corynebacterium sp. [Shukla, Kaul, 1974]; Bacillus sp. шт. 4 [Watson, Cain, 1972]; Nocardia sp. [Watson, Cain, 1975]; Micrococcus luteus [Sims et al., 1985, 1986] могут использовать пиридин в качестве единственного источника углерода и азота при его концентрации 1,5-2,0 г/л и времени утилизации от 2 до 5 дней. Первыми идентифицированными интермедиатами оказались насыщенные алифатические кислоты, янтарный и глутаровый полуальдегиды, присутствие которых свидетельствует о восстановлении пиридинового кольца [Shukla, 1973; Watson, Cain, 1975]. Вполне вероятно, что интермедиатом при деградации пиридина является 1,4-дигидропиридин (Watson, Cain, 1972), однако прямых доказательств этого процесса нет, первичные продукты восстановительной реакции не были выделены. Исследования девяностых годов дали несколько другие результаты. Бактерия Nocardia sp. КМ-2 (Коростелева, 1982) утилизировала пиридин в качестве единственного источника углерода и азота при максимально потребляемой концентрации 0,2% за 96 часов. В КЖ накапливался интермедиат, который был идентифицирован как 3-гидроксипиридин, что предполагает раскрытие кольца пиридина, предшествующее его окислению. И в этом случае в качестве интермедиата был идентифицирован янтарный полуальдегид.

На данный момент в научной литературе представлены работы по изучению биодеградации небольшого ряда алкилпиридинов, в основном метил- и этил- производных пиридина. [Bai, 2008; Stobdan, 2008; McCulloch, 2009.] В основном описаны кинетические зависимости разрушения субстратов ограниченным числом различных видов микроорганизмов, и достаточно скудно представлены материалы по изучению путей метаболизма этих соединений. К настоящему времени нет четких, обоснованных данных о путях деградации пиридина и его производных, а также диагностике штаммов, обладающих высокой деструктивной активностью по отношению к этим сильнейшим токсикантам. Так как до сих пор не удалось получить бесклеточные экстракты, трансформирующие пиридины, не были определены и охарактеризованы ферменты биодеградации пиридинового кольца.

Цель. Целью работы было исследование микробной деструкции пиридиновых загрязнителей: поиск и выделение высокоактивных штаммов-деструкторов пиридина и его производных; изучение их физиологической активности; а также исследование путей и направлений биохимических реакций разложения пиридинов для использования выявленных закономерностей и выделенных бактерий – деструкторов в биотехно-логических процессах очистки промышленных сточных вод и биоремидиации почв.

Основные задачи исследований:

1. Поиск и выделение высокоактивных бактерий-деструкторов пиридиновых соединений, идентификация выделенных штаммов бактерий.

2. Изучение кинетических параметров и подбор оптимальных условий для утилизации пиридина и пиридиновых производных выделенными штаммами.

3. Оценка выживаемости и сохранения утилизирующей активности бактерий-деструкторов по отношению к исследуемым субстратам после 20 лет хранения штаммов.

4. Выделение, характеристика и определение структуры индивидуальных продуктов интермедиатов биодеградации пиридинов, методами хроматографии и хроматомасс-спектрометрии.

5. Установление путей деградации пиридина и его производных в процессе их разрушения выделенными бактериями.

7. Масс-спектрометрический анализ белкового профиля бактерий родов Arthrobacter sp. КМ-Р и Rhodococcus wratislaviensis KM-P, утилизирующих пиридин, методом матрично-активированной лазерной десорбции /ионизации (МАЛДИ).

8. Иммобилизация клеток бактерий Arthrobacter sp. КМ-Р, утилизирующие пиридин, в альгинате кальция для разработки основ биотехнологического процесса деструкции ксенобиотиков этого класса.

Научная новизна работы. Выделены бактерии-деструкторы пиридинов из почв, отобранных с территорий химико-фармацевтического предприятия «Акрихин» и предприятия по синтезу легких пиридинов. Выделенные штаммы обладали исключительно высокой деградирующей активностью, были идентифицированы на основании морфологических, культуральных, физиолого-биохимических свойств и результатам сиквенирования 16S рРНК как представители родов Аrthrobacter и Rhodococcus .

Исходный штамм Аrthrobacter sp. КМ-4 и полученные варианты обладали широкой субстратной специфичностью по отношению к производным пиридина.

Установлено, что деградация, как незамещенного пиридина, так и его производных выделенными микроорганизмами происходит по окислительному пути: гетероциклическое кольцо на первом этапе подвергается гидроксилированию вС-2 и (или) С-3 положении цикла. Впервые в качестве промежуточных продуктов метаболизма пиридина выявлены 2-гидрокси-, 2,3-дигидрокси- и 2,6-дигидроксипро-изводные. Обнаружение продуктов гидратации пиридина у Аrthrobacter sp. КМ-P и Rhodococcus wratislaviensis KM-P предполагает происхождение атома кислорода в гидроксильных группах у С-2 и С-6 из воды. На основании анализа продуктов раскрытия дигидроксипроизводных установлено, что пиридиновое кольцо подвергается гидролитическому разрыву по С–N связи обоими штаммами бактерий. Впервые при изучении метаболизма 2-МП показано, что раскрытие кольца гидрокси-2-МП между 2-м и 3-м атомами углерода с последующей реакцией конденсации приводит к образованию N-ацетилпиррола. Раскрытие кольца между 5-м и 6-м атомами углерода, аналогично, приводит к образованию N-формил-2-метилпиррола, т. е. раскрытие кольца наблюдается и в орто- и в мета-положении. В процессе метаболизма 4-МП штаммом Аrthrobacter sp. КМ-4МР образуются розовый и голубой пигменты, которые являются продуктами конденсации 2,3-дигидрокси-4- и 2,3,6-тригидрокси-4-МП, соответственно. Метаболизм 2,4-ДМП сопровождается окислением как кольца гетероцикла, так и метильных групп. Утилизация 2,6-ДМП сопровождается образованием 3,4-дигидрокси-2,6-диметилпиридина, с раскрытием кольца в мета-положении.

Практическое значение работы. Из почв, длительное время подвергавшихся воздействию пиридина и его производных, выделены штаммы бактерий родов Аrthrobacter и Rhodococcus, которые способны разлагать устойчивые азотсодержащие поллютанты – незамещенный пиридин, 2-метил-, 4-метил-, 2,4-диметил- и 2,6-диметил-пиридины. Создана коллекция штаммов бактерий, адаптированных к высоким концентрациям токсикантов и характеризующихся высокой скоростью их разложения. Штамм Аrthrobacter sp. КМ-4 за 24 часа утилизировали 2,5 г/л пиридина и 2-МП, 1,5 г/л 4-МП и 3,0 г/л 2,6-ДМП. Варианты штамма, утилизирующие: пиридин – Аrthrobacter sp. КМ-Р; 2-метилпиридин – Аrthrobacter sp. КМ-2МР; 4-метилпиридин –  Аrthrobacter sp. КМ-4МР и 2,6-ДМП – Аrthrobacter sp. КМ-2.6DMP.

Штамм Rhodococcus wratislaviensis KM-P за 24 часа утилизировал 2,5 г/л пиридина, Rhodococcus erythropolis 2.4DMP – 2,0 г/л 2,4-диметилпиридина в течение 36 часов. Штаммы утилизировали пиридин и его производные до СО2 и Н2О. Аrthrobacter sp. КМ-4 депонирован в ВКМ (Ас-1098Д).

Лабораторные испытания по биодеградации пиридиновых оснований, содержащихся в сточных водах коксохимического производства с помощью бактерий Аrthrobacter sp. КМ-4 показали их высокую деструктивную активность: снижение концентрации пиридинов с 75–90 мг/л до 8–15 мг/л в течение 6 часов.

Штаммы Rhodococcus wratislaviensis KM-P и Rh. erythropolis 2.4DMP утилизирующие пиридин и 2,4-диметилпиридин рекомендованы для очистки промышленных сточных вод коксохимической и химико-фармацевтической отраслей промышленности.

Материалы диссертационной работы используются в лекционной работе профессорско-преподавательским составом ВУЗов КБР.

Апробация результатов и публикации. Результаты работы представлены и обсуждались на 4-м Европейском конгрессе по биотехнологии (Амстердам, Голландия, 1987); на конференции «Охрана окружающей среды» (Братислава, Чехословакия, 1988); на 8-м Международном симпозиуме по биотехнологии (Париж, Франция, 1988); на 3-м Симпозиуме актиномицетологов (Будапешт, Венгрия, 1988); на 5-м Международном конгрессе по коллекциям культур (Вашингтон, США, 1988); на 2-м Международном симпозиуме по микробиологии (Киото, Япония, 1989); на 3-м Съезде ВМСО и всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2007); на Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007); на Международной научно-практической конференции «БИОТЕХНОЛОГИЯ» (Москва, 2008); на 56-ом съезде по масс-спектрометрии (Денвер, США, 2008); на 3-м Европейском конгрессе по микробиологии (Гётеборг, Швеция, 2009); на 18-ой Международной конференции по масс-спектрометрии (Бремен, Германия, 2009), на 3-ей Международной конференции "Химия гетероциклических соединений" (Москва, 2010).

Защищаемые положения диссертации.

  • Представители немицелиальных актинобактерий из р.р. Аrthrobacter и Rhodococcus обладают высокой деградативной способностью в отношении широкого спектра пиридиновых токсикантов.
  • Широкая субстратная толерантность, свойственная исходному выделенному из природных образцов штамму, восстановлена после хранения в виде спектра выщипившихся диссоциантов, высокоактивных в отношении отдельных субстратов.
  • Бактерии-деструкторы, утилизирующие пиридин и его производные и не способные расти на их индивидуальных интермедиатах разложения пиридина, могут индуцироваться исходным субстратом (пиридином).
  • Первой стадией разложения пиридина и его производных актинобактериями р.р. Аrthrobacter и Rhodococcus могут быть не только восстановление, но окисление гетероцикла, аналогично начальному этапу окисления ароматического кольца при биодеструкции замещенных фенолов.
  • Разрыв окисленного кольца пиридина может идти по нескольким путям: орто-, мета- или между C-N, аналогично многочисленным путям разрушения ароматического кольца у замещенных фенолов. Дальнейшие превращения окисленных пиридинов могут осуществляться по нескольким независимым путям.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 35 работ, из них 14 экспериментальных статей в рекомендуемых ВАК`ом изданиях, 1 патент, тезисы 15 докладов.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 236 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов, списка цитируемой литературы, который включает 327 источников, содержит 27 таблицы и 40 рисунков.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность сотрудникам кафедры микробиологии биологического и лаборатории органического анализа химического факультетов МГУ им. М.В. Ломоносова оказавшим помощь и поддержку на всех этапах выполнения представленной работы. Автор признателен научным консультантам настоящей работы профессору Александру Ивановичу Нетрусову (Биологический ф-т, МГУ, зав. каф. микробиологии) и профессору Альберту Тарасовичу Лебедеву (Химический ф-т, МГУ, зав. лабораторией масс-спектрального анализа) за внимание и постоянный интерес к работе, а также за помощь в обсуждении результатов работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В обзоре описаны основные пути микробной деструкции соединений, содержащих пиридиновое кольцо, с помощью микроорганизмов, также обобщены данные о применении метода МАЛДИ для масс-спектральной характеристики сапротрофных групп микроорганизмов по белковым профилям.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы. Используемые реактивы были аналитической чистоты. В качестве субстратов для деградации использовали свежеперегнанные препараты незамещенного пиридина; 2-метил- и 4-метилпиридина; 2,4- и 2,6-диметилпиридина. Чистота реактивов после перегонки составила 98% (данные ГХ-МС). В качестве соединений «свидетелей» использовали коммерческие препараты 6-гидрокси-2-метилпиридина и 5-гидрокси-2-метилпиридина. Соединения: 3-гидрокси-2,6-диметилпиридин; 4-гидрокси-2,6-диметил-пиридин; 3,4-дигидрокси-2,6-диметилпиридин; 3-гидрокси-2-метилпиридин; 2-гидрок-си-4-метилпиридин; 2,3-дигидрокси-4-метилпиридин; N-ацетилпиррол; N-формил-2-метилпиррол – были синтезированы.

Микроорганизмы. Штаммы бактерий выделяли из почв, отобранных с территорий химико-фармацевтического предприятия «Акрихин» (г. Купавна, Московская обл.) и Авдеевского коксохимического завода (г. Авдеевка, Украина) по синтезу легких пиридинов, длительно подвергавшихся воздействию пиридинов в сточных водах. Выделение бактерий проводили методом накопительных культур на жидкой синтетической среде Шуклы [Shukla, 1973]., культивировали в колбах 750мл с 200 мл среды, на качалке (200 об/мин) при 28-300С. Пересевы производили до появления видимого роста микроорганизмов, с каждым разом увеличивая концентрацию вносимого субстрата. После нескольких пересевов, источник азота в виде (NH4)2SO4 исключали. Чистые культуры получали по методу Коха [Нетрусов, 2005]. Морфологические особенности штаммов изучали с помощью микроскопии, используя иммерсионную систему, фазово-контрастное устройство и электронно-микроскопическую технику (Hitachi-S-405A). Идентификацию штаммов проводили согласно Берджи [Bergey’s, 1986].

Секвенирование последовательности гена 16S рРНК. ДНК из клеток бактерий выделяли по методу [Булыгина, 2002]. Амплификацию гена 16S рРНК проводили с использованием системы универсальных праймеров [Edwards, 1989]. Состав реакционной смеси для ПЦР: праймеры по 25 пмоль, каждого; 10 буфер – 2,5 мкл; 2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата – 2,5 мкл; Bio Taq-полимераза 5Е/мкл – 0,2 мкл («Диалат», Москва); ДНК-матрица  – 50 нг; Н2О – до 25 мкл. Реакцию проводили по схеме: до 30 циклов амплификации при следующем температурном режиме: денатурация ДНК при 94оС – 0,5 мин; отжиг праймеров при 45оС – 1 мин; элонгация при 72оС – 1 мин; окончательная полимеризация – 7 мин. Продукты ПЦР анализировали электрофоретически в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см. Использовали систему видеодокументации BioDocII (Biometra, Германия). Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps (Promega, США). Секвенирование ПЦР-продуктов проводили с использованием набора реактивов Silver Sequencing, (Promega, США), согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями. Для сиквенирования использовали как внешние, так и внутренние праймеры. Чтение проводили в двух направлениях.

Первичный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов проводили с помощью сервера BLASTA, и выравнивание последовательностей – с помощью программы CLUSTAL.W [Thompson, 1994]. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий проводили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON [Van de Peer, 1994].

Количественные определения потребления пиридинов из культуральной жидкости (КЖ) проводили на спектрофотометре «Hitachi-200-20» (Япония) при следующих длинах волн: 255 нм для пиридина (П); 262 нм для 2-метилпиридина (2-МП) и 4-метилпиридина (4-МП); 260 нм для 2,4-диметилпиридина (2,4-ДМП); 268 нм для 2,6-диметилпиридина (2,6-ДМП). Для этого культуру подкисляли HCl, отделяли клетки центрифугированием, 1 мл супернатанта доводили до 100 мл 0,1 н раствором HCl и определяли величину оптической плотности. Калибровочную кривую строили по анализируемым субстратам.

Хранение исходного штамма Arthrobacter sp. KM-4. Лиофилизацию клеток осуществляли на центробежно-сублимационной установке (Edvards High Vacuum Company, Англия). Высушивание – 3 часа на первичной сушке 3ОРI при остаточном ваккуме 110 мм рт.ст., t рефрижератора – 45оС и t сублиматора – 22оС. Ампулы с клетками с остаточной влажностью 2,0-3,0 %, запаивались под ваккумом и хранились при 4оС без доступа света [Герна, 1983]. Тест на «ускоренное хранение» проводили по методу [Banno, Sakane, 1981]. Криоконсервацию суспензии клеток проводили ультрабыстрым способом со скоростью охлаждения ~ 400 град/мин путем непосредственного погружения в жидкий азот и последующим хранением при –196оС.

Определение потребления пиридина суспензией и иммобилизованными клетками Аrthrobacter sp. KM-P Скорость утилизации пиридина оценивали суспензией свободных и иммобилизованных в альгинате кальция клеток на среде следующего состава (г/л): KH2PO4 – 0,2; MgSO4·7H2O – 0,2; FeSO4·7H2O – 0,01; CaCl2·2H2O – 0,02; MnSO4·H2O – 0,002; Na2MoO4 – 0,001; pH 7,0-7,2.В колбы Эрленмейера с 200 мл среды вносили пиридин, в концентрациях по 1,5, 2,5, 3,0 и 3,4 г/л. В каждую из колб ввели по 8,3 мл суспензии клеток и по 25 мл гранул с клетками и культивировали при аэрации и 28о-30оС. Пробы на предмет утилизации 1,5 г/л пиридина отбирали через каждые 3 часа и через каждые 6 часов для остальных концентраций.

Выделение и идентификация индивидуальных продуктов деградации пиридинов. Экстракты 1-3, полученные при рН 8,0-9,0; 7,0-7,5 и 2,0-3,0 из 1-2 л КЖ, упаривали, остаток растворяли в 0,5-1,0 мл этанола и проводили разделительную хроматографию на пластинках “Silufol UV - 254” (DC-Alufolies Kieselgel 60 F254, Merck, Германия) и пластинках с целлюлозой (TLC-Ready Plastic Sheets F1440, Merck, Германия). Использовали следующие системы растворителей 1 – хлороформ-метанол (20:3); 2 – хлороформ-ацетон-этанол (7:2:2); 3 – этанол-аммиак-вода (20:1:4); 4 – петролейный эфир-этилацетат (1:5). Хроматограммы проявляли в УФ-свете или парами йода. Фенольные соединения – опрыскивая хроматограммы 2% спиртовым раствором FeCl2; кетокислоты – 0,5% раствором 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ) в 2 н растворе HCl; карбоновые кислоты – 0,05% спиртовым раствором бромкрезолового зеленого (рН 7,0-8,0). Для препаративного выделения индивидуальных продуктов использовали тонкослойную и колоночную хроматографию. В первом случае экстракты, растворенные в этаноле, хроматографировали на силикагеле (PSC- Fertigplatten Kieselgel 60 F254, Merck, Германия), используя системы растворителей 1, 2 и 3. Хроматографические зоны сорбента вырезали и элюировали этанолом, полученные растворы фильтровали, фильтраты упаривали, осадок анализировали.

Для препаративного выделения карбоновых кислот использовали колоночную хроматографию (30х1,7) на целлюлозе (Silicagel L 40/100, Chemapol, CzSR) в системе растворителя 3, а также тонкослойную препаративную хроматографию в системах растворителей 2, 3 и 4. Структуру выделенных индивидуальных соединений доказывали анализом их масс-, УФ-, ИК- и ЯМР-спектров. 2,4-динитрофенилгидразоны кетокислот получали путем обработки образцов раствором 2,4-ДНФГ в хлорной кислоте с последующим разделением в тонком слое силикагеля, в системе петролейный эфир-этилацетат-уксусная кислота (26:14:3).

Триметилсилилирование полученных образцов проводили по методу, описанному в [Gehrke, Laking, 1971]: к исследуемому образцу добавляли 25 мкл ацетонитрила, 25 мкл дихлорэтана и 50 мкл бистриметилсилилтрифторацетамида (Regisil BSTFA), смесь выдерживали 30 мин при 150-160оС.

Хроматомасс-спектральный анализ проводили на приборе «Varian-MAT-211» со стеклянной капиллярной колонкой (50м x 0,2 мм) с неподвижной фазой SE-30. Масс-спектры получали на приборе « Finigan МАТ-4615» методом химической ионизации (газ-реагент NН3) при энергии ионизации 70 эВ с прямым вводом вещества в ионный источник. Спектры ЯМР 1Н сняты на спектрометре «Tesla BS-467» в растворе СDСl3, внутренний стандарт – тетраметилсилан (ТМС).

Выделение и идентификация продуктов деградации 2-МП Пробы отбирали в динамике роста культуры в объеме 200 мл, подкисляли до рН 2,0-3,0 HCl, клетки отделяли центрифугированием, 30 мл супернатанта трижды экстрагировали 10 мл свежеперегнанного дихлорметана. Суммарную кислотную дихлорметановую вытяжку (~30 мл) упаривали на роторном испарителе до объема ~3 мл (экстракт 1). Оставшийся водный раствор подщелачивали до рН 8,0-9,0 40% раствором NаOH, после чего трижды экстрагировали 10 мл дихлорметана. Суммарную вытяжку упаривали до объема ~3 мл (экстракт 2). Для получения дериватизированных экстрактов 30 мл КЖ упаривали досуха на роторном испарителе, сухой остаток растворяли в 2 мл дихлорметана, в полученный раствор добавляли 1 мл раствора BF3 в метаноле, кипятили 2 мин и трижды промывали дистиллированной водой. Конечный объем составлял ~3 мл (экстракт 3). Аналогичным образом была проведена дериватизация кислотного экстракта (экстракта 1), к которому добавляли 1 мл раствора BF3 в метаноле и кипятили 2 мин, после чего экстракт трижды промывали дистиллированной водой, упаривали до конечного объема 3 мл (экстракт 4). Силилирование продуктов деградации 2-МП из экстрактов КЖ проводили N,O-бис(триметилсилил)-ацетамидом. К 1 мл экстракта добавляли 10 мкл силилируещего агента. Процесс проводили в ультразвуковой бане в течение 2 часов при 60оС. Затем аликвоту объемом 100 мкл доводили дихлорметаном до 1 мл. Анализ продуктов, содержащихся в экстрактах, проводили на масс-спектрометре ГХ-МС (LECO Pegasus 4D, Германия), снабженном капиллярной силиконовой колонкой RTX-5MS (30 м), при энергии ионизующих электронов 70 эВ. Диапазон регистрируемых масс – от 29 до 500 Да. Экстракты хроматографировали в температурном режиме: 2 мин при 50oС, 2 мин при 280оС, скорость нагрева – 20оС/мин. Объем вводимой пробы – 0,1 мкл. Компоненты анализируемых смесей идентифицировали с помощью компьютерных библиотек масс-спектров органических соединений: 1) NIST - National Institute of Science and Technology, библиотека на 130 тысяч соединений; 2) WILEY-библиотека на 275 тысяч соединений, а также вручную с использованием известных направлений распада молекулярных ионов органических соединений [Лебедев, 2003].

Количественный масс-спектрометрический анализ КЖ 2-МП, проводили в пробах, отобранных в динамике роста культуры (3; 6; 9; 12; 18; 20 и 22 ч). В качестве внутреннего стандарта использовали пердейтерированный нафталин, в количествах 10-100 мкг в зависимости от соотношения аналитических сигналов самого стандарта и определяемых компонентов. Определение проводили по площадям хроматографических пиков по полному ионному току и по отдельным характеристическим ионам в масс-спектрах при использовании метода внутреннего стандарта. Количество определяемого вещества рассчитывается по формуле: mx = Sx х mst/Sst, где Sx и Sst – площади хроматографических пиков продукта и внутреннего стандарта соответственно, а mх и mst – их количество [Золотов, 2002].

Синтезом соединений «свидетелей» подтверждали структуры интермедиатов, обнаруженных в ходе анализа. N-ацетилпиррол синтезировали по методу, предложен-ному в работе [Drew et al., 1985], 3-гидрокси-2-метилпиридин – в работе [Williams et al., 1955].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение штаммов-деструкторов и оценка утилизации ими пиридина и его производных. Из почв, которые в течение долгого времени подвергались воздействию сточных вод, содержащих пиридин и его производные, были выделены в виде чистых культур, штаммы бактерий – деструкторов пиридинов. По результатам идентификации штаммов на основании фенотипических и генетических методов анализа, они были отнесены к родам Аrthrobacter и Rhodococcus.

Утилизацию субстратов изучали в динамике роста штаммов на минеральной среде, содержащей пиридины как единственные источники углерода, азота и энергии.

Штамм Arthrobacter sp. КМ-4 обладал широкой субстратной специфичностью по отношению к производным пиридина и исключительно высокой деградирующей активностью: за 24 часа штамм утилизировал по 2,5 г/л пиридина и 2-МП, 1,5 г/л 4-МП и 3,0 г/л 2,6-ДМП. Arthrobacter sp. КМ-4 был способен использовать перечисленные субстраты, как по отдельности, так и в смеси, самая высокая концентрация (3 г/л), которой не должно было превышать для их полной утилизации. В процессе работы с Arthrobacter sp. КМ-4, когда культивирование штамма проводили исключительно на индивидуальном субстрате, были изолированы 4 варианта исходной культуры: вариант штамма, утилизирующий пиридин – Arthrobacter sp. КМ-Р; 2-метилпиридин – Arthrobacter sp. КМ-2МР; 4-метилпиридин – Arthrobacter sp. КМ-4МР и 2,6-диметилпиридин – Arthrobacter sp. КМ-2.6DMP (рис. 1-4).

Рис. 1. Утилизация субстрата (а) и накопление (б) биомассы при росте штамма Arthrobacter sp. KM-Р на пиридине.

Изучение влияния температуры на скорость утилизации субстратов с учетом их летучести показало, что оптимальной для их метаболизма является 28-30оС. Однако процесс мог протекать и при более низкой (22-24оС), при которой полное потребление веществ наблюдается за 40 ч роста, и при более высокой (40оС) температуре. Для роста штамма бактерий оптимальной была концентрация пиридина 2,5 г/л, которая утилизировалась за 24 часа (рис. 1). Аналогичны показатели и для 2-МП (рис.2).

Рис. 2. Утилизация субстрата (а) и накопление (б) биомассы при росте штамма Arthrobacter sp. KM-2МР на 2-МП.

Для 4-МП оптимальной была концентрация 1,5 г/л: утилизировался бактериями за 24ч (рис. 3).

Рис. 3. Утилизация субстрата (а) и накопление (б) биомассы при росте штамма Arthrobacter sp. KM-4МР на 4-МП.

Наибольшая деградирующая активность у штамма проя-вилась относительно 2,6-ДМП: за 24 часа было потреблено 3,0 г/л этого субстрата (рис. 4).

Рис. 4. Утилизация субстрата (а) и накопление (б) биомассы при росте штамма Arthrobacter sp. KM-2.6DМР на 2,6-ДМП.

Перекрестные пересевы каждого их вариантов на другие субстраты, показало, варианты, утилизирующие 2-МП и 2,6-ДМП без лаг-фазы расли и взаимно утилизировали оба субстрата, тогда как варианты, утилизирующие пиридин и 4-МП росли исключительно на своих субстратах.

Штамм Rhodococcus  wratislaviensis КМ-Р обладал высокой деструктивной активностью по отношению к пиридину, утилизируя 2,5 г/л субстрата за 24 часа (рис. 5). При этом катаболизм пиридина штаммом проходил без длительного лаг-периода.

Рис. 5. Утилизация субстрата (a) и накопление (б) биомассы при росте штамма Rhodococcus wratislaviensis KM-P на П.

Наиболее интенсивное потребление субстрата (30%) наблюдалось между 18 и 21 час и рост штамма на пиридине не сопровождается образованием пигмента

Штамм Rhodococcus erythropolis 2.4DMP, обладал довольно высокой деструктивной активностью по отношению к 2,4-ДМП: 2,0 г/л субстрата утилизировалось за 36 часов (рис. 6). Для штамма была характерна узкая субстратная специфичность, он утилизировал только 2,4-ДМП, на котором был выделен.

Рис. 6. Утилизация субстрата (a) и накопление биомассы (б) при росте штамма Rh. erythropolis 2.4DMP на 2,4-ДМП.

2. Кинетика утилизации пиридина штаммами Arthrobacter sp. KM-Р и Rhodococcus wratislaviensis KM-P. Штамм Rh. wratislaviensis KM-P, в отличие от Arthrobacter sp. КМ-Р, целенаправленно выделяли, используя в качестве ростового субстрата пиридин, и обладал узкой субстратной специфичностью. Время утилизации (24 ч) и концентрации пиридина (по 2,5 г/л) для обоих штаммов идентичны. Для более полного описания утилизирующей активности штаммов, были рассчитаны следующие кинетические параметры: удельная скорость роста μ культуры, экономический коэффициент Ys и удельная утилизирующая активость биомассы q. Графики, использованные для расчета удельной скорости роста и экономических коэффициентов Rh. wratislaviensis КМ-Р и Arthrobacter sp. КМ-Р приведены на рис. 7, 8 и рис. 9, 10, соответственно.

Рис. 7. Зависимость накопления биомассы от времени роста Rh. wratislaviensis КМ-Р в полулогарифмических координатах

Рис. 8. График для расчета экономического коэффициенташтамма Rh. wratislaviensis КМ-Р.

Рис.9. Зависимость накопления биомассы от времени роста Arthrobacter sp. КМ-Р в полулогарифмических координатах

.

Рис. 10. График для расчета экономического коэффициента

штамма Аrthrobacter sp. КМ-Р.

Анализ полученных зависимос-тей позволяет сделать вывод, что кинетика в исследуемых услови-ях роста штаммов адекватно описывается уравнением ln M = ln M0 + µt [Варфоломеев и др., 1990].

Рассчитанные значения кинетических параметров для штаммов приведены в таблице 1.

Таблица 1. Кинетические характеристики штаммов-деструкторов пиридина

Штамм

Удельная скорость роста, ч-1

Экономический коэффициент

Удельная активность биомассы, моль[C]/г*ч

Arthrobacter sp. KM-4

0,0461

0,2634

13,8

Rhodococcus wratislaviensis  KM-Р

0,0661

0,2884

18,1

Поскольку значения удельной скорости роста связаны со скоростью деления клеток исследуемых культур, можно сделать вывод, что у Rh. wratislaviensis KM-P этот процесс проходит на 40% быстрее, чем у Аrthrobacter sp. KM-Р. Удельная активность биомассы дает наглядное представление о способности культур к деградации. Так, рост Rh. wratislaviensis KM-P был более интенсивен, равно как и удельная активность биомассы была значительно выше: 1 г клеточной массы Rh. wratislaviensis KM-P потреблял на 4,3 моля пиридина больше, чем Аrthrobacter sp. KM-Р, что в пересчете составлял 3,4 г.

3. Хранение штамма Arthrobacter sp. КМ-4, утилизирующего пиридин и его производные. В связи с потенциальной перспективностью использования штаммов-деструкторов в биотехнологии и охраны окружающей среды, отдельной практической задачей явилась разработка способов хранения штаммов с сохранением высокого уровня жизнеспособных клеток и их утилизирующей активности.

В доступной литературе отсутствуют сведения касающиеся сохранности физиологических свойств штаммов, способных к утилизации пиридиновых производных. В связи с этим на примере высокоактивного штамма Arthrobacter sp. KM-4 были подобраны условия его хранения.

Для длительного хранения штамма использовали несколько методов: лиофилизацию клеток в различных защитных средах и криоконсервацию в криопротекторах. Согласно предварительно полученным данным консервировали зрелые клетки начала стационарной фазы роста, выращенные на минеральной среде с 2,6-ДМП. Исходная плотность клеток в суспензии для консервации составляла 109 кл/мл. Регидратацию клеток после хранения проводили в той же минеральной среде. Полученные результаты были экстраполированы для консервации бактерий Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р и Rh.  erythropolis 2.4DMP.

3.1. Лиофилизация. Лиофилизация в настоящее время широко используется для длительного хранения коллекционных и многих промышленных штаммов (Ashwood-Smith, 1980; Бланков и др., 1981; Kirsop,1983). Лиофилизированные культуры могут храниться в течение длительного времени, при условии их содержания без доступа кислорода, влаги и света при пониженных температурах (Heckly, 1978, Ashwood-Smith, Farrat, 1980).

В качестве защитных сред при лиофилизации клеток Arthrobacter  sp. KM-4 использовали 5% раствор трегалозы, лошадиную сыворотку с 5% раствором мезо-инозита и сухое молоко. Количество жизнеспособных клеток на использованных защитных средах оценивали на протяжении 9 месяцев хранения (табл. 2). Наиболее высокая плотность жизнеспособных клеток непосредственно после лиофилизации клеток было получено при использовании сухого молока ~ 30% от исходного, более низкий титр – при лиофилизации в растворе трегалозы ~ 18% и лошадиной сыворотки с мезо-инозитом ~ 14%.

Таблица 2. Жизнеспособность клеток штамма бактерий Arthrobacter sp. KM-4 при

лиофилизации

Защитная среда

Количество жизнеспособных лиофилизированных клеток в %

Y0

1 сутки

15 суток

1 месяц

6 месяцев

9 месяцев

Y1

%

Y2

%

Y3

%

Y4

%

Y5

%

5% трегалоза

8,34

7,60

18

7,47

14

7,47

14

7,47

14

7,47

14

Лошадиная сыворотка с 5% мезо-инозита

8,47

7,60

14

7,60

14

7,56

14

7,50

  12

7,60

  12

сухое молоко

9,32

8,77

30

8,77

30

8,77

25

8,77

25

8,77

25

В процессе хранения штамма жизнеспособность клеток на всех использованных защитных средах практически не изменялась.

Анализ результатов определения утилизирующей активности штамма Arthrobacter sp. KM-4 также показал, что лиофилизированные клетки во всех трех средах в течение 9 месяцев хранения не теряла своей активности (93-96 % от исходного).

Полученные результаты по данным сохранения жизнеспособности клеток, так и их утилизирующей активности не позволили отдать предпочтение какой-либо из сред для длительного хранения штамма Arthrobacter sp. KM-4.

3.2. Тест на «ускоренное хранение» лиофилизированных клеток штамма бактерий Arthrobacter sp. KM-4. С целью определения гарантированного времени сохранности штамма при 4оС и быстрой оценки эффективности использованных сред проводили «тест на ускоренное хранение». Для этого ампулы с лиофилизированными клетками в течение месяца хранили при 4о, 28о и 37оС, после чего оценивали как жизнеспособность бактерий, так и их утилизирующую активность (таблицы 3 и 4).

Таблица 3. Результаты «теста на ускоренное хранение» лиофилизированных клеток штамма Arthrobacter sp. KM-4 на различных защитных средах

Защитная среда

Температура хранения, оС

Титр жизнеспособных клеток

до консер-вацииYо

1 сутки

15 суток

30 суток

Y1

Y2

Y3

5% трегалоза

4

28

37

8,34

7,60

7,60

7,60

7,50

7,47

7,30

7,49

7,41

7,00

Лошадиная сыворотка с 5% мезо-инозита

4

28

37

8,47

7,60

7,60

7,60

7,60

7,60

7,60

7,59

7,69

7,67

Сухое молоко

4

28

37

9,32

8,77

8,77

8,77

8,77

8,77

8,77

8,47

8,74

8,36

Динамика титра жизнеспособных клеток представлена на рисунке 11, a, b, c.

Рис. 11. Жизнеспособность Аrthrobacter sp. KM-4 по результатам «теста на ускоренное хранение» в: а) лошадиной сыворотке с 5% раствором мезо-инозита (46 лет); b) 5% раствор трегалозы (4 года); c) сухом молоке (5 лет).

Из их анализа следует, что на лошадиной сыворотке с 5% раствором мезо-инозита титр жизнеспособных клеток снизится до ~ 102 кл/мл за 46 лет (а); 5% растворе трегалозы – за 4 года (b); на сухом молоке – за 5 лет хранения (с).

Прогнозирование выживаемости лиофилизированных клеток штамма Arthrobacter sp. KM-4, основанное на «тесте ускоренного хранения», базируется на следующих теоретических положениях. Первое состоит в том, что скорость снижения выживаемости лиофилизированных клеток подчиняется уравнению кинетики 1-го порядка. Отсюда зависимость выживаемости от времени хранения при постоянной температуре носит экспоненциальный характер. Второе теоретическое положение основано на использовании уравнения Аррениуса при описании зависимости константы скорости К от температуры хранения. Результаты расчетов коэффициента К уравнения Аррениуса согласно [Banno, Sakane, 1981; Griffin et al., 1981] представлены на рисунке 11.

Рис. 11. Расчет коэффициента К уравнения Аррениуса [Banno, Sakane, 1981, Griffin, et al.,1981].

Как видно из рисунка, экспериментальные значения lg К=f (I/Т103), соответствующие использованным нами температурам 4о, 28о и 37оС, легли на одну прямую, что подтверждает возможность применения теста для прогнозирования возможного времени хранения лиофилизированной культуры.

Оценка утилизирующей активности лиофилизированных клеток штамма Arthrobacter sp. KM-4 после хранения при разных температурах (4о, 28о и 37оС) показала, что при использовании всех защитных сред и разных температурных значений способность утилизировать 2,6-ДМП сохранялась на высоком уровне (табл. 4).

Таблица 4. Результаты «теста на ускоренное хранение» лиофилизированных клеток штамма Arthrobacter sp. KM-4 в различных защитных средах (утилизация 2,6-ДМП)

Защитная среда,

Температура хранения,

0С

до консер-вации

%

Утилизирующая активность* в %

1 сутки

15 суток

30 суток

5% раствор

трегалозы

4

28

37

100

100

100

94-97

88-91

85-88

94-98

85-89

82-86

94-96

83-85

74-78

Лошадиная сыворотка с 5% мезо-инозита

4

28

37

100

100

100

95-97

93-96

89-92

94-97

92-96

87-90

94-97

90-95

84-89

Таблетка сухого молока

4

28

37

100

100

100

96-97

91-94

83-88

95-97

87-92

80-85

95-97

81-84

76-79

*Примечание: за 100% утилизирующую активность принята утилизация штаммом Arthrobacter sp. KM-4 3,0 г/л 2,6-диметилпиридина за 24 часа

3.3. Криоконсервация. Криоконсервация в настоящее время является наиболее перспективным методом длительного хранения коллекционных штаммов микроорга-низмов [Shannon, et al., 1975, Calcott, 1978, Пучков и др., 1983, Пушкарь и др., 1983].

Для криоконсервации штамма Arthrobacter sp. KM-4 в качестве криопротекторов были выбраны: 10% раствор глицерина; 12% раствор сахарозы; 5% раствор трегалозы и лошадиная сыворотка с 5% раствором мезо-инозита (табл. 5).

Таблица 5. Жизнеспособность штамма Arthrobacter sp. KM-4 при криоконсервации

Криопротектор

Количество жизнеспособных клеток в % при хранении

Y0

1 сутки

1 месяц

6 месяцев

9 месяцев


Y1

%

Y3

%

Y4

%

Y5

%


5% трегалоза

10% глицерин

12% сахароза

Лошадиная сыворотка с 5% мезо-инозита

8,46

8,30

9,60

8,30

7,90

7,90

8,47

7,60

27

40

10

20

7,84

7,84

7,60

7,60

24

35

1,0

20

7,78

7,84

7,47

7,60

20

35

0,75

20

7,84

7,47

7,60

35

0,75

20


Наиболее высокий титр жизнеспособных клеток ~ 40% от исходного, был получен при использовании 10% глицерина: жизнеспособность клеток за 9 месяцев хранения снизилась только на 5%. Эти данные согласуются с имеющиеся в литературе (Аркадьева, 1983) сведениями о том, что глицерин является одним из универсальных криопротекторов. Наиболее низкое значение жизнеспособности ~10% от исходного, было получено при использовании 12% сахарозы: за время хранения наблюдалось резкое падение титра жизнеспособных клеток до ~ 0,75%. В вариантах криоконсервации Arthrobacter sp. KM-4 в 5% трегалозы, а также лошадиной сыворотке с 5% мезо-инозита титр жизнеспособных клеток сразу после консервации был значительно ниже, чем при использовании глицерина. Однако в лошадиной сыворотке с 5% мезо-инозита за 9 месяцев хранения жизнеспособность не снижалась и составила ~ 20%, как и сразу после криоконсервации. За это же время при использовании 5% трегалозы наблюдалось снижение жизнеспособности с ~ 27 до ~ 20%(табл. 5).

Утилизирующая активность штамма Arthrobacter sp. KM-4 после криоконсервации сохранялась на высоком уровне при использовании лошадиной сыворотки с 5% мезо-инозита и была равна 100%, тогда как на остальных криопротекторах наблюдалось некоторое снижение активности (табл. 6).

Таблица 6. Утилизация 2,6-диметилпиридина штаммом бактерий Arthrobacter sp. KM-4

криопротектор

Активность* клеток штамма в % при хранении

1 сутки

15 суток

30 суток

6 месяцев

9 месяцев

5% трегалоза

10% глицерин

12% сахароза

Лошадиная сыворотка с 5% мезо-инозита

94 – 97

95 – 98

95 – 98

100

85 – 89

87 – 90

73 – 80

100

63 – 67

87 – 90

87 – 89

100

96 – 98

85– 87

100

*Примечание: за 100% утилизирующую активность принята утилизация штаммом  Arthrobacter sp. KM-4 3,0 г/л 2,6-диметилпиридина за 24 часа

Таким образом, исследования по оценке эффективности использованных защитных сред при лиофилизации и криоконсервации как жизнеспособности клеток, так и их утилизирующей активности по отношению к 2,6-ДМП, и подтвержденные «тестом на ускоренное хранение» позволили рекомендовать для длительного хранения штамма Arthrobacter sp. KM-4 использование лошадиной сыворотки с 5% раствором мезо-инозита в качестве защитной среды.

После 20 лет хранения штаммов – деструкторов количество жизнеспособных клеток составило 107 кл/мл, что достаточно для восстановления бактериальной популяции [Ившина, 2005]. Исходная плотность клеток в суспензии для консервации составляла 109 кл/мл. Оценка утилизирующей активности штамма при росте на среде, содержащей 2,6-ДМП как источник азота, показала, что способность утилизировать субстрат, на котором он был выделен, сохранилась на высоком уровне. К деструкции пиридина, 2-МП и 2,6-ДМП, варианты штамма Arthrobacter sp. KM-4 приступали без лаг-фазы. Первоначальная активность бактерий (1,5, 2,0 и 3,0 г/л упомянутых субстратов соответственно за 24 ч), восстановилась за несколько пассажей на минеральной среде с субстратами. В результате многократных пересевов активность вариантов штамма значительно возросла и в настоящее время оценивается утилизацией по 2,5 г/л пиридина и 2-МП за 24 часа. Восстановительный период для штамма Rhodococcus wratislaviensis KM-Р, разрушающего пиридин, длился месяц. При длительных пересевах активность штамма возросла с 1,5 г/л за 36 часов до 2,5 г/л за 24 часа. Для штамма Rhodococcus erythropolis 2.4DMP разрушающего 2,4-ДМП, адаптационный период был длительным (1 год).

4. Масс-спектрометрический анализ клеток бактерий. Масс-спектрометрия была впервые применена для анализа микроорганизмов по типу «отпечатков пальцев» в 70-х годах прошлого века [Anhalt, Fenselau, 1975], используя в качестве одного из маркеров белки. Метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) позволяет получить информацию о молекулярной массе белков, и продуктов их энзиматического расщепления. Наиболее часто используемые матрицы при исследовании белкового профиля бактерий: 2,5-дигидроксибензойная (DHB); -циано-4-гидроксикоричная (HCCA); синапиновая кислоты (SA).

4.1. Сравнительный анализ биодеградирующих штаммов Arthrobacter sp. КМ-P и Rh. wratislaviensis КМ-Р методом МАЛДИ. Исследуемые штаммы – деструкторы пиридина представлены грамположительными клетками, их суспендирование проводили в 50% растворе ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУК) с обработкой клеток ультразвуком для разрушения клеточной стенки. Первый этап работы включал подбор подходящей матрицы. Были опробованы DHВ, HCCA, SA. При использовании DHВ не удалось получить хорошего разрешения анализируемом диапазоне масс. На рис. 12 приведены два спектра МАЛДИ для штамма Arthrobacter sp. КМ-P, полученных на HCCA и SA. Видно, что при использовании SA визуализируется гораздо больше пиков, следовательно, полученный МАЛДИ-спектр является более полным.

Рис. 12. МАЛДИ-профили штамма Arthrobacter sp. KM-Р на двух разных матрицах.

       Аналогичная картина наблюдалась и для Rh. wratislaviensis КМ-Р. Для проведения последующих экспериментов в качестве матрицы использовали SA.

       На рис. 13 приведены масс-спектры сравниваемых штаммов на среде с пиридином. Детальный анализ обнаруживал шесть сигналов с одинаковым значением m/z, различающиеся только интенсивностью.

Рис. 13. МАЛДИ-профили пиридин-деградирующих штаммов: a – Arthrobacter sp. KM-P; b – Rh. wratoslaviensis KM-P.

       На рис. 14 приведена гистограмма, демонстрирующая степень схожести белковых профилей клеток исследуемых бактерий.

Рис. 14. Сравнение относительной интенсивности пиков, общих для штаммов Arthrobacter sp. KM-Р и Rh. wratislaviensis KM-P.

Таким образом, для двух немицелиальных актино-бактерий разных видов при анализе методом МАЛДИ удалось выявить сходство их белковых профилей. Можно предположить, что белки, дающие сигнал в спектре обоих штаммов, относится к ферментной системе, осуществляющей деградацию пиридина.

4.2. Влияние условий культивирования на МАЛДИ-профиль бактерий. Анализ проведен на примере штамма Arthrobacter sp. KM-P. Постулируется, что вне зависимости от условий культивирования клетки конкретного микроорганизма вырабатывают определенный набор белков, пики молекулярных ионов которых должны присутствовать в спектре [Bernardo et al., 2002]. При этом, безусловно, возможны существенные изменения в интенсивности соответствующих пиков.

       Для проведения сравнительного анализа белковых профилей, полученных методом МАЛДИ, клетки Arthrobacter sp. КМ-Р выращивали на трех различных средах: агаризованной минеральной среде с пиридином (АМП), сусло-агаре (СА) и мясо-пептонном агаре (МПА). На рис. 15 приведены полученные для всех трех вариантов спектры.

Рис. 15. Белковые профили (МАЛДИ) штамма Arthrobacter sp. КМ-P на разных средах.

       Как и предполагалось, характерный для Arthrobacter sp. КМ-P пик с максимальной интенсивностью и m/z 7297-7299 сохраняется при всех условиях культивирования. Обратим внимание, что наибольшее число значимых пиков наблюдается в спектре, полученном для клеток, выращенных на АМП. Эта среда является наиболее бедной из всех трех использованных, в ней единственным источником углерода, азота и энергии для роста бактерий является пиридин. По всей видимости, в связи с этим, клетки штамма максимально активизируют ферментные системы, что приводит к синтезу белков, обладающих деструктивной и каталитической активностью. Для более удобного визуального сравнения на рис. 16 приведена гистограмма, отображающая относительные интенсивности основных пиков МАЛДИ-профилей, полученных для каждой из трех сред. Интересно, что пики, кроме основного пика с m/z 2797, были общими в спектрах клеток Arthrobacter sp. КМ-P и Rh. wratislaviensis KM-P, выращенных на АМП. В МАЛДИ-профилях клеток Arthrobacter sp. КМ-P, культивируемых на органических средах (СА и МПА), отсутствуют.

Рис. 16. Гистограмма, демонстрирующая совпадение пиков при анализе Arthrobacter sp. KM-Р, на различных средах.

       Таким образом, вне зависимости от условий культивирования, штамм бактерий может быть успешно идентифицирован с применением МАЛДИ-МС.

5. Исследование путей деградации пиридина е его производных.

Обычно данные о путях метаболизма органического соединения получают при работе с бесклеточными экстрактами, определяя активности соответствующих ферментов. К настоящему времени с использованием такой методологии достаточно хорошо изучен метаболизм бензольного кольца под воздействием бактерий. Деструкция фенолов, например, проходит с образованием пирокатехина, который далее может подвергаться расщеплению в мета- или в орто-положении. Было показано, что ключевыми ферментами биодеградации фенолов являются пирокатехин-1,2- или 2,3-диоксигеназы, которые были выделены и охарактеризованы [Солянникова, 2007]. О реакциях раскрытия пиридинового кольца однозначной информации нет. Это, с одной стороны, обусловлено физико-химическими особенностями азотсодержащего гетероцикла [Джилкрист, 1996], с другой – безуспешностью попыток получить каталитически активные бесклеточные экстракты, трансформирующие пиридин и его производные. Так как ферменты биодеградации пиридинового кольца не были выделены и охарактеризованы, к настоящему времени нет обоснованных данных о путях деградации этих токсикантов.

Исследования путей деградации этих соединений штаммами актинобактерий проводили в динамике роста их культур. Интермедиаты, накапливаемые в КЖ, были обнаружены и извлечены. Выделенные образцы, состояли, как правило, из смеси веществ, и содержались в малых количествах (мкг). Поэтому идентификацию многих из них удалось осуществить в виде триметилсилилированных производных при использовании хроматомасс-спектрометрии (ГХ-МС).

5.1. Анализ и идентификация продуктов деградации пиридина штаммом Аrthrobacter sp. КМ-Р. Из экстракта 1 (щелочного) было выделено вещество, которое присутствовало в КЖ в следовых количествах. Основное количество этого вещества (2-3 мг) было выделено из экстракта 3 (кислого). При анализе методом ВЭЖХ оказалось, что время удерживания (Rf) 2,4-динитрофенилгидразона этого соединения идентично Rf 2,4-ДНФ-гидразона синтетического свидетеля – янтарного полуальдегида (120 сек).

Хроматографирование экстракта 2 (нейтрального) показало присутствие соединения, которое окрашивалось FeCl 2. Оно не соответствовало по значению Rf ни одному гидроксипиридину, что давало основание предположить наличие двух гидроксильных групп в пиридиновом кольце. Хроматомасс-спектральный анализ данного образца доказал наличие в нем нескольких соединений, одно из которых имело м.м. 111 и соответствовало дигидроксипиридину (табл. 7, I).Для разделения этой смеси образец триметилсилилировали и исследовали хроматомасс-спектрометрически. После указанной обработки в образце удалось выявить два соединения: с молекулярными массами 183 и 257.

Масс-спектральный распад первого вещества соответствовал распаду моно-ТМС-производного 2,3-дигидроксипиридина, в котором просилилировался один атом водорода гидроксила (табл. 7, II). Молекулярная масса, а также распад второго соединения указывали на то, что оно является продуктом присоединения воды к молекуле гидроксипиридина в положении С–6 (С–2). Учитывая сравнительно низкую величину времени удерживания (tуд) для этого соединения на хроматограмме (5 мин 39 сек) которая оказалось близко к tуд бис-ТМС-производного (см. далее) 2,6-дигидрокси-пиридина. Наиболее вероятной для этого гидрата гидроксипиридина можно считать структуру 2,6-дигидрокси-1,2-дигидропиридина (табл. 7, III).

Для выявления структуры дигидроксипиридина был проведен дополнительный анализ КЖ, снятой в середине экспоненциальной фазы роста культуры. С помощью тонкослойной препаративной хроматографии на силикагеле из экстракта 2 был выделен образец, который давал характерное окрашивание с FeCl2. После обработки бистриметилилсилилтрифторацетамидоном образец был исследован хроматомасс-спектрометрически. В нем было обнаружено 5 соединений: два изомера с м.м. 255, соответствующие дигидроксипиридинам, в которых два атома водорода замещены ТМС-группами, соединение с м.м. 167, соответствующее гидроксипиридину и два продукта раскрытия пиридинового кольца с м.м. 161 и 248.

Один из изомеров с м.м 255 с большим значением Rf на хроматограмме (6 мин 38 сек) имел хроматографические характеристики такие же, как у синтетического свидетеля ТМС-производного 2,3-дигидроксииридина (6 мин 40 сек).

Время удерживания второго изомера (5 мин 45 сек) резко отличалось от аналогичной характеристики синтетического ТМС-производного 2,5-дигидрокси-пиридина (7 мин 35 сек). Очень короткое время удерживания для выделенного изомера с м.м. 255 свидетельствовало о высокой пространственной затрудненности его атома, что исключает возможность присутствия 2,5-, 3,4- и 2,4-изомеров. Это позволяет предположить для данного соединения единственно возможную структуру бис-ТМС-производного 2,6-дигидроксипиридина (табл. 7, IV).

Масс-спектр гидросипиридина с м.м. 167 был идентичен спектру ТМС-производного синтетического 3-гидроксипиридина.

Анализ соединения с м.м. 161 позволяет предложить для него структурную формулу 3-амино-2 (либо 3)-гидроксипропионового альдегида в виде моно-ТМС-производного(табл. 7, V). Этот альдегид может образовываться из 2,6-дигидрокси-1,2-дигидро-пиридина при его гидролитическом окислении.

Вещество с м.м. 248 (ТМС-производное) представляет собой, по-видимому, 2-гидроксималоновый полуальдегид. Вероятно, он образуется аналогично предыдущему соединению из 2,6-дигидрокси-1,2-дигидропиридина в результате его гидролитического дезаминирования (табл. 7, VI).

Таблица 7. Масс-спектры соединений, интермедиатов распада пиридина

(Arthrobacter sp. KM-P)

Соединения

Структура соединений

m/z

Интенсив-ность в % к максималь-ному пику

Процесс образования фрагмента

Дигидрокси-пиридин

(I)

111

109

83

82

71

55

12

11

74

29

100

46

М

М–2Н

М–СО

М–СНО

М–С2Н2N

М–2СО

2,3-дигидрок-

сипиридин (моно-ТМС-производное)

(II)

183

168

155

150

139

112

73

30

17

4

5

15

4

100

М

М–СН3

М–СО

М–СН3–Н2О

М–СН3–СНО

М–СН3–СНО–НСN

Si(СН3)3

2,6-дигидрок-си-1,2-дигид-ропиридин (бис- ТМС-производное)

(III)

257

215

185

145

129

103

73

30

87

72

100

16

33

72

М

М–СН2–СО

(М–(СН3)2SiСН2) = А

А–C3H4

А–C2H2NО

А–C3H4NCО

Si(СН3)3

2,6-дигидро-ксипиридин (бис-ТМС-производное)

(IV)

255

240

225

156

103

96

73

7

10

38

14

58

15

100

М

М–СН3

М–2СН3

М–СНСОSi(СН3)2

СН2ОSi(СН3)3

М–2СН3–Si(СН3)3–2СО

Si(СН3)3

3-амино-2-ги-дроксипропи-оновый аль-д (ТМС-произ-водное)

(V)

161

146

118

116

103

75

73

2

80

38

20

65

100

50

М

М–СН3

М–СН3–СО

М–СН3– СН2NН2

М–2СН3–СО

(СН3)2 SiОН

Si(СН3)3

2-гидрокси-малоновый полуаль-д. (ТМС-производное)

(VI)

248

233

218

205

189

147

117

103

89

73

5

2

30

85

40

68

50

20

9

100

М

М–СН3

М–2СН3

М–СН3–СО

М–СН3–СО2

(СН3)3SiОSi(СН3)2

СООSi(СН3)3

(СН3)3 SiОСН2

(СН3)3SiО

Si(СН3)3

5-амино-2-ок-со-4-пентено-воя к-та (бис-ТМС-произ-водное)

(VII)

273

258

229

228

214

156

147

117

102

73

16

10

6

6

4

62

52

4

4

100

М

М–СН3

М–СН3–СНО

М–СН3–СН2О

М–СН3–СО2

М–СООSi(СН3)3

(СН3)3 SiОSi(СН3)2

СООSi(СН3)3

СООSi(СН3)2

Si(СН3)3

2,3,6-тригид-рокси-5,6-ди-гидропиридин

(VIII)

129

111

101

95

84

60

56

45

44

86

16

16

28

100

52

82

83

86

М

М–Н2О

М–СО

М–2ОН

М–Н2О–НСN

М–СО–СНСО(С2Н6NО)

С3Н4О(С2О2)

С2 Н5О

С2 Н4O

пигмент азахиноновой природы

(IX)

369

368

339

313

299

297

284

256

255

239

237

236

213

200

199

185

71

55

4

6

2

4

3

3

5

13

5

7

5

7

7

4

5

10

40

100

М

М–Н

М–Н–НСО

M-2CO

М–NС2О2

М–H-HNС2О2

(М–НNСO-NСO )=A

(A–CO) = B

(М–2HNСO–CО)=B

Б–OH

B–H2O

B–H2O–H

(A–HNCO–CO) = Г

Б–2СO

Б–СO–СНO

Г–СО

С2НNO2

С2НNO

бис-ТМС-производное полуамида винной  кислоты

(X)

293

218

205

191

177

147

133

129

117

103

73

3

20

45

5

5

60

8

9

28

31

100

М

М–ОSi(СН3)2

(М–NHSi(СН3)3 )=А

М–СН3NSi(СН3)3

М–(СН3)3SiNHCO

HOCHCOOSi(СН3)3

A–Si(СН3)2СН2

A–(СН3)2SiНOH

COOSi(СН3)3

СН2OSi(СН3)3

Si(СН3)3

5.2. Превращение 2- и 3-гидроксипиридинов штаммом  Arthtrobacter sp. KMР.

Полагая, что 2- и 3-гидроксипиридины являются одними из интермедиатов начального пути деградации пиридина штаммом Arthtrobacter sp. KM–Р, была проверена способность штамма расти на этих субстратах. Культура не росла на гидроксипиридинах (0,5-1,0 г/л), хотя клетки оставались жизнеспособными длительное время. Внесение в среду пиридина (до 0,3 г/л) стимулировало потребление гидрокси-пиридинов и рост биомассы. При хроматографировании экстрактов КЖ, выросшего на 2-гидроксипиридине штамма, кроме исходного соединения были обнаружены два вещества, окрашивающиеся 2,4-ДНФГ, а также пигмент интенсивно голубой окраски.

Хроматомасс-спектральный анализ показал, что оба вещества, дающие реакцию с 2,4-ДНФГ, имели м.м. 129. Масс-спектральный распад одного из них соответствовал структуре 2,3,6-тригидрокси-5,6-дигидроксипиридина (табл. 7, VIII), который является продуктом гидратации 2,3-дигидроксипиридина.

Распад второго вещества с такой же м.м. позволил идентифицировать его как 5-амино-2-оксо-4-пентеновую кислоту (табл. 7, VII), которая является продуктом гидролиза 2,3-дигидроксипирдина. Такая структура полностью подтверждается данными ИК-спектра, в которой наблюдали полосы поглощения в области 1680 см-1 (с=0), 1600 см-1 (с=0) и размытую полосу 3400 см-1 (NH+COOH).

Данные масс-спектра голубого пигмента (м.м 369) говорят о том, что он имеет азахиноновую структуру. В масс-спектральном распаде этого пигмента наблюдались многократные потери молекул СО, NCO, HNCO, H2O, что характерно для таких полиненасыщенных хиноноподобных структур. Крайне малые количества этого вещества не позволили проанализировать его с помощью других физико-химических и спектральных методов исследования. Можно предположить, что обнаруженный нами голубой пигмент является продуктом конденсации трех молекул тригидроксипиридина (табл. 7, IX).

Продукты трансформации 2-гидроксипиридина, обнаруженные хроматомасс-спектрометрически в КЖ после предварительного хроматографического разделения на пластинке с последующим бистриметилсилилированием образцов, включали вещества с м.м. 183, 227, 273 и 293. Первое вещество по Rf 5 мин 5 сек и масс-спектральному распаду отличалось от моно-ТМС-производного 2,3-дигидроксипиридина (Rf = 5 мин 29 сек), который имеет такую же молекулярную массу. Такая малая величина tуд  на хроматограмме может соответствовать только моно-ТМС-производному 2,6-дигидрок-сипиридина, так как Rf для моно-ТМС-производных 2,3-, 3,4- и 2,5-дигидрокси-пиридинов близки между собой, но резко отличаются от Rf 2,6- производного.

Соединение с м.м. 273 соответствовало бис-ТМС-производному 5-амино-2-оксо-4-пентеновой кислоты (табл. 7, VII). Масс-спектральная фрагментация вещества с м.м. 293 позволила предположить для него структуру бис-ТМС-производного полуамида винной кислоты (табл. 7, X). Появление этого соединения в КЖ можно объяснить как результат раскрытия 2,3,6-тригидроксипиридина с последующим дигидроксили-рованием полуамида малеиновой кислоты.

Как и в опыте с 2-гидроксипиридином, добавление пиридина индуцировало потребление 3-гидроксипиридина штаммом Arthtrobacter sp. KM–Р.

Анализ экстракта КЖ с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе 1 показал, что кроме исходного 3-гидроксипиридина он содержит еще несколько полярных веществ с близкими значениями Rf. Смесь этих веществ была выделена с помощью препаративной колоночной хроматографии на силикагеле и обработана бистриметилсилилтрифторацетамидом. При хроматомасс-спектральном анализе этой смеси были обнаружены четыре вещества с м.м. 183, 227, 293 и 219. Первое соединение соответствовало по величине Rf  и масс-спектру моно-ТМС-производному 2,3-гидроксипиридина, а два других с м.м. 227 и 293-бис-ТМС-производным 2-гидроксипиррола и полуамида винной кислоты. Для вещества с м.м. 219, основываясь на данных его масс-спектра, можно предположить структуру бис-ТМС-производного аминоуксусной кислоты (глицина). Появление последнего в КЖ можно объяснить окислительно-восстановительными превращениями 5-амино-2-оксо-4-пентеновой кислоты, хотя присутствие глицина может иметь неспецефический характер.

Суммируя все вышеизложенное, путь катаболизма незамещенного пиридина штаммом Arthtrobacter sp. KM–Р можно представить следующим образом (рис. 17).

Рис.  17. Катаболизм пиридина (I) штаммом Аrthrobacter sp. КМ-Р

II – 3-гидроксипиридин; III – 2-гидроксипиридин; IV – 2,5-дигидроксипиридин; V – 2,3-дигидроксипиридин; VI – 2,3,5-тригидроксипиридин; VII – 5-амино-2-оксо-4-пентено-вая кислота; VIII – янтарный полуальдегид; IX – пигмент азахиноновой структуры.

5.3. Анализ и идентификация продуктов деградации 2-МП штаммом Аrthrobacter sp. КМ-2MP. Анализ хроматограмм кислых дихлорметановых экстрактов, полученных из проб, отобранных через 6, 12, 18, и 22 часа роста Arthrobacter sp. КМ-2MP, отражает динамику изменений в составе продуктов биодеградации 2-МП (рис. 18).

Наблюдается уменьшение количества исходного 2-МП до практически полного его исчезновения (рис 18 а-с, пик 1), параллельно с возрастанием количества бутанона-2 (пик 2), 4-оксопентановой кислоты (пик 9) и других продуктов (пики 3-8 и 10-15). Процесс интерпретации масс-спектров оказался не столь простым. Масс-спектры лишь нескольких продуктов трансформации 2-МП были представлены в компьютерных библиотеках масс-спектров (гидрокси-2-МП, 4-оксопентановая кислота, бутанон-2). Спектры остальных соединений были идентифицированы вручную с использованием известных направлений распада органических соединений в условиях электронной ионизации [Лебедев, 2003] и представлены в таблице 8

Рис. 18. Хроматограммы (ГХ-МС) кислых экстрактов КЖ в динамике роста Arthrobaсter sp. КМ-2MP на 2-МП (а-6, b-12, c-18; d-22 часа)

Одним из самых интен-сивных на хроматограммах был пик вещества с tуд=6,52 мин (рис. 18, пик 7). Его м.м. (109 Да) совпадала с ожидае-мой для гидрокси-2-МП как первичного продукта окисле-ния исходного субстрата, однако такие гидроксироиз-водные характеризуются су-щественно большими време-нами выхода. Библиотека масс-спектров также не предложила приемлемого варианта.

Таблица 8.  Основные интермедиаты деградации 2-метилпиридина

#

Название

R.T. (мин)

m/z

6 часов

12 часов

18 часов

22 часа

1

2-метилпиридин

5,40

93

78,9

63,6

9,69

0,57

2

2-бутанон

5,52

72

7,55

46,5

12,3

3

5-метил-2(3Н)-фуранон

5,65

98

0,38

0,28

0,34

4

бутиролактон

6,10

86

0,06

0,64

0,64

5

2(3Н)-фуранон

6,15

84

0,15

0,43

6

5-метил-2(3Н)-дигидрофуранон

6,45

100

0,09

0,04

0,11

1,44

7

N-ацетилпиррол

6,52

109

18,2

12,1

10,6

0,01

8

N-формил-2-метилпиррол

6,57

109

1,86

6,44

5,32

0,13

9

4-оксопентановая кислота

7,25

116

0,8

2,11

39,0

10

дигидрокси-2-метилпиридин

7,75

125

0,32

0,11

0,45

11

дигидрокси-2-метилпиридин

7,81

125

0,36

2,01

2,04

10,7

12

тригидрокси-2-метилпиридин

7,93

141

0,18

1,9

1,92

1,05

13

3.6-дигидрокси-3.4-дигидро-2-метилпиридин

7,95

127

0,02

3,05

1,15

21,2

14

дигидрокси-2-метилпиридин

8,05

125

1,28

6,27

3,32

15

дигидрокси-2-метилпиридин

8,30

125

0,05

0,3

1,26

16

дигидрокси-2-метилпиридин

8,35

125

0,25

0,17

0,51

Масс-спектр этого вещества (рис. 19), характеризовался интенсивным пиком молекулярного иона с m/z 109. Ион с m/z 67 образуется при элиминировании из М+ нейтральной частицы с массой 42 Да. Наиболее вероятной нейтральной частицей является молекула кетена, выброс которого может происходить, если в молекуле присутствует ацетильный фрагмент. Дальнейший распад иона с m/z=67 соответствовал фрагментации пиррола. Исходя из этого, было предположено, что вещество в пике 7 представляет собой N-ацетилпиррол.

Рис. 19.  Масс-спектры выделенного из КЖ (А) и синтезированного (Б) N-ацетилпиррола

Для подтверждения образования N-ацетилпиррола как одного из интер-медиатов деградации 2-МП, он был синтезирован. Масс-спектры синтези-рованного соединения и обнаруженного в экстрактах КЖ оказались полностью идентичны (рис. 19).

Таким образом, доказано наличие N-ацетилпиррола среди продуктов биодеградации 2-метилпиридина штаммом Arthrobacter sp. КМ-2MP. Предполагаемый путь образования N-ацетилпиррола – раскрытие гидроксилированного пиридинового кольца между С-2 и С-3 атомами с последующей реакцией конденсации по атомам N и C (рис. 20). Такой разрыв связи в химической реакции может быть затруднительным, но энзиматическая реакция весьма вероятна.

Рис. 20. Предполагаемый путь образования N-ацетилпиррола

Пик 8 вещества с tуд=6,57 мин и м.м. 109 Да мог быть одним из изомеров моногидрокси-2-МП (рис. 18, пик 8). В связи с тем, что по масс-спектральному распаду невозможно установить точную структуру изомеров гидрокси-2-метилпиридина, для идентификации этого интермедиата были проанализированы масс-спектры коммерческих препаратов 6-гидрокси-2-МП и 5-гидрокси-2-МП, а также специально синтезированного 3-гидрокси-2-МП. Времена удерживания оказались следующими: 3-гидрокси-2-МП = 10,00 мин; 5-гидрокси-2-МП = 10,40 мин; 6-гидрокси-2-МП = 10,58 мин; т.е. на 3-4 минуты превышали tуд вещества из КЖ. Анализ масс-спектра определяемого вещества в пике 8 дал возможность предположить структуру N-формил-2-метилпиррола. Масс-спектр этого соединения (рис. 21) в компьютерных базах данных и в литературе отсутствовал. В условиях электронной ионизации от N-формил-2-метилпиррола отщепляется молекула CO и образуется М+ 2-метилпиррола (m/z=81). Дальнейший распад связан с последовательным элиминированием атома водорода (m/z 80) и молекулы НСN (m/z 53).

Рис. 21. Масс-спектр ЭИ N-формил-2-ме-тилпиррола

Ещё одним косвенным доказательством в пользу структуры N-формил-2-метилпиррола было его tуд=6,57 мин, близкое к tуд=6,52 мин для N-ацетилпиррола. Можно предположить, что образование N-формил-2-метилпиррола при биодеградации 2-метилпиридина осуществляется по механизму, аналогичному  для образования N-ацетилпиррола, но с энзиматическим раскрытием пиридинового кольца между 5 и 6 атомами углерода и последующей конденсацией по атомам N и C (рис. 22).

Рис. 22. Предполагаемый путь образования N-формил-2-метилпиррола

При дальнейшем анализе кислых экстрактов КЖ (рис. 18, пики 10,11,14-16) был обнаружен ряд изомеров с м.м. 125 Да и следы соединения с м.м. 141 (пик 12). В спектрах соединений с м.м. 125 Да присутствовали пики фрагментных ионов, свидетельствующие о наличии в их составе фенольных гидроксилов. Это позволило предположить, что данные соединения являются изомерами дигидрокси-2-МП. Установление положения гидроксильных групп без наличия стандартных образцов невозможно. Количество двух изомеров с м.м. 125Да в смеси было велико, они обнаруживались во всех кислотных экстрактах (3-22 ч) тогда как количество остальных трех изомеров было мало, они определялись только в 12, 15 и 18 часовых экстрактах. Нельзя исключить, что эти соединения являются гидроксилсодержащими пирролами, которые с потерей молекулы воды превращаются в соответствующие зарегистри-рованные пиррольные структуры (рис. 20 и 22).Анализ масс-спектра соединения 13 (рис. 18) с tуд=7,93 мин (м.м.141 Да), следы которого были обнаружены в 12 и 15 часовых экстрактах КЖ, позволил предположительно идентифицировать его как тригидрокси-2-МП (рис. 23)

.

Рис. 23. Масс-спектр ЭИ три-гидрокси-2-МП

Для подтверждения предполагаемых структур и обнаружения других интермедиатов, содержащих ОН-группы, было проведено их силилирование в дихлорметановых экстрактах КЖ. Триметилсилильные производные изучаемых соединений имели характерные пики в масс-спектрах, что облегчает их идентификацию. Этот подход позволил детектировать соединение, с m/z 181 и tуд=10,12 мин (рис. 24). Масс-спектр этого вещества был найден в базе данных и соответствовал триметилсилильному производному гидрокси-2-МП. Однако масс-спектральный распад не позволяет однозначно отнести обнаруженное соединение к 3-гидрокси-2-метил- или 5-гидрокси-2-метилпиридину.

Рис. 24. Масс-спектр ЭИ

силильного

произвоного

гидрокси-2-ме-тилпирдина

Если в КЖ в качестве интермедиата присутствует изомер 3-гидрокси-2-МП, то вещество с м.м. 127 и tуд=10.60 мин, обнаруживаемое в экстрактах КЖ разного времени культивирования может быть продуктом присоединения воды к 3-гидрокси-2-МП и представлять собой 3,6-дигидрокси-3,4-дигидро-2-метилпиридин (рис.25).

Рис. 25. Масс-спектр ЭИ 3,6-дигидрокси-3,4-дигидро-2-МП.

Хотя нами не был однозначно де-тектирован 5-гидрок-си-2-МП в качестве интермедиата, однако обнаружение как 4-оксопентановой кис-лоты, так и N-формил-2-метилиррола подтверждает образование этого соединения при деградации 2-МП.

Как следует из вышеизложенного, нами были идентифицированы, в основном, соединения промежуточных стадий трансформации первичных гидрокси-2-МП: N-ацетилпиррол; N-формил-2-метилпиррол; 4-оксопентановая кислота; 3,6-дигидрокси-3,4-дигидро-2-МП;изомерные дигидрокси-2-МП и тригидрокси-2-МП. При этом основная масса дигидрокси-2-МП подвергается дальнейшему гидроксилированию с образованием тригидрокси-2-МП, который в свою очередь служит субстратом для образования пигмента азахиноновой структуры.

Предполагаемые пути катаболизма 2-МП штаммом Arthrobacter sp. КМ-2MP. Суммируя полученные данные о структуре образующихся интермедиатов (рис. 26), можно сделать вывод, что штамм осуществляет катаболизм 2-МП в результате реализации несколько необходимых и обязательных реакций.

1. Катаболизм 2-МП штаммом Arthrobacter sp. КМ-2MP начинается с гидроксилирования пиридинового кольца в 3 или 5 положениях, с образованием гидрокси-2-МП.

2. В результате раскрытия кольца 3-гидрокси-2-МП (рис. 26, II) по связи С2-С3, с образованием N-ацетилпиррола (рис. 26, IX). Раскрытие кольца 5-гидрокси-2-МП между С-5 и С-6, аналогично, приводит к образованию N-формил-2-метилпиррола (рис. 26, VIII), которые в дальнейшем подвергаются как окислению, так и восстановлению. Такой путь показан впервые.

3. Гидрокси-2-МП (рис.26, II и III) окисляются в дигидрокси-2-МП (рис.26, IV и V). При раскрытии цикла на этом этапе, образуется 4-оксопентановая кислота (рис.26, X). Тригидрокси-2-МП (рис.26, VI), образующийся при дальнейшем окислении дигидроксипроизводного, в свою очередь быстро конденсируется с образованием пигмента азахиноновой природы (рис. 26, VII).

Рис. 26. Катаболизм 2-метилпиридина (I) штаммом Аrthrobacter sp. КМ-2МР.

II – 3-гидрокси-2-метилпиридин; III – 5-гидрикси-2-метилпиридин; IV – 3,6-дигидрок-си-2-метилпиридин; V – 5,6-дигидрокси-2-метилпиридин; VI – 3,5,6-тригидрокси-2-метилпиридин; VII – пигмент азахиноновой природы; VIII – N-формил-2-метилпиррол; IX – N-ацетилпиррол; X – 4-оксопентановая кислота.

5.4. Анализ и идентификация продуктов деградации 4-МП штаммом Аrthrobacter sp. КМ-4MP.  Хроматографирование (TCХ) щелочного экстракта КЖ показал появление в ней вещества с Rf  = 0,38 (система 2). Соединение было выделено в индивидуальном состоянии. При обработке раствором FeCl2 оно окрашивалось в желтый цвет, что говорило о возможном присутствии ОН-группы в положении 2- или 4-пиридинового кольца [Watson et al., 1974].

При подщелачивании этанольного раствора выделенного вещества, максимум поглощения ( max = 295 нм) не сдвигался в длинноволновую область спектра, что также свойственно для 2- и 4-гидроксипиридина [Klinsberg, 1962].

Характерную для 2-гидроксипиридина полосу поглощения в области 1660 см -1 наблюдали в ИК-спектре [Schofield, 1967]. В масс-спектре анализируемого соединения наблюдался интенсивный пик молекулярного иона, последующая фрагментация которого приводила к образованию фрагментов 109(100)М+, 81(10)(М–СО)+, 80(54)(М–НСО)+, и 53(17)(М–НСО–НСN)+, характерных для гидроксипирдинов.

В спектре – ЯМР образца этого вещества, снятого в СDС13 (стандарт ТМС - внутренний) наблюдался дублет протона в 6-ом положении пиридинового кольца с химическим сдвигом 6,37 м.д. (J5,6 = 6,6Гц), уширенный синглет протона Н-3 с химическим сдвигом 6,37 м.д., дублет дублетов протона Н-5 с химическим сдвигом 6,12 м.д. (J3,5 = 1,7 Гц, J5,6 = 6,6Гц) и синглет трех протонов метильной группы с химическим сдвигом 2,23 м.д. На основании совокупности спектральных данных структура выделенного интермедиата была определена как 2-гидрокси-4-МП (рис.27, II).

Пигментирование КЖ при росте штамма на 4-МП отличалась от такового при росте на 2-МП и 2,6-ДМП. Анализ (ТСХ) КЖ с нейтральной рН выявил наличие голубого и розового (Rf = 0,69; Rf = 0,8 в системе 2) пигментов, которые препаративно были выделены. Количество розового пигмента оказалось недостаточным для его идентификации. По данным масс-спектров химической ионизации (m/z): 259(100)(МН)+, 242(15)(МН–ОН)+, 224(4)(МН–ОН–Н2О)+, 215(5)(МН–ОН–HCN)+, 168(72)(МН–ОН–Н2О)+, голубой пигмент, возможно, имел структуру замещенного диазафлуорена, который мог образоваться из соответствующего диазахинона в результате ферментативной дегидратации (рис. 26, VI).

Химическая литература конца ХХ века содержит сведения об образовании пигментов интенсивно голубой и слабо-голубой окраски при окислении соединений пиридиновой природы, к которым применили групповое название “азахиноны” [Ensign et al., 1963]. Образование голубых пигментов наблюдали в процессе метаболизма никотиновой кислоты микроорганизмами рода Bacillus [Ensign et al., 1965], никотина [Holmes et al., 1975], 2-гидроксипиридина штаммом A. crystallopoietes [Ensign et al., 1963], тремя видами Arhtrobacter [Kolenbrander, 1977]. Для штамма A. crystallopoietes, который утилизирует 2-гидроксипиридин, характерно образование голубого пигмента диазадифенохиноновой природы [Knackmuss, 1962; Gupta, 1975]. Известно, что он образуется при автоокислении 2,3,6-тригидроксипиридина. По видимому, это соединение является одновременно интермедиатом пути деградации пиридинового кольца и предшественником пигмента [Ensign et al., 1965]. На основании этих данных мы предположили, что розовый и голубой пигменты, образуемые выделенным нами штаммом Arthrobacter sp. КМ-4MP, являются продуктами конденсации 2,3-дигидрокси-4-МП и 2,3,6-тригидрокси-4-МП соответственно (рис. 26, VI).

Хроматограммы кислых экстрактов КЖ были обработаны спиртовым раствором бомкрезолового зеленого. Наблюдали проявление желтых пятен на синем фоне, что свидетельствовало о наличие карбоновых кислот специфического строения. Действительно, на хроматограмме было обнаружено соединение, Rf которого (Rf = 0,15, система 3) был идентичен Rf метилмалеиновой (цитраконовой) кислоты (Rf = 0,17). Клетки Arthrobacter sp. KM-4МР потребляли цитраконовую кислоту в качестве единственного источника углерода без лаг-фазы.

Известно, что при раскрытии кольца 2,3,6-тригидроксипиридина образуется полуамид малеиновой кислоты, малеиновая и фумаровая кислоты [Коростелева и др., 1981]. Можно предположить, что раскрытие 2,3,6-тригидрокси-4-МП аналогичным образом приведет к образованию полуамида метилмалеиновой и метилмалеиновой кислот. Присутствие в среде полуамида метилмалеиновой кислоты доказать не удалось. Участие в процессе метилмалеиновой кислоты было зафиксировано как прямыми, так и косвенными методами (рис. 26, V).

Рис. 27. Катаболизм 4-метилпиридина (I) штаммом  Аrthrobacter sp. KM-4МР.

II – 2-гидрокси-4-метилпиридин; III – 3-гидрокси-4-МП,

IV – 4-(N-ацетиламино)-2-оксо-пентен-3-овая кислота;

V – метилмалеиновая кислота; VI – пигмент диазафлуореновой природы.

Следовательно, катаболизм 4-МП штаммом Arthrobacter sp. KM-4МР протекает так, как показано на рисунке.

5.5. Анализ и идентификация продуктов деградации 2,6-ДМП штаммом Аrthrobacter sp. КМ-2.6DMP. При хроматографическом анализе щелочных экстрактов параллельно со снижением количества субстрата (Rf = 0,8, система 1), наблюдали появление вещества 2 (табл. 9, II), хроматографическая подвижность которого на силикагеле (Rf = 0,43) соответствовала хроматографической  подвижности (Rf = 0,42) 3-гидрокси-2,6-ДМП. Для соединения 2 было характерно пурпурное окрашивание раствором FeCl2, что указывало на возможность присутствия ОН-группы в кольце пиридина. При анализе нейтральных экстрактов была получена аналогичная картина, то есть появление вещества 2 с Rf 3-гидрокси-2,6-ДМП. Используя тонкослойную препаративную хроматографию, соединение 2 было выделено в виде белых кристаллов, температура плавления которых (Тпл 200-210С) была идентична Тпл синтетического свидетеля. При подщелачивании метанольного раствора выделенного соединения 2 до рН 8,0 максимум поглощения сдвигался в длинноволновую область спектра (при рН 7,0 – 288 нм, при рН 8,0 – 311 нм) на 23 нм, что характерно для 3-гидроксипиридина. Результаты масс-спектрального анализа выделенного образца и синтетического свидетеля, представленные в таблице 9, подтвердили их идентичность. В спектре, помимо молекулярного иона наблюдались характерные для метилпиридинов (М-Н)+ ионы, а также ионы (М-СО)+  и (М-СНО)+, что доказывало наличие в структуре ароматической гидроксигруппы, присутствие которой подтверждала также полоса поглощения 3510 см-1. Отметим, что в начальной фазе роста соединение 2 присутствовало в следовых количествах, максимально накапливалось к 15 ч и изчезало к 24 ч культивирования. Растущие клетки использовали 3-гидрокси-2,6-ДМП в качестве ростового субстрата (табл. 9, II).

Таблица 9.  Масс-спектры соединений, интермедиатов распада 2,6-диметил-пиридина (Аrthrobacter sp. КМ-4)

Соединения

Масс-спектры

m/z, (I %)

ИК- спектры

см -1

УФ – спектры

max, нм

3-гидрокси-2,6-ДМП

(II)

123(73)М+, 122(12)(М-Н)+,

108(6)(М-СН3)+, 95(20)(М-СО)+, 94(100)(М-СНО)+,

81(7)(МСН3-НСN)+,

80(11)(М-СН3-СО)+

3510

рН 7,0 288

рН 8,0  311

3,4-дигидрокси-

2,6-ДМП

(III)

139(51)+ (M),  111(20)(M-CO)+  ,

110(100)(M-CHO)+,

96(7)(M-CO-CH3)+,

95(5)(M-CHO-CH3)+

3525

3490

рН 7,0  276

рН 9,0  302

2,4-динитро-фенилгидразон

ацетил-ПВК

(IV)

491(2)(МН)+,  474(2)(МН-ОН)+

447(2)(МН-СО2)+,

266(19)(СН2-С(СООН)-N2-Ar*)+ ,

237(9)(СН3-С(СН2)-N2H-Ar)+ ,

223(9)(СН3-СN+-NH-Ar), 183(42)(NH2-Ar)+ , 182(100)(NH-Ar)+,  167(35)(Ar)+

Ar* - 2,4(NC2)2C6H3

При хроматографировании кислых экстрактов было обнаружено присутствие соединения, дающего реакцию с 2,4-динитрофенилгидразином. На основании масс-спектрального распада бисгидразона, его идентифицировали как бис-2,4-динитрофенил-гидразон ацетилпировиноградной кислоты (табл.9, IV). Присутствие в КЖ кетокислоты такого строения указывало на то, что пиридиновое кольцо раскрывалось между 2-м и 3-м атомами углерода, причем раскрытию предположительно подвергалось кольцо, содержащее две ОН-группы. Таким соединением в данном случае мог быть 3,4-дигидрокси-2,6-ДМП.

Однако ни в КЖ штамма, растущего на 2,6-ДМП, ни в суспензии неделящихся клеток в присутствии данного субстрата дигидрокси-производное выявлено не было. Его удалось обнаружить в следовых количествах в КЖ культуры, растущей на 3-гидрокси-2,6-ДМП, и при метаболизме 3-гидрокси-2,6-ДМП клетками, выращенными на 3-гидрокси-2,6-ДМП. В обоих случаях наблюдали уменьшение концентрации внесенного субстрата и появление нового вещества с Rf = 0,4 (система 2) соответствующим Rf 3,4-дигидрокси-2,6-ДМП. Вещество было выделено с помощью тонкослойной препаративной хроматографии и по физико-химическим свойствам (УФ-спектр: при рН 7,0 max = 276 нм; при рН 9,0 max = 302 нм; масс-спектральный анализ), было идентифицировано как 3,4-дигидрокси-2,6-ДМП (таблица 9, III).

Ни  в растущей культуре с 2,6-ДМП, ни в суспензии клеток с 3-гидрокси-2,6-ДМП образование аммиака не наблюдалось. На основании строения выделенных интермедиатов, можно предположить, что азот включается в состав двухуглеродного фрагмента – ацетамида, образующегося при гидролизе ацетил-ПВК (табл. 9, IV). Хотя ацетамид не был обнаружен в КЖ, но культура использовала его в качестве единственного источника углерода и азота.

Итак, первичной ферментативной реакцией при росте выделенного нами штамма на 2,6-ДМП является гидроксилирование его кольца. На основании полученных результатов экспериментальных исследований и литературных данных, предлагаем путь катаболизма 2,6-ДМП штаммом Arthrobacter sp. KM-2.6DMP (рис. 28).

Рис. 28. Катаболизм 2,6-метилпиридина (I) штаммом Arthrobacter sp. KM-2.6DMP

II – 3-гидрокси 2,6-ДМП; III – 1,3-дигидро-4-оксо-2,6-ДМП;

IV – ацетилпировиноградная кислота; V – ацетамид.

5.6. Анализ и идентификация продуктов деградации пиридина штаммом  Rodococcus wratislaviensis КМ-Р. При хроматогравировании щелочного экстракта КЖ штамма, растущего на пиридине, был выделен образец, который по данным хроматомасс-спектрального анализа содержал два вещества. Масс-спектральный распад вещества с м.м. 97, (табл. 10, I) позволяет интерпретировать его как продукт гидратации пиридина. В масс-спектре второго вещества наблюдается пик молекулярного иона с массой 95, что соответствует моногидроксипиридину. (-пиридону) (табл. 10, II). Такая структура полностью подтверждается масс-спектральным распадом моно-ТМС-производного этого соединения: фрагментация вещества 167 была идентична таковой моно-ТМС-производного синтетического свидетеля 2-ГП.

При хроматографировании кислого экстракта был получен образец, неоднородность которого бала выяснена при анализе его ТМС-производных: на хроматограмме были получены два четких пика разной интенсивности. В масс-спектре количество доминирующего вещества наблюдался пик с м.м. 257. Такая м.м. и фрагментация может соответствовать продукту гидратации 2-гидроксипиридина в виде бис-ТМС-производного. По хроматографической характеристике, и по масс-спектральному распаду, наиболее вероятной для этого соединения является структура 2,6-дигидрокси-1,2-дигидропиридина (см. табл. 7, III).

Таблица 10.  Масс-спектры соединений, интермедиатов распада пиридина

(Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р)

Соединение

Структура соединения

m/z

Интенсивность в % к макси-мальному иону

Процесс образования фрагмента

Гидрат

Пиридина

(I)

97

95

80

79

59

52

43

19

13

70

64

100

41

76

М

М-2Н

М-ОН

М-Н2О

М-С3Н2

М-Н2О-НСN

НОСN

2-гидрокси-

пиридин

(II)

95

78

67

52

43

24

84

22

70

100

М

М-ОН

М-СО

М-НОСN

НОСN

4-карбонил-амино-3-бутеновая к-та(бис ТМС-производноe)

(III)

273

258

230

202

156

147

73

2

16

12

4

100

10

32

М

М-CН3

М-СН3-CO

М-СН3-2CO

М-COOSi(СН3)3

(CH3)3 SiОSi(СН3)2

Si(СН3)3

амид -гидроксипро-пионовой к-ы (бис-ТМС-производное )

(IV)

233

218

202

130

116

73

4

100

16

19

2

8

М

М-CН3

М-ОСН3

М-СН2OSi(СН3)3

(СН3)SiNHCO

(СН3)3Si

2,6-дигидрок-сипиридин(моно-ТМС-производное)

(V)

183

168

155

150

139

112

100

95

81

73

25

24

6

2

9

4

3

3

4

100

М

М-CН3

М-СО

М-СН3-Н2О

М-СН3- СНО

М-СН3-СНО-HCN

(CН3)2 SiOCN

M-OSi(CH3)2CH2

M-CHOSi(CH3)3

Si(СН3)3

В другом хроматографическом пике, на основании м.м., равной 233, и данных спектрального распада, соединение идентифицировано как амид -гидрокси-пропионовой кислоты в виде бис-ТМС-производного, которое может образоваться в результате гидроксилирования таутомерной формы этого же соединения по кратной связи с последующим ее разрывом (табл. 10, IV). Кроме того, в экстрактах КЖ Rh. wratislaviensis КМ-Р были обнаружены два вещества, которые изучали в виде ТМС-производных. Одно из соединений, с м.м. 183, по Rt (5 мин 5 сек) и масс-спектральному распаду, соответствовало моно-ТМС-производному 2,6-дигидроксипиридина (табл.10, V). Второе вещество, с м.м. 273, и длительным временем выхода на хроматограмме (11 мин 30 сек), по масс-спектру соответствовало бис-ТМС-производному 4-карбонил-амино-3-бутеновой кислоты (табл. 10, III).Эта кислота может образоваться из 2,6-дигидроксипиридина путем гидролитического расщепления по C-N связи.

При росте Rh. wratislaviensis КМ-Р на синтетической среде с 2-гидроксипиридином потребление субстрата и накопление биомассы происходило только после добавления пиридина (0,3 г/л). Хроматомасс-спектральный анализ ТМС-производных продуктов, выделенных из экстрактов КЖ, позволил идентифицировать вещества с м.м. 183, 273 и 233, которые по своим характеристикам соответствовали соединениям: моно-ТМС-производному 2,6-ДГП (табл.10, VII), бис-ТМС-производным 4-карбониламино-3-бутеновой кислоты и амида -гидроксипропионовой кислоты (табл. 10, III и IV).

Итак, путь катаболизма пиридина штаммом бактерий Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р можно изобразить следующим образом (рис. 29).

Рис. 29. Катаболизм пиридина (I) штаммом бактерий Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р

II 2-гидрат пиридина: III 2-гидроксипиридин; IV 2,6-дигидрокси-1,2-дигидропири-дин; V 2,6-дигидроксипиридин; VI 4-карбониламино-3-бутеновая кислота; VII амид -гидроксипропионовой кислоты; VIII карбаминовая кислота.

5.7. Анализ и идентификация продуктов деградации 2,4-ДМП штаммом Rodococcus erythropolis 2.4DMP. Хроматографирование щелочного и нейтрального экстрактов показало убывание исходного субстрата (Rf=0,7) параллельно с появлением нового вещества с Rf=0,4. В начале роста (6 ч) оно присутствовало в крайне малых количествах, накапливалось в логарифмической фазе (18-20 ч) и убывало в стационарной фазе (30 ч). Препаративной тонкослойной хроматографией это соединение (рис. 31, II) было выделено. С раствором FeCl2, оно давало розовое окрашивание, характерное для 3-гидроксипиридинов. В УФ-спектре выделенного образца в этаноле (рН 7,0) наблюдали поглощение с максимумом 275 нм, который при подщелачивании раствора до рН 9,0 сдвигался до 297 нм. Такой батохромный сдвиг на 22 нм характерен для гидроксипиридинов с ОН-группой в положении 3 пиридинового кольца [Кlinsberg, 1962]. Окончательно строение выделенного вещества было установлено на основании данных спектра ЯМР, снятого в CDCl3 (стандарт ТМС-внутренний). В спектре наблюдались синглет протона Н – 2 с химическим сдвигом 7,63 м.д., синглет протона Н – 5 с химическим сдвигом 7,00 м.д., и два трехпротонных синглета 4–СН3 и 6–СН3 – групп с химическим сдвигом соответственно 2,30 м.д. и 2,50 м.д. В спектре, так же, присутствовал синглет протона ОН-группы в виде уширенного сигнала с химическим сдвигом 6,20 м.д. Структура соединения исследуемого соединения соответствовала данной картине.

Рис. 31. Катаболизм 2,4-ДМП (I) культурой Rhodococcus erythropolis 2.4DMP.

II – 3-гидрокси-4,6-диметилпиридин; III – лутидиновая кислота,

IV – 2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовая кислота;

V – 3-гидрокси-2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовая кислота.

На хроматограммах кислых экстрактов КЖ (система 2) после обработки раствором 2,4-ДНФГ в 2 н HCl в виде ярко-желтых пятен были обнаружены две карбоновые кислоты с Rf=0,37 (IV) и 0.21 (V). Вещества были выделены, очищены с помощью препаративной хроматографии (система 4) на силикагеле и проанализированы в виде их 2,4-динитрофенилгидразидов. По результатам анализа масс-спектров одно из соединений, с большей хроматографической подвижностью, было идентифицировано как 5-(2,4-динитрофенилгидразид)-2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовая кислота (IV). Другому соединению с меньшей хроматографической подвижностью на основании анализа его масс-спектра была приписана структура 3-гидрокси-5-(2,4-динитро-фенилгидразида)-2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовой кислоты (V). Соединения присутствовали исключительно в экстрактах КЖ культур логарифмической фазы роста. Дальнейшее превращение продуктов раскрытия кольца – 2-карбокси-4-формил-иминопентен-2-диовой (IV) и 3-гидрокси-2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовой (V) кислот, можно представить так, как это происходит для близко родственных по строению дикарбоновых кислот--(N-ацетиламинометилен) янтарной и -гидроксиметил--(N-ацетиламинометилен) янтарной кислот – продуктов раскрытия пиридинового кольца. Они образуются при деградации пиридоксамина штаммом Pseudomonas MA-I и пиридоксина штаммом Pseudomonas-IA [Huynh, 1985].

Хроматографический анализ кислых экстрактов КЖ в стационарной фазе роста показал присутствие еще одной карбоновой кислоты с Rf=0,38, которая была выделена и проанализирована в виде ее бутилового эфира и идентифицирована  как дибутиловый эфир 2,4-пиридинкарбоновой (лутидиновой) кислоты (III).

Таким образом, на основании анализа структур выделенных нами интермедиатов можно констатировать, что первичный процесс деградации 2,4-ДМП протекал как за счет гидроксилирования кольца с образованием 3-гидрокси-4,6-ДПМ, так и в результате окисления метильных групп, приводящего к образованию лутидиновой кислоты. Строение двух выделенных трикарбоновых кислот свидетельствовало о раскрытии гидроксилированного пиридинового кольца, (у которого обе метильные группы были окислены до карбонильных групп) между С-5 и С-6 атомами углерода. Однако это не позволило установить, какой процесс являлся первичным – гидроксилирование кольца или окисление метильных групп. Поэтому процесс деградации 2,4-ДМП (I) можно представить следующим образом (рис. 31).

6. Деградация пиридина культурой, суспензионными и иммобилизованными клетками Arthrobacter sp. KM-Р

Анализируя кинетику утилизации пиридина Arthrobacter sp. KM-Р (см. рис. 1), видно, что продолжительность лаг-фазы составляла около 3 часов. Начиная с 6 часов, наблюдалось интенсивное потребление субстрата, которое продолжалось вплоть до 21 часа роста. За это время культурой потреблялось до 90% внесенного субстрата при интенсивном накоплении биомассы. Таким образом, выделенный нами штамм обладает высокой утилизирующей активностью, является одним из наиболее перспективных штаммов-деструкторов и рекомендован для очистки сточных вод от пиридина.

Следует отметить, что несмотря на высокую эффективность биологических способов очистки использование микроорганизмов в очистных сооружениях приводит к накоплению больших объемов избыточной биомассы, которая требует утилизации. Замена суспензии растущих клеток на иммобилизованные частично разрешает эту ситуацию. Хотя использование иммобилизованных клеток микроорганизмов открывает новые возможности биотехнологии, нельзя, тем не мене, обойти молчанием трудности, которые возникают при замене клеток погруженных культур на иммобилизованные.

В качестве носителя для иммобилизации клеток  Arthrobacter sp. KM-Р использовали Сa-альгинатный гель. Выбор обусловлен относительно мягкими условиями иммобилизации; обеспечением иммобилизованных клеток питательными веществами и кислородом, а также возможностью отвода продуктов метаболизма, так как материал носителя не создает значительных диффузных препятствий массообменным процессам.

Рис. 32. Деградация пиридина суспензией клеток (А) и иммобилизованными (Б) клетками Arthrobacter sp. KM-4.

Оценивали скорость утилизации пиридина суспензией планктонных клеток и клеток, иммобилизованных в альгинате кальция (рис. 32, А и Б). В колбы Эрленмейера с 200 мл среды вносили пиридин, в концентрациях по 1,5; 2,5; 3,0 и 3,4 г/л; по 8,3 мл суспензии клеток и по 25 мл гранул с клетками. Инкубацию на качалке (200 об/мин) проводили при 28о-30оС. Пробы отбирали через 3 часа (1,5 г/л пиридина) и 6 часов (остальные концентрации).

Показано, что скорость утилизации пиридина была выше у суспензионных клеток, чем у иммобилизованных или растущих в культуре клеток. Пиридин, в концентрации 1,5 г/л полностью потребляется суспензионными клетками за 6 часов. Иммобилизованные клетки использовали эту концентрацию за 9 часов. Пиридин, в концентрации 2,5 г/л, для растущих клеток является оптимальной, суспензионными клетками потреблялось за 12 часов, а иммобилизованными – за 18 часов.

Пиридин, в концентрации 3,0 г/л, которая вызывала удлинение лаг-фазы в культуре и 3,4 г/л, которая ингибировала рост штамма, суспензионными клетками утилизировался за 18 часов и 24 часа соответственно. Иммобилизованные клетки эти же количества субстрата разрушали медленнее суспензионных клеток (рис. 32, А), но значительно быстрее, чем культура (см. рис. 1).

Таким образом, продемонстрирована эффективность использования суспензионных или иммобилизованных клеток Arthrobacter sp. KM-Р для деградации пиридиновых токсикантов, присутствующих в очищаемой водной среде в высоких концентрациях (3,0-3,4 г/л)

Заключение

Настоящее исследование содержит сумму доказательств высокой биологической активности групп немицелиальных актинобактерий, широко представленных в различных природных субстратах и обнаруживаемых в большом количестве в длительно консервированных глубоко мерзлых почвенных осадках. Штаммы, выделенные из почв и длительно подвергавшихся воздействию пиридинов, идентифицированные как Arthrobacter и Rhodococcus обладали не только широкой субстратной специфичностью в отношении соединений пиридинового ряда, но способностью утилизировать высокие их концентрации со скоростью, существенно превышающей известные для мировых аналогов, что подтверждено сравнительным анализом полученных результатов и литературных данных (табл. 12).

Таблица 12. Микроорганизмы, утилизирующие пиридин и его производные

Штаммы-деструкторы

Потребляемая концентрация пиридинов

Ссылки

Corynebacterium sp. Brevibacterium sp.

1,5-2,0 г/л (2-5 дн)

Shukla, 1973

Nocardia sp. Z1

10 ммоль/л (50 ч)

Houghton, Cain, 1972

Nocardia sp. KM-2

2,0 г/л (72 ч)

Коростелева, 1981

Nocardioides pyridinolyticus OS4

0,1 г/л

Yoon et al., 1997

Micrococcus luteus

0,8 г/л (48 ч)

Sims et al., [1986]

Shewanella putrefaciens

0,5 г/л (140 ч)

Mathur et al., 2008

Azoarcus evansii pF6

0,2 г/л (60ч)

Rhee et al., 1997

Alcaligenes sp.

0,1г/л(44 ч)

Ronen et al., 1991

Bacillus sphaericus

0,5 г/л на (150 ч)

Mathur et al., 2008

Pseudomonas putida MK1

0,5 г/л (168 ч)

Kim et al., 2006

Pseudomonas pseudoalcaligenes

0,3 г/л

Pandey et al.,  2007

Arhtrobacter sp. KM-P

2,5 г/л (24 ч)

Хасаева и др. [2008]

Arhtrobacter sp.KM-2MP

2,5 г/л (24 ч)

Хасаева и др. [2008]

Arhtrobacter sp. KM-4MP

1,5 г/л (24 ч)

Хасаева и др  [2007]

Arhtrobacter sp. 2.6DMP

3,0 г/л (24 ч)

Хасаева и др  [2007]

Rhodococcus wratislaviensis KM-P

2,5г/л (24 ч)

Хасаева и др. [2009]

Rhodococcus erythropolis 2.4DMP

2,0 г/л (36 ч)

Хасаева.и др. [2008]

Rhodococcus opacus UFZ

0,21 г/ч

Brinkmann et al., 1996

Rhodococcus opacus

1,5 г/л (48 ч)

Zefirov et al., 1994

Rhodococcus pyridinivorans PDB9T

3,5г/л

J.-H. Yoon et al., 2000

Rhodococcus sp. KCTC

0,07мг/л (15 ч)

J.W. Do et al., 1999

Paracoccus sp. BW001

2,6 г/л (50 ч)

Yaohui et al., 2008

Gordonia terrea IIPN1

2,3 г/л (72 ч)

Stobdan et al., 2008

В связи с этим полученные штаммы, не имеющие аналогов в мировой практике, рекомендованы для биотехнологий очистки сточных вод и биоремидиации почв.

Другой результат работы связан с выяснением метаболических путей биодеградации пиридинов. Отметим, что широко применяемая методология подобных исследований, основанная на изучении ферментов биодеградации определенных токсикантов, и показавшая блестящие результаты для разложения замещенных фенолов [Solyanikova, Golovleva, 2004; Travkin et al., 2006] казалось непригодной для изучения разложения пиридинов. Объективной практикой было показано невозможность получения активных бесклеточных экстрактов и стабильно функционирующих ферментов биодеградации. Нами был использован подход, основанный на выделении и идентификации интермедиатов пиридинов при их использовании в качестве единственных источников питания и энергии бактерий-деструкторов. Отметим, что утилизация интермедиатов начиналась только при соокислении пиридином, который, по-видимому, является отличным индуктором синтеза ферментов всей системы биодеградации. Другой подход, дополняющий первый принцип, был построен по аналогии между предполагаемыми нами реакциями и уже известными для разрушения других циклических соединений [Watson et al., 1974; Holmes et al., 1975; Huynh, Snell, 1985; Sims et al., 1986]. Совмещение этих подходов позволило идентифицировать интермедиаты деструкции пиридинов и предложить обобщенную схему их разложения. Схема включает следующие и необходимые этапы 1) окисление гетероцикла, а не его первоначальное восстановление, как это предполагалось ранее [Houghton, Cain, 1972; Shukla, 1975]; 2) раскрытие окисленного кольца по орто-, мета-пути и между N – C; 3) дальнейшее окисление и циклизация с образованием пирролов или реакции конденсации.

Еще одним важным результатом является апробация возможности и использования протеомного анализа МАЛДИ для характеристики белковых профилей клеток Arthrobacter и Rhodococcus. Сравнение белковых спектров клеток, выращенных на среде с пиридином или органической среде, позволило сделать следующие выводы: 1) клетки артробактера и родококка, вне зависимости от условий их роста имеют в МАЛДИ-спектре пики, характеризующие их таксономическую принадлежность на уровне рода; 2) белковые спектры клеток одного и того же штамма различались в зависимости от источников питания; 3) белковые спектры клеток артробактера и родококка, выращенного на среде с пиридином, и имели один набор пиков, отсутствующих при росте на органической среде, и, по-видимому, принадлежащих белкам, вовлеченным в систему деградации пиридинов.

В Ы В О Д Ы

1. Выделены и идентифицированы высокоэффективные штаммы бактерий-деструкторов пиридинов, обладающие более высокой деградативной активностью, чем их мировые аналоги, утилизирующие за короткий срок (24-36 ч) высокие концентрации (1,5-3,0 г/л) пиридина и его метил- и диметилпроизводных в качестве единственных источников углерода, азота и энергии. Штаммы рекомендованы для очистки от пиридиновых токсикантов промышленных сточных вод, а также с целью биоремидиации почв (Патент №4222352/31–13, 1993 г).

2. Катаболизм пиридиновых соединений выделенными штаммами идет через окисление гетероцикла. Первой стадией является гидроксилирование с образованием 2- и 3- гидроксипроизводных с превращением их в ди- и трипроизводные с последующим раскрытием цикла. Утилизация субстратов штаммом Аrthrobacter sp. КМ-4, сопровождается синтезом пигментов, интенсивность которого коррелирует с количеством вносимого субстрата.

3. При катаболизме пиридина Аrthrobacter sp. КМ-4 и Rhodococcus wratislaviensis KM-P, впервые выделены и идентифицированы продукты гидратации пиридина, 2-гидроксипиридина и 2,3-дигидроксипиридина, что позволяет сделать вывод о происхождении атома кислорода в гидроксильных группах у С-2 и С-3 из воды. Раскрытие пиридинового кольца на уровне дигидроксипиридинов происходит путем гидролиза по С-N связи с образованием кетокислот специфического строения.

4. Обнаружено, что при катаболизме 2-метилпиридина после раскрытия гидроксилированного кольца, и в орто- и в мета-положении, реализуются несколько путей: а) образование, пятичленных циклов – N-ацетилпиррола и N-формил-2-метилпиррола; б) разрыв кольца на уровне дигидрокси-2-метилпиридина; с образованием 4-оксопентановой кислоты; в) окисление дигидрокси-2-метилпиридина до тригидрокси-2-метилпиридина, который конденсируется с образованием пигмента азахиноновой природы.

5. Установлено, что продуктами конденсации 2,3-дигидрокси-4-метилпиридина и 2,3,6-тригидрокси-4-метилпиридина в процессе метаболизма 4-метилпиридина являются розовый и голубой пигменты, соответственно; структура голубого пигмента установлена. Раскрытие цикла у 4-метил- и 2,6-диметилпиридинов проходит только в мета-положении.

6. Обнаружено, что при катаболизме 2,4-диметилпиридина штаммом Rhodococcus erythropolis 2.4DMP, происходит как гидроксилирование кольца, так к окисление метильных групп 2,4-ДМП.

7. Оптимизированы условия хранения штамма Аrthrobacter sp. КМ-4, при которых после 20 лет хранения бактерий лиофилизированных в лошадиной сыворотке с 5% мезо-инозита количество жизнеспособных клеток и утилизирующая активность штаммов сохраняется на высоком уровне.

8. Проведен сравнительный анализ методом МАЛДИ белкового профиля клеток штаммов Arthrobacter sp. KM-4 и Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р, развивающихся на среде с пиридином. Показаны наличие общих сигналов, отсутствующих при росте штаммов на богатых питательных средах без пиридина.

9. Иммобилизованные в альгнате кальция или суспензионные клетки Arthrobacter sp. KM-4 способны эффективно окислять пиридин, что можно рекомендовать для разработки биотехнологии очистки от пиридиновых токсикантов сточных вод и в целях биоремидиации почв.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ

  1. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Модянова Л.В., Терентьев П.Б. Arthrobacter crystallopoietes KM-4 – штамм-деструктор метил- и диметилпиридинов. //Биотехнология. 2007. № 3. С.58-63.
  2. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Модянова Л.В., Терентьев П.Б. Утилизация штаммом Arthrobacter crystallopoietes KM-4 метил- и диметилпиридинов. //Биотехнология. 2007. № 4. С.61-63.
  3. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Модянова Л.В., Терентьев П.Б. Деструкция 2,6-метилпиридина штаммом Arthrobacter crystallopoietes KM-4. //Биотехнология. 2007. № 4. С.64-68
  4. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Модянова Л.В., Терентьев П.Б. Деструкция 4-метилпиридина штаммом Arthrobacter crystallopoietes KM-4. //Биотехнология. 2007. № 6. С.50-54.
  5. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Модянова Л.В., Терентьев П.Б.Биодеградация 2,4-диметилпиридина штаммом Rhodococcus sp. //Биотехнология. 2008. № 1 С.72-78.
  6. Хасаева Ф.М., Терентьев П.Б. Изучение начальных путей катаболизма пиридина штаммом Arthrobacter sp. KM-4. //Вода: химия и экология. 2008. №4. С.35-40.
  7. Хасаева Ф.М., Терентьев П.Б. Установление путей катаболизма пиридина штаммом Arthrobacter sp. KM-4. //Вода: химия и экология. 2008. №6. С.35-41.
  8. Хасаева Ф.М., Колганова, Т.В., Турова Т.П. Утилизация 2,4-диметилпиридина штаммом Rhodococcus erythropolis 2.4DMP. //Биотехнология. 2008. №3. С.85-89.
  9. Khasaeva F., Vasilyuk N., Terentyev P., Troshina M., Lebedev A. GC/MS Study of microbiological destruction of pyridine and its methyl derivatives. //Environmental Chemisrty Letters. 2010. (in press).
  10. Хасаева Ф.М., Василюк Н.В., Лебедев А.Т., Колганова, Т.В., Турова Т.П. Штамм бактерий Rhodococcus wratislaviensis KM-Р – деструктор незамещенного пиридина. //Вода: химия и экология. 2010. №6. С.29-33.
  11. Хасаева Ф.М. Изучение путей катаболизма незамещенного пиридина штаммом бактерий Rhodococcus wratislaviensis KM-Р. //Вода: химия и экология. 2011. №1.С.30-36.
  12. Хасаева Ф.М., Василюк Н.В., Лебедев А.Т. Изучение путей катаболизма 2-метилпиридина штаммом бактерий Arthrobacter sр. КМ-2МР. Микробиология, 2010. (в печати).

Статьи в других журналах и сборниках

  1. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Модянова Л.В., Терентьев П.Б., Бундель Ю.Г. Очистка окружающей среды от алкилпиридинов. //В кн. «Охрана окружающей среды», 1988. Братислава, ЧССР.
  2. Хасаева Ф.М. Методы хранения штамма Arthrobacter crystallopoietes KM-4. //Сборник научных статей «Проблемы и перспективы повышения продуктивных и племенных качеств сельскохозяйственных животных» г. Нальчик, 2001. С. 21-24.
  3. Хасаева Ф.М., Мирзоев Р.С., Хочуев И.Ю., Валехова  М.А. Исследование токсичности бентонитовых глин, месторождения «Герпегеж» методом биотестирования. //Межвузовский сборник. Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Проблемы и перспективные направления прикладной биологической науки в начале XXI века. Часть 2. Москва - Нальчик, 2003 г. С. 54-58

Патенты

Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Довгилевич Е.В., Таптыкова С.Д., Модянова Л.В., Терентьев П.Б., Бундель Ю.Г. Штамм Arthrobacter crystallopoietes  КМ-4, используемый для очистки сточных вод от 2,6-демитилпиридина, 2-метилпиридина и 4-метилпиридина. Патент на изобретение № 4222352/31-13. 1993 г.

Материалы научных конференций

  1. Khasaeva F.M., Vorobyeva L.I., Modyanova L.V. Degradation of 2,4 – Iutidine by mixed culture of microorganisms. //Pros. 8 International biotechnology, Simposium, 17-22 july, 1988. Paris, Franse.
  2. Khasaeva F.M., Vorobyeva L.I., Modyanova L.V., Taptykova S.D. Unique properties of new isolates of Arthrobacter. //3 Symposium of Europ. Grup of Actinomicetologists, 2-4 september, 1988, V.I, p. C.6. Budapest, Hyngary.
  3. Khasaeva F.M., Sidyakina T.M., Modyanova L.V., Taptykova S.D. Juroival and biochemical activity of bacteria Arthrobacter crystallopoietes VKM Ac-1098 after freeze-drying and cryopreservation. //Abst. IV International Congress on Culture Collection, 28 October -5 November, 1988. Washington, USA.
  4. Хасаева Ф.М., Базарова И.М.Агапова С.Р. Разработка биотехнологических методов детоксикации промышленных сточных вод. //Конференция молодых ученых «Человек в биосфере», 1988 г, C. 86. Москва.
  5. Khasaeva F.M., Basarova I.V., Vorobyeva L.I., Terentyev P.B., Modyanova L.V. Degradation of 4-methylpyrdine by coryneform bacteria. Tifth international symposium on microbiology 27 august-1 septenber, 1989, Kyoto, Japan.
  6. Хасаева Ф.М., Модянова Л.В., Базарова И.М., Терентьев П.Б. Микробиологический метод очистки промышленных сточных вод от пиридинов. //Труды VIII научно-технической конференции молодых ученых, 1989 г, Нальчик.
  7. Хасаева Ф.М., Модянова Л.В.,Терентьев П.Б. Микробиологический метод детоксикации промышленных сточных вод от пиридиновых оснований. //Международный симпозиум по гидробиологии, 1990 г, Нальчик.
  8. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Артеменко К.А., Терентьев П.Б., Лебедев А.Т. Характеристика микроорганизмов методом MALDI – TOF. //3-ий съезд ВМСО и всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» 03-07 сентября 2007 г. Москва.
  9. Хасаева Ф.М., Воробьева Л.И., Евтушенко Л.И. Выживаемость и деградирующая активность штаммов-деструкторов пиридиновых производных после 15-20 лет хранения. //Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера» Москва, 19-20 ноября 2007 г.
  10. Хасаева Ф.М., Терентьев П.Б., Лебедев А.Т., Трошина М.А. Аэробная детоксикация ксенобиотиков штаммом Arthrobacter sp. и Rhodococcus opacus. //Международная научно-практическая конференция БИОТЕХНОЛОГИЯ. Вода и пищевые продукты. Москва, 11-13 марта 2008 г.
  11. Хасаева Ф.М., Трошина М.А., Терентьев П.Б., Лебедев А.Т. Штамм ARTHROBACTER SP. KM-4 – деструктор пиридина и алкилпиридинов. //Ломоносовские чтения. Москва, Апрель, 2008 г.
  12. Воробьева Л.И., Воробьева Н.В., Хаджаев Е.Ю., Хасаева Ф.М. Пропионовокислые бактерии как пробиотики. //Международная конференция «Пробиотики, птебиотики и синбиотики». С-Питербург, май 2007г. С.59.
  13. Khasaeva F., Terentyev P., Troshina M., Lebedev A. GC-MS Study of microbiological destruction of pyridine with its alkyl derivatives and MALDI characterization of the strain destructor. //56th ASMS Conference on Mass Spectrometry, jule 1-5, 2008. Denver, USA.
  14. Lebedev A., Khasaeva F., Vasilyuk N. Rhodococcus and Arhrobacter strains – new bacterial destructor of pyridine and alkylpyridines. //FEMS-2009, 28 june-03 jule 2009, Gotenburg, Sweden.
  15. Lebedev A., Khasaeva F. Pyridine and alkylpyridines: biodegradation by microordanisms. //Conference on Mass Spectrometry, 30 august-03 september 2009. Bremen, Germany.
  16. Василюк Н.В., Присяжная Н.В., Хасаева Ф.М. Видовое разнообразие актиномицетов рода Kribbella. //Всероссийская конференция «Экотоксикология», 26-30 октября 2009г. г. Пущино. Московская обл.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.