WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Калаев Владислав Николаевич

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ЛИСТВЕННЫХ ДРЕВЕСНЫХ

РАСТЕНИЙ НА СТРЕССОВЫЕ УСЛОВИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ

ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ОЦЕНКИ  ГЕНОТОКСИЧНОСТИ

ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Специальности 03.00.16 – экология

  03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Воронеж – 2009

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный консультант:                 заслуженный деятель науки РФ, 

доктор биологических наук, профессор

                                               Артюхов Валерий Григорьевич

Официальные оппоненты:        член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор                        Захаров Владимир Михайлович

доктор биологических наук, профессор 

Косиченко Николай Ефимович

доктор биологических наук, профессор

Ильинских Николай Николаевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

.

Защита диссертации состоится «_______» _______________2009 г. в ______часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.05 при Воронежском государственном университете по адресу: г. Воронеж, Университетская пл., 1, биолого-почвенный факультет, аудитория _________

       C диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

       Автореферат разослан «___» ____________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета                                                Г.И. Барабаш

Актуальность темы. Исследование цитогенетических характеристик древесных растений и закономерностей их изменений под действием различных экзогенных и эндогенных факторов представляет собой важную проблему, стоящую перед специалистами в области генетики, цитологии, экологии и смежных наук. Это обусловлено, с одной стороны, масштабным воздействием различного рода поллютантов на экосистемы, с другой - широким использованием древесных растений для озеленения городов, создания промышленно-парковых зон (леса являются своеобразными фильтрами, задерживающими пыль и вредные соединения; после аварии на Чернобыльской АЭС они стали ловушкой для радионуклидов), для рекультивации земель. В связи с этим возникает задача создания насаждений, устойчивых к стрессовым влияниям, обусловленным действием загрязнителей различной природы. Ее решение заключается в выявлении молекулярно-клеточных механизмов обеспечения резистентности растений к неблагоприятным факторам и отборе соответствующих генотипов.

Достаточно широк перечень исследований древесных растений по морфологическим, биохимическим и др. признакам (Дружкина, 2007; Матвеев, 2004; Онучин, 1993; Осколков, 1998а, б; Романовский, 1992; Федорова, 1997; Эрна, 1986 и др.), однако, особое внимание следует уделить цитогенетическим признакам, которые позволяют проследить изменения генетической системы, обусловленные загрязнением или другим стрессовым воздействием, на ранних стадиях их возникновения - еще до момента фенотипического проявления, или же выявить генетические особенности изучаемого материнского дерева, например, его мутантную природу.

В настоящее время как в России, так и за рубежом, активно проводятся исследования цитогенетических реакций древесных растений на воздействие различного рода модификаторов, но в большинстве случаев эти работы выполняются на видах хвойных (Изменчивость цитологических показателей …, 2005; Владимирова, 2005; Дорошев, 2004; Калашник, 2008; 2009; Квитко, 2009; Мазурова, 2009; Машкина, 2008; Муратова, 1991; 2004; Седельникова, 2008; Черкашина, 2007; Шафикова, 1999 и многие другие). В них отмечается, что механизмами адаптации к стрессовым условиям (краевой ареал, избыточная увлажненность почвы, аэротехногенное загрязнение) являются увеличение числа хромосом с вторичными перетяжками, появление кольцевых и добавочных В-хромосом, возможна также замена митоза на амитоз. Показано, что в условиях антропогенного загрязнения может происходить изменение ядрышковых характеристик, как правило, увеличение или уменьшение числа ядрышек в клетке, ядерно-ядрышковых отношений, возрастает уровень нарушений митоза, расширяется их спектр, возможно появление микроядер, изменение числа делящихся клеток. Для лиственных древесных растений подобного рода работ выполнено значительно меньше (Вострикова, 2006; 2007; Карпова, 2002; Миронов, 2002; Сенькевич, 2007 и др.). Так, установлено, что в условиях загрязнения возрастает уровень патологий митоза и расширяется их спектр, возможно появление остаточных ядрышек на стадии метафазы – телофазы митоза, которому приписывается адаптивное значение.

Для оценки воздействия стресс-факторов на цитогенетический аппарат древесных растений необходимо выявить в контролируемых лабораторных условиях чувствительность к этим факторам различных цитогенетических показателей. В природных условиях провести подобный эксперимент не представляется возможным, т.к. трудно подобрать территории со строго определенной концентрацией и составом загрязнителей.

Работы по изучению суточной ритмики цитогенетических показателей (патологических митозов, ядрышковых характеристик) у лиственных древесных растений практически не известны. Ранее на ряде видов травянистых было показано, что митотическая активность в пролиферирующих тканях подвержена изменениям в течение 24 часов (Гриф, 1994). Исследований суточной динамики патологических митозов и ядрышковых характеристик вообще не проводилось, хотя эти параметры также подвержены подобного рода изменениям. Хотелось бы особо отметить, что в научных  периодических изданиях описания цитогенетических показателей древесных растений приводятся без указания сроков фиксации материала, соответственно, не учитывается факт колебаний величин изучаемых параметров в течение дня, что не позволяет провести корректного сравнения результатов, полученных разными авторами, между собой и зачастую приводит к ошибочным заключениям о характере наблюдаемых явлений.

Важным прикладным аспектом применения цитогенетических показателей древесных растений является осуществление цитогенетического мониторинга состояния окружающей среды с их использованием, т.к. древесные растения в качестве тест-объектов обладают рядом преимуществ: 1) являются многолетниками, что позволяет проводить лонгитюдные исследования; 2) широко представлены в защитных лесонасаждениях около промышленных предприятий; 3) в 10 – 12 раз более радиочувствительны, чем травянистые (радиочувствительность (LD50) сосны обыкновенной приближается к таковой человека), что позволяет допустить возможность экстраполяции результатов, полученных на древесных растениях, на человека (Радиоактивное загрязнение районов …, 1990). Знание реакций ядерного аппарата древесных растений на антропогенное загрязнение позволит разработать теоретические основы такого мониторинга.

Основная ценность цитогенетического мониторинга загрязнения окружающей среды состоит в получении сведений о том, будет ли среда генотоксична для человека. Выявление корреляционных связей между цитогенетическими показателями семенного потомства лиственных древесных растений, произрастающих около промышленных объектов, и уровнем аберрантных клеток буккального эпителия детей, проживающих в этих же районах, а в дальнейшем, возможно, установление математической зависимости между этими показателями, позволит, вероятно, ответить на этот вопрос. На возможность существования такой зависимости указывает обнаруженная нами ранее связь между частотой врожденных пороков развития у новорожденных и уровнем патологических митозов у семенного потомства сосны обыкновенной на изучаемой территории (Relationship between cytogenetic ..., 2000).

Принимая во внимание изложенное выше, становится очевидной необходимость исследования цитогенетических механизмов формирования устойчивости лиственных древесных растений на клеточном и субклеточном уровнях к антропогенному загрязнению и другим стрессовым воздействиям.

Целью диссертационной работы явилось выявление цитогенетических реакций лиственных древесных растений на примере дуба черешчатого (Quercus robur L.) и березы повислой (Betula pendula Roth) на антропогенное загрязнение и установление путей их адаптации к стрессовому воздействию на клеточном и субклеточном уровнях, а также перспектив использования древесных растений для оценки генотоксичности окружающей среды для человека.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1) провести комплексное изучение основных цитогенетических показателей семенного потомства лиственных древесных растений, их роли в процессах морфогенеза в условиях антропогенного загрязнения и в норме (нестрессовых условиях);

2) выявить пути адаптации лиственных древесных растений к загрязнению окружающей среды, вызванному деятельностью человека, факторами физической и химической природы;

3) разработать шкалу чувствительности критериев цитогенетического мониторинга к стрессовым воздействиям различной интенсивности;

4) исследовать в течение суток динамику цитогенетических показателей проростков семян березы повислой и дуба черешчатого, собранных на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения, и установить закономерности их изменений в норме и в стрессовых условиях;

5) выявить отдаленные цитогенетические эффекты радиоактивного облучения в результате аварии на Чернобыльской АЭС у семенного потомства дуба черешчатого;

6) оценить степень генотоксичности среды для человека по данным цитогенетического мониторинга с использованием видов древесных растений.

Научная новизна выполненной работы.

Впервые установлена разная резистентность цитогенетических показателей растений к стрессовым факторам (на примере Zebrina pendula). Среди изученных параметров можно выделить чувствительные (изменения которых выявляются при самых незначительных отклонениях условий среды от оптимальных), например, ядрышковые характеристики и время прохождения клетками стадий митоза, и устойчивые (эти показатели изменяются только при сублетальных стрессовых воздействиях), например, появление клеток с микроядрами, депрессия митотической активности.

Проведено систематическое исследование цитогенетических характеристик проростков семян Q. robur L. и B. pendula Roth, собранных на экологически «чистой» территории, в зонах антропогенного загрязнения (химического, радиационного, комбинированного), в разных лесорастительных условиях. Установлены пределы изменчивости цитогенетических показателей семенного потомства березы повислой и дуба черешчатого в норме (на экологически «безопасной» территории). Выявлены суточные ритмы изменения цитогенетических показателей проростков семян дуба черешчатого в норме и березы повислой на экологически «чистой» и антропогенно загрязненной территориях. Показан сдвиг (сбой) циркадных ритмов цитогенетических характеристик при стрессовом воздействии, обусловленный адаптацией к неблагоприятным факторам.

Дано формальное описание суточных ритмов цитогенетических показателей березы повислой и дуба черешчатого с использованием полиномиальных функций.

Предложена схема цитогенетических реакций двух видов лиственных древесных растений на стрессовые воздействия различной природы. Установлены пути адаптации Q. robur L. и B. pendula Roth на клеточном и субклеточном уровнях к условиям обитания.

Выявлены отдаленные цитогенетические эффекты у семенного потомства деревьев дуба черешчатого, подвергшихся радиоактивному облучению в результате аварии на Чернобыльской АЭС. Установлено, что мутационный процесс характеризуется волновой кинетикой. Показано модулирующее действие антропогенного загрязнения на проявление указанных эффектов.

Продемонстрирована возможность интегральной оценки загрязнения среды по совокупности цитогенетических показателей лиственных древесных растений с использованием методов кластерного анализа.

Установлены сходные тенденции в изменениях частоты встречаемости клеток с микроядрами в слизистой эпителия ротовой полости детей и морфологических характеристик ядрышек в клетках семенного потомства березы повислой. Методом регрессионного анализа была подобрана формула, описывающая зависимость между показателями ядрышковой активности (площадь поверхности одиночных ядрышек) семенного потомства березы повислой и частотой цитогенетических нарушений у человека (встречаемость клеток с микроядрами в эпителиоцитах ротовой полости детей). Опытная проверка предложенной математической формулы выявила хорошее совпадение прогнозируемых и экспериментальных данных.

Научно-практическое значение результатов исследований.

Научные положения диссертационной работы углубляют теоретические представления, касающиеся установления цитогенетических реакций лиственных древесных растений на стрессовые воздействия разной этиологии и выявления механизмов адаптации к неблагоприятным факторам среды на клеточном и субклеточном уровнях.

Полученные результаты по влиянию антропогенного загрязнения (химического, радиоактивного, комбинированного), лесорастительных условий на цитогенетические показатели проростков семян дуба черешчатого и березы повислой необходимо учитывать при проведении лесовосстановительных работ с использованием семенного материала, собранного на загрязненных территориях.

Представленные данные можно рассматривать как результаты мониторинга загрязнения окружающей среды в населенных пунктах Воронежской и Белгородской областей с использованием цитогенетических показателей древесных растений и микроядерного теста в буккальном эпителии человека. Предложенный метод кластерного анализа совокупности цитогенетических показателей древесных растений и человека позволяет произвести интегральную оценку состояния среды. Его использование дало возможность выявить наиболее загрязненные и чистые территории в местах проведения исследования.

Уравнение, связывающее изменения ядрышковых характеристик березы повислой и уровень клеток с микроядрами в буккальном эпителии человека на загрязненных территориях, позволяет проводить прогноз генотоксичности среды для человека по цитогенетическим показателям семенного потомства древесного растения.

В ходе проведения работы по математическому описанию суточных ритмов цитогенетических характеристик Q. robur L. и B. pendula Roth разработан способ, позволяющий на основе одного экспериментально полученного значения цитогенетического показателя провести расчет его величины в любой момент времени в течение суток. Получено два патента на изобретение способов изучения суточных ритмов цитогенетических показателей древесных растений. На их основе созданы 4 программы для ЭВМ: «Прогнозирование суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства дуба черешчатого», «Прогнозирование суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства березы повислой (Betula pendula Roth)», «Прогнозирование суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.)», «Прогнозирование суточных ритмов ядрышковых показателей семенного потомства сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.)».

На основании проведенных исследований создан интернет-ресурс (www.cytogenetica-trees.vivt.ru), посвященный цитогенетическим исследованиям древесных растений.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета при подготовке выпускных квалификационных работ и кандидатских диссертаций. Они вошли в курсы лекций «Экологическая генетика», «Радиационная генетика», «Анатомия, генетика, радиобиология», «Человек», в программы лабораторных занятий Большого практикума для студентов кафедры генетики, цитологии и биоинженерии.

Материалы диссертационной работы по биотестированию представлены в виде информации для внедрения (Информационный листок № 150-98 «Цитогенетический мониторинг загрязнения территорий», Воронежский ЦНТИ, 1998 г.).

На защиту выносятся следующие положения.

1. Разработанная шкала чувствительности цитогенетических показателей к экзогенным и эндогенным факторам позволит выбирать адекватные силе их воздействия цитогенетические критерии при проведении цитогенетического мониторинга и оценке генотоксичности среды/химических соединений.

2. Цитогенетические показатели дуба черешчатого и березы повислой подвержены суточным колебаниям, ритмы которых могут изменяться в стрессовых условиях.

3. Суточная динамика изменений цитогенетических показателей древесных растений описывается и прогнозируется с помощью полиномиальных функций.

4. На территориях, подвергшихся радиоактивному загрязнению в результате аварии на Чернобыльской АЭС, после нормализации радиационного фона у семенного потомства лиственных древесных растений выявлена волновая кинетика мутационного процесса.

5. Крайние минимальные и максимальные величины исследованных цитогенетических характеристик березы повислой и дуба черешчатого могут служить показателями пределов изменчивости изучаемых параметров в нестрессовых условиях и учитываться при проведении цитогенетического мониторинга состояния окружающей среды с использованием указанных видов.

6. Антропогенное загрязнение (радиоактивное, химическое, комбинированное) и определенные лесорастительные условия вызывают разнонаправленные изменения процессов протекания митоза и ядрышковых характеристик в клетках апикальной меристемы проростков семян лиственных древесных растений, которые являются отражением реакций адаптации на клеточном и субклеточном уровнях к стрессовому воздействию.

7. Использование методов кластерного анализа совокупности цитогенетических показателей семенного потомства лиственных древесных растений позволяет дать интегральную оценку состояния среды.

8. Обоснование прогноза генотоксичности окружающей среды по цитогенетическим показателям древесных растений значимо для оценки генетического гомеостаза организма человека

Личный вклад.

Диссертационная работа является результатом многолетних (1994 – 2009 гг.) комплексных исследований, выполненных лично автором или под его руководством совместно с сотрудниками, магистрами и студентами-дипломниками кафедры генетики, цитологии и биоинженерии Воронежского госуниверситета. Автором разработаны теоретические и методические положения, обоснованы цели и задачи исследования, проведён сбор и анализ экспериментального материала, обобщены результаты исследований. Статьи и научные доклады подготовлены самостоятельно и в соавторстве.

Апробация результатов исследования.

Результаты диссертационной работы были представлены на 11 World Forestry Congress (Antalya, Turkey, 1997); conference of IUFRO Working Party 2.08.05 held Oct. 12-17, 1997, College of Agricultural Sciences, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, U.S.A. «Diversity and Adaptation in Oak Species»; Symposium of IUFRO Cytogenetics Working Party. S2.04 – 08 «Cytogenetic Studies of Forest Trees and Shrubs – Review, Present Status, and Outlook on the Future» (Graz, 1998); Международном совещании «Методы оценки состояния и устойчивости лесных экосистем» (Красноярск, 1999); Международном симпозиуме «Радикальное повышение экологических функций леса в 21 веке» (Воронеж, 1999); Международной научно-практической конференции «Интеграция фундаментальной науки и высшего лесотехнического образования по проблемам ускоренного воспроизводства, использования и модификации древесины» (Воронеж, 2000); International conference «Modern problems of radiobiology, radioecology and evolution dedicated to centenary of N.W. Timofeeff-Ressovsky» (Dubna, Russian, 2000); 2 съезде ВОГиС (Санкт-Петербург, 2000); Международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды (Биорад-2001)» (Сыктывкар, 2001); Международной научно-практической конференции «Интеграция науки и высшего лесотехнического образования по управлению качеством леса и лесной продукции» (Воронеж, 2001); 7 международной научно-практической экологической конференции «Приспособления организмов к действию экстремальных факторов» (Белгород, 2002); Международной научной конференции, посвященной 25-летию кафедры ботаники Сыктывкарского университета, «Экологическая ботаника: наука, образование, прикладные аспекты» (Сыктывкар, 2002); International Conference DYGEN «Dynamics and conservation of genetic diversity in forest ecosystems» (Strasbourg, 2002, France); 4 и 5 мiжнародноi науковоi конференцii (м. Донецьк,  2003; 2007 р.р.); 8 международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004); 3 съезде ВОГиС «Генетика в 21 веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004); Second international conference Dedicated to the 105th anniversary of the birth of N.W. Timofeeff-Ressovsky and the 70th anniversary of the paper “On the nature of gene mutations and gene structure” by N.W. Timofeeff-Ressovsky, K.G. Zimmer, and M. Delbruck «Modern problems of genetics, radiobiology and evolution» (Yerevan, Armenia, 2005); 5 международном Совещании и школе молодых ученых по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений «Кариология, кариосистематика и молекулярная филогения растений» (Санкт-Петербург, 2005); 2 международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ботаники и методики преподавания биологии» (Белгород, 2007); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 – 2012 годы» (Москва, 2007); 8 и 9 международных научно-методических конференциях «Информатика: проблемы, методология, технологии» (Воронеж, 2008; 2009); 15 международной научной конференции «Математика, компьютер, образование» (Дубна, 2008); 10 международной научно-практической экологической конференции «Живые объекты в условиях антропогенного пресса» (г. Белгород, 2008); Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале 21 века» (Петрозаводск, 2008); Международной научной конференции «Генетика и биотехнология 21 века. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, 2008); Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения К.В. Горбунова «Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем» (Астрахань, 2008); 5 съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009); на отчетных научных сессиях биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета (Воронеж, 1999 - 2009 гг.).

Исследования, выполненные при подготовке диссертационной работы, поддержаны грантами Президента РФ для молодых ученых - кандидатов наук и их научных руководителей (грант № МК-2587.2004.4 и № МК-3481.2007.4); НИОКР Министерства природных ресурсов РФ «Биогеосферные исследования состояния и динамики природной среды в условиях интенсивного воздействия антропогенных факторов на территории Центрально-Черноземного региона», (государственный контракт № ВК-02-47/301); государственным контрактом Минобрнауки России от 25 июня 2007 г. № 02.512.11.2130 «Цитогенетические реакции древесных растений (на примере лиственных и хвойных) на стрессовые условия, обусловленные антропогенным загрязнением, и оценка генотоксичности окружающей среды для человека по цитогенетическим показателям древесных растений»; грантом РФФИ  № 09-04-97503-р-центр-а. Исследование «Оценка генотоксичности окружающей среды в районах г. Воронежа и Воронежской области по цитогенетическим реакциям человека и древесных растений», являющаяся частью представленной диссертации, удостоена премии администрации Воронежской области для молодых ученых за лучшую научную работу в 2001 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 90 научных работ, в том числе 16 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских диссертаций по биологическим наукам, 2 патента, 2 свидетельства на регистрацию программ для ЭВМ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из 6 глав, содержит 414 страниц, 93 рисунка, 82 таблицы. В работе процитировано 415 литературных источников.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Рассмотрены вопросы о генетических основах гомеостаза и цитогенетическом гомеостазе (Бочков, 2002; Шмальгаузен, 1968), подробно описаны методы его изучения (анализ митотической активности (Алов, 1972; Гриф, 1994, 1996; Grif, 2002) и ядрышковых характеристик (Архипчук, 1990, 1995; Соболь, 2001, Челидзе, 1988), оценка уровня и спектра патологических митозов (Алов, 1955, 1964; Казанцева, 1981), микроядерный тест (Микроядерный анализ …, 1992; Ильинских, 1988)). Изложены современные представления об адаптации и неспецифическом адаптационном синдроме у растений (Озернюк, 2002; Пахомова, 1995; Фурдуй, 1986). Отмечено, что вопрос о цитогенетических механизмах адаптации лиственных древесных растений к антропогенному загрязнению разработан недостаточно. Дано описание цитогенетического мониторинга, его места в системе биомониторинговых исследований, обсуждаются его преимущества и принципы подбора тест-объектов (Алтухов, 1984; 2003; Захаров, 1993; 1995; 2000; Здоровье среды: методика…, 2000; Кабиров, 1997; Экологический мониторинг…, 1995). Особое внимание уделено использованию растительных тест-объектов для определения степени генотоксичности окружающей среды (Дмитриева, 1989; Мочалов, 2000; Николаевский, 1998) и возможности экстраполяции данных цитогенетического мониторинга, выполненного на различных тест-объектах (в том числе и растениях), на человека (Дубинин, 1977; Сусков, 1983).

Глава 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ В РАЙОНАХ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ НА ТЕРРИТОРИИ ВОРОНЕЖСКОЙ И БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТЕЙ

Исследования цитогенетических показателей семенного потомства лиственных древесных растений (березы повислой (Betula pendula Roth) и дуба черешчатого (Quercus robur L.)) проводили на территории г. Воронеж, г. Нововоронеж, 1-км зоны Нововоронежской АЭС, поселка Землянск, в районах биологического учебно-научного центра Воронежского госуниверситета «Веневитиново», поселка Старый Курлак, поселка Хреновое Воронежской области и г. Старый Оскол и поселка Уразово Белгородской области в период с 1994 по 2006 гг. Дана общая характеристика экологической ситуации в местах проведения исследований.

Приведено описание исследованных районов г. Воронеж в 1999 – 2003 гг. (Коминтерновского, Левобережного, Ленинского и Советского). Отмечено, что первые три района характеризуются напряженной экологической обстановкой. Советский район (Юго-Западный микрорайон) относится к так называемым «спальным», где отсутствуют промышленные предприятия. Однако в последнее время и здесь отмечается повышенная замусоренность территории бытовыми отходами и чрезмерное скопление автотранспортных средств во дворах (Куролап, 2000; Экология и мониторинг…, 1997).

Для выявления отдаленных эффектов радиационного воздействия в условиях значительного антропогенного загрязнения на цитогенетические характеристики семенного потомства дуба черешчатого была выбрана территория г. Воронеж, прилегающая к Задонскому шоссе, где в 1986 г., по данным кафедры ядерной физики ВГУ, наблюдалось повышение радиационного фона (~ 200 мкР/ч). Основными загрязнителями являются выхлопные газы автотранспорта. γ-фон во время сбора желудей колебался на опытных площадках от 12 до 18 мкР/ч. Материал для цитогенетических исследований собирали осенью 1994 г. с 8 опытных площадей, в 1996, 1998, 2001 гг. - с одной опытной площади и в 2007 г. - с двух опытных площадей.

Приведена характеристика 1-км зоны Нововоронежской АЭС (10 опытных площадей, исследования осуществляли в 1996, 1998 и 2001 гг.), и в г. Нововоронеж, расположенном в 50 км к югу от г. Воронеж, где исследования проводили в 2000 г. Для удобства проведения исследований территория г. Нововоронеж была поделена на три условных района (район № 1 расположен в северо-восточной части города; суммарная техногенная загрязненность этого района наименьшая по сравнению с двумя другими. Район № 2 расположен в северо-западной части города, суммарная техногенная загрязненность характеризуется средними значениями. Район № 3 расположен в юго-западной части города и примыкает к пруду-охладителю Нововоронежской АЭС; техногенная загрязненность данной территории максимальна по сравнению с двумя предыдущими).

Село Землянск Семилукского района Воронежской области расположено в 40 км к востоку от г. Воронеж. Территория села подверглась в 1986 г. воздействию «чернобыльских осадков», в настоящее время радиоактивный фон не превышает нормальных значений. Исследования на территории с. Землянск в 2001 г. проводили в двух условных районах (район № 1, расположенный вблизи автотранспортного предприятия и подвергающийся действию загрязнителей от его работы; район № 2 удален более чем на 1 км от автотранспортного предприятия. Территорию этого района можно считать экологически благополучной).

Определение отдаленных цитогенетических эффектов воздействия радиоактивного облучения на территориях с незначительным уровнем антропогенной нагрузки у семенного потомства дуба черешчатого проводили на территории населенного пункта Старый Курлак Аннинского района Воронежской области, где в 1986 году загрязненность почв цезием-137 достигала 3 Ки/км2 (Экологический информационный бюллетень ... , 1993). Сбор семян осуществляли с трех опытных площадок: Кашара (1996, 1998 г.г.), Кушелево (1996, 1997, 1998 г.г.); Ясная поляна (1998 г.). Во время сбора гамма-фон не превышал 14 – 17 мкР/час, а загрязненность территории цезием-137, по данным кафедры ядерной физики ВГУ, составляла для Кашары в 1995 г. 0,74 Ки/км2, в 1998 г. –  0,15 Ки/км2, для Кушелево в 1995 г. – 0,15 Ки/км2, в 1998 г. – 0,07 Ки/км2, для Ясной поляны в 1998 г. – 0,23 Ки/км2. Указанные территории в настоящее время практически не подвергаются антропогенному прессингу, поэтому обнаруженные цитогенетические эффекты у семенного потомства дуба можно рассматривать как отдаленные последствия действия радиоактивного загрязнения.

В г. Старый Оскол Белгородской области для исследований были выбраны 3 района: Центральный (загрязненный); Юго-западный (среднезагрязненный) и Северо-восточный (чистый) (Махотин, http://conf.intbel. ru). В каждом из районов выбирали по 2 опытных территории, одна из которых находилась вблизи автодороги, а другая - во дворах.

Территория поселка Уразово Валуйского района Белгородской области подверглась в 1986 г. радиоактивному загрязнению в результате аварии на Чернобыльской АЭС. Уровень загрязнения почвы Сs137 составлял, по данным кафедры ядерной физики Воронежского госуниверситета, около 0,9 Ки/км2. Во время исследований уровень гамма-фона не превышал 20 мкР/ч. Исследования цитогенетических показателей семенного потомства березы повислой проводили в 1999-2000 гг. на 6 опытных площадях.

Выявление влияния экологических условий произрастания деревьев березы повислой (Вetula pendula Roth) на цитогенетические характеристики ее семенного потомства проводили в Хреновском бору. Было выделено 3 опытные территории: опытная площадка № 1 (сухой бор, сосняк злаково-лишайниковый) – вершины (гряды) холмов; опытная площадка № 2 (свежий бор, сосняк травяной) – склоны холмов; опытная площадка № 3 (влажный бор, сосняк молиниевый) – нижние части рельефа, понижения между холмами. Дана таксационная характеристика древостоев сосны и березы.

Для изучения цитогенетических показателей древесных растений в нормальных (экологически безопасных) условиях с целью получения контрольных данных были выбраны деревья, произрастающие на территории Усманского леса (район Биологического учебно-научного центра Воронежского госуниверситета «Веневитиново» Новоусманского района Воронежской области). Эту территорию можно считать экологически безопасной, так как содержание контролируемых химических элементов и уровни загрязнения радиоактивными веществами растительного сырья, почвы в указанном районе не превышают соответствующих ПДК (Минеральный состав …, 1992; Семенова, 2009).

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Приведена схема постановки опыта по облучению зебрины радоном (эквивалентные равновесные объемные активности (ЭРОА) составляли 200 и 400 Бк/м3; экспозиция - 14 дней). Контрольные растения находились под колпаком в том же помещении, ЭРОА радона составляла 24 Бк/м3. На окрашенных ацетогематоксилином микропрепаратах подсчитывали общее количество просмотренных клеток (не менее 400), количество делящихся клеток, число клеток с патологиями митоза, количество метафаз, анафаз, телофаз с остаточным ядрышком, число клеток с 1, 2, 3 ...  n ядрышками, количество клеток с микроядрами и с остаточными ядрышками в цитоплазме интерфазных клеток. Определяли митотическую активность, долю клеток на стадиях митоза (%), долю клеток с патологиями митоза от общего числа делящихся клеток (%), ядрышковую активность, под которой понимали изменение числа клеток с n ядрышками в ядре, долю клеток с микроядрами (%), долю клеток с остаточным ядрышком в цитоплазме (%).

Описаны условия сбора и проращивания семян. Корешки проростков желудей дуба длиной 0,5 – 1,5 см, собранных из района «Веневитиново», и семян березы длиной до 0,5 см, собранных в Советском районе г. Воронеж, отбирали в течение суток с интервалом два часа и фиксировали в ацетоалкоголе. Корешки проростков желудей, собранных на территории, прилегающей к Задонскому шоссе, фиксировали в 1994 г. в 16 часов, во все остальные годы исследования - в 22 часа; материал (апикальную меристему Q. robur L.) из района 1-км зоны Нововоронежской АЭС и населенного пункта Старый Курлак - в 22 часа; проростки семян березы, собранных на опытных территориях - в 8 часов. Описана методика изготовления постоянных давленых микропрепаратов корневой меристемы проростков семян (Wittmann, 1962). При анализе препаратов определяли митотическую активность (митотический индекс - МИ), вычисляли долю патологических митозов, долю каждого типа нарушений клеточного деления и долю клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы – телофазы митоза. Для изучения ядрышковых характеристик в клетках корневой меристемы семенного потомства берёзы повислой производили измерение диаметра ядрышек с помощью окулярмикрометра (анализировали по 200 клеток на каждом микропрепарате) и высчитывали площадь поверхности ядрышек; учитывали количество клеток с разным числом ядрышек и вычисляли их долю (%); определяли долю ядрышек различных типов (%) по классификации Челидзе и Зацепиной (1988). Среди клеток с парными ядрышками определяли долю клеток с гомоморфными и гетероморфными ядрышками. Гетероморфными считали парные ядрышки, площадь поверхности которых различалась более чем на 3 мкм2 (Архипчук, 1995).

Обсуждаются преимущества детского контингента в качестве объекта мониторинговых исследований, а также достоинства микроядерного теста в буккальном эпителии. Описана методика изготовления временных давленых препаратов для проведения микроядерного анализа (Цитогенетические нарушения в соматических …, 1998). Исследования проводили в г. Воронеж, г. Нововоронеж, поселке Землянск. Всего в 1999 – 2002 гг. обследовано 339 детей (169 мальчиков и 170 девочек).

Статистическая обработка данных выполнена с использованием пакета статистических программ «Stadia» согласно рекомендациям Кулаичева (2006).

Глава 4. ОЦЕНКА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КРИТЕРИЕВ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

Для оценки воздействия стресс-факторов на цитогенетический аппарат древесных растений необходимо выявить в контролируемых условиях чувствительность к этим факторам различных цитогенетических показателей. В природной среде провести подобный эксперимент не представляется возможным.

Мы предприняли попытку оценить чувствительность к стресс-фактору (радоновому облучению) отдельных цитогенетических характеристик зебрины повислой, являющейся более радиочувствительной по сравнению с другими видами традесканций (Калаев, 1998). Ранее нами была разработана шкала для дозиметрии радона в жилых помещениях с использованием в качестве тест-объекта Zebrina pendula Schnitz. (Пат. 2237914. Способ оценки радонового …, 2004) при ЭРОА 100, 1800, 6100, 27500 Бк/м3 и экспозиции  от 10 дней до 3 месяцев. При облучении Z. pendula объемной активностью 100 Бк/м3 отклонений цитогенетических показателей от контрольных не обнаружено. Было  показано увеличение числа многоядрышковых клеток при облучении низкими активностями радона (1800 Бк/м3), при увеличении активности радона (6100 Бк/м3) появлялось остаточное ядрышко в метафазе – телофазе митоза, возрастало число и расширялся спектр нарушений митоза,  при облучении самыми высокими активностями радона (27500 Бк/м3) в клетках апикальной меристемы корня были выявлены микроядра, отмечено угнетение митотической активности и выход остаточного ядрышка в цитоплазму интерфазной клетки.

ЭРОА радона 200 и 400 Бк/м3, являющиеся предельно допустимыми для жилых и нежилых помещений соответственно, индуцировали изменения времени прохождения клетками стадий митоза, увеличение число многоядрышковых клеток. Рассмотрена роль функционирования системы checkpoint-репарации в возникновении выявленных отклонений от нормы цитогенетических показателей. Таким образом, проявление цитогенетических эффектов зависит от ЭРОА радона и времени экспозиции.

В результате экспериментов по облучению различными ЭРОА радона Z. pendula и анализа данных литературы была построена шкала чувствительности критериев цитогенетического мониторинга к стрессовым воздействиям (рис. 1).

Широкое распространение для оценки степени генетического риска для человека получили методы цитогенетического мониторинга, позволяющие определить суммарную нагрузку, складывающуюся из сложнейших комбинаций мутагенов и модификаторов. На тест-объектах, как правило, анализируется один из критериев цитогенетического мониторинга: митотическая активность, частота и спектр патологий митоза, ядрышковая активность, частота сестринских хроматидных обменов, количество хромосомных аберраций, микроядерный тест. Каждый из критериев имеет свои преимущества и недостатки, различную чувствительность к стрессовым воздействиям. Поэтому применение их по отдельности не всегда позволяет точно оценить эффекты загрязнителей. Применение совокупности тестов значительно усложняет интерпретацию полученных результатов. Для решения проблемы нами предложено использовать несколько критериев на одном тест-объекте.

Депрессия митотической активности; появление клеток с микроядрами; увеличение числа патологий митоза; снижение числа многоядрышковых клеток (угнетение ядрышковой активности); появление остаточного ядрышка в цитоплазме неделящихся клеток

Увеличение числа патологий митоза; увеличение числа многоядрышковых клеток (возрастание ядрышковой активности); появление остаточного ядрышка на стадии метафазы – телофазы митоза

Увеличение числа патологий митоза; расширение спектра нарушений митоза; увеличение числа многоядрышковых клеток (возрастание ядрышковой активности)

Увеличение числа многоядрышковых клеток (возрастание ядрышковой активности); изменение времени прохождения клетками стадий митоза

Критерии цитогенетического мониторинга

Рис. 1. Шкала чувствительности критериев цитогенетического мониторинга к стрессовым факторам среды

Глава 5. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ЛИСТВЕННЫХ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ НА СТРЕССОВЫЕ ФАКТОРЫ

5.1. Суточные ритмы цитогенетических показателей проростков семян лиственных древесных растений, произрастающих в различных экологических условиях

Установлено наличие трех пиков митотической активности в клетках корневой меристемы проростков семян березы повислой в экологически благоприятных условиях: в 6 (6,5±0,6 %), 12 (6,8±1,1 %) и 22 (6,4±0,6 %) ч по зимнему времени. Максимум митотической активности, приходящийся на 12 ч, обеспечивался пулом профазных клеток. В условиях антропогенного загрязнения отмечалось его нивелирование до среднесуточных значений, а также сдвиг пика с 22 на 20 ч. При анализе митотической активности, подсчитанной без учета профазных клеток, выявлено по два максимума как на опытной, так и на контрольной территориях: в 6 (5,8±0,8 %) и 20 (5,1±0,6 %) ч и в 6 (4,2±0,5 %) и 22 (4,3±0,5 %) ч, соответственно. Предполагается ведущая роль пула профазных клеток в поддержании суточного ритма делений. В условиях антропогенного загрязнения изменялась скорость прохождения клетками стадии профазы, отмечалась задержка клеток на стадии анафазы-телофазы, в то время как скорость прохождения клетками стадии метафазы отличалась высокой стабильностью.

Митотическая активность Q. robur в норме характеризовалась наличием двух максимумов в течение суток – в 8 ч (1995 г. – 12,1±0,3 %; 1996 г. – 12,4±0,3 %) и в 22 ч (1995 г. – 14,7±0,7 %; 1996 г. – 12,2±0,6 %). Это свидетельствует о наличии двух синхронизированных пулов пролиферирующих клеток в корневой меристеме. MИ, как правило, только в пики активности статистически достоверно отличался от среднесуточного значения, которое составило в 1995 г. 11,1±0,3 %, в 1996 г. – 11,1±0,1 %. Значения MИ, подсчитанные без учета профаз, не подвержены суточным колебаниям. Т.о., ведущая роль в формировании суточной ритмики митозов, предположительно, принадлежит стадии профазы; существует механизм, блокирующий переход клеток из профазы в метафазу.

Суточная динамика доли клеток на стадии профазы значительно варьировала по годам. Своей высокой пластичностью пул профазных клеток поддерживает стабильность других более важных морфогенетических процессов в клеточной меристеме. Слабая корреляционная связь этого показателя с MI и значительная - с MИ, подсчитанным без учета профаз, указывает на возможное существование блока метафаза-анафаза.

Изменение в течение суток доли метафазных клеток также весьма существенно. Данный показатель отрицательно коррелировал с долей профазных клеток. Несмотря на это, возрастание количества метафазных и профазных клеток в 8 и 22 ч (в пики митотической активности) было синхронным. Изменение времени прохождения метафазы стабилизирует пролиферативный пул клеток при изменении более пластичных показателей (времени прохождения профазы) в дневные часы и таким образом амортизирует колебания пула профазных клеток, так что эффект внешнего воздействия, вызвавшего изменения, постепенно затухает в системе. Одновременная задержка прохождения клетками профазы и метафазы приводит к формированию ритмов митотической активности.

Суточная динамика доли клеток на стадии анафазы-телофазы более вариабельна, чем таковая профазных и метафазных клеток. Выявлена сильная отрицательная корреляция между долями клеток на стадии профазы и анафазы-телофазы и слабая положительная - между количеством клеток на стадии метафазы и анафазы-телофазы. Это объясняется постоянством времени прохождения клетками стадии анафазы-телофазы (или незначительным его изменением). Для поддержания стабильности общего пула пролиферативных клеток и морфогенеза корня происходит поочередная задержка клеток на стадии профазы и метафазы. Водителем ритма анафазно-телофазных клеток при отсутствии задержки клеток на стадии телофаза-интерфаза будет пул профазных клеток.

В условиях антропогенного загрязнения происходил сдвиг пиков встречаемости остаточных ядрышек в корневой меристеме проростков семян березы повислой. Вероятно, появление остаточного ядрышка в митозе является механизмом, поддерживающим высокий уровень митотической активности. Пикам MИ соответствует спад ядрышковой активности (уменьшалась доля клеток с высокоактивными ядрышками типа «кора-сердцевина» и возрастала доля клеток с умеренноактивными ядрышками типа «кора-сердцевина с вакуолью»). Максимум синтетической активности в интерфазных клетках, выражающийся в увеличении площадей поверхности ядрышек различных типов, приходится на час фиксации материала, следующий за пиком митотической активности в утренние часы. Сдвиг ритмов делений коррелировал со сдвигом ядрышковых характеристик. Выявлена сравнительно низкая чувствительность к загрязнителям среды встречаемости клеток с двумя и более ядрышками в ядре по сравнению с показателями доли и площади поверхности ядрышек различных типов.

У дуба черешчатого встречаемость клеток с двумя ядрышками в ядре подвержена значительной индивидуальной и суточной изменчивости. Этот показатель не обнаруживал корреляционных связей с другими цитогенетическими характеристиками.

У отдельных проростков дуба черешчатого в нестрессовых условиях обнаружено остаточное ядрышко на стадии метафазы, анафазы, телофазы митоза. В 1995 г. остаточное ядрышко наблюдалось только в вечерние и ночные часы (22-4 ч), а в 1996 г. - в течение суток с максимумом в вечерние, ночные и утренние часы (22-8 ч). Появление остаточного ядрышка преимущественно в ночные и вечерние часы является компенсаторным механизмом, поддерживающим максимальный уровень митотической активности.

На экологически чистой территории пики встречаемости патологических митозов в клетках апикальной меристемы  березы повислой приходились на 2 (15,5±2,4 %, 6 (13,6±2,4 %), 10 (12,9±3,2 %) и 20 (9,5±1,6 %) ч. Выявлено совпадение пиков митотической активности и встречаемости патологических митозов. На антропогенно загрязненных территориях в корневой меристеме проростков березы повислой происходило увеличение частоты и расширение спектра патологических митозов по сравнению с контролем на фоне высокой изменчивости исследуемого показателя в течение суток; обнаружен сдвиг пиков встречаемости патологических митозов в вечерние часы. Последнее необходимо учитывать при оценке загрязнения окружающей среды по уровню патологических митозов, так как анализ материала, зафиксированного однократно в течение суток (в одно и то же время), может неадекватно отразить общую картину.

В течение суток в апикальной меристеме корня дуба выявлено 4 пика встречаемости патологий митоза. Они приходились в 1995 г. на 8 (1,4±0,5 %), 12 (1,5±0,9 %), 16 (1,3±0,5 %) и 22 (1,5±0,4 %) часа, в 1996 г. – на 8 (1,6±0,3 %), 12 (1,6±0,6 %), 18 (2,0±0,3 %) и 22 (1,2±0,4 %) часа. Совпадение по времени и величине максимумов и минимумов количества нарушений митоза в течение суток в разные годы свидетельствует о значительной канализованности процессов, влияющих на образование патологий, и их связи с биохимическими реакциями, протекающими в апикальной меристеме и обусловливающими морфогенетические процессы. Суточная динамика встречаемости патологий митоза, подсчитанных без учета профаз, повторяет ход кривой динамики патологий митоза, определенных с учетом этой стадии. Спектр нарушений митоза у дуба был представлен отставанием хромосом в метакинезе и анафазе, мостами, агглютинациями, «редкими» патологиями (частичная деспирализация хроматина, асимметричный митоз, однополюсный митоз, трехполюсный митоз).

Т.о. , в результате проведенных исследований выявлено, что на опытных площадях происходило изменение суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства березы повислой по сравнению с таковыми на экологически чистой территории. Предполагается, что это является следствием адаптации меристематической ткани к стрессовым условиям. Варьирование цитогенетических показателей в течение суток необходимо учитывать при оценке цитогенетического гомеостаза древесных растений и при проведении цитогенетического мониторинга окружающей среды с использованием их в качестве тест-объектов, так как заключения, сделанные при анализе материала, зафиксированного в определенное время суток, могут не соответствовать тому, что реально происходит в корневой меристеме.

На основании полученных данных мы выявили пределы изменчивости цитогенетических показателей семенного потомства березы повислой и дуба черешчатого в течение суток (табл. 1, 2, 3) и предлагаем использовать эти значения в качестве нормальной вариабельности признаков, не приводящей к нарушению процессов морфогенеза.

Таблица 1

Спектр патологических митозов в корневой меристеме проростков  желудей дуба черешчатого в норме

Тип патологий

Частота встречаемости патологии, %

Пределы варьирования (95 %-й доверительный интервал)

Отставание хромосом в метакинезе

55,6

От 49,0 до 61,9

Мосты

25,8

От 20,5 до 31,9

Отставание хромосом в анафазе

4,9

От 2,8 до 8,6

Агглютинация

8,4

От 5,0 до 12,4

Редкие патологии

5,3

От 3,1 до 9,1

Таблица 2

Пределы варьирования цитогенетических показателей семенного потомства дуба черешчатого  в нормальных (нестрессовых) условиях

Показатель

Пределы варьирования

Минимум

Максимум

Пролиферативный пул клеток, %

10,8

11,4

Митотический индекс, %

7,6

16,3

Митотический индекс, подсчитанный без учета профаз, %

1,5

5,4

Доля профаз, %

46,5

84,5

Доля метафаз, %

6,7

22,8

Доля анафаз-телофаз, %

6,3

41,3

Патологические митозы, %

1,0

1,4

Патологические митозы, подсчитанные без учета профаз, %

3,2

4,2

Число пиков митотической активности в течение суток

2 (в 8 и 22 часа по зимнему времени)

Максимальная частота встречаемости ядрышек в ядре

4

Таблица 3

Пределы варьирования цитогенетических показателей семенного потомства березы повислой в нормальных (нестрессовых) условиях

Показатель

Пределы варьирования

Минимум

Максимум

Пролиферативный пул клеток, %

4,2

5,0

MI, %

4,6

5,6

MI, подсчитанный без учета профаз, %

2,6

3,2

Доля профаз, %

37,5

46,3

Доля метафаз, %

23,9

31,1

Доля анафаз-телофаз, %

28,7

35,3

Патологические митозы, %

2,4

4,4

Патологические митозы, подсчитанные без учета профаз, %

3,9

7,3

Доля остаточных ядрышек, %

7,8

11,4

Площадь поверхности одиночных ядрышек, мкм2

102,8

113,2

Площадь поверхности ядрышек типа «кора-сердцевина», мкм2

94,7

104,3

Площадь поверхности ядрышек типа «кора-сердцевина с вакуолью», мкм2

116,6

140,2

Доля клеток с ядрышками типа «кора-сердцевина», %

72,8

81,6

Доля клеток с ядрышками типа кора-сердцевина с вакуолью, %

18,3

27,1

Доля клеток с 2-я ядрышками в ядре, %

2,2

3,4

Доля многоядрышковых клеток, %

2,6

4,0

Число пиков митотической активности в течение суток

3 (в 6, 12 и 22 часа по зимнему времени)

Максимальное число ядрышек в ядре

5

Таблица 4

Значения цитогенетических показателей семенного потомства дуба

черешчатого, используемые в качестве контроля при проведении

цитогенетического мониторинга среды

Показатель

Значение, %

95 %-й доверительный интервал

Митотический индекс

13,5±0,6

[12,3 ; 14,7]

Митотический индекс, подсчитанный без учета профаз

3,6±0,2

[3,1 ; 4,1]

Патологии митоза

1,4±0,3

[0,8 ; 2,0]

Патологии митоза, подсчитанные без учета профаз

5,9±1,4

[3,0 ; 8,8]

Доля профаз

72,3±2,1

[67,9 ; 76,7]

Доля метафаз

13,9±1,1

[10,7 ; 16,2]

Доля анафаз-телофаз

13,7±1,4

[10,7 ; 16,7]

Встречаемость остаточного ядрышка на стадии метафазы

13,6±2,8

[7,8 ; 19,4]

Частота встречаемости клеток с двумя ядрышками в ядре

3,1±0,3

[2,4 ; 3,8]

В качестве контроля для цитогенетического мониторинга среды с использованием проростков желудей дуба черешчатого были выбраны результаты, полученные при цитологическом анализе клеток проростков, зафиксированных в 22 часа (табл. 4).

Для целей мониторинга с использованием в качестве тест-объекта березы повислой мы рекомендуем использовать контрольные данные, полученные именно в год исследований опытной территории, т.к. обычно деревья березы повислой плодоносят ежегодно и проблем со сбором семенного материала с экологически чистых территорий не возникает (у дуба плодоношение происходит не каждый год). Это позволит нивелировать возможную погодную компоненту при проведении такого рода исследований.

5.2. Математические модели суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства древесных растений, произрастающих на территориях с различной антропогенной нагрузкой

Математическое моделирование позволяет прогнозировать циркадные ритмы цитогенетических показателей древесных растений. При анализе цитогенетических показателей возможно использовать различные регрессионные модели. Для математического описания суточных ритмов цитогенетических характеристик (митотической активности, патологических митозов, ядрышковых характеристик) дуба черешчатого и березы повислой мы предлагаем следующие формулы:

                                        (1)

и

                               (2),

где N – степень полинома, j=1..M, где M – число точек наблюдения, ai – коэффициенты полинома, полученные в рамках метода наименьших квадратов, yj – значения экспериментально полученных цитогенетических показателей, xj – моменты времени, в которые проводится наблюдение, yn – значение прогнозируемого цитогенетического показателя, xn – момент времени, в который проводится прогноз. Значения коэффициентов определяются отдельно для каждого из цитогенетических показателей на основе метода наименьших квадратов.

Формула (1) универсальна и позволяет анализировать суточные ритмы практически любой сложности, формула (2) дает более точный результат в случаях зависимостей, где увеличение и уменьшение показателя в течение суток происходит не менее 3 раз. Для каждой из цитогенетических характеристик была подобрана полиномиальная модель и определены коэффициенты при независимых переменных.

Использование указанных подходов дает возможность по одному экспериментально полученному значению цитогенетического показателя проводить его расчет в любое заданное время суток. Метод позволяет значительно снизить как временные, так и финансовые затраты и решить проблему невозможности выявления суточного ритма из-за гибели особи при фиксации.

Кроме того, использование математических моделей ликвидирует или снижает влияние групповой компоненты в определении показателя (обычно в течение суток материал от нескольких сотен биообъектов фиксируют с определенным интервалом и рассчитывают среднее значение цитогенетических показателей в данный момент времени).

Используя адекватные уравнения, описывающие суточные колебания исследуемого показателя, возможно корректно сравнивать результаты исследований, выполненных на материале, зафиксированном в разное время суток.

На основании разработанных подходов и моделей были созданы 4 компьютерные программы.

5.3. Цитогенетические характеристики семенного потомства берёзы повислой в экологически безопасных условиях

Средние значения митотического индекса в корневой меристеме проростков берёзы повислой в экологически благоприятных условиях в разные годы изменялись незначительно, что может рассматриваться как свидетельство сохранения генетического гомеостаза популяции. Высокая канализированность процесса клеточного деления подтверждалась также отсутствием достоверных различий между долями клеток на стадиях профазы, метафазы и анафазы-телофазы митоза в течение всех лет исследования.

Невысокие значения частоты встречаемости патологических митозов, по-видимому, отражали уровень спонтанного мутационного процесса, что подтверждалось отсутствием влияния фактора года сбора семян на данный показатель. В спектре патологических митозов преобладали мосты. Появление остаточного ядрышка в митозе в нестрессовых условиях не имело чёткой закономерности и, возможно, связано с компенсаторным синтезом белка для поддержания нормального прохождения митоза в пики митотической активности.

Наибольшим колебаниям в течение всех лет исследования подвергались характеристики ядрышкового аппарата, что, по-видимому, отражает зависимость метаболических процессов, происходящих при прорастании семян, от условий, влияющих на качество семян при их формировании. Преобладали высокофункциональные ядрышки типа «кора-сердцевина», характерные для активной меристематической ткани. Так же отмечено присутствие вакуолизированных ядрышек типа «кора-сердцевина». Появление в ядрышке вакуоли свидетельствует о снижении его функциональной активности (Челидзе, 1988). Наибольшие площади поверхности наблюдались у вакуолизированных ядрышек типа «кора-сердцевина», и они статистически достоверно превышали таковой показатель у ядрышек типа «кора-сердцевина» (P<0,05). Увеличение площади поверхности ядрышек типа «кора-сердцевина с вакуолью», возможно, компенсировало их пониженную функциональную активность и отражало переходы между вакуолизированными и невакуолизированными ядрышками. Достоверных различий во встречаемости гетероморфных парных ядрышек в течение всех лет исследования не обнаружено. Средние суммарные площади поверхности гетероморфных ядрышек изменялись по годам более значительно, чем гомоморфных. В клетках с гетероморфными парными ядрышками размеры «большого» ядрышка превышали размеры «маленького» в 2,7 – 3,3 раза.

Таким образом, выявленная степень изменчивости цитогенетических показателей позволяет рекомендовать использование семян берёзы повислой, собранных в районе Биологического учебно-научного центра Воронежского госуниверситета «Веневитиново», в качестве контрольных для исследований, в частности, по цитогенетическому мониторингу.

5.4. Цитогенетические характеристики семенного потомства берёзы повислой в условиях антропогенного загрязнения

5.4.1. Цитогенетические характеристики семенного потомства берёзы повислой в условиях г. Воронеж

Было установлено, что в клетках корневой меристемы проростков семян берёзы повислой на антропогенно загрязнённых территориях наблюдалась значительная изменчивость средних величин цитогенетических характеристик, в то время как их пределы варьирования (95 %-й доверительный интервал) не отличались от контрольных (табл. 4).

В большинстве случаев достоверные различия MИ как с контрольными показателями, так и с показателями в других опытных районах отсутствовали, что можно связать с высокой резистентностью митотической активности к воздействию поллютантов. В некоторых случаях митотическая активность на опытных территориях достоверно превышала контрольные значения (P<0,05), что было обусловлено задержкой клеток на стадии анафазы-телофазы митоза или стимулирующим действием загрязнителей среды, не приводящим к изменению скорости прохождения клетками стадий митоза. Только в Советском и Коминтерновском районах в 2003 г. значения митотической активности (с учётом и без учёта профаз) были достоверно ниже контрольного (P<0,05), что возможно, обусловлено присутствием загрязнителей-ингибиторов митотической активности или сдвигом пика митозов на другие часы. Кроме того, анализ распределения клеток по стадиям митоза позволил установить, что в 2001 г. в Советском районе г. Воронеж наблюдалась задержка клеток на стадии профазы, а в Коминтерновском районе – на стадии метафазы.

На большинстве опытных территорий в течение всех лет исследования наблюдалось статистически достоверное превышение контрольных значений встречаемости патологических митозов (как с учётом, так и без учёта профазных клеток) (P<0,05), в то время как достоверные различия между опытными районами существовали не всегда, что можно объяснить сравнительно одинаковой их загрязненностью или инертностью этого показателя. Т.о., уровень патологических митозов мог оставаться постоянным в широком интервале уровней загрязнения за счёт изменчивости других показателей (например, ядрышковых характеристик). Обращает на себя внимание факт устойчивого сохранения высоких значений частоты патологических митозов в Советском районе г. Воронеж, который считается экологически благополучным.

Спектр патологических митозов на опытных территориях г. Воронеж был представлен отставанием хромосом в метакинезе и в анафазе, хромосомными мостами в ана- и телофазе, агглютинацией хромосом в метафазе, асимметричными митозами, полыми метафазами, трёхгрупповыми метафазами, многополюсными митозами. В 2001 г. отмечено появление микроядер и фрагментаций ядра во всех опытных районах г. Воронеж. Расширение спектра аномальных клеточных митозов можно объяснить значительным загрязнением атмосферного воздуха поллютантами по сравнению с контрольной территорией.

Чёткой зависимости в изменении частоты встречаемости остаточных ядрышек на стадии метафазы-телофазы митоза на антропогенно загрязнённых территориях не выявлено. Однако на опытных территориях доля проростков, у которых обнаружено остаточное ядрышко в митозе (80,9 %), была выше таковой на экологически чистой территории (66,9 %).

Анализ ядрышковых характеристик позволил установить снижение площадей поверхности ядрышек в 1999 – 2001 гг. и их рост в 2003 г. Однако в ряде районов г. Воронеж в 1999 – 2001 гг. площади поверхности ядрышек были больше контрольных значений, что связано с возможной амплификаций рибосомальных генов, которая направлена на поддержание нормальной концентрации белка в клетках в условиях подавления активности многих генов поллютантами. В 2002 – 2003 гг. в большинстве опытных районов г. Воронеж площади поверхности ядрышек были ниже таковых в контроле, что могло быть вызвано накоплением на указанных территориях загрязняющих веществ, ингибирующих работу ядрышкового аппарата.

В норме для берёзы повислой характерна 1 пара хромосом с вторичными перетяжками (Макарова, 1989). На опытных территориях отмечено присутствие клеток с 3, 4, 5 ядрышками в ядре. Это свидетельствует об активации латентных ядрышкообразующих районов хромосом, что способствует обеспечению клеток необходимым количеством продукции ядрышек в условиях подавления синтетической активности загрязнителями среды.

Чётких закономерностей в изменении частот встречаемости гетеро- и гомоморфных парных ядрышек в клетках корневой меристемы проростков семян берёзы, подвергавшихся действию загрязнителей среды, не обнаружено. В клетках с гетероморфными парными ядрышками размеры «большого» ядрышка превышали размеры «маленького» в 1,8–4,1 раза, т.е. диапазон изменчивости данных показателей на опытных территориях был значительно шире, чем в контроле. Кроме того, установлено, что в условиях загрязнения окружающей среды площади поверхности «маленьких» ядрышек меняются более значительно, чем «больших», и в связи с этим можно предположить, что активация транскрипции рибосомальных генов происходит не за счёт равномерной активации двух ядрышкообразующих районов, а за счёт дополнительного усиления работы менее активного.

Так же, как и на контрольной, на всех опытных территориях в клетках корней проростков семян берёзы повислой преобладали ядрышки типа «кора-сердцевина». В ряде опытных районов выявлялась тенденция к выравниванию частот встречаемости ядрышек типа «кора-сердцевина» без вакуоли и с вакуолью. Увеличение доли ядрышек с низкой функциональной активностью, вероятно, обусловлено присутствием поллютантов, подавляющих функционирование рибосомных генов.

Площади поверхности ядрышек типа «кора-сердцевина» на загрязнённых территориях были в большинстве случаев достоверно ниже контрольных значений (P<0,05). Это свидетельствовало о снижении синтетической активности в меристеме в условиях антропогенного загрязнения, что в свою очередь указывало на присутствие в окружающей среде загрязнителей, ингибирующих синтетическую активность ядрышек. Бльшая изменчивость площади поверхности ядрышек типа кора-сердцевина по сравнению с изменчивостью площади поверхности вакуолизированных ядрышек «кора-сердцевина» позволяет предположить ведущую роль ядрышек первого из указанных типов в изменении синтетической активности на загрязнённых территориях, в то же время второй показатель является более стабильным.

Таким образом, показано, что вследствие антропогенного загрязнения происходили изменения цитогенетического гомеостаза семенного потомства берёзы повислой по сравнению с контролем, при этом степень изменчивости цитогенетических характеристик семенного потомства берёзы повислой отражала уровень антропогенной нагрузки и позволила сделать заключение о сопоставимости уровней загрязнения в исследованных районах города.

5.4.2. Цитогенетические характеристики семенного потомства березы повислой в условиях г. Старый Оскол

Было показано, что митотическая активность во всех опытных точках возрастала по сравнению с контролем (опыт - от 3,1 % до 5,1 %; контроль – 2,7 % (Р<0,01)). Это происходило за счет увеличения времени прохождения клетками стадии профазы, а в отдельных районах - стадии ана- и телофазы, что может быть обусловлено повреждением хромосом, нарушением цитотомии и невозможностью перехода клеток из одной стадии митотического цикла в другую. На большинстве опытных территорий отмечен рост встречаемости патологических митозов (опыт – 1,9 % до 6,0 %; контроль – 0,1 % (Р<0,05)). Это свидетельствовало об увеличении числа нарушений хромосом и митотического аппарата на опытных участках. Спектр патологий митоза был значительно шире, чем на контрольной территории (где 100 % нарушений составляли мосты) и включал отставание хромосом в метафазе и анафазе, мосты, трехполюсные митозы. На двух опытных территориях в чистом и среднезагрязненном районах происходило уменьшение площади поверхности одиночных ядрышек, что свидетельствовало об угнетении метаболических процессов в клетках березы повислой. Исследование других ядрышковых характеристик (числа двухядрышковых клеток, долей разных типов ядрышек, частоты встречаемости остаточных ядрышек на стадии метафазы - телофазы митоза) не выявило достоверных различий с контролем. По-видимому, ядрышковые характеристики – это наиболее чувствительный критерий в условиях незначительного загрязнения. При высоких концентрациях загрязняющих веществ более информативны такие критерии, как митотическая активность и патологии митоза.

5.5. Цитогенетические реакции семенного потомства лиственных древесных растений, произрастающих около крупных ядерных объектов и на территориях, подвергшихся радиоактивному загрязнению в результате аварии на Чернобыльской АЭС

5.5.1. Цитогенетические показатели семенного потомства лиственных древесных растений , произрастающих в 1-км зоне Нововоронежской АЭС

Была предпринята попытка провести оценку влияния крупного объекта атомной энергетики – Нововоронежской АЭС – на цитогенетические показатели дуба черешчатого, березы повислой и установить уровень загрязнения исследуемой территории. В результате проведенных исследований у семенного потомства дуба выявлено увеличение митотической активности, подсчитанной без учета профазных клеток (до 25,1 %), по сравнению с контролем (13,9±1,1 %), что связано с увеличением числа клеток (задержкой) на стадии (до 32,9 %, контроль – 13,7±1,4 %), у березы возросло время прохождения клетками стадии анафазы-телофазы (до 45,6 %, контроль - 30,3±4,6 %). Указанные изменения связаны с нарушением формирования веретена деления, задержкой процессов цитотомии, запуском системы checkpoint-репарации генетического материала. У дуба отмечался рост числа патологий митоза при подсчете нарушений с учетом профазных клеток (до 4,6 %, контроль - 1,4±0,3 %), что обусловлено ростом доли метафаз, анафаз, телофаз – стадий, на которых возможно выявить нарушения методом световой микроскопии. Подсчет аномалий на стадии метафазы, анафазы, телофазы не выявил изменений данного показателя. У березы увеличения числа нарушений митоза не отмечалось, что, возможно, связано с большей резистентностью данного вида к загрязнению. Спектр патологий митоза значительно расширился, появились нехарактерные для контроля агглютинация, многополюсные митозы, асимметричные митозы, трехгрупповые метафазы, рассеивание хромосом. Возросла доля мостов по сравнению с отставанием хромосом в метакинезе и анафазе-телофазе митоза, что свидетельствует об усилении работы систем репарации. У дуба увеличилось число многоядрышковых клеток (до 7,4 %, контроль - 3,1±0,3 %), что обусловлено активацией «спящих» ядрышкообразующих районов и рассматривается как один из механизмов адаптации к стрессовому воздействию. У березы доля многоядрышковых клеток по сравнению с контролем снижалась (до 1,9 %, контроль - 5,4±1,4 %), однако, возрастала площадь поверхности одиночных ядрышек (до 177,4 мкм2, контроль - 124,4±7,5 мкм2) и появлялись высокоактивные компактные ядрышки, что связано с усилением транскрипции ранее работающих ядрышкообразующих районов. Возможно, наблюдаемые феномены связаны с синергическими эффектами выбросов АЭС и поллютантов среды. Показано неоднородное загрязнение 1-км зоны АЭС. Пользуясь шкалой для оценки влияния стрессовых факторов на генетическую систему организма, можно говорить о среднем уровне загрязнения 1-км зоны станции. Предложено использовать древесные растения для оценки загрязнения окружающей среды в районах атомных электростанций.

5.5.2. Цитогенетические характеристики семенного потомства берёзы повислой в условиях г. Нововоронеж

Были исследованы цитогенетические показатели семенного потомства березы повислой в г. Нововоронеж, расположенном вблизи Нововоронежской АЭС. Была выявлена стимуляция митотической активности только в районе № 1, т.к. не отмечалось изменения времени прохождения клетками стадий митоза по сравнению с контролем.

В районах №№ 2 и 3 выявлено возрастание числа нарушений митоза. Различий по частоте патологических митозов между семенным потомством берёзы повислой из районов г. Воронеж и г. Нововоронеж, не обнаружено (среднее значение в г. Воронеж с учётом профаз – 4,7±0,6 %, без учёта профаз – 6,7±0,9 %, в г. Нововоронеж – 5,3±0,8 % и 7,6±1,0 % соответственно). Это свидетельствует о сравнительно одинаковой загрязненности территорий (максимальный вклад вносит автотранспортный комплекс) и, возможно, о высокой инертности данного критерия к воздействию поллютантов. Спектр нарушений митоза на опытных территориях был более широким по сравнению с контрольным.

Доля остаточных ядрышек в клетках семенного потомства берёзы повислой из районов г. Нововоронеж в 2000 г. была достоверно ниже данного показателя в контроле (P<0,01) и в районах г. Воронеж (P<0,001). Отмечалось уменьшение площади поверхности одиночных ядрышек, доли клеток с двумя и более ядрышками в ядре и высокоактивных ядрышек типа «кора-сердцевина».

Анализ цитогенетических характеристик семенного потомства берёзы повислой позволил предположить достаточно высокий уровень антропогенного загрязнения г. Нововоронеж, соизмеримый с таковым в г. Воронеж.

5.5.3. Цитогенетические реакции семенного потомства лиственных древесных растений, произрастающих на территориях, подвергшихся радиоактивному загрязнению в результате аварии на Чернобыльской АЭС

Авария на Чернобыльской АЭС привела к широкомасштабному загрязнению лесных экосистем. После нормализации радиационного фона на территориях, подвергшихся радиационному загрязнению, встал вопрос о выявлении отдаленных последствий облучения и установлении возможных синергических эффектов радиоактивного воздействия и химических поллютантов, поступающих в среду в результате деятельности человека, в формирование цитогенетических эффектов у древесных растений.

У дуба в отдельные годы исследований происходило увеличение митотического индекса до 28 % (контроль – 10 %) за счет возрастания доли профазных клеток до 80 % (контроль – 68 %), что можно рассматривать как патологию митоза, обусловленную блокированием перехода клеток на следующую стадию деления. Из-за повреждения хромосом возможно возрастание митотического индекса без изменения времени прохождения клетками стадий митоза, что рассматривается как стимуляция митотической активности, обусловленная воздействием мутагенов. В течение ряда лет выявлялось снижение митотической активности (до 7,5±0,3 %). Уровень патологий митоза также значительно колебался по годам. Частота нарушений митоза могла не отличаться от контроля (1,4±0,3 %), быть выше и ниже его. Причем с увеличением митотического индекса возрастала доля патологических митозов, что можно рассматривать как механизм компенсации гибели части клеток большим числом делений.

Спектр нарушений митоза на опытных территориях был представлен мостами, отставанием хромосом в метакинезе и анафазе, агглютинациями и не отличался от контрольного, однако, частота мостов была выше, а частота агглютинаций ниже. Это свидетельствовало о том, что у исследуемых проростков преобладали процессы «разрыв-воссоединение» и образование дицентрических хромосом по сравнению с нормой, где преобладали процессы слипания хромосом. Соотношение в спектре нарушений фрагментов и мостов отражает репарационные способности объектов при воздействии радиации (Акопян, 1967; Симаков, 1983). С увеличением времени, прошедшего с момента радиоактивного загрязнения, встречаемость мостов снижалась и приближалась к контрольным значениям. Другим объяснением падения доли мостов является уменьшение пострадиационной составляющей в образовании нарушений. С увеличением расстояния от автомагистрали, являющейся источником химического загрязнения среды, число нарушений митоза снижалось, их спектр сужался.

Изменения встречаемости клеток с двумя ядрышками, появление которых свидетельствует об активации ядрышкообразующих районов, а также клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы, анафазы-телофазы по сравнению с контролем не было выявлено. Однако происходило уменьшение доли высокоактивных ядрышек «кора-сердцевина» и увеличение площади поверхности умеренноактивных вакуолизированных ядрышек и ядрышек типа «кора-сердцевина вакуолизированные».

На опытных территориях отмечалось возрастание гетерогенности семенного потомства дуба черешчатого по показателю MИ. Дисперсия этого показателя достигала 39,2, в контроле - 5,7 (различия достоверны (P<0,001)). Это свидетельствовало о присутствии в исследованной выборке чувствительных и резистентных к влиянию поллютантов форм.

Исследования березы повислой проводили в 2 населенных пунктах, подвергшихся радиоактивному загрязнению (п. Землянск и п. Уразово).

На большинстве опытных территорий был выявлен рост митотической активности за счет увеличения времени прохождения клетками метафазы и анафазы-телофазы митоза, что, возможно, связано с нарушениями веретена деления, процессов цитотомии и работой систем checkpoint-репарации генетического материала. Возрастала доля нарушений митоза, среди которых наиболее часто встречалось отставание хромосом в анафазе и метафазе. Также отмечались мосты, агглютинации и трехгрупповые метафазы. Преобладание в спектре патологий митоза отставаний хромосом в метакинезе и анафазе свидетельствовало о том, что в корневой меристеме проростков семян березы повислой происходили преимущественно процессы повреждения веретена деления, а не разрыва и воссоединения хромосом. Это подтверждалось высокими значениями долей метафаз в клеточном цикле, количество которых значительно превышало число профаз. Преобладание нарушений, связанных с повреждением веретена деления, характерно для территорий, подвергающихся значительному химическому загрязнению.

На опытных площадях в п. Уразово отмечалось уменьшение площади поверхности одиночных ядрышек по сравнению с контролем, а в п. Землянск - рост значений этого показателя, что свидетельствовало, соответственно, о снижении транскрипционной активности рибосомальных генов или же об их активации. Однако в п. Уразово выявлено значительное возрастание доли клеток с высокоактивными ядрышками типа «кора-сердцевина», а в п. Землянск в клетках семенного потомства березы повислой обнаружены в основном клетки с умеренноактивными ядрышками типа «кора-сердцевина вакуолизированные». Это, вероятно, объясняется тем, что у березы повислой возможна компенсация активности рибосомальных генов за счет перехода количественных изменений в качественные. Т. о., происходило или возрастание числа активных ядрышек («кора-сердцевина»), или увеличение размеров малоактивных ядрышек («кора-сердцевина с вакуолью»). На всех опытных территориях отмечались клетки с 3 и 4 ядрышками в ядре, хотя в норме для березы повислой характерно наличие 1-2 ядрышек. На препаратах проростков семян березы повислой в п. Уразово были обнаружены клетки с 2, 3, 4 ядрышками в ядре. Таким образом, происходила активация дополнительных ядрышкообразующих районов. В п. Землянск была выявлена противоположная тенденция: отмечалось снижение в общем пуле доли многоядрышковых клеток. Т.о., высокая транскрипционная активность может поддерживаться как за счет уже активно работающих ядрышкообразующих районов (увеличение площади поверхности ядрышка или замена умеренноактивного типа ядрышек на высокоактивный), так и за счет активации дополнительных ядрышкообразующих районов. У семенного потомства березы повислой на опытных территориях появлялись клетки с остаточными ядрышками на стадиях метафазы, анафазы, телофазы митоза. Это явление можно рассматривать как пуфинг рибосомальных генов в результате стрессового воздействия, вызванного загрязнением окружающей среды радионуклидами и химическими веществами. Их частота колебалась по сравнению с контрольными значениями. Это, скорее всего, обусловлено взаимной компенсацией, обеспечивающей высокий уровень транскрипционной активности и, как следствие, интенсивный метаболизм в стрессовых условиях. С увеличением расстояния от химического источника загрязнения цитогенетические эффекты у семенного потомства березы нивелировались.

В результате проведенных исследований выявлены общие и специфические реакции 2-х обследованных видов лиственных древесных растений. Так, у березы и дуба в отдаленные сроки после радиоактивного облучения возможно возрастание митотического индекса. Наиболее значимо оно у дуба (в 2 – 2,5 раза по сравнению с контролем). Это может быть связано как с задержкой клеток на различных стадиях митотического цикла (у дуба - профазы, у березы - метафазы и анафазы-телофазы), так и с истинной стимуляцией митотической активности. Возможно возрастание числа патологических митозов и повышение доли мостов, что свидетельствует об активации репаративных процессов в меристеме. У дуба черешчатого не отмечалось увеличения встречаемости числа клеток с 2-я и более ядрышками в ядре и с остаточным ядрышком на стадии метафазы, анафазы, телофазы митоза по сравнению с контролем. Однако происходило изменение доли разных типов ядрышек и площади их поверхности. У березы могло происходить увеличение/снижение числа многоядрышковых клеток по сравнению с контролем, что обусловлено активацией/деактивацией ядрышкообразующих районов. Изменялись площадь поверхности одиночных ядрышек и их типы. Указанные явления связаны с влиянием поллютатнтов на метаболизм ткани и обусловлены взаимно компенсирующими друг друга механизмами - включением дополнительных ядрышкообразующих районов или изменением синтетической активности уже работающих.

Варьирование по годам цитогенетических характеристик древесных растений может быть связано с одной из причин: 1) волновой кинетикой мутационного процесса, на которую указывает Дмитриева (2000), на территориях, подвергшихся загрязнению вследствие аварии на Чернобыльской АЭС; 2) изменением объема и качественного состава химических поллютантов.

Обнаруженные изменения цитогенетических показателей свидетельствуют о ведущем вкладе химических соединений, образующихся в результате производственной деятельности человека, в модификацию наследственного аппарата клеток лиственных древесных растений после нормализации радиационного фона на территориях, подвергшихся радиоактивному загрязнению.

5.5.4. Цитогенетические показатели семенного потомства деревьев дуба черешчатого, произрастающих на территориях с незначительным уровнем антропогенной нагрузки

У семенного потомства материнских деревьев дуба черешчатого, подвергшихся радиоактивному облучению, в отдаленные сроки после воздействия радиации наблюдалось изменение цитогенетических показателей: митотической активности (этот показатель подвержен сильным колебаниям в зависимости от погоды), времени прохождения клетками стадий митоза, что обусловлено нарушениями процессов цитотомии и образования веретена деления. Несмотря на нормализацию радиационного фона, у семенного потомства наблюдалась повышенная репаративная активность в клетках меристемы, о чем свидетельствует увеличение доли мостов в спектре нарушений по сравнению с отставаниями хромосом в метакинезе и анафазе (рис. 2). Активировались «спящие» ядрышкообразующие районы. В отдельные годы повышался уровень патологических митозов. Данные изменения согласуются с концепцией о волновой кинетике мутационного процесса у растений в отдаленные сроки после радиоактивного облучения. Все это, на наш взгляд, свидетельствует о нецелесообразности применения семенного потомства дуба черешчатого из районов, подвергшихся радиоактивному загрязнению, для целей лесовосстановления или же использование его должно проводиться с большой осторожностью (после проверки цитогенетических показателей), т.к. такой семенной материал может ухудшить качество лесонасаждений.

Опираясь на созданную нами шкалу чувствительности к стрессовым факторам цитогенетических показателей, можно оценить цитогенетические

       

Рис. 2. Спектр патологических митозов в корневой меристеме проростков желудей дуба черешчатого, собранных на опытных территориях в районе населенного пункта Старый Курлак в 1996 - 1998 г.г. Обозначения: 1 - отставание хромосом в метакинезе; 2 - мосты; 3 - отставание хромосом в анафазе; 4 - "редкие" патологии; 5 - агглютинация

эффекты у семенного потомства, обусловленные отдаленными последствиями радиоактивного облучения материнских деревьев, в 1996, 1998 г.г. на опытной территории Кашара как средней степени повреждения генетического аппарата (т.к. происходило возрастание патологических митозов и изменение митотической активности), на других опытных площадях эффекты были менее выражены.

5.6. Цитогенетические характеристики семенного потомства деревьев березы повислой, произрастающих в различных лесорастительных условиях Хреновского бора

На всех опытных территориях с различными лесорастительными условиями в Хреновском бору отмечалась низкая всхожесть семян: наибольшая - в сухом (40 %), наименьшая - в свежем бору (7,8 %). Высокая всхожесть соответствовала участку леса с низкой полнотой, низкая всхожесть - загущенной территории. Возможно, это один из механизмов регуляции численности потомства у березы повислой. Наименьшая доля пустых семян встречалась в сухом бору – 54 %, в свежем и влажном – 60 и 62 % соответственно. Предполагается, что проанализированные показатели в большей мере связаны с эндогенными (генетическими) причинами, чем с почвенно-климатическими. Низкая всхожесть семян в свежем и влажном бору, возможно, является механизмом регуляции численности потомства путем самоизреживания.

Показано отсутствие различий между семенным потомством деревьев, произрастающих на опытных площадях, по митотической активности, что, возможно, связано с высокой консервативностью этого важного для онтогенеза организмов показателя. Выявлена задержка клеток на стадии анафазы-телофазы митоза в корневой меристеме проростков семян материнских деревьев, произрастающих в сухом (50,5±3,2 %) и влажном бору (47,7±2,0 %), по сравнению со свежим бором (35,4±5,4 %) вследствие нарушения цитотомии. Отмечена наибольшая частота патологических митозов в условиях травяного сосняка с высокой плотностью древостоя (9,3±2,0 %) и преобладание в спектре аномальных клеточных делений отставаний хромосом на стадии метафазы и анафазы. Это свидетельствует о низкой активности репаративных процессов и может рассматриваться как механизм, ведущий к самоизреживанию березы в условиях затенения. Установлены отличия семенного потомства березы повислой из влажного бора от такового из других типов лесорастительных условий по ядрышковым характеристикам: наблюдается возрастание площадей одиночных ядрышек, увеличение доли клеток с двумя и более ядрышками в ядре, что обусловлено активацией латентных ядрышкообразующих районов и свидетельствует о процессах компенсаторного синтеза белка в стрессовых условиях, вызванных повышенным увлажнением почвы, уменьшение доли ядрышек типа «кора-сердцевина» и возрастание доли ядрышек типа «кора-сердцевина» с вакуолью, которые компенсируют свою низкую функциональную активность увеличением площади поверхности.

5.7. Цитогенетика лиственных древесных растений в стрессовых условиях (заключение)

На основании проведенных исследований цитогенетических показателей семенного потомства двух видов лиственных древесных растений (березы повислой и дуба черешчатого), произрастающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения, разработанной шкалы чувствительности к неблагоприятному воздействию цитогенетических показателей и анализа литературных данных мы предлагаем следующую схему цитогенетических реакций лиственных древесных растений на воздействие, обусловленное как экзогенными (антропогенным воздействием, лесорастительными условиями и т.д.), так и эндогенными (суточные ритмы) факторами (рис. 3).

Выявлены следующие типы цитогенетических реакций исследованных видов в стрессовых условиях: 1) изменение циркадных ритмов митотической активности, патологических митозов, ядрышковых показателей, которые обеспечивают нормальный морфогенез ткани; 2) повышение или понижение митотической активности по сравнению с контрольными значениями, 3) задержка прохождения клетками стадий митоза, 4) рост числа и расширение спектра патологических митозов, 5) изменение частоты встречаемости остаточных ядрышек в митозе, 6) варьирование ядрышковых характеристик в интерфазных клетках (изменение площадей поверхности одиночных ядрышек, пределов изменчивости суммарной площади поверхности ядрышек в клетках с парными гомоморфными ядрышками; увеличение разницы между размерами «большого» и «маленького» ядрышек в клетках с гетероморфными парными ядрышками, а также изменение частоты встречаемости ядрышек различных типов и уровня клеток с двумя и более ядрышками в ядре).

Установлены механизмы адаптации этих видов к стрессовым условиям:

1) усиление репаративных процессов в клетках меристемы (цитологическим признаком этого явления может служить увеличение встречаемости в спектре нарушений митоза мостов по сравнению с нарушениями, связанными с отставанием хромосом при расхождении к полюсам и потерей хромосом в митозе) и запуск механизмов chekpoint-репарации генетического материала, что выражается в пролонгировании отдельных стадий митоза; 2) повышение числа ядрышкообразующих районов (в тканях появляется большое количество клеток с двумя и более ядрышками в ядре), активация транскрипции ранее работавших ядрышковых организаторов (увеличение размеров и появление высокоактивных типов ядрышек, нарастание ядрышкового гетероморфизма) и появление остаточного ядрышка в метафазе, анафазе, телофазе митоза, обусловленное пуфингом рибосомальных генов на этих стадиях; 3) возрастание числа делящихся клеток (при увеличении числа клеток с нарушениями митоза) и изменение времени прохождения клетками стадий митоза.

Подобного рода данные могут быть использованы для отбора резистентных генотипов и материнских деревьев, продуцирующих семена с такими генотипами, для создания устойчивых насаждений в экстремальных условиях произрастания, а также позволят заложить основы цитогенетического мониторинга загрязнения окружающей среды с использованием древесных растений.

Установлено, что репером изменения длительности стадий митоза является митотический индекс, подсчитанный без учета профаз. Его увеличение по сравнению с контролем указывает на задержку прохождения клетками митоза на стадии метафазы или анафазы-телофазы, а уменьшение - на задержку на стадии профазы.

Рис. 3. Схема цитогенетических реакции семенного потомства лиственных древесных растений на стрессовые условия

Подсчет патологий митоза с учетом профаз является экспресс-методом оценки состояния митотического аппарата, т.к. позволяет диагностировать изменение в его функционировании (возрастание патологий митоза и/или изменение времени прохождения клеткой стадий митоза). Для более точного определения причины нарушения митотического аппарата необходимо проводить подсчет патологий митоза без учета профазных клеток и распределение по клеток стадиям цикла.

Глава 6. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК СЕМЕННОГО ПОТОМСТВА ЛИСТВЕННЫХ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ОКРУЖАЮЩЕЙ ЧЕЛОВЕКА СРЕДЫ

Один из основных недостатков использования древесных растений для оценки генотоксичности окружающей среды – трудность переноса полученных результатов на человека. В то же время изучение цитогенетических эффектов антропогенного загрязнения в популяции человека имеет ряд ограничений в основном методического характера, связанных со сложностями при сборе и подготовке материала для анализа. Поэтому возникает необходимость разработки методов экстраполяции данных по определению загрязнения окружающей среды, полученных на древесных растениях, на человека.

Нами были исследованы эффекты воздействия антропогенного загрязнения на наиболее чувствительные цитогенетические показатели – ядрышковые характеристики – семенного потомства березы повислой (B. pendula Roth) и проведен микроядерный тест в соматических клетках человека, установлены зависимости между исследованными показателями указанных тест-объектов и показана возможность экстраполяции результатов цитогенетического мониторинга, полученных на растительном объекте, на человека.

6.1. Анализ результатов микроядерного теста в буккальном эпителии детей

Результаты микроядерного теста, выполненного в буккальном эпителии 339 детей в возрасте 2 – 6 лет, проживающих в районах г. Воронеж и Воронежской области, представлены в табл. 5.

Было установлено, что в 1999 г. у детей из Советского района г. Воронеж уровень клеток с микроядрами статистически достоверно превышал данный показатель у детей из других районов города. В 2000 – 2001 гг. наблюдалось статистически достоверное (P<0,01) уменьшение показателя частоты встречаемости клеток с микроядрами в буккальном эпителии детей, однако, в 2001 г. в Советском и Коминтерновском районах частота встречаемости клеток с микроядрами была выше, чем в Ленинском. Одной из возможных причин повышения уровня клеток с микроядрами у детей в Советском и Коминтерновском районах г. Воронеж может являться загрязнение атмосферного воздуха формальдегидом и бенз(а)пиреном. Их концентрация в данных районах превышала показатели на остальных опытных площадках, а также ПДК. При ингаляционном поступлении в организм человека указанные вещества способны индуцировать образование микроядер в клетках эпителия слизистой оболочки ротовой полости, в первую очередь подвергающейся действию мутагенов. Подобные факты были выявлены рядом исследователей (Арутюнян, 1990;  Микроядерный анализ …, 1992; Нерсесян, 1996; Цитогенетические нарушения…, 1998).

В 2002 г. в Ленинском районе частота встречаемости клеток с микроядрами оставалась на уровне 2001 г., в Коминтерновском - снизилась в 3,1 раза по сравнению с показателем предыдущего года, а в Советском – возросла в 1,8 раза и статистически достоверно превышала значения в двух других районах (P<0,01). В то же время среднее значение частоты встречаемости клеток с микроядрами в эпителиоцитах ротовой полости детей в г. Воронеж оставалось на уровне 2000 – 2001 гг. Таким образом, напряжённая экологическая ситуация сохранялась на территории Советского и Ленинского районов.

Таблица 5

Частота встречаемости клеток с микроядрами в эпителиоцитах ротовой полости детей, %

Год

Район исследования

1999

2000

2001

2002

г. Воронеж

Левобережный район

0,48±0,20

*

-

-

-

Ленинский район

0,31±0,16

**

-

0,17±0,03

**

0,20±0,05**

Коминтерновский район

0,63±0,23*

0,33±0,09

0,56±0,15

0,18±0,06**

Советский район

1,28±0,23

0,35±0,09

0,42±0,08

0,71±0,15

Среднее значение

0,81±0,12

0,34±0,06

0,33±0,06

0,39±0,14

г.Нововронеж

Район № 1

-

0,48±0,20

***

-

-

Район № 2

-

0,16±0,07

-

-

Район № 3

-

0,46±0,14

***

-

-

Среднее значение

-

0,39±0,07

-

-

с. Землянск

Район № 1

-

-

0,21±0,10

****

-

Район № 2

-

-

0,09±0,04

-

Среднее значение

-

-

0,14±0,05

-

Обозначения:

* - различия с Советским районом г. Воронеж достоверны (P<0,05);

** -различия с Советским районом г. Воронеж достоверны (P<0,01);

*** - различия с  районом № 2 г. Нововоронеж достоверны (P<0,05);

**** - различие с районом № 2 с. Землянск достоверно (P<0,05)

В г. Нововоронеж уровни встречаемости клеток с микроядрами в слизистом эпителии ротовой полости детей в районах №№ 1 и 3 статистически достоверно превышали данный показатель в районе № 2 и были практически равны друг другу (табл. 5). Полученные результаты свидетельствуют о худшем качестве окружающей среды в районах №№1 и 3. Несмотря на то, что, по данным Государственной службы санитарно-эпидемиологического надзора, территория района № 1 считается «экологически благополучной», высокая частота встречаемости клеток с микроядрами у детей, скорее всего, свидетельствует о значительном загрязнении воздуха выбросами от автотранспорта и промышленных предприятий, сосредоточенных в основном в северо-восточной части города. Более того, частота встречаемости клеток с микроядрами у детей в г. Нововоронеж не отличается от таковой в двух районах г. Воронеж (Коминтерновском и Советском) в 2000 г. Следовательно, загрязненность атмосферного воздуха небольшого города Нововоронеж сопоставима с загрязненностью районов крупного промышленного центра.

В с. Землянск наибольшая частота встречаемости клеток с микроядрами наблюдалась у детей, проживающих на территории района № 1 (табл. 5), что позволяет говорить о худшей экологической ситуации на данной территории по сравнению с другой опытной площадью. Однако невысокие показатели уровня аберрантных клеток в буккальном эпителий детей, проживающих в с. Землянск (различия с данным показателем у детей из г. Воронеж в 2001 г. достоверны, Р<0,001), свидетельствуют о сравнительно благоприятной экологической обстановке на территории указанного населенного пункта по сравнению с г. Воронеж, в частности, состоянии атмосферного воздуха.

6.2. Прогнозирование генотоксичности окружающей среды для человека по цитогенетическим показателям растительных тест-объектов

Были установлены сходные тенденции в изменении частоты встречаемости клеток с микроядрами в слизистом эпителии ротовой полости детей и морфологических характеристик ядрышек в клетках семенного потомства берёзы повислой на опытных территориях трех населённых пунктов. Нами выявлено наличие положительной корреляционной связи между площадью поверхности одиночных ядрышек в клетках семенного потомства берёзы повислой и частотой встречаемости клеток с микроядрами в буккальном эпителии ротовой полости детей (rs=0,3122 (P<0,05)). Этот факт создает предпосылки для возможной экстраполяции данных, полученных на растительном тест-объекте, на человека.

По данным цитогенетического анализа, выполненного в 1999–2001 гг., с использованием методов регрессионного анализа нами была предложена формула, позволяющая установить зависимость между показателями ядрышковой активности (площадь поверхности одиночных ядрышек) семенного потомства берёзы повислой и частотой цитогенетических нарушений у человека (частота встречаемости эпителиоцитов с микроядрами в ротовой полости детей):

Y = - 2,482 + 0,603ln(X),

где X – площадь поверхности одиночных ядрышек в клетках корневой меристемы проростков семян берёзы повислой; Y – частота встречаемости клеток с микроядрами в буккальном эпителии ротовой полости детей.

Безусловно, указанная формула, опирающаяся на цитогенетические показатели березы повислой, не отражает всего многообразия процессов, происходящих в организме человека под влиянием мутагенов. Однако факт установления такой зависимости заслуживает внимания, т.к. показывает возможность оценки генотоксичности окружающей среды для человека по цитогенетическим показателям древесных растений.

Адекватность разработанной нами математической модели проверяли по результатам цитогенетического анализа, выполненного в 2002 г. В Ленинском и Коминтерновском районах наблюдалось хорошее совпадение полученных в ходе вычислений и экспериментальных значений. Расхождение теоретических данных с опытными в Советском районе г. Воронеж можно обосновать расчётной ошибкой коэффициентов в формуле регрессионного уравнения. Следует отметить также, что разработанная математическая модель показала хорошие результаты при прогнозировании генотоксичности окружающей среды для человека в г. Старый Оскол (Калаев, 2006).

Указанная формула позволяет проводить экстраполяцию данных цитогенетического мониторинга, полученных на растительном тест-объекте, на человека и прогнозировать качество окружающей среды для здоровья человека по состоянию цитогенетического аппарата древесных растений.

6.3. Интегральная оценка состояния окружающей среды по цитогенетическим характеристикам семенного потомства древесных растений

Применение нескольких цитогенетических характеристик одного тест-объекта при проведении мониторинговых исследований, несмотря на положительные результаты, получаемые при качественной оценке загрязнения, приводит к затруднениям в интерпретации результатов при количественной оценке, т.е. при выявлении уровня загрязнения обследуемой территории. Это обусловлено разной чувствительностью отдельных цитогенетических критериев как к уровню, так, возможно, и к типу загрязнения. Взаимная компенсация изменений, приводящая в итоге к нормальному результату (канализованность признака), не позволяет дать точную оценку степени загрязнения. Для решения проблемы предложено применять методы кластерного анализа, которые по совокупности цитогенетических характеристик позволяют выявить сходство исследованных территорий. Ниже представлены дендрограммы кластерных расстояний между опытными территориями в 1-км зоне Нововоронежской АЭС и контролем, построенные по цитогенетическим показателям семенного потомства деревьев дуба черешчатого (рис. 4).

Данные кластерного анализа показали, что в 1996 и 1998 гг. опытные территории в районе станции группировались в четкий единый кластер, отделенный от контроля. Это подтверждает предположение о влиянии выбросов АЭС на цитогенетические показатели проростков желудей дуба черешчатого. Наибольшее кластерное расстояние (соответственно, наибольшие различия с контролем) в 1996 г. отмечено между опытной территорией № 5 (район шламоотвала) и контролем, в 1998 г. – между опытной территорией № 4 (район дороги) и контролем. Наименьшее расстояние от контроля имели опытные территории № 4 (1996 г.) и № 2 (1998 г.) (территория за шламоотвалом).

С использованием кластерного анализа выявлены наиболее загрязненные территории в г. Воронеж, г. Нововоронеж, г. Старый Оскол, пос. Землянск, пос. Уразово, а также сходное влияние лесорастительных условий сосняка злаково-лишайникового и сосняка травяного на генетический гомеостаз семенного потомства деревьев березы повислой, произрастающих в Хреновском бору.

  2  3 4  5 1  6 К

 

1996 г.

  4 1  3  2 5 К

1998 г.

Рис. 4. Дендрограмма кластерных расстояний между опытными территориями в районе 1 км зоны Нововоронежской АЭС в 1996, 1998 гг., построенная по цитогенетическим показателям семенного потомства дуба черешчатого

(К – контроль, 1, 2, 3, 4, 5, 6  – номер опытной территории в 1-км зоне Нововоронежской АЭС)

Изложенное выше позволяет сделать вывод о том, что семенное потомство дуба черешчатого и березы повислой может применяться, как и разработанные ранее тест-объекты - виды хвойных из родов Pinus, Larix, Picea, Abies (Индикация загрязнения окружающей …, 1999; Калашник, 2000; 2008; 2009; Квитко, 2009; Мазурова, 2008; Миронов, 2002; Сенькевич, 2007), для адекватной оценки степени загрязнения окружающей среды как в комплексе с хвойными, так и самостоятельно, а применяемые нами цитогенетические методы могут быть рекомендованы для широкомасштабного внедрения в целях ранней диагностики состояния флоры в частности и окружающей среды в целом, так как позволяют выявить повреждения наследственного аппарата организмов и установить их глубину еще до момента фенотипического проявления.

ВЫВОДЫ

1. Выделены чувствительные цитогенетические показатели (ядрышковые характеристики и время прохождения клетками стадий митоза), модификации которых выявляются при незначительных отклонениях условий среды от оптимальных, и устойчивые (появление клеток с микроядрами, депрессия митотической активности), которые изменяются только при сублетальных стрессовых воздействиях. Создана шкала чувствительности цитогенетических показателей к стрессовым факторам.

2. В качестве эталона при проведении цитогенетического мониторинга и для сравнительной оценки семенного потомства деревьев разных селекционных категорий предложены пределы изменчивости цитогенетических показателей проростков семян деревьев березы повислой  (по 17 показателям) и дуба черешчатого (по 10 показателям), собранных на экологически «чистой» территории.

3. Представлено математическое описание суточных ритмов цитогенетических показателей дуба черешчатого и березы повислой с использованием полиномиальных функций. Показана необходимость увеличения степени полинома при описании динамики изменения основных характеристик митотического аппарата в условиях антропогенного загрязнения.

4. Разработанные нами математические модели позволяют прогнозировать значения цитогенетических показателей в любое время суток по единственному экспериментально полученному в определенный час, а также корректно сравнивать результаты цитогенетических исследований, выполненных на проростках семян, зафиксированных в разное время.

5. У потомства материнских деревьев дуба черешчатого, подвергшихся радиоактивному облучению, в отдаленные сроки после воздействия радиации наблюдались изменения цитогенетических показателей (мутационный процесс), характеризующиеся волновой кинетикой.

6. В 1-км зоне Нововоронежской АЭС происходит изменение цитогенетических показателей семенного потомства дуба черешчатого и березы повислой по сравнению с контролем, связаное с функционированием атомной станции. У исследованных тест-объектов наиболее чувствительным к загрязнению оказались ядрышковые характеристики (площадь поверхности одиночных ядрышек, встречаемость многоядрышковых клеток) и время прохождения клетками стадий митоза, что связано с активацией механизмов checkpoint-репарации генетического материала.

7. Установлено влияние лесорастительных условий в Хреновском бору (сухой, свежий и влажный бор) на цитогенетические показатели проростков семян березы повислой (митотическая активность, уровень и спектр нарушений митоза, ядрышковые характеристики).

8. Выявлены разнонаправленные цитогенетические реакции семенного потомства дуба черешчатого и березы повислой, обусловленные уровнем загрязнения и альтернативными адаптивными реакциями. Построена схема цитогенетических реакций в зависимости от силы стрессового воздействия.

9. Выявлены механизмы адаптации лиственных древесных к стрессовым условиям: а) усиление репаративных процессов в клетках меристемы и запуск механизмов chekpoint-проверки целостности генетического материала; б) увеличение числа ядрышкообразующих районов, активация транскрипции ранее работавших ядрышкообразующих районов и появление остаточного ядрышка в метафазе, анафазе, телофазе митоза; в) возрастание числа делящихся клеток при увеличении числа клеток с нарушениями митоза.

10. Установлены сходные тенденции в изменении некоторых цитогенетических характеристик проростков семян березы повислой и человека на обследованных территориях. Предложена формула, описывающая зависимость между показателями ядрышковой активности (площадь поверхности одиночных ядрышек) семенного потомства берёзы повислой и частотой цитогенетических нарушений у человека (встречаемость клеток с микроядрами в эпителиоцитах ротовой полости детей), проведена ее проверка и отмечено хорошее совпадение прогнозируемых и экспериментальных данных по выявлению уровня аберрантных эпителиоцитов.

11. С использованием методов кластерного анализа по совокупности показателей тест-объектов выявлены наиболее антропогенно загрязненные и чистые территории в 5 населенных пунктах и в 1-км зоне Нововоронежской АЭС.

12. Цитогенетические характеристики дуба черешчатого и березы повислой являются интегральным отражением влияния загрязнения на биоту и могут быть рекомендованы для ранней диагностики состояния насаждений и окружающей среды в целом, т.к. их отклонения от нормы могут быть обнаружены еще до того, как нарушения проявятся на фенотипическом уровне.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 90 работ, основные из которых следующие:

Глава в коллективной монографии и учебное пособие

  1. Artyukhov V.G., Kalaev V.N. Cytogenetic indices of English oak (Quercus robur L.) seminal progeny subject to radioactive radiation in the Chernobyl nuclear disaster and growing on territories with different levels of anthropogenic contamination // 20 Years after Chernobyl Accident: past, present and future: Editors E.B. Burlakova, V.I. Naidich. – New York: Nova Science Publishers, Inc., 2006. – P. 247 – 264.
  2. Калаев В.Н., Карпова С.С. Цитогенетический мониторинг: методы оценки загрязнения окружающей среды и состояния генетического аппарата организма: Учебное пособие. – Воронеж: ВГУ, 2004. – 79 с.

Информационные листки, свидетельства на регистрацию программ для ЭВМ, патенты

  1. Буторина А.К., Калаев В.Н., Бережная Е.Е. Цитогенетический мониторинг загрязнения территорий // Инф. листок Воронежского ЦНТИ. - № 150 – 98. -1998. – 2 с.
  2. Свидетельство РФ об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2005612221. Прогнозирование суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства дуба черешчатого / Калаев В.Н., Преображенский А.П. – Заявка № 2005611613. – Регистрация 1.09.2005 г.
  3. Свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2008610143. Прогнозирование суточных ритмов цитогенетических показателей  семенного потомства березы повислой (Betula pendula Roth) / Калаев В.Н., Преображенский А.П., Карпова С.С. – Заявка № 2007614328. – Регистрация 9.01.2008 г.
  4. Пат. 2365091 Российская Федерация, МПК А01G 7/00. Способ изучения суточного ритма цитогенетических показателей растений / Калаев В.Н., Артюхов В.Г., Преображенский А.П.: заявитель и патентообладатель Воронежский государственный университет. - № 2007144823/12; заявл. 05.12.07, опубл. 27.08.09, Бюл. № 24. – 10 с.
  5. 11. Пат. 2365092 Российская Федерация, МПК А01G 7/00. Способ изучения суточного ритма цитогенетических показателей древесных растений / Калаев В.Н., Карпова С.С., Артюхов В.Г., Львович И.Я., Преображенский А.П.: заявитель и патентообладатель Воронежский государственный университет. - № 2007144824/12; заявл. 05.12.07, опубл. 27.08.09, Бюл. № 24. – 12 с.

Статьи

  1. Буторина А.К., Калаев В.Н., Вахтель В.М., Луняк А.И., Евстратов Н.В. Характер воздействия физических и химических мутагенов среды на наследственный аппарат клетки // Экологический вестник Черноземья. - 1996. - Вып. 4. - С. 8 – 9.
  2. Butorina A. K., Kalaev V.N. Diversity of Cytological Characteristics in Oak Under Normal Conditions // Diversity and Adaptation in Oak Species.  Proceedings of a conference of IUFRO Working Party 2.08.05 held Oct. 12-17, 1997, College of Agricultural Sciences, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, U.S.A. –  Pennsylvania, 1998. - P. 46 - 48.
  3. *Буторина А.К., Калаев В.Н. Шкала чувствительности критериев цитогенетического мониторинга // Цитология. – 1999. – Т. 41, № 12. – С. 1056 - 1057.
  4. *Буторина А.К. , Калаев В.Н.  , Вострикова Т.В. , Мягкова О.Е. Цитогенетическая  характеристика  семенного потомства некоторых видов древесных растений в условиях антропогенного загрязнения г. Воронежа // Цитология . – 2000. – Т. 42, № 2. – С. 196 - 201.
  5. *Буторина А.К., Калаев В.Н.,  Карпова С.С. Цитогенетические эффекты антропогенного загрязнения у детей, проживающих в различных районах г. Воронежа // Вестник Воронежского государственного университета. Серия химия, биология. – 2000. - № 2. – С. 91 – 93.
  6. Буторина А.К., Калаев В.Н. Использование охраняемых территорий в качестве контрольных для проведения цитогенетического мониторинга загрязнения окружающей среды с применением древесных растений // Состояние, изучение и сохранение заповедных природных комплексов лесостепной зоны: сб. науч. статей, посвященный 65-летию Хоперского государственного природного заповедника. – Воронеж, 2000. – С. 201 – 204.
  7. Butorina A.K., Kalaev V.N., Najdenova O.S., Myagkova O.E., Vostricova T.V., Mitroshina O., Dirdina O.V., Polyakova N.A. Relationship between cytogenetic anomalies in forest trees subjected to radioactive contamination and industrial pollution with inherent defects in human infants in Central Russia // Cytogenetic Studies of Forest Trees and Shrubs – Review , Present Status , and Outlook on the Future (special issue of the Forest Genetics). - Zvolen, 2000. P. 35 - 41.
  8. *Буторина А.К., Калаев В.Н., Карпова С.С. Влияние пола и возраста детей на частоту встречаемости микроядер в буккальном эпителии ротовой полости // Вестник Воронежского государственного университета. Серия химия, биология. – 2000. - № 6. – С. 143 – 145.
  9. *Буторина А.К., Калаев В.Н. Анализ чувствительности различных критериев цитогенетического мониторинга // Экология. – 2000. - № 3. – С. 206 - 210.
  10. *Калаев В.Н., Буторина А.К., Мильшин А.В., Вахтель В.М., Бабенко А.Г. О возможности нестохастических биологических эффектов при облучении радоном в эквивалентных равновесных объемных активностях 200 и 400 Бк/м3 зебрины повислой (Zebrina pndula Schnizl.) // Вестник ВГУ. Серия химия, биология. – 2001. - № 2. – С. 109 – 113.
  11. *Буторина А.К., Калаев В.Н., Карпова С.С. Особенности протекания митоза и ядрышковые характеристики семенного потомства березы повислой в условиях антропогенного загрязнения // Цитология. – 2002. – Т. 44, № 4. – С. 392 – 399.
  12. *Буторина А.К., Калаев В.Н., Карпова С.С. Цитогенетические нарушения в соматических клетках человека и березы повислой в районах г. Воронежа с различной интенсивностью антропогенного загрязнения // Экология. – 2002. - № 6. – С. 438 – 441.
  13. Карпова С.С., Калаев В.Н., Трофимова В.А., Осташкова Л.Г., Шелухина О.Ю. Микроядерный тест в буккальном эпителии детей, проживающих в районах Центрально-Черноземного региона с различным уровнем антропогенного загрязнения окружающей среды // Актуальные проблемы медицины и биологии: сборник научных работ. – Томск: Сибирский медицинский университет, 2003. – Вып. 2. – С. 58 – 62.
  14. Карпова С.С., Калаев В.Н., Трофимова В.А., Осташкова Л.Г., Шелухина О.Ю. Влияние курения родителей на уровень микроядер в эпителиоцитах детей // Актуальные проблемы медицины и биологии: сборник научных работ. – Томск: Сибирский медицинский университет, 2003. – Вып. 2. – С. 62 – 63.
  15. Калаев В.Н., Буторина А.К., Карпова С.С. Оценка генотоксичности окружающей среды для человека по показателям растительных тест-объектов // Актуальные проблемы медицины и биологии: сборник научных работ. – Томск: Сибирский медицинский университет, 2003. – Вып. 2. – С. 57 – 58.
  16. Kalaev V.N., Karpova S.S. The influence of air pollution on cytogenetic characteristics of birch seed progeny // Forest Genetics. – 2003. - V.10, №1. – P. 11 – 18.
  17. *Артюхов В.Г., Калаев В.Н., Савко А.Д. Влияние радиоактивного облучения материнских деревьев дуба черешчатого (Quercus robur L.) на цитогенетические показатели семенного потомства (отдаленные эффекты) // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. – 2004. – № 1. – С. 121 – 128.
  18. *Артюхов В.Г., Калаев В.Н., Сенькевич Е.В., Вахтель В.М., Савко А.Д. Цитогенетические показатели семенного потомства лиственных древесных растений  в 1-километровой зоне Нововоронежской АЭС // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2004. – Т. 44, № 4. – С. 445 – 457.
  19. *Артюхов В.Г., Калаев В.Н. Цитогенетические показатели семенного потомства деревьев дуба черешчатого (Quercus robur L.), подвергшихся воздействию радиоактивности в результате аварии на Чернобыльской АЭС и произрастающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2005. – Т. 45, № 5. – С. 619 – 628.
  20. Калаев В.Н., Преображенский А.П. Прогнозирование суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства дуба черешчатого // Программы для ЭВМ. Базы данных. Топология интегральных микросхем. – 2005. - № 4. – С. 135.
  21. *Карпова С.С., Калаев В.Н., Артюхов В.Г., Трофимова В.А., Осташкова Л.Г., Савко А.Д. Использование морфологических характеристик ядрышек клеток корней проростков  березы повислой для определения степени загрязнения окружающей среды // Известия АН. Сер. биологическая. – 2006. - № 1. – С. 86 – 94.
  22. *Артюхов В.Г., Калаев В.Н. Цитогенетический мониторинг состояния окружающей среды на территориях, подвергшихся радиоактивному загрязнению в результате аварии на Чернобыльской АЭС (на примере поселка Уразово Белгородской области) // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2006. – Т. 46, № 2. – С. 248 – 255.
  23. Kalaev V.N., Butorina A.K. Cytogenetic effect of oak (Quercus robur L.) trees growing on sites contaminated by Chernobyl fallout // Silvae Genetica. – 2006. -  V. 55, issue 3. – P. 93 – 101.
  24. Калаев В.Н. Чернобыльские следы в клетках // Химия и жизнь. – 2006. - № 7. – С. 50 – 51.
  25. * Калаев В.Н., Буторина А.К., Шелухина О.Ю. Оценка антропогенного загрязнения районов г. Старый Оскол по цитогенетическим показателям семенного потомства березы повислой // Экологическая генетика. – 2006. - Т. 4, № 2. С. 9 – 23.
  26. Калаев В.Н., Калаева Е.А., Преображенский А.П., Хорсева О.В. Регрессионный анализ в биологических исследованиях // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. – 2007. – Т. 6, № 3. – С. 755- 759.
  27. Калаев В.Н., Калаева Е.А., Артюхов В.Г., Преображенский А.П. Применение кластерного анализа в биологических исследованиях // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. – 2007. – Т. 6, № 4. – С. 1008 -  1014.
  28. Калаев В.Н., Преображенский А.П., Карпова С.С. Прогнозирование суточных ритмов ядрышковых показателей семенного потомства березы повислой (Betula pendula Roth) // Программы для ЭВМ. Базы данных. Топологии интегральных микросхем. – 2008. - № 2. – Ч. 2. – С. 37 - 38.
  29. *Калаев В.Н., Карпова С.С., Артюхов В.Г., Матвеев С.М., Таранков В.И. Цитогенетические характеристики семенного потомства деревьев березы повислой в Хреновском бору // Лесоведение. – 2009. - № 3. – С. 43 – 51.
  30. *Артюхов В.Г., Калаев В.Н., Карпова С.С. Цитогенетический полиморфизм семенного потомства деревьев березы повислой (Betula pendula Roth), произрастающих в различных экологических условиях // Экологическая генетика. – 2009. – Т. 7, № 1. – С. 30 – 40.

Материалы конференций

  1. Butorina А.К., Kalaev V.N., Najdenova L.S., Dirdina O.V. Using of forest tree species for the cytogenetical monitoring on contaminated areas // Forests and tree resources: Proceedings of the 11 World Forestry Congress. - Antalya, 1997. - V. 1А. - Р. 181.
  2. Butorina А.К., Kalaev V.N., Mashkina O.S., Muraya L.S. Raising of efficiency of forest tree genetic resources utilisation by means of cytogenetical method // Forests, biological diversity and the maintenance of the natural heritage: Proceedings of the 11 World Forestry Congress. – Antalya, 1997. - V. 2В. - Р. 211.
  3. Butorina A.K., Kalaev V.N., Najdenova O., Myagkova O., Dirdina O.V. Common and specific types of cytological disturbances in different forest tree species, growing on contaminated areas of Central Russia // Cytogenetic Studies of Forest Trees and Shrubs – Review , Present Status , and Outlook on the Future: Abstracts of Invited Papers Symposium of IUFRO Cytogenetics Working Party. S2.04 – 08, Graz, September 6 – 11, 1998.  – Graz, 1998. – P. 32A.
  4. Буторина А.К. , Калаев В.Н., Вострикова Т.В., Богданова Е.В., Мазурова И.Э. Адаптивные реакции на клеточном уровне на антропогенный стресс у древесных растений // Современные проблемы генетики и селекции плодовых и ягодных культур и пути их решения: сб. докл. и сообщ. 19 Мичуринских чтений. – Мичуринск, 1999. – С. 12 – 14.
  5. Буторина А.К., Калаев В.Н., Богданова Е.В., Мазурова И.Э. Общие и специфические механизмы устойчивости древесных растений к антропогенному загрязнению // Проблемы повышения экологических функций леса: материалы симпозиума. – Воронеж, 2000. – С. 128 – 129.
  6. Буторина А.К., Сиволапов А.И., Мурая Л.С., Калаев В.Н., Иванов Р.В., Лысак М.Б., Богданова Е.В., Миронов А.Н. Перспективы использования цитогенетического метода в лесоводстве для ускоренного воспроизведения ценных лесных ресурсов // Интеграция науки и высшего лесотехнического образования по управлению качеством леса и лесной продукции: материалы международ. науч.-практич. конф. – Воронеж: Воронеж. гос. лесотехн. акад., 2001. – С. 83 – 87.
  7. Буторина А.К., Калаев В.Н., Карпова С.С. Влияние антропогенного загрязнения на процессы протекания митоза у семенного потомства березы повислой в городе Воронеже // Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий: матер. 14 межресп. науч.-практич. конф.– Краснодар: Кубанский госуниверситет, 2001. – С. 12 – 13.
  8. Буторина А.К., Калаев В.Н. Цитологические механизмы адаптации пролиферативного пула клеток корневой меристемы дуба черешчатого к антропогенному загрязнению // Онтогенез и популяция: сб. материалов 3 всероссийск. популяционного семинара. – Йошкар-Ола: Марийский государственный университет, 2001. – С. 63 – 65.
  9. Калаев В.Н. Цитогенетические механизмы адаптации лиственных древесных растений к антропогенному загрязнению // Приспособления организмов к действию экстремальных факторов: материалы 7 международной научно-практической экологической конференции. – Белгород, 2002. – С. 107.
  10. Kalaev V.N., Karpova S.S. The cytogenetic mechanisms of adaptation of deciduous woody plants to anthropogenic pollution // Dynamics and conservation of genetic diversity in forest ecosystems: Abstracts of International Conference DYGEN. - Strasbourg, 2002. – P. 128.
  11. Калаев В.Н., Сенькевич Е.В., Вахтель В.М. Влияние работы Нововоронежской АЭС На цитогенетические показатели семенного потомства древесных растений, произрастающих в окрестности станции, и перспективы их использования для оценки загрязнения окружающей среды // Промислова ботанiка: стан та перспективи розвитку: матерiали 4 мiжнародноi науковоi конференцii. – Донецьк: Лебiдь, 2003. – С. 66 – 68.
  12. Буторина А.К., Калаев В.Н., Карпова С.С. Остаточные ядрышки как механизм адаптации клеток к воздействию экстремальных факторов // Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем: материалы 8 международ. науч. экологической конференции. – Белгород, 2004. – С. 28 – 29.
  13. Karpova S.S., Kalaev V.N. Polymorphism of cytogenetic characteristics of birch seed progeny on ecological clean and polluted territories // Modern problems of genetics, radiobiology and evolution: second intern. conf. Dedicated to the 105th anniversary of the birth of N.W. Timofeeff-Ressovsky and the 70th anniversary of the paper “On the nature of gene mutations and gene structure” by N.W. Timofeeff-Ressovsky, K.G. Zimmer, and M. Delbruck (Yerevan, September 8 – 11, 2005): Abstr., Papers by Young Scientists. – Dubna: JINR, 2005. – P. 68.
  14. Калаев В.Н., Карпова С.С., Артюхов В.Г., Матвеев С.М., Таранков В.И. Цитогенетические характеристики проростков, всхожесть и полнозернистость семян деревьев березы повислой, произрастающих в различных лесорастительных условиях Хреновского бора // Современные проблемы популяционной экологии: материалы 9 международ. научн.-практич. экологич. конф. – Белгород: Политера, 2006. – С. 81 – 83.
  15. Калаев В.Н., Преображенский А.П., Карпова С.С. Прогнозирование суточных ритмов цитогенетических показателей в апикальной меристеме  проростков семян березы повислой // Интеллектуальные информационные системы: труды всерос. конф. – Воронеж: Воронежский государственный технический университет, 2007. – С. 180 – 182.
  16. Калаев В.Н. Влияние техногенного загрязнения на всхожесть семян и некоторые цитогенетические показатели семенного потомства деревьев березы повислой (Betula pendula Roth) // Актуальные проблемы ботаники и методики преподавания биологии: материалы 2 международ. научно-практич. конф.– Белгород: Политерра, 2007. – С. 160 – 166.
  17. Калаев В.Н. Цитогенетика некоторых лиственных древесных растений, произрастающих на территориях, подвергшихся радиоактивному загрязнению в результате аварии на Чернобыльской АЭС, и испытывающих значительные антропогенные нагрузки // Промислова  ботанiка: стан та перспективи розвитку: матерiали мiжнар. наук. конф. – Донецьк, 2007. – С. 193 – 198.
  18. Калаев  В.Н. Цитогенетическая изменчивость семенного потомства дуба черешчатого (Quercus robur L.) в условиях антропогенного загрязнения и на экологически чистых территориях // Проблемы деградации дубрав и современные системы ведения лесного хозяйства в них: материалы науч.-практич. семинара. – Воронеж: ВГЛТА, 2007. – С. 114 – 117.
  19. Калаев В.Н., Преображенский А.П., Карпова С.С. Методические подходы к формальному описанию суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства древесных растений с целью их прогнозирования // Информатика: проблемы, методология, технологии: материалы 8 международ. научно-методической конференции. – Воронеж: ИПЦ Воронежского государственного университета, 2008. – Т. 1. – С. 250 – 254.
  20. Карпова С.С., Калаев В.Н. Цитогенетические реакции березы повислой на антропогенное загрязнение и перспективы ее использования для оценки генотоксичности окружающей человека среды // Живые объекты в условиях антропогенного пресса: матер. 10 международ. науч.-практич. экологической конференции. – Белгород: ПОЛИТЕРРА, 2008. – С. 83 – 84.
  21. Калаев В.Н., Логачева А.А. Ядрышковые характеристики семенного потомства дуба черешчатого в условиях загрязнения окружающей среды автотранспортным комплексом // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале 21 века: матер. всероссийск. конф. – Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2008. – Ч. 3. – С. 34.
  22. Калаев В.Н., Логачева А.А. Цитогенетические реакции семенного потомства дуба черешчатого (Quercus robur L.) на загрязнение атмосферного воздуха выхлопными газами автотранспорта // Генетика и биотехнология 21 века. Фундаментальные и прикладные аспекты: материалы международ. науч. конф. (. – Минск: Издательский центр БГУ, 2008. - С. 93 – 95.
  23. Карпова С.С., Калаев В.Н. Анализ корреляционных связей между цитогенетическими характеристиками семенного потомства березы повислой в связи с вопросами ее адаптации к антропогенному загрязнению // Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем: матер. международ. научно-практич. конф., посвященной 100-летию со дня рождения К.В. Горбунова. – Астрахань: ПолиграфКом, 2008. – С. 100 – 104.
  24. Калаев В.Н., Преображенский А.П., Львович И.Я. Математическая модель суточных ритмов цитогенетических показателей в апикальной меристеме корня проростков желудей дуба черешчатого (Quercus robur L.) // Информатика: проблемы, методология, технологии: материалы 9 международ. науч.-метод. конф. – Воронеж: ИПЦ Воронежского государственного ун – та, 2009. – Т. 1. – С. 335 – 340.
  25. Карпова С.С., Калаев В.Н. Суточные ритмы цитогенетических показателей семенного потомства деревьев березы повислой (Betula pendula Roth), произрастающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения // 5 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров: матер. конференции. – Москва: Изд – во РГАУ-МСХА, 2009. - Ч. 2.– С. 241.
  26. Логачева А.А., Калаев В.Н. Цитогенетический полиморфизм семенного потомства деревьев дуба черешчатого (Quercus robur L.), произрастающих на антропогенно загрязненных территориях //  5 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров: матер. конференции. – Москва: Изд – во РГАУ-МСХА, 2009. – Ч. 2. – С. 247.

16 работ (отмеченные знаком*) опубликовано в изданиях, соответствующих списку ВАК РФ для публикации материалов докторских диссертаций по биологическим наукам (10, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 24, 25, 26, 28, 29, 32, 36, 37).







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.