WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Гарипова Розалия Фановна

       биотестирование и экоанализ        

в мониторинге территорий, подверженных микроэлементному загрязнению

03.02.08. «Экология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Оренбург – 2011

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»

Научный консультант:

доктор сельскохозяйственных наук,

профессор        

калиев

Асылхан Жолдасбаевич

Официальные оппоненты:        

доктор медицинских наук, профессор, проректор по научной и инновационной деятельности ФППС ГОУ ВПО  «Оренбургская государственная  медицинская академия»

сетко

Нина Павловна

доктор биологических наук, профессор кафедры экологии и генетики ГОУ ВПО «Тюменский государственный университет»

петухова

Галина Александровна

доктор биологических наук, профессор, исполнительный директор Института биоэлементологии ГОУ ВПО «Оренбургский государственный университет»

Мирошников

Сергей Александрович

Ведущая организация: Учреждение РАН Институт экологии растений и животных УрО РАН

Защита состоится « _ »  __  2011 года в  __  часов на заседании диссертационного совета Д.208.066.03 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: 460000, г.Оренбург, ул. Советская, д.6, зал заседаний диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской

государственной медицинской академии.

Автореферат разослан «____»_________________ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

д.м.н., профессор               Немцева Наталия Вячеславовна

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Окружающая среда постоянно пополняется вредными факторами физической, химической, биологической природы. Объективная оценка и прогнозирование опасности загрязняющих веществ возможны только при совершенствовании экоанализа, включающего учет данных химического состояния объектов окружающей среды, постановки модельных экспериментов с использованием биотестов, экстраполяции реакций тест-объектов на природные популяции организмов. Экологическая оценка территорий с использованием биотестирования предусматривает выявление токсических реакций чувствительных тест-систем по летальности, модификационной, мутационной изменчивости, стрессовому ответу. Среди токсикантов мутагены отличаются способностью вызывать все перечисленные формы токсикации. При скрининге мутагенов используются микробные, растительные, животные тест-объекты. В связи с прогрессирующим техногенным загрязнением биоресурсов слабыми мутагенами все большую актуальность приобретает проблема отдаленных последствий подобного воздействия. Распространение малых концентраций мутагенов увеличивает число онкозаболеваний среди населения, число неопухолевых форм отдаленной патологии (развитие катаракты, пневмо- и нефросклероза, ослабление эластичности кожи, различные нейродистрофические расстройства), в том числе и нарушений нейроэндокринной регуляции, снижающих адаптивные возможности организма. На уровне эмбриональных клеток даже одиночный клеточный дефект может привести к нарушениям развития, тератогенезу. Данная проблема связана и с ускоренным старением, бесплодием, смертью в первом поколении (Бочков, Чеботарев, 1989; Дубинин, 1990; Москалев, 1991; Бычковская и др., 2003, 2007; Турзин, Ушаков, 2007 и др.). Появление новых экспериментальных данных, развитие теории эпигенетической наследственности и изменчивости признаков (Chandler et al., 2000; Голубовский, 2000; Чураев, 2000; Васильев, 2000, 2004, 2005, 2009; Гродницкий, 2001; Назаренко, 2002; Жерихин, 2003; Шишкин, 2006; Bird, 2007; Chandler, 2007; Жерихин и др., 2008) выявили необходимость разработки теоретических основ и технологий интегрированного биотестирования поллютантов с учетом их способности вызывать генетические и эпигенетические изменения в биообъектах.

Источниками формирования повышенного мутагенного фона являются и тяжелые металлы в составе выбросов предприятий. Существует практика утилизации сточных вод предприятий на земледельческих полях орошения. При этом авторы подобного решения, основанного на экономии финансовых вложений предприятия, трудоемкости строительства очистных сооружений и т.д., ссылаются на внедрение технологий рационального использования водных ресурсов. Так, сточные воды Оренбургского газохимического комплекса (ОГХК) используются для полива кормовых культур на земледельческих полях орошения (ЗПО) с 1974 г. В процессе переработки газа на ОГХК ежегодно образуется до 4 млн. м3 биологически очищенных сточных вод, которые утилизируются на площади 1670 га. Мониторингом почв, растений и качества животноводческой продукции занимались ученые Оренбургского государственного аграрного университета с 1974 года, практически с первых лет существования ЗПО. Мониторинг первых 10 лет показал тенденцию к микроэлементному загрязнению почв и кормов, прогнозировался риск прогрессивного засоления почв за счет использования высокоминерализованных вод предприятия с повышенным содержанием ионов натрия и хлора (Иоаниди и др., 1977, 1978, 1979, 1980, 1982, 1986).

Загрязнения микроэлементной природы являются одной из важных сторон возрастающей агрессивности внешней среды, что декларируется экспертными комитетами ВОЗ и в многочисленных публикациях. Последствиям техногенного загрязнения территории в зоне влияния ОГХК уделялось внимание многих специалистов региона (Блохин, 1997; Блохин, Грошев, 2003; Боев, Быстрых, Верещагин и др., 2003; Калиев, 1990, 1991, 1993, 1995, 1996, 2009; Сетко, Скрипко, 2005; Макшанцев, 2008). Большинство авторов связывает риск микроэлементного загрязнения почв, грунтовых вод, растениеводческой и животноводческой продукции с развитием газоперерабатывающей промышленности. Однако комплексного экологического анализа территории в зоне влияния газоперерабатывающего предприятия с учетом реакций биосистем на нарастающий микроэлементный фон не проводилось.

В связи с этим в диссертационном исследовании решается проблема разработки методологических основ и технологии комплексного биотестирования потенциальных загрязнителей с учетом их способности вызывать генетические и эпигенетические изменения в биообъектах.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований являлась разработка интегрированной системы оценок экологического состояния территории, подверженной микроэлементному загрязнению, на основе биотестирования поллютантов и экоанализа зоны техногенного воздействия газоперерабатывающего предприятия.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

  1. Исследовать химическое состояние сточных вод Оренбургского газохимического комплекса, почв земледельческих полей орошения в динамике, выявить приоритетные загрязнители, подобрать блок тест-систем для скрининга генетически активных веществ и индукторов эпигенетической изменчивости.
  2. Выявить компоненты сточных вод и почв ЗПО с учетом микроэлементного состава, способные индуцировать мутации и эффекты последействия, в натурных исследованиях и модельных экспериментах.
  3. Разработать систему комплексной эколого-генетической и эпигенетической оценки воздействия микроэлементов окружающей среды.
  4. Анализ экспериментальных данных и разработка условий экстраполяции для прогнозирования отдаленных последствий воздействия сточных вод на микробные, растительные и животные объекты.

Научная новизна. На основании многолетнего мониторинга и экоанализа, с применением традиционных и оригинальных методов биотестирования  установлена микроэлементная природа мутагенной и эпигенетической активности выбросов газоперерабатывающей промышленности и риск  развития микроэлементозов в популяциях растительных и животных организмов, находящихся в зоне влияния газоперерабатывающего предприятия. Выявлено, что основу мутагенной и эпигенетической активности сточных вод ОГХК и почв ЗПО составляют соединения никеля, цинка и меди. Показана перспективность использования фитотестов для выявления индукторов цито- и морфофизиологических нарушений, а также внутрипопуляционных реакций растений на загрязнение окружающей среды; рекомендованы наиболее удобные и практичные из них. Разработаны новые способы биотестирования воды, почвы, биологически активных веществ, позволяющие проводить экспресс-диагностику способности поллютантов вызывать отдаленную патологию у многоклеточных организмов, потенциальные дестабилизирующие изменения в фитопопуляциях, а также повысить объективность оценки токсикантов за счет интегрированного учета индукции цито- и морфофизиологических нарушений в фитотестах (Патенты на изобретение RU № 2319959; RU № 2322669). На основании полученных данных предложены новые способы эпигенетической оценки индукторов отдаленных последствий воздействия, включающие учет проявлений нестохастической наследуемой клеточной летальности на дрожжах-сахаромицетах и клеточных структурно-метаболических изменений в фитотестах. Разработана и использована система комплексной эколого-генетической и эпигенетической оценки поллютантов, включающая применение тест-объектов от микроорганизмов до млекопитающих, учет индуцированных мутаций, морфозов, модификаций, а также анализ взаимодействия компонентов загрязнителя в модельных экспериментах, что позволило выявить реальную опасность слабых доз мутагенов техногенного происхождения как индукторов эффектов последействия в онтогенезе и в репродукциях.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Использование сточных вод газоперерабатывающего предприятия для получения растениеводческой продукции привело к накоплению и повышению содержания микроэлементов в почвах и растениях до токсичных концентраций, что свидетельствует о недопустимости дальнейшей эксплуатации ЗПО для доочистки сточных вод ОГХК и получения кормов.
  2. Основу мутагенной и эпигенетической активности сточных вод Оренбургского газохимического комплекса и почв земледельческих полей орошения составляют соединения никеля и меди.
  3. Комплексное биотестирование, включающее учет традиционных генетических и предложенных новых методов эпигенетической оценки индукторов отдаленных последствий воздействия, позволяет дать объективную оценку загрязнителям и рекомендовать использование этих методов в структуре экологического мониторинга.
  4. Прослеженная цепочка миграции микроэлементов от загрязняемых в процессе орошения почв к растениям ЗПО ОГХК, а также результаты экспериментов, проведенных на растительных и животных объектах, позволяют прогнозировать в зоне влияния ОГХК развитие патологий по типу микроэлементозов.

Практическая значимость. Полученные на основании обобщения 30-летний опыта утилизации сточных вод газохимического производства и результатов мониторинга состояния загрязненных почв с момента определения тенденций к микроэлементному загрязнению до установления факта загрязнения почв ЗПО солями никеля по нормам ОДК (по ГН 2.1.7.020-94) данные, позволили выявить новые закономерности и биологическая обусловленность реакции биосистем на техногенное воздействие. Результаты диссертационного исследования включены в Государственный доклад Комитета по охране окружающей среды и природных ресурсов Оренбургской области за 2008 г.; доведены до сведения администрации ОГХК (акт о внедрении № 1) и являются научным обоснованием перспективы реконструкции очистных сооружений и внедрения технологий замкнутого цикла водопотребления. Разработанные методы биотестирования внедрены в комплексный мониторинг окружающей среды зоны влияния ОГХК (акт внедрения № 2), в систему почвенного мониторинга и токсикологической оценки препаратов сельскохозяйственного назначения в учебном опытном хозяйстве Оренбургского государственного аграрного университета и хозяйствах Оренбургской области (акты о внедрениях №№ 3-9) и используется в системе подготовки кадров (Методические рекомендации). Использование разработанных способов биотестирования вод, почв, биологически активных веществ в экологических лабораториях предприятий позволяет дать объективную оценку опасности загрязнителей и качеству природоохранных мероприятиям, а также выявить эффективные агротехнологии, сохраняющие генофонд ценных популяций растений и способствующие экологизации производства. Итоги многолетней исследовательской работы были представлены во Всероссийском Выставочном Центре (ВВЦ, г. Москва) в 2005 г., автор награжден нагрудным знаком «Участник ВВЦ».

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на 13 научно-практических конференциях ученых и специалистов (Самарканд, 1986; Оренбург, 1995, 1997, 1998, 2001-2003; Челябинск, 2002; Санкт-Петербург, 2002; Уфа, 2006; Екатеринбург, 2007), на 4 Международных конференциях и симпозиумах (Ставрополь, 2002; Оренбург, 2003, 2004; Курган, 2008), XXVII Российской научно-практической школы «Наука и технологии. Секция Новые технологии» (Екатеринбург, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано: 12 научных статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, 39 научных статей в других периодических изданиях и сборниках, два патента РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 281 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 408 источников, из которых - 130 иностранных. Текст иллюстрирован 40 таблицами, 33 рисунками. Диссертация содержит приложения на 28 страницах.

Объектом экоанализа и биотестирования настоящей исследовательской работы являлись сточные воды ОГХК и почвы ЗПО ОГХК. Исследования осуществлялись в соответствии с научно-технической программой «Дать оценку изменениям наземных и водных экосистем в условиях антропогенного воздействия» (№ ГР 08501080202), с межведомственной координационной программой РАСХН «Агропатологический мониторинг и практические приемы комплексной защиты сельскохозяйственных культур от болезней, вредителей и сорняков в степной зоне Южного Урала. Разработка растительных тест-систем для токсикогенетической оценки вод, почв, биологически активных веществ» (№ ГР 01200105539).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Источники микроэлементного загрязнения природных ресурсов и биомониторинг (обзор литературы) представлена тремя разделами, в  которых освещены взаимосвязанные проблемы рационального использования и сохранения биоресурсов, микроэлементного загрязнения территорий, а также обосновывается необходимость разработки новых технологий комплексного экологического мониторинга на основе эконализа и биотестирования для прогнозирования отдаленных последствий воздействия слабых доз поллютантов на организмы. Рациональное использование водных ресурсов и проблема загрязнения агроландшафтов. В разделе кратко излагаются практика устройства ЗПО как способа утилизации хозяйственно-бытовых, промышленных стоков и  проблемы детоксикации промышленных загрязнителей на ЗПО. Раздел завершается описанием технологических проблем утилизации сточных вод газоперерабатывающих предприятий, возникающих в связи с химическим  загрязнением территории в процессе длительной эксплуатации ЗПО. Источники микроэлементного загрязнения окружающей среды и реакции живых систем на избыток и дефицит металлов. В данном разделе представлены виды техногенного воздействия, ведущие к микроэлементному загрязнению, характеристика микроэлементного загрязнения конкретной изучаемой территории в зоне влияния Оренбургского газохимического комплекса по материалам ученых региона, а также описана реакция живых систем на загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами. Эколого-генетический мониторинг и перспективы использования эпигенетической изменчивости в комплексной оценке опасности поллютантов. В разделе описаны распространенные в мировой практике методы эколого-генетического тестирования химических веществ, поступающих в окружающую среду, приводится анализ применения некоторых из них в биотестировании специфических загрязнителей газоперерабатывающей промышленности. Дан обзор источников по особенностям действия слабых доз мутагенов и перспектив использования их фенотипических эффектов в комплексной оценке опасности загрязняющих веществ.

Глава 2. Материалы и методы исследований. Химический состав сточных вод определяли перед поливами на ЗПО по методике Лурье и Рыбниковой (1966). В образцах растений, почв и сточной воды определяли содержание металлов спектральным методом (Канякин и Грибовская, 1979) в период с 1989 по 1995 гг. (225 образцов сточной воды, 112 образцов почв, 80 образцов растений); атомно-адсорбционным методом (по ГОСТу 8.505.-84; МИ-858.-85) - в период с 1996 по 2002 гг. (80 образцов сточной воды, 103 образца почв, 56 образцов растений). Определялась валовая и подвижная форма металлов. Анализируемые образцы включали усредненные отборы из 5-10 точек в районе расположения всех 20 гидрантов.

Определение мутагенной активности сточных вод проводили с помощью модифицированного полуколичественного теста Эймса с метаболической активизацией in vitro (Фонштейн и др., 1977; Ames et al., 1975).

Повреждения митотических хромосом и нарушения митоза исследовали в соответствии с методиками цитогенетического анализа (ЦГА), предложенными З.П. Паушевой (1988). В качестве объекта использовали лук A. cepa, у которого были изучены первые митозы после воздействия веществом.

Помимо вышеуказанных показателей, дополнительно учитывали: время, необходимое для мацерации; количество ядрышек в ядре клеток. Модельный эксперимент на определение цитогенетических эффектов компонентов сточной воды включал варианты растворов в мг/л (модель-1):

1. Медь углекислая        - 5; 0,5; 0,05.

2. Никель углекислый        - 7; 0,7; 0,07.

3. Двухлористый цинк        - 10; 1,0; 0,10.

4. Комбинация из трех солей в соотношении растворов Cu:Zn:Ni равном 1:1:1.

Минимальная концентрация (min) соответствовала концентрации металлов в сточных водах, поступающих в емкость сезонного регулирования (ЕСР).

Водные вытяжки почв из 10 усредненных (по 5-10 отборам из корнеобитаемого слоя) образцов (1:5) исследуемой территории протестированы на луке A. cepa, пшенице T. aestivum сортов Людмила и Саратовская 59. Модельный эксперимент включал максимальную концентрацию (max) солей меди, цинка и никеля, известную по результатам определения валового содержания этих элементов в почвах ЗПО ОГХК в вариантах (модель-2):

1. Двухлористый цинк        - 68 мг/л.

2. Медь углекислая        - 66 мг/л.

3. Никель углекислый        - 343 мг/л.

4. Комбинация из трех солей в соотношении растворов Cu:Zn:Ni равном 1:1:1.

Минимальная концентрация (min) содержала в 10 раз меньше солей в тех же вариантах и соответствовала концентрации металлов в водных вытяжках почв.

В качестве тест-систем, определяющих частоту соматических мутаций и рекомбинаций у дрозофилы D. melanogaster были использованы гомозиготные самки линии mwh ju и гетерозиготные самцы линии ДР (103) SE; flr/ТМ1, Meri Sbd. Исследования проводили по методике Lindsley, Grell (1968). Тест на сцепленные с полом рецессивные летальные мутации (СПРЛМ) проводили с использованием линий Д-32 и Меллер-5 по классической схеме (Орлова, 1991). В модельных экспериментах использовали соли тяжелых металлов (модель-1).

Применены методы выявления стохастических и нестохастических наследуемых клеточно-летальных эффектов по описаниям И.Б. Бычковской (1986), а также авторский метод (Гарипова Р.Ф. Патент на изобретение RU № 2319959). Использованы штаммы дрожжей-сахаромицетов Saccharomyces cerevisiae-гаплоид и его -мутант-диплоид. Гаплоидный штамм интродуцирован из природной популяции - дикий тип. Исследования проводили в соответствии с рекомендациями по работе с дрожжами-сахаромицетами И.А. Захарова и др. (1984). Так как штамм гаплоидной формы был выделен из дикой популяции, необходимо было изучить некоторые характеристики, в частности, определить реакцию генотипа на воздействие мутагенами. Нами исследована выживаемость и мутабильность при гамма-облучении. Реакция на воздействие мутагенами принята за позитивный контроль. Кроме того, изучена метаболическая активность этих дрожжей, изменяющаяся при воздействии облучения, методом радиометрии; описаны морфозы колоний.

При оценке активности вещества как мутагенного фактора, усиливающего частоту морфозов в растительных организмах использовали семена фасоли P. vulgaris и пшеницы T. durum. Определяли всхожесть, частоту морфозов, морфометрические параметры роста и развития (Гарипова Р.Ф. Патент на изобретение RU № 2322669). Для оценки фитотоксичности почв ЗПО ОГХК применили методику биотестирования, рекомендованную СанПиН 2.1.7.573-96 и его модификацию. В качестве тест-объектов растительного происхождения использованы: редис R. sativus сорта красно-розовый с белым кончиком, пшеница T. aestivum сортов Людмила, Саратовская 59. Протестированы водные вытяжки (1:5) из 10 образцов почв исследуемой территории. В модельном эксперименте использовали максимальную концентрацию (max) солей меди, цинка и никеля, известную по результатам определения валового содержания этих элементов в почвах (модель-2).

При проведении экспериментов по выявлению отдаленных эффектов воздействия вещества на животные организмы применили методики и статистическую обработку результатов, описанные Ю.А. Ивановым и О.Н. Погорелюк (1990). Использованы китайские хомячки C. griseous в репродуктивном возрасте (от 3-х мес.). В организм самцов и самок вещество вводили с пищей, ежедневно, из расчета 0,2 мл/кг массы животного в двух экспозициях - 10 и 30 дней. Учитывали особенности внешних изменений, отклонения в поведении, характер летальности. Животных после гибели вскрывали для патологоанатомического анализа. Первую опытную группу составляли 10 животных обоих полов, которые получали сточные воды ЕСР в объеме 2 мл в течение 30 дней. В эксперименте определяли влияние вещества на жизнеспособность животных. Во втором опыте в трех повторностях определяли влияние вещества на плодовитость самок в перекрестных скрещиваниях с тремя самцами; в эксперименте три самки получали сточные воды ЕСР в объеме 2 мл в течение 10 дней, через 2,5 месяца их спаривали с самцами, не индуцированными сточными водами. В третьем опыте в трех повторностях три интактные самки спаривались с тремя экспериментальными самцами, получавшими сточные воды в объеме 2 мл в течение 10 дней. Действие сточных вод на репродуктивность самок наблюдали после проверки на плодовитость по последним трем пометам в перекрестных скрещиваниях с тремя самцами. Для определения характера токсичности сточных вод применен пробит-анализ. Определили показатели токсичности при разовом и хроническом введении вещества в организм животных. Китайским хомячкам вводили возрастающие дозы сухого остатка сточных вод. Исследовались дозы: 600, 800, 900, 1000, 1400. Определялись ЛД116; ЛД150; ЛД184; ЛД1100. При разовом введении использованы 60 особей (по четыре самца на каждую дозу, 5 доз, 3 повторности). При хроническом введении животные получали ежедневно в течение недели препарат в дозе 1/10 ЛД50. Каждую неделю дозу увеличивали в два раза, при этом отмечали гибель животных, использованы 12 особей (по четыре самца, 3 повторности).

Обработка данных включала вычисление средней арифметической, ее стандартной ошибки, доверительного интервала для средней. Для расчета статистической значимости различия между группами были применены следующие критерии: критерий 2 Пирсона, F-критерий Фишера, параметрический t-критерий Стьюдента, непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Для оценки корреляционной зависимости использовалия коэффициент корреляции rS Спирмена. Для прогнозирования динамики загрязнения почв в зоне влияния выбросов ОГХК использовали регрессионный анализ, для выявления тенденций взаимовлияния потенциальных токсикантов - корреляционный анализ. Обработка данных и построение диаграмм проведены с помощью программы Excel и статистического пакета «Statistics».

Экспериментальная работа выполнена в период 1989-2006 гг. Анализ химического состава сточных вод, почв, растений выполнен в разные годы в лабораториях агрохимцентра «Оренбургский», «Оренбурггеология», «Волгогипрозем». Все эксперименты на дрожжах, растениях и китайских хомячках проведены на базе лабораторий Оренбургского ГАУ. Тест в системе Эймса проведен при участии сотрудников лаборатории физико-химии биомембран при биофаке МГУ им. М. Ломоносова к.б.н. В.М. Глазером и Л.И. Степановой.

Глава 3. Экоанализ микроэлементного загрязнения сточных вод, почв, растений ЗПО ОГХК. В таблицах 1 и 2 приводится химический состав сточных вод ОГХК, в том числе микроэлементный. В избытке в сточных водах присутствуют ионы Na и Cl (на 30%), наблюдается колебание показателей минерализации (на 17%), содержания одновалентных ионов K++Nа+ (на 29%) и сульфатов (на 17%) по годам в сторону превышения ПДК. Из общего количества солей 31% приходится на Ca(HCO), 21% - NaCl, 18,8% - NaSO, 14,4% - Mg(HCO) и 14% - NaHCO. Орошение сточными водами данного химического состава негативно влияет на химизм почв (Калиев и др., 1993, 1995, 1997, 1998, Блохин, 1997; Блохин, Грошев, 2003). Наиболее токсичные соли - NaCl и NaSO - составляют 40,6%; на фоне небольших запасов солей присутствие солей натрия в таком количестве указывает на потенциальную фитотоксичность почв ЗПО. В целом орошаемые сточными водами почвы охарактеризованы как незасоленные, но с тенденцией к хлоридно-сульфатному типу засоления. Общее количество солей оценено как не достигшее критического уровня.

Таблица 1. Химический состав сточных вод и допустимые концентрации для поливных вод ЗПО, мг/л

pH

Сухой остаток

Ca

Mg

K++Nа+

NО3-

NО2-

HCO3-

CО3-

SO4-2

Cl-

NH-4

Минера-лизация

Среднее по годам

7,26

±0,77

1649

±154,7

99,2

±15,8

43,6

±16,6

517

±197,0

0,38

±0,66

0,66

±0,05

180,9

±4,3

4,9

±0,7

470,7

±128,3

432,8

±73,8

1,6

±1,8

1751,2

±305,2

ДК для с.-х.

культур*

5,5-7,5

2500

500

300

400

0,50

-

350

75

400

350

-

1500

В таблице даны средние значения и доверительные интервалы среднего при = 0,05;

* - допустимые концентрации по Новикову В.Ф. и Додолиной В.Т., 1974

Таблица 2. Среднее содержание металлов в сточных водах ОГХК и допустимые концентрации, мг/л

МЭ

Среднее

по годам

ПДКв

ПДКр.х.

МЭ

Среднее

по годам

ПДКв

ПДКр.х.

Cu

Zn

Pb

Ni

Co

Cr

0,058±0,035

0,031±0,020

0,007±0,050

0,050±0,033

0,003±0,002

0,015±0,011

1,33

1,33

0,013

0,026

0,13

0,67

1,0

1,0

0,01

0,02

0,1

0,5

0,001

0,01

0,06

0,01

0,01

0,07

Мо

Sn

Ba

Sr

Мn

0,005±0,002

0,003±0,001

0,033±0,006

0,330±0,568

0,346±0,558

0,33

0,13

0,91

9,10

0,13

0,25

0,1

0,7

7,0

0,1

0,001

0,112

0,74

0,4

0,01

В таблице даны средние значения и доверительные интервалы среднего при = 0,05;

*С- расчетный показатель с учетом эвапотранспирации и оросительной нормы по СанПиН 2.1.7.573 – 96; ГН 2.1.5.1315-03;

жирным шрифтом выделено превышение по ПДКр.х. (по: «Нормативам качества воды…», 2010).

По микроэлементному (МЭ) составу по ПДКр.х сточные воды регламентированы для использования по Cu, Zn, Ni, Pb, Mo («Нормативы качества воды…», 2010), а по ПДКв (ГН 2.1.5.1315-03) - только по Ni. В течение всего времени наблюдений качество сточных вод существенно не менялось. Относительно концентраций металлов в почвах 1980 г. (по ретроспективным данным) к 1991 г. орошение сточными водами привело к увеличению содержания Zn в два раза, Pb в три раза, концентрации остальных металлов снижены или изменились незначительно. К 1998 г. относительно 1991 г. наблюдали завышенную концентрацию Ni (в 2,7 раза), остальные МЭ не накапливались выше контроля. Динамика изменения содержания металлов в почвах ЗПО в период 1980-1998 гг. показана на рисунке 1.

Рис.1. Динамика изменения содержания металлов в почвах ЗПО

в период с 1980 по 1998 гг.

Концентрация МЭ в растениях в 1980 году на 1-2-3 порядка ниже их содержания в почвах. К 1991 г. концентрация большинства МЭ в растениях увеличилась на 2 порядка относительно тех же МЭ 1980 г. Содержание МЭ в кормах с ЗПО превосходило временный допустимый уровень (МДУ по СанПиН 2.1.7.573 - 96) по меди в 1,7 раза, по цинку - в 4,4 раза, по свинцу – в 2,5 раза, по никелю – в 18 раз, по кобальту – в 4,8 раза; по хрому – в 155,8 раза, по молибдену - в 2 раза. В 1980 г. наибольшие значения коэффициента биологического поглощения (КБП) выявлены по Cu, Pb, Mo, Sr. В 1991 г. КБП увеличен по всем элементам, в наибольшей степени по Cu, Zn, Mo, Ni, Ba (рис. 2). Зависимость валового содержания Cu, Zn, Pb, Ni, Mn, Mo в кормах ЗПО ОГХК от их концентрации в почве выражалась коэффициентом корреляции, равным 0,83. Систематическое использование сточных вод для орошения привело к формированию особого микроэлементного режима в почвах, в результате которого, при незначительной (с позиции существующих ОДК для почв) их кумуляции, изменилась активность поглощения растениями всех металлов.

Рис.2. График изменений коэффициента биологического поглощения

металлов из почв растениями ЗПО в период 1980-1998 гг.

При этом, по нашим наблюдениям, повышение КБП в 1991 г. сочеталось со снижением концентраций большинства металлов в почвах. Фитодетоксикация почв ЗПО сдерживала накопление металлов и в 1998 г. Однако, в этот год зафиксировано превышение содержания никеля относительно ОДК (по ГН 2.1.7.020-94).

Так как КБП является критерием биологической активности элемента, мы склонны предполагать, что основными носителями повреждающего действия являются металлы с высоким значением этого показателя и их антагонисты. Из вышеперечисленных компонентов сточных вод ОГХК никель и медь являются наиболее активными агентами в режиме конкуренции при комплексообразовании с различными лигандами в биосредах. Присутствие металлов-антагонистов в средах усиливает их токсичность. Из полученных нами данных за 1998 гг. по валовому содержанию металлов в почвах ЗПО обращает на себя внимание концентрация солей никеля; ее среднее значение составляет 164 мг/кг, что превосходит ПДК, принятые в странах Европы более чем в 3 раза, ОДК, утвержденные Госкомсанэпиднадзором России (ГН. 2.1.7.020-94) - в 2 раза. По подвижным формам солей металлов концентрация солей никеля в разных образцах почв ЗПО ОГХК составляет от 0,97 до 1,41 мг/кг. Почвы ЗПО ОГХК характеризуются повышенной щелочностью. Слабо подвижный в кислых почвах никель, при pH = 6,7 и ниже образует плохо растворимый оксид никеля, выпадающий в осадок. В щелочной среде при рН = 7,59,5 никель переходит в подвижные, крайне токсичные формы (Бандман и др., 1989).

Таким образом, действие антагонистов никеля и щелочность раствора определяет степень токсичности никеля.

По результатам статистической оценки поведения металлов в различных средах с использованием коэффициента корреляции rS Спирмена сделано следующее заключение:

1. В ассоциированных по точкам отбора образцах растений и почв отмечается тривиальная (высокая положительная) корреляционная зависимость концентрации большинства металлов от концентрации меди в тканях. Это подтверждает гипотезу о высокой деполяризующей клеточные мембраны активности меди, что ведет к усиленному накоплению прочих металлов (и др. токсинов) в растениях.

2. Выявлена высокая положительная корреляция содержания конкретного металла в растениях от его концентрации в почве по хрому, умеренная положительная – по свинцу и никелю, высокая отрицательная – по меди, умеренная отрицательная – по цинку и олову. Таким образом, первичный барьер на пути поглощения металлов из почвенного раствора преодолевается доступными формами меди, цинка, олова, вслед за которыми в ткани растений проникают хром, никель, свинец.

3. Отмечена умеренная положительная корреляция между содержанием меди и концентрацией цинка в почвах, отрицательная умеренная корреляция проявилась в ряду: никельсвинец<хром. Можно предположить, что, находясь в почвах, медь и цинк могут проявлять сходное активное действие на растения (аддитивность, синергизм); проникновение никеля, свинца, хрома опосредовано действием меди, например, это могут быть условия нарушенного медью транскорневого потенциала растений.

На основе выше представленных рассуждений и ряда констант устойчивости образуемых металлами комплексных соединений по Меллор и Мели: Hg>Cu>Ni>Pb>Co=Zn>Cd>Fe>Mn>Mg в модельных экспериментах нами была запланирована и проведена проверка гипотезы о вероятном риске формирования токсичного никелевого фона в почвах при поливе сточными водами ОГХК, а также предположения об усилении повреждающего действия никеля в присутствии его антагонистов (меди и цинка) и «автономного» компонента (олова), склонного к накоплению в тканях животных организмов.

Из проведенного экологического анализа состояния почв и растений ЗПО сделано следующее заключение:

  1. динамика изменений микроэлементного состава почв и кормов ЗПО сводится к кумуляции металлов в почвах корнеобитаемого слоя и загрязнению кормовых растений;
  2. прогнозируется риск загрязнения почв ЗПО никелем и хромом при продолжении техногенного воздействия;
  3. причиной микроэлементного загрязнения являются не только сточные воды ОГХК, но и особенности химии почвообразующих пород, поэтому следует признать, что дальнейшее использование ЗПО ОГХК для получения кормов недопустимо;
  4. для проведения модельных экспериментов по критерию биологического поглощения и ряду констант устойчивости выбраны соли никеля и его антагонистов (меди, цинка). Олово выбрано как независимый по отношению к никелю и меди компонент, способный к накоплению в клетках животных;
  5. хром в почве и в растениях находится в виде низкомолекулярного комплекса, не связанного с субклеточными структурами, а также проявляет инертность в биологических реакциях в щелочной среде, поэтому соединения этого элемента не рекомендованы для проведения модельных экспериментов.

Глава 4. Биотестирование с использованием методов экогенетической оценки сточных вод, водных вытяжек почв ЗПО ОГХК и их компонентов.

Определение генотоксичности сточных вод в тесте Эймса. Для первичной оценки мутагенности сточных вод ОГХК использован просеивающий метод Эймса сальмонелла/микросомы, который позволяет вести учет генных мутаций у Salmonella typhimurium. В экспериментах в качестве позитивного контроля использовали 2-аминоантрацен - мутаген, достоверно индуцирующий мутации при метаболической активации монооксигиназной системой печени крыс, в обычном контроле - дистиллированную воду. Усредненные пробы сточной воды были отобраны в двух точках: 1 – биологически очищенный сток (БОС), поступающий в ЕСР; 2 – поверхностные пробы воды (с глубины  20-30 см) из емкости сезонного регулирования (ЕСР). По химическому составу воды этих уровней не имеют значимых отличий (р>0,05) (рис. 3).

По результатам двух опытов слабую мутагенность (-МА) на штамме  S. typhimurium ТА 98 проявили пробы с точки 2. Значения показателей по пробам с точки 1 находились в пределах фона. Следовательно, сточные воды ОГХК содержат в составе компонентов химические соединения, обладающие мутагенной активностью; концентрация мутагенного агента в сточных водах, поступающих в ЕСР, недостаточна для индуцирования реверсий у штаммов S. typhimurium ТА 98, ТА 100. Генотоксичность сточных вод из ЕСР оценивается в 1 балл. Таким образом, выявляется склонность мутагена накапливаться с течением времени по мере поступления в ЕСР. В условиях метаболической активации генотоксичность сточных вод снижается. По полученным данным можно судить о характере компонентов, входящих в исследуемые образцы сточных вод. Тяжелые металлы действуют отлично от действия других мутагенов и канцерогенов, так как им не нужна метаболическая активация для проявления генотоксичности, и свободный или комплексный ион является основной формой мутагена или канцерогена (Mccann,Yamasaki, Ames, 1975; Кожанова, Дмитриева, цит. по: Физиология растительных организмов и роль металлов, 1989). В исследуемом поликомпонентном растворе прослеживается характерная для металлов форма генотоксичности. Ослабление действия раствора при метаболической активации можно объяснить появлением хелатных соединений, которые нейтрализовали ионы генотоксичных металлов. Металлоорганические комплексы могут образовываться в ходе эксперимента при активации микросомальной фракцией S-9.

Рис.3. Микроэлементный состав сточных вод ОГХК

Цитогенетический анализ на корневой меристеме лука Аllium сера.

Пробы отбирали в трех точках: 1 - БОС, поступающий в ЕСР; 2 - поверхностные воды ЕСР (с глубины 20-30 см); 3 – вода придонного уровня ЕСР. В качестве контроля использована дистиллированная вода.

По результатам ЦГА, сточные воды не вызывали грубых хромосомных аномалий. Выявлены увеличение числа клеток с нарушениями в митозе (в сумме на 1000 анафаз приходилось более двух нарушений, т.е. проявлялся слабый мутагенный эффект) и значительные изменения показателя митогенности (MI) относительно контроля (отмечено стимулирование митотической активности меристемной ткани в два и более раз).

В модельном эксперименте использованы соли никеля, меди, цинка в дозах в 0-10-100 раз превышающих концентрацию в сточных водах (табл.4). По результатам модельного эксперимента в клетках корневой меристемы лука не выявлены хромосомные и геномные мутации. По исследованным компонентам сточных вод ОГХК в дозах: медь углекислая - 5 мг/л; никель углекислый - 7 мг/л; цинк двухлористый - 10 мг/л наблюдали митотические нарушения по трем показателям (время, необходимое для мацерации; митотический индекс; число клеток с ядрышками более двух на 1000 клеток) (табл. 5). В меньших концентрациях не обнаружены статистически значимые различия относительно контроля или значимость различий выявлена по одному или двум показателям.

Таблица 4. Влияние сточных вод ОГХК на цитогенетические показатели в клетках корневой меристемы лука

Митотический индекс, ‰

Митотический

индекс к контролю, %

Число клеток с нарушениями

на 1000 клеток

Вариант

сточные  воды

контроль

полиплоидных

с отставаниями

хромосом

с фрагментами

хромосом

Пробы с точки 1

Пробы с точки 2

Пробы с точки 3

132,7±3,8*

192,3±4,2*

139,5±6,9*

34,5±2,2

97,9±5,6

28,6±4,7

384,4

196,0

487,7

0

2,28±0,06*

1,37±0,04*

0

4,55±0,02*

2,68±0,02*

0

0

0

В таблице даны средние значения и доверительные интервалы среднего при = 0,05;

уровни значимости различий между вариантом и контролем по t-критерию Стьюдента *р<0,001.

Таблица 5. Изменение цитогенетических показателей под влиянием

сточных вод ОГХК и солей никеля, меди, цинка

Вариант

Время,

необходимое для

мацерации

Митотический

индекс, ‰

Число клеток

с ядрышками

более двух на 1000 клеток

Контроль

3′17″± 0′06″

111,5±8,8

2,2±0,4

Пробы с точки 2

4′05′′±0′07″*

68,4±5,2*

25,1±3,0*

Пробы с точки 3

312±004

58,1±6,8*

21,80±4,2*

Медь углекислая, 5 мг/л

236±006*

78,2±6,3*

18,45±2,9*

Цинк двухлористый, 10 мг/л

342±005″*

89,1±4,9*

30,99±3,2*

Никель углекислый, 7 мг/л

1047±003*

52,4±6,7*

28,57±3,4*

Медь углекислая (5 мг/л) +

никель углекислый (7 мг/л)+

цинк двухлористый (10 мг/л)

223″±006″*

38,4±6,2*

42,2±4,1*

В таблице даны средние значения и доверительные интервалы среднего при = 0,05;

уровни значимости различий между вариантом и контролем по t-критерию Стьюдента *р<0,001; остальные значения p>0,1

Во всех вариантах с максимальной концентрацией солей меди, никеля и цинка наблюдали снижение показателей митотического индекса и увеличение числа ядрышек. Корешки, полученные на фоне повышенной концентрации меди, легче подвергались мацерации, а, следовательно, корнеобразование протекало в условиях измененного режима синтеза клеточной оболочки и межклеточного пространства. Это, безусловно, отражается на транспортной функции мембран и функциональности корневой системы. Следствием нарушения избирательности поглощения окружающего раствора клеточными мембранами на фоне токсичных концентраций меди может являться усиление всасывающей способности корня. Корешки, полученные в условиях воздействия никеля, мацерировались при более длительной экспозиции, чем в контроле, при этом время мацерации увеличивалось в 3 раза (до 10 мин. 4 сек при максимальной концентрации никеля относительно 3 мин. 17 сек в контроле). Это свидетельствует о формировании утолщенной клеточной оболочки клеток, уплотнении межклеточного пространства и блокировании всасывающей способности корня. Для растительных клеток характерно формирование клеточных контактов - плазмодесм, обеспечивающих межклеточный обмен веществ; при разрастании и уплотнении клеточной оболочки плазмодесмы разрываются, в результате межклеточные и межтканевые взаимодействия нарушаются, начинаются деструктивные изменения и некротизация отдельных участков ткани или органов.

Анализ статистически значимых токсических эффектов металлов в модельных экспериментах на меристеме лука показал, что:

- нарушения в потенциале клеточных мембран растительных клеток выявляются с дозы углекислой меди 5 мг/л и выражаются в сокращении времени мацерации до 2 мин 36 сек относительно контроля (3 мин 17 сек); с дозы двухлористого цинка 10 мг/л и выражаются в увеличении времени мацерации до 3 мин 42 сек, с дозы углекислого никеля 0,7 мг/л и выражаются в увеличении времени мацерации до 10 мин 4 сек;

- изменения в митотической активности ткани фиксируются с дозы углекислой меди 0,5 мг/л, при этом митотический индекс снижается до 98,6‰ относительно показателя в контроле (111,5‰), с дозы двухлористого цинка 10 мг/л, при этом значение снижается до 89,1‰, с дозы углекислого никеля 7 мг/л, при этом значение снижается до 52,4‰;

- компенсаторные метаболические реакции (увеличение числа ядрышек) проявляются с дозы углекислой меди 5 мг/л, с дозы двухлористого цинка 1 мг/л, с дозы углекислого никеля 0,7 мг/л.

Синергичный токсический эффект меди, цинка и никеля на мембранный потенциал выявлен при комбинации: медь углекислая (5 мг/л) + никель углекислый (7 мг/л) + цинк двухлористый (10 мг/л). При этом выявлено увеличение числа клеток с ядрышками более двух в 19 раз, снижение показателя митотической активности ткани в 2,9 раза относительно контроля. В той же комбинации подавляется митотическая активность ткани. Компенсаторные метаболические реакции в этом варианте начинают выявляться при дозах в 100 раз меньших.

Таким образом, можно допустить, что разряжение ткани, достигнутое воздействием меди, способствовало проникновению никеля и цинка в активную зону корешка, где наблюдалось максимальное угнетение митотического деления и мобилизация синтетических процессов. Усиление метаболизма в индуцированных токсикантами тканях мы связываем с синтезом стрессовых белков, мобилизацией металлотионеинов, что согласуется с данными Riordan, Richards, 1980; Степановой, Ильина, 1982; Skujns, McDonald, Knight, 1983; Webb, 1987; Wormster, Calp, 1988; Дубиной, 1989; Sideris, 1989; Кожанова, Дмитриева, 1989. Ни один из компонентов модельного эксперимента, взятых в токсичных дозах, не индуцировал генетические нарушения на корешках лука. Но в отдельности, и особенно при совместном влиянии на ткань корневой системы, соли никеля, меди и цинка изменяли митогенность ткани, усиливали белковый синтез в клетках. Исходя из эмпирического и теоретического источников, следует, что усиленное поглощение меди из субстрата корневой системой и локализация его в растениях связано с повышенной биогенной активностью элемента. Никель и цинк накапливаются в почвах по причине меньшей проникающей способности в сравнении с солями меди. Отсюда неблагоприятное соотношение Сu/Ni и кумуляция цинка в орошаемых почвах. Концентрация меди в почвах ЗПО способна нарушить барьерный потенциал корневой системы и вызвать накопление прочих токсикантов в тканях и, следовательно, являться проводником и индуктором предмутационных событий в растительных тканях.

По результатам ЦГА водных вытяжек почв на корневой меристеме лука в 70% вытяжек наблюдали увеличение митотического индекса (МI) на 14-75% (табл. 6). В вытяжке 5 выявлялась цитотоксичность в снижении МI на 20%; в вариантах 9, 10 в подавлении корнеобразования. Таким образом, изученные среды способны вызывать нарушения веретена деления. Корреляция между ядрышковым тестом и содержанием подвижных металлов в образцах почв составила: Cu – 0,24; Zn – 0,79; Ni - 0,54; Pb - 0,54; Cr - 0,22 (принято условие: rS 0,25 – слабая корреляция; rS = 0,260,74 – умеренная; rS 0,75 - сильная). На препаратах, полученных при проращивании в водных вытяжках почв, кроме вариантов 3, 8, обнаружены клетки, содержащие более двух ядрышек в ядре. Последнее свидетельствует о том, что в клетках имеет место повышенная синтетическая активность. Наибольшее число таких клеток наблюдали в вариантах 1, 5, 6. Повышенная синтетическая активность клеток сопровождает большинство цитопатологических процессов, так как подобный синтез включает синтез стрессовых белков и белков, блокируемых экзотоксинами. Это явление оценивается нами как состояние сенсибилизации. Мутации фиксировали в вариантах 1, 6. Наблюдали нарушения митоза типа отставаний хромосом в анафазе, асимметричное расположение хромосом в анафазе, разброс хромосом в метафазе. Положительная корреляция между митотической активностью и содержанием подвижных металлов в образцах почв зафиксирована по меди и составила - 0,46; никель и цинк проявили отрицательную корреляцию (-0,66 и -0,34 соответственно); по остальным металлам корреляция не обнаружена. По корреляционным зависимостям, стрессовый сверхсинтез белка может быть обусловлен интенсивным поступлением цинка, никеля и свинца, а повышенная митотическая активность ткани – медью. При этом никель и цинк ингибируют митоз, что можно объяснить перераспределением энергетических ресурсов клеток (ткани, организма) на синтез металлотионеинов. Как известно, в момент стресса подавляется синтез метаболических белков, следовательно, подавляется и рост, и размножение клеток (Riordan, Richards, 1980; Степанова, Ильин, 1982; Skujnњ, McDonald, Knight, 1983; Webb, 1987; Wormster, Calp, 1988; Дубина, 1989; Sideris, 1989; Катрич, цит. по: Физиология растительных организмов и роль металлов, 1989).

Таблица 6. Результаты тестирования сред на цитотоксичность

и мутагенную активность в фитотесте A. cepa

Вариант

Изменения на 1000 клеток

более двух

ядрышек

мутации*

MI в %

к контролю

1.

Контроль

1,2±0,02

0

100

2.

№1

50,1±4,06*

1,90±0,04*

114±6,3*

3.

№2

5,5±1,02*

0

175±5,8*

4.

№3

0*

0

153±7,9*

5.

№4

6,0±1,0*

0

130±4,9*

6.

№5

58,2±4,0*

0

80±8,2*

7.

№6

76,3±3,1*

6,19±0,01*

141±7,7*

8.

№7

22,3±4,5*

0

157±7,4*

9.

№8

0*

0

119±5,9*

10.

№9

подавление корнеобразования

11.

№10

подавление корнеобразования

12.

Cu (min)

подавление корнеобразования

13.

Zn (min)

43,4±6,3*

0

141±9,2*

14.

Ni(min)

подавление корнеобразования

15.

Cu+Zn+Ni (min)

2,7±0,04*

0

63±7,0*

16.

Cu (max)

подавление корнеобразования

17.

Zn (max)

подавление корнеобразования

18.

Ni (max)

подавление корнеобразования

19.

Cu+Zn+Ni (max)

подавление корнеобразования

В таблице даны средние значения и доверительные интервалы среднего при = 0,05;

уровни значимости различий между вариантом и контролем по t-критерию Стьюдента *р<0,001.

По результатам ЦГА водных вытяжек почв, на корневой меристеме пшеницы на сорте Людмила выявили повышение МI в 80% вытяжек и в вариантах Cu (min), Zn (min); ингибирование МI - в 20% и в вариантах Ni (min), Cu+Zn+Ni (min), Cu (max), Zn (max), Cu+Zn+Ni (max). Мутации фиксировали в 20% вытяжек и варианте Cu+Zn+Ni (min); подавление корнеобразования в варианте Ni (max). На сорте Саратовская 59 стимуляция митотической активности выявлялась в 70% образцов почв; ингибирование - в 10% и в вариантах Cu (max), Zn (max), Cu+Zn+Ni (max); приближены к контролю в вариантах 5, Cu (min), Zn (min), Ni (min). Мутации фиксировали в вариантах 7, Cu+Zn+Ni (min), подавление корнеобразования в вариантах 8, Ni (max). Практически во всех вариантах водных вытяжек почв при тестировании на пшенице отмечено увеличение числа клеток, содержащих более двух ядрышек в ядре, подавление или усиление митогенности ткани. По результатам модельных экспериментов на том же объекте можно заключить, что в почвах ЗПО содержится концентрация солей, которая, в потенциале, может вызвать насыщение растений мутациями и формировать в популяции растений дополнительный мутационный груз.

Оценка мутагенности сточных вод ОГХК в тестах на соматический мозаицизм и сцепленные с полом рецессивные летальные мутации на дрозофиле. Тест на соматический мозаицизм по крыловым маркерам – flr и mwh заключался в учете частоты одиночных и двойных пятен, фенотипически проявляющихся в изменении формы и числа щетинок. Результаты тестирования сточных вод  приведены в таблице 7 вместе с результатами модельного эксперимента. По данным тестирования выявлено, что сточные воды являются индукторами мутаций типа нерасхождений хромосом, что определяется по увеличению частоты характерных flr–пятен. Ту же мутацию наблюдали в варианте концентрация Ni+Cu+Sn, превосходит в 100 раз. Идентичность нарушений, вызываемых сточными водами и исследованными солями тяжелых металлов, показывает, что основу генетической активности сточных вод составляют именно тяжелые металлы.

Таблица 7. Действие сточных вод и солей Ni, Cu, Sn на частоту

возникновения соматических мутаций и рекомбинаций у дрозофилы

Вариант

Количество пятен на крыло

одиночных

двойных

всего

mwh

flr

mwh/flr

Контроль

Сточная вода ЕСР

Ni, превосходит в 100 раз

Cu, превосходит в 100раз

Sn, превосходит в 100 раз

Ni+Cu+Sn, превосходит в 100 раз

Ni, превосходит в 10 раз

Cu, превосходит в 10 раз

Sn, превосходит в 10 раз

Ni+Cu+Sn, превосходит в 10 раз

Ni, не превосходит

Cu, не превосходит

Sn, не превосходит

Ni+Cu+Sn, не превосходит

0,06±0,03

0,05±0,03

0,04±0,01

0,06±0,03

0,04±0,02

0,04±0,03

0,04±0,01

0,06±0,04

0,06±0,02

0,04±0,01

0,06±0,01

0,04±0,03

0,05±0,04

0,05±0,03

0,24±0,05

0,35±0,04*

0,31±0,07

0,24±0,06

0,32±0,03

0,36±0,05*

0,23±0,02

0,22±0,03

0,24±0,01

0,24±0,03

0,23±0.04

0,23±0,02

0,24±0,05

0,23±0,03

0,04±0,02

0,02±0,02

0,01±0,03

0,03±0,01

0,01±0,04

0,03±0,02

0,04±0,02

0,02±0,03

0,04±0,07

0,04±0,02

0,04±0,06

0,03±0,01

0,06±0,03

0,06±0,01

0,34±0,05

0,42±0,06*

0,36±0,03

0,33±0,05

0,37±0,07

0,43±0,04**

0,31±0,04

0,30±0,03

0,34±0,01

0,32±0,05

0,33±0,05

0,30±0,06

0,35±0,04

0,34±0,04

В таблице даны средние значения и доверительные интервалы среднего при = 0,05;

уровни значимости различий между вариантом и контролем по t-критерию Стьюдента *р<0,05; **р<0,02; остальные значения - p>0,1.

Второй тест на выявление частоты сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций (СПРЛМ) выявил способность сточных вод индуцировать небольшое число леталей (3%) (табл. 8). Следовательно, сточные воды ОГХК генетически активны по отношению к генеративным клеткам животных. По последним двум тестам, сточные воды ОГХК характеризуются как мутагены малой интенсивности, оказывающие слабый эффект геномных и генных мутаций на объекты животного происхождения. При совместном действии солей никеля, меди и олова в дозе, не превышающей концентрацию в сточной воде, выявлена небольшая частота СПРЛМ (в контроле - 0, в опыте -1,6%). Соли никеля и меди в дозах, превосходящих концентрацию в сточной воде в 10 раз, также индуцировали СПРЛМ с частотой 8,0% и 2,5% соответственно. Соли олова не проявили мутагенности ни в одной из испытанных концентраций. По результатам модельного эксперимента выявлено, что никель и медь являются элементами, несущими основу генетической активности сточных вод ОГХК. Мутагенная активность сточных вод основана на взаимодействии ряда компонентов. В частности, наблюдали аддитивный эффект никеля и меди при формировании цитогенетического нарушения в животной клетке. Роль олова отразилась лишь в формировании общего токсичного фона, на основе которого происходят мутации.

Таблица 8. Действие сточных вод и солей Ni, Cu, Sn на частоту СПРЛМ

Вариант

СПРЛМ,%

Контроль

0

Сточная вода

3±1,5*

Ni, превосходит в 100 раз

абсолютная летальность

Cu, превосходит в 100 раз

абсолютная летальность

Sn, превосходит в 100 раз

абсолютная летальность

Ni+Cu+Sn, превосходит в 100 раз

абсолютная летальность

Ni, превосходит в 10 раз

8,0±1,4**

Cu, превосходит в 10 раз

2,5±1,2*

Sn, превосходит в 10 раз

0

Ni+Cu+Sn, превосходит в 10 раз

абсолютная летальность

Ni, не превосходит

0

Cu,не превосходит

0

Sn, не превосходит

0

Ni+Cu+Sn не превосходит

1,6±0,7*

В таблице даны средние значения и доверительные интервалы среднего при = 0,05;

уровни значимости различий между вариантом и контролем по t-критерию Стьюдента *р<0,05; **р<0,001.

Исходя из представленных данных, в тестах на дрозофиле основу мутагенности сточных вод ОГХК и почв ЗПО (их водных вытяжек) составляют соединения никеля и меди.

В таблице 9 приведены результаты тестирования сточных вод ОГХК на мутагенность. Сточные воды ОГХК в системе оценок на мутагенность определены как слабые мутагены, с тенденцией усиления эффекта повреждающего действия по мере повышения концентрации компонентов.

Таблица 9. Мутагенность сточных вод ОГХК в различных тест-системах

Тип

нарушения

Система проверки

Наличие

эффекта

Генные

Бактериальный тест Эймса

без метаболической активации (-МА)

с метаболической активацией (+МА)

Сцепленные с полом рецессивные летальные мутации (СПРЛМ)

+

-

+

Хромосомные

ЦГА на меристеме корешков лука

-

Геномные

ЦГА на меристеме корешков лука

Соматический мозаицизм по крыловым маркерам на дрозофиле

+

+

Таким образом, с течением времени пробы воды из ЕСР, особенно придонные, при оценке на мутагенность будут проявляться как более интенсивный мутагенный фактор окружающей среды. Экстраполяция данных, полученных в классических тестах на выявление мутагенности сред, насыщенных солями тяжелых металлов, позволяет прогнозировать в условиях исследованного МЭ-загрязнения насыщение генофонда почвенной фауны, микрофлоры, растений генетическим грузом. Следствием такого воздействия могут быть нарушение плодородия почв, появление новых форм насекомых-вредителей, патогенов растений и животных.

Глава 5. Биотестирование с использованием методов эпигенетической оценки сточных вод, водных вытяжек почв ЗПО ОГХК и их компонентов.

Малые дозы мутагена могут не вызывать грубых нарушений ядерных структур, при этом воздействие на активность генетического аппарата передается через изменения в биоструктурах цитоплазмы и внутриклеточной регуляции, т.е. слабые дозы мутагенов могут индуцировать эпигенетическую изменчивость, которая обуславливает появление новых фенотипов и определяет тенденции развития популяции. Известно, что эпигенетическая изменчивость наследуется. Если она не связана с появлением слабых, элиминирующихся фенотипов, то может быть обратимой. Возврат к прежнему фенотипу возможен при оптимизации условий существования популяции. Эпигенетическая изменчивость может быть обусловлена действием не мутагенных, но сенсибилизирующих факторов (Васильев, 1988-2009; Falls, Pulford, Wyhe, Jirtle, 1999; Chandler, Eggleston, Dorweiler, 2000; Голубовский, 2000; Чураев, 2000; Назаренко, 2002; Жерихин, 2003; Ванюшин, 2004; Шишкин, 2006; Bird, 2007; Chandler, 2007; Жерихин, Пономаренко, Расницин, 2008 и др.). Следовательно, индукторы подобной изменчивости могут составить основу эффектов последействия, фиксируемых в ходе онтогенеза и в процессе развития популяции (отдаленные популяционные эффекты). И.Б. Бычковской (1986) впервые на обширном экспериментальном материале было описано явление нестохастической наследуемой клеточной летальности. Эффект проявлялся при воздействии слабых доз ионизирующей радиации, повышенных температур и некоторых химических веществ в культуре одноклеточных. Позже группой ученых были получены данные об индукции такой летальности в тканях животных и человека (Бычковская, Степанов, Кирик, 2003; Бычковская, Федорцева, Антонов, Алексанин, 2006; Бычковская, Федорцева, Антонов, Долинский, 2007; Бычковская, Егорова, Иголкина, Федорцева, 2007). Это явление было применено нами при разработке способов и принципов оценки поллютантов как индукторов эпигенетической изменчивости. Экспериментальные данные вышеперечисленных авторов получены в одно время с нашими результатами, что подтверждает объективность и логичность экстраполяции данных с одноклеточных на многоклеточные организмы, а также обусловленность прогнозирования отдаленных эффектов воздействия индукторов с использованием экспресс-диагностики.

Исследование наследуемой клеточной летальности гаплоидных и диплоидных форм дрожжей-сахаромицетов. На уровне диплоидных дрожжевых клеток рассматриваемый эффект выражается в снижении выживаемости клеток и сокращении размеров колоний в ряду пассажей (Бычковская, 1986; James, Werner, 1966; Williams, Frank, 1982; Yudin, 1981). В первых пассажах после индукции возникают колонии увеличенных размеров, при этом диаметры колоний варьируют в значительных пределах. Гипотетически, особенности процесса колониеобразования зависят от плоидности клеток, т.к. от плоидности зависит жизнеспособность индуцированных клеток. Вероятно, после воздействия малыми дозами мутагена диплоид-специфическая репарация способна восстановить жизнеспособность части поврежденных клеток, но не в состоянии полностью репарировать их репродуктивный потенциал. Клеточное опустошение приводит к возникновению колоний с измененными параметрами пространственного положения клеток и, как следствие, к повышению вариационной изменчивости размеров колоний, частоты морфозов. Последнее не характерно для колоний гаплоидов. У гаплоидов диаметры колоний сокращаются в первых же пассажах и отличаются однородностью размеров (Бычковская, 1986; Jensen P., Aцalstensson S., 1989).

Оценка токсичности сточной воды на организмах различной генетической организации проводилась с использованием дикого штамма дрожжей – S. cerevisiae - гаплоид и его γ-мутант-диплоид. Наблюдали выживаемость обработанных клеток и особенности колониеобразования по диаметрам макроколоний. В позитивных контролях, где выявлена реакция на повышенную температуру и гамма-облучение, наблюдали ингибирование роста колоний у гаплоидов и стимулирование – у диплоидов. В позитивном контроле, где в качестве индуктора нестохастической клеточной летальности представлена повышенная температура, гаплоиды и диплоиды проявляли признаки снижения выживаемости более чем на 50%. Сточные воды ОГХК проявили токсичность по отношению к дрожжам-гаплоидам. При этом летальность клеток достигала 47,7%, наблюдали сокращение размеров колоний (рис. 4). По отношению к дрожжам-диплоидам сточные воды малотоксичны, так как выживаемость снизилась незначительно, но имело место увеличение размеров колоний - первичное изменение в морфологии колониеобразования диплоидных дрожжей при летальности в поколении, вызванной слабой дозой мутагена. Морфометрическая реакция популяции на воздействие показана пунктиром на рисунке 4. Она проявлялась в первых же пассажах. В последующих пассажах эффект сохранялся, но у диплоидов признак увеличенных колоний убывал с течением времени.

Рис. 4. Распределение диаметров колоний дрожжей под влиянием сточных вод ОГХК: А.- дрожжи-диплоиды; Б. – дрожжи-гаплоиды

Увеличение размеров организмов в популяциях при воздействии малыми дозами мутагена часто объясняют стимулирующим эффектом агента (Тарасенко, 1980; Виленчик, 1987; Демченко, 1987; Москалев, 1991). В основе такого явления лежат деструктивные внутриклеточные изменения эпигенетического характера, известные как «плюс»-модификации (Раппопорт, 1984). По результатам наших исследований на дрожжах, дозы индукторов, вызывающие стимуляцию метаболических процессов, не исключают повреждения, ведущие к летальности в клеточных поколениях; следовательно, клеточное опустошение при тканеобразовании может сопровождаться морфозами, «плюс»-модификациями на растениях и животных.

Отдаленная гибель клеток, индуцируемая малыми дозами мутагена, обусловлена передачей скрытых летальных изменений в процессе клеточного размножения. По нашим исследованиям, такая форма эпигенетической изменчивости, как и другие ее формы, проявляется с момента компенсаторной реакции, что согласуется с представлениями этого явления Р.Н. Чураевым, (1992), М.Д. Голубовским (2000); Д.Л. Гродницким (2000), С.А. Назаренко (2002) и др.

Таким образом, для экологической безопасности значимость имеют не только события, связанные с явным накоплением генетического груза, но и явления, ведущие к нарушению метаболической активности клеток и, как следствие, к формативным аномалиям на уровне колоние-, ткане-, органообразования.

Исследование морфозов и морфометрических реакций, индуцируемых сточными водами и почвами ЗПО на растениях фасоли P. vulgaris, редиса R. sativus и пшеницы T. durum, T. aestivum. В эксперименте использованы пробы сточной воды: 2 – поверхностная вода из ЕСР; 3 - вода придонного уровня  ЕСР. Типичные морфофизиологические изменения у растений фасоли наблюдали с частотой 7,4% (в контроле - 2%), всхожесть семян составляла 63% к контролю. Наблюдаемые у растений фасоли снижение всхожести семян, значительное увеличение числа и разнообразия морфозов можно объяснить вторичными эффектами на основе наследуемой клеточной летальности (клеточного опустошения). При этом вес зеленой массы растений оказался увеличенным на 27% к контролю, т.е. стимуляция развития вегетативных органов сопровождалась всплеском разнообразных морфофизиологических аномалий.

Сточные воды на растениях пшеницы T. durum сорта Оренбургская 2 индуцировали морфозы с частотой 1,7%, всхожесть семян составляла 88% к контролю. При этом наблюдали один морфоз - нарушение синхронного развития колеоптиля и первого листа. Внешне данное изменение выглядело как образование первым листом спирали внутри колеоптиля, затем наблюдали разрыв колеоптиля и высвобождение деформированного первого листа (рис. 5). В норме колеоптиль разворачивается без нарушения целостности ткани и деформации первого листа.

Эффект соматической стимуляции представляет собой ряд ускоренных метаболических процессов, которые можно пронаблюдать на внутриклеточных, тканевых и органных уровнях. Малые дозы мутагена вызывают функциональные и структурные нарушения клеточных мембран, инактивацию некоторого числа ферментов протоплазмы. Затем включается режим сверхсинеза белка, направленный на создание защитного стрессового фона. Усиление синтетических процессов клетки приводит к увеличению притока питательных веществ (аттрагирующему действию меристем), ускоренному нарастанию объема клеток, повышению митотической активности ткани, стимуляции органогенеза. Все это сопровождается истощением внутриклеточных и системных ресурсов, предназначенных для обеспечения адаптивных реакций организма. Следствием стимуляции органообразования являются морфометрические и морфофизиологические нарушения. При этом, если морфометрические реакции обычно рассматриваются как проявления адаптивной нормы реакции, то морфозы отражают итог аномального развития организма, однако, и те, и другие эффекты могут индуцироваться одними и теми же факторами среды, а характер измененного фенотипа формируется в зависимости от степени поражения мишеней - молекулярных и клеточных структур. Таким образом, морфозы являются результативной формой проявления первичных, структурно-метаболических клеточных повреждений, в том числе, следствием аномального ускорения развития, результатом несоответствия между программой генома и условиями его реализации.

А.   Б.

       

Целью модельного эксперимента было определение функциональной роли никеля, меди и цинка в формировании морфозов и влияния на развитие первого листа и колеоптиля. Концентрации солей взяты в дозах, в 100 раз превосходящих концентрации в сточных водах ОГХК. По нашим результатам, морфоз «спираль» у пшеницы может быть индуцирован агентом, вызывающим ингибирование развития колеоптиля при нормальном развитии первого листа (никель, цинк), или агентом, вызывающим стимуляцию первого листа при обычном развитии колеоптиля (медь). На рисунке 6 показано влияние солей никеля, цинка и меди на стеблевой морфогенез. На гистограммах, построенных по средним значениям длины колеоптиля во всех вариантах, кроме варианта соль меди, показатели ниже контроля или не изменены. В целом изменчивость длин колеоптиля по средним показателям мало выражена (р>0,05). При этом статистически значимое изменение по среднему показателю обнаружено лишь в варианте соль никеля (р<0,05). По нашим наблюдениям, длина колеоптиля детерминирована генотипом и не может превосходить крайний максимальный показатель, но среда, влияющая на его линейный рост, может изменить характер распределения этого признака. Гипотетически, стимуляцию длины колеоптиля можно наблюдать по показателю его средней длины, только если все растения выборки одинаково реагируют на воздействие, формируя длину, приближенную к максимальной, что маловероятно, даже если выборка состоит из клонов.

Рис. 6. Влияние сточных вод, растворов солей никеля, меди, цинка,

комбинации солей на линейный рост проростков пшеницы.

В отличие от длины колеоптиля, другой показатель – длина стебля, - формирующийся с развитием автотрофного питания проростка и корневой системы, проявляет большую вариабельность признака при воздействии индукторов. Статистически значимое увеличение длин стебля зафиксировано в варианте соль меди (на 21%), подавление длин стебля – в вариантах: вода ЕСР поверхностный уровень (на 31%), вода ЕСР придонный уровень (на 24%), соль никеля (на 38%). Антагонистическое компенсаторное влияние оказала медь в комбинации трех солей, в результате показатель длины стебля статистически незначимо превосходил контроль, но не был подавлен ингибиторным влиянием цинка и никеля.

Для того, чтобы проследить за отдаленными патологиями воздействия агента на животных и человека, необходим длительный промежуток времени между моментом воздействия и искомым эффектом. Благодаря особенностям органообразования, растения оказываются удобным объектом для экспресс-анализа потенциальной способности вещества вызывать клеточное опустошение тканей и создавать основу морфозам.

В соответствии с методикой СанПиН 2.1.7.573-96, нами проведено определение фитотоксичности водных вытяжек почв на редисе R. sativus сорта красно-розовый с белым кончиком. Помимо измерения длины корня редиса, дополнительно нами учитывалась длина всего растения и длина стебля, определялась всхожесть семян, проведен модельный эксперимент. По данной оценке, все водные вытяжки почв ЗПО ОГХК, отобранные в 2000 году, обладают стимулирующими свойствами на показатели всхожести семян, роста и развития растений. Однако показатели длины стебля во всех вариантах водных вытяжек почв сократились, стимуляция корневого морфогенеза происходила в ущерб развитию надземной части растения. На рисунке 7 показано увеличение всхожести семян по всем водным вытяжкам почв относительно контроля на 5-25%.

Рис. 7. Всхожесть семян редиса относительно контроля в различных средах

(в нижней строке - % к контролю)

В модельном эксперименте тенденцию к стимулированию прорастания семян проявили варианты: Ni (min) – на 10%, Ni + Cu + Zn (min) – 4%, Cu (max) – 13%, Zn (max) – 8%; ингибировали или проявляли статистически незначимый подавляющий эффект варианты: Ni (max) – на 67%, Cu (min) – 2%, Zn (min) – 9%, Cu + Zn + Ni (max) – 6%. В варианте Cu + Zn + Ni (max) антагонистами компенсировалось негативное влияние никеля на всхожесть, при этом наблюдали повышение всхожести относительно варианта Ni (max) на 61%.

Всхожесть семян зависит как от внешних условий прорастания, так и от концентрации и активности фитогормонов в семени. В эксперименте наблюдали, что под влиянием водной вытяжки почв и растворов солей никеля, меди, цинка активируется резерв фитогормонов-стимуляторов прорастания. Последнее возможно при активации микроэлементами гидролаз, локализованных в эндосперме.

На рисунке 8 показано формирование линейных признаков роста и развития проростков под влиянием водных вытяжек почв и модельных растворов. В вариантах с водными вытяжками почв длина корня увеличена на 13-68%, длина стебля снижена на 16-45%. В варианте Cu (min) длина корня увеличена на 32%, Zn (min) – на 12%, Cu+Zn+Ni (min) – на 57%, Zn (max) – на 17%, при этом длина стебля в этих вариантах сокращена на 7-21%. В остальных вариантах выявлено одновременное подавление роста корня и стебля.

Рис. 8. Изменение линейных показателей роста редиса в различных средах

       

       Во всех вариантах наблюдали смещение линейных показателей роста и развития растений в сторону корневого морфогенеза. В фитогормональной системе за корневой морфогенез отвечают преимущественно ауксины, те же гормоны координируют фототропизм растений в момент прорастания. Следствием преимущественного распределения ауксинов в корне может являться усиление индукции корневого морфогенеза и ослабление фототропизма. А ослабление реакций фототропизма приводит к подавлению зеленения растений и нарушению ауксин-цитокининового баланса, необходимого для их нормального развития. Действие солей никеля на проростки выражалось в утолщении и огрублении корня. В комбинации Cu+Zn+Ni (max) формировались более эластичные  ткани корня и стебля. Преимущественную роль в процессе растяжения клеток играет ауксин; вероятно, в условиях воздействия солями меди этот гормон активируется и обеспечивает перераспределение ресурсов морфогенеза в сторону корневого роста.

Экстраполируя данные модельных экспериментов на результаты испытаний водных вытяжек почв, можно заключить, что концентрации и баланс никеля, меди и цинка в почвах ЗПО ОГХК влияют на органообразование в растениях. Исследована реакция двух сортов пшеницы T. aestivum Людмила и Саратовская 59. На сорте Людмила тенденцию к стимулированию роста колеоптиля проявили 90% вытяжек. Тот же эффект по длине 1-го и 2-го листа наблюдали в 40% вытяжек. Всхожесть семян снизилась в 30% вытяжек. В модельном эксперименте снижение всхожести наблюдали во всех вариантах, кроме Ni (max), Cu + Zn + Ni (max); ингибирование по длине 1-го листа – во всех вариантах; по длине 2-го листа – Cu (min), Zn (min), Cu + Zn + Ni (min), Zn (max). Из выше изложенного следует, что сорт Людмила отзывчив на широкий спектр концентраций меди и цинка. На сорте Саратовская 59 увеличение всхожести наблюдали в 20% вытяжек, в остальных - ингибирование. Стимуляцию роста колеоптиля наблюдали в 70% вытяжек, роста первого и второго листа - в 60%. Сравнение результатов тестирования вытяжек с данными модельного эксперимента позволило сделать вывод, что «плюс»–эффекты наблюдались в вытяжках, содержащих биологически активную форму меди.

Результатами биотестирования в фитотестах показано, что причиной повышенной биологической активности водных вытяжек почв исследованной территории является присутствие солей меди, цинка и никеля в цитотоксичных концентрациях. Эти три компонента проявляют аддитивный эффект при формировании признаков развития проростков; приоритетными индукторами морфозов являются соли никеля и меди, что доказано модельными экспериментами. Результаты исследований согласуются с данными по тестированию на мутагенность сточных вод ОГХК.

В экспериментах на растениях наблюдали проявления эпигенетической изменчивости на клеточном (структурно-метаболические нарушения, компенсаторные реакции), тканевом (изменение митогенности), органном (морфозы, некрозы) и организменном уровнях (изменения параметров роста и развития, летальность). Однако эпигенетическая изменчивость, прежде всего, рассматривается как результат взаимодействия генотипа с условиями его реализации и изучается как фактор эволюционного развития популяций. При этом именно стресс рассматривается как индуктор фенотипической изменчивости, ведущий к эволюции или элиминации популяции (Jablonka, Lamb, 1998; Гродницкий, 2001). Следовательно, разработка методов оценки популяционных реакций на техногенное воздействие является неотъемлемым компонентом прогнозирования последствий эпигенетической изменчивости.

Применение математического анализа для моделирования нормы реакции растений однородной популяции позволяет прогнозировать внутрипопуляционные события, возникающие под влиянием техногенного фактора. Суть метода заключается в использовании фитотестов для выявления тенденций развития популяций под влиянием изучаемого индуктора. В оптимальных константных условиях среды популяции подчиняются стабилизирующему отбору и формируют относительно одинаковые показатели роста и развития. При описании морфометрических показателей таких растений возникает одновершинная кривая с равными отклонениями от среднего показателя в сторону больших и меньших значений. Вариабельность, укладывающаяся в понимание генетически обусловленной толерантности как адекватная модификация, характеризует потенциал развития популяции в стабильных условиях. Если условия существования популяции обременены лимитирующим фактором, ведущим к дизруптивному отбору, можно ожидать распад популяции на субпопуляции по признакам роста и развития. Этот факт свидетельствует о возможном обеднении генофонда в силу сокращения численности растений, вступающих в фазу репродукции. Эпигенетическая изменчивость в этом случае проявляется в разнообразии фенотипов, формирующих «минус»- и «плюс»-модификации на основе компенсаторной реакции.

Для оценки результатов тестирования любых растворов (как потенциально биологически активных) мы предлагаем использовать кривые нормального и математического распределения морфометрических признаков. В эксперименте на редисе применили методику, предложенную СанПиН 2.1.7.573-96 и ее модификацию. В частности, для обнаружения эффектов металлов, находящихся в разном химическом состоянии – хелатном и минеральном, - использовали водные вытяжки в двух режимах: «без кипячения» и «с кипячением», при этом вытяжки через каждые 5 минут три раза доводили до кипения в колбе со стеклянной воронкой, титр растворов сохраняли добавлением дистиллированной воды. При термическом воздействии разрушалась биологически активная фракция металлоорганических соединений и появлялась возможность наблюдать эффект действия одного фактора – минеральной фракции солей металлов. Данные обрабатывались статистически и представлялись в форме диаграмм и таблиц. Сравнивались фактические распределения линейных признаков растений в опыте и контроле. Для анализа значимости различий выборки использовали t-критерий Стьюдента.

По полученным графикам распределения морфометрических показателей корня, в частности, по характеру растяжения кривых, можно заключить, что стимуляция роста корня выражена как в опыте без кипячения, так и в опыте с кипячением. Так, на рисунке 9 в опыте крайние показатели длины превосходят контроль на 11 см. В контроле в варианте без кипячения двухвершинность слабо выражена. Исследуемая популяция полиморфна – состоит из двух групп растений с различной генетической детерминацией метрических параметров; под влиянием водных вытяжек почв форма кривой не изменяется. На рисунке 10 в контроле с кипячением наблюдали двухвершинность. В опытном растворе признак двухвершинности диаграммы исчезает; кривая по форме приближена к кривой нормального распределения. Следовательно, минеральная фракция водных вытяжек почв направленно влияет на характер формирования длины корней; повышенная концентрация солей металлов активнее влияет на морфогенез  растений, чем комбинированный поликомпонентный загрязнитель почв, включающий органические фракции. При этом приближение кривой фактического распределения к кривой теоретического распределения раскрывает общий адаптивный потенциал групп растений, составляющих тест. Полученное заключение согласуется с представлениями об эпигенетической изменчивости в популяциях А.П. Расницына (1987), К.А. Каллис (1990), Д.Л. Гродницкого (2001), В.В Жерихина (2003), М.А. Шишкина (2006), А.Г. Васильева (1988-2009), А.Г. Васильева и И.А Васильевой (2009).

Рис. 9. Изменение характера фактического распределения длин корня под влиянием разных сред: А.- контроль в опыте без кипячения; Б. – водная вытяжка в опыте без кипячения. Пунктиром показано нормальное теоретическое распределение.

Рис. 10. Изменение характера фактического распределения длин корня под влиянием разных сред: А.- контроль в опыте с кипячением; Б. – водная вытяжка в опыте с кипячением. Пунктиром показано нормальное теоретическое распределение.

На основании токсикогенетической оценки и биотестирования эпигенетических эффектов в микробиальных и фитотестах прогнозировалась вероятность способности сточных вод ОГХК вызывать отдаленную патологию на животных объектах. К отдаленным эффектам, прежде всего, относят развитие генетических нарушений, ведущих к сокращению численности популяции и накоплению генетического груза. Вероятность возникновения мутаций под влиянием поллютанта устанавливается при проведении токсикогенетической оценки. Но даже отсутствие генетических повреждений в традиционных тестах на мутагенность не свидетельствует о безопасности загрязнителя как индуктора отдаленных эффектов воздействия. По заключению С.А. Назаренко (2002),  М.Д. Голубовского (2000) эпигенетические изменения, возникающие в онтогенезе многоклеточных эукариот, способны передаваться не только в рамках клеточной наследственности, но и через половое размножение и обеспечивать разнокачественное наследование признаков родителей потомками («геномный импринтинг»). Для выявления отдаленных эффектов сточных вод ОГХК на млекопитающих нами поставлены эксперименты на грызунах.

Исследование отдаленных последствий воздействия сточных вод на организм китайских хомячков C. griseous. В экспериментах определяли влияние сточных вод ОГХК на индивидуальное развитие животных, репродуктивность и качество потомков. В первой опытной группе животных подкормка сточными водами продолжалась 30 дней. В первые две недели с начала эксперимента у животных наблюдали хороший аппетит, некоторую сонливость, повышение густоты шерсти; в последующие дни вплоть до летальности - дерматит, состояние повышенной возбудимости, умеренную агрессивность, поредение шерсти (взъерошенная шерсть). Через 16 дней после прекращения подкормки зафиксирована гибель первого животного, в течение недели погибло 75% особей. Смерть наступала внезапно, обычно в момент сна, сопровождалась слизистыми кровяными выделениями из обонятельной и ротовой полостей, слезотечением, гиперемией носа. Патологоанатомическое вскрытие показало наличие отека, застойной гиперемии легких, диффузной дистрофии почек, печени, миокарда. Летальность 100% животных наступила на 57 день с момента окончания подкормки. В отдельных случаях гибель наступила в результате септикопиемии (предполагалась изначальная локализация в печени, гнойный лимфаденит). Подсаживание интактного самца к экспериментальным самкам не привело к результатам, - самки оказались стерильными. Во второй опытной группе животных самки получали сточные воды в тех же условиях, но при длительности подкормки 10 дней. Через 2,5 месяца после окончания подкормки провели скрещивание с интактными самцами. Наступившая беременность завершалась гибелью самок в момент родов. При вскрытии обнаруживались плоды без видимых патологий. В третьей опытной группе три самца получали сточные воды в режиме второй опытной группы. Скрещивание также проводили спустя 2,5 месяца после прекращения приема сточных вод. Каждый самец скрещивался с тремя интактными самками. Детеныши рождались и развивались в период лактации без особенностей, в полуторамесячном возрасте молодые особи изолировали от самки. Потомство отличалось повышенной смертностью. В норме гибель новорожденных особей прекращалась к 3-му месяцу существования, в опыте гибель животных продолжалась и после трехмесячного возраста. Разница в показателях количества выживших особей к первому месяцу жизни между контролем и опытом статически не существенна. Таким образом, период лактации в опытной группе проходил относительно благополучно. Однако, после прекращения периода лактации наблюдали, что потомство ослаблено и не приспособлено к существованию в условиях оптимального рациона для животного данного возраста. Потомство отличалось прогрессирующим истощением, отсутствием аппетита, проявлением депрессии, слабой иммунной защищенностью. В результате к 5-му месяцу смертность в потомстве превзошла контроль на 41,6% (рис. 11).

Рис. 11. Выживаемость потомков, полученных от скрещивания:

интактная самка экспериментальный самец

Проявления эпигенетической изменчивости в первой группе животных мы связываем с последовательным переходом «плюс»-модификаций к «минус»-модификациям фенотипов, тканевыми повреждениями органов на основе клеточной летальности, системными нарушениями, ведущими к ооцитотоксикации. Во второй группе животных беременность самок завершалась их гибелью. Подобные факты относительно КРС, потребляющих корма с ЗПО, были известны нам из данных предшествующих исследований (Иоаниди, Степанова, Блохин и др., 1980; Иоаниди, Калиев, Степанова и др., 1982). Специалисты гибель коров объясняли патологией родов, связанной с крупноплодностью. В соответствии с эпигенетической конфликтной теорией отцовского и материнского геномов в регуляции роста плода Moore Т., Haig D. (1991), качественное состояние зиготы зависит от конкурентности геномов родителей. Подавление генома матери геномом отца приводит к истощению организма самки и одновременно к патологической крупноплодности. Следовательно, в этой группе проявление эпигенетической изменчивости подтверждается характером патологии. В третьей группе детеныши, полученные от индуцированных самцов, проявили энзиматическую зависимость от материнского организма. В соответствии с вышеуказанной теорией, потомки преимущественно унаследовали признаки матери, экспрессия признаков отца была подавлена токсикацией настолько, что был нарушен баланс жизненно важных ферментов.

Нами сделано предположение, что наблюдаемые изменения в организме животных связаны с накоплением никеля, дисбалансом отношений Cu/Ni и Cu/Zn, так как существует ряд сведений об эффектах никеля и его антагонистах. В токсикологических исследованиях при анализе действия различных веществ необходимо рассчитывать ЛД16, ЛД50, ЛД84, ЛД100. Самым точным методом расчета является метод наименьших квадратов с использованием пробит-анализа. Метод позволяет выявить вещества, склонные к кумуляции. Китайским хомячкам вводили возрастающие дозы сухого остатка сточных вод ОГХК. Использовали дозы, при которых не погибает ни одно животное, и от которой гибнут все животные группы. Определили показатели токсичности при разовом и хроническом введении сухого остатка сточных вод в организм животных по методикам, предложенным Ивановым и Погорелюк (1990): ЛД116=672; ЛД150=923; ЛД184=1174; ЛД1100=1299; ЛДn16=452; ЛДn 50=1040; ЛДn 84=1627.

По результатам исследования, коэффициент кумуляции поликомпонентного загрязнителя равен 0,6. Природа «привыкания», а, точнее, пролонгирующего действия веществ, характерна для солей металлов, обладающих биологической активностью (например, относящихся к эссенциальным). Таким образом, токсичность поликомпонентного состава сточных вод ОГХК выявляется по типу микроэлементозов. Кроме того, для солей эссенциальных металлов при хроническом их воздействии характерно «привыкание», сопряженное со стимуляцией физиологических процессов, которое при дальнейшей экспозиции сменяется их ингибированием и гибелью животного. Исследованные сточные воды газоперерабатывающей промышленности могут стать индукторами патологических процессов в организме животных при их длительном использовании для производства кормов. В результате проведенных экспериментов наблюдали патологические изменения в организме животных, вызванные хроническим воздействием сточных вод в течение короткого времени. Полученной дозы вещества было достаточно для индукции необратимых нарушений, приводящих к истощению и скорой гибели животных. Кроме того, наблюдалось и отражение токсического эффекта на уровне потомства. Таким образом, сточные воды способны вызывать отдаленные последствия воздействия на млекопитающих, что прогнозировалось в предыдущих экспериментах на дрожжах-сахаромицетах и растениях. В таблице 10 показаны результаты биотестирования сточных вод предприятия, загрязненных почв ЗПО ОГХК как индукторов эпигенетических изменений.

Таблица 10. Влияние источников МЭ загрязнения

на эпигенетическое развитие организмов

Тип

нарушения

Система проверки

Наличие

эффекта

Клеточные

Тест на индукцию наследуемой клеточной летальности на гаплоидных и диплоидных формах дрожжей-сахаромицетов

+

Органные,

организменные,

популяционные

Тест на индукцию морфофизиологических аномалий и морфометрических реакций на растениях фасоли, редиса и пшеницы

+

Тест на развитие эпигенетических нарушений на китайских хомячках

+

Тестирование позволило выявить клеточные, органные, организменные, популяционные изменения, индуцируемые микроэлементным загрязнением. При этом в главе 6 были описаны реакции организмов в традиционных тестах на мутагенность и предложены дополнительные критерии оценок на выявление структурно-метаболических нарушений в ЦГА (определение числа ядрышек, времени мацерации), которые позволяют интегрировать проявления морфометрических реакций, аномалий и клеточные изменения в единую систему оценки. Основой эпигенетической изменчивости организмов являются метаболические, системные нарушения, влияющие на детерминацию признаков генетическими факторами, то есть экспрессивность признаков в поколениях зависит от условий онтогенеза родоначальных организмов (от оптимизации генотипического потенциала); следовательно, прогнозирование отдаленных последствий воздействия фактора с использованием генетических тестов необходимо дополнить тестами на индукцию эпигенетической изменчивости. В таблице 11 приводится общая схема выявления действия индуктора эпигенетических эффектов в малых дозах с применением фитотестов.

Таблица 11. Общая схема выявления действия индуктора

эпигенетических эффектов в малых дозах с применением фитотестов

Признаки, учитываемые при биотестировании на различных уровнях

оценки, и связанные с ними физиологические реакции

Клеточный

Тканевый

Органный,

организменный

Популяционный

Увеличение числа ядрышек (сверхсинтез белка, сопровождающий стрессовую реакцию, индукция

нестохастической клеточной летальности)

Увеличение

митотического

индекса

Стимуляция органообразования, отражающаяся на линейных параметрах и массе, индукция морфозов

Распределение признаков роста и развития формирует кривую с увеличением крайних показателей, или ее уплощением, многовершинностью, что не характерно для нормального математического (дестабилизированная популяция, риск генетического вырождения)

Увеличение числа ядрышек, уплотнение и утолщение клеточной оболочки (сверхсинтез белка, сопровождающий стрессовую реакцию, разрыв плазмодесм индукция нестохастической клеточной летальности)

Снижение

митотического индекса, увеличение времени мацерации (защитная реакция, ведущая к прекращению межтканевого обмена и некрозу тканей)

Подавление органообразования, отражающееся на линейных параметрах и массе индукция морфозов (токсины депонируются в органах, вызывают утрату функциональности и отмирание)

Распределение признаков роста и развития формирует кривую со снижением крайних показателей, или ее уплощением, многовершинностью, что не характерно для нормального математического (дестабилизированная популяция, риск генетического вырождения)

Оценивая результаты работы, пришли к заключению об эффективности интеграции экоанализа и биотестирования в мониторинге загрязняемых территорий, при этом основой новых способов и принципов оценки явилась ныне успешно развивающаяся теория эпигенетической наследственности и изменчивости признаков. Был установлен факт накопления микроэлементов при утилизации сточных вод газоперерабатывающей промышленности в почвах и растениях, а последствия воздействия такого загрязнения на живые системы прогнозировались с использованием генетической и эпигенетической активности загрязнителей. При этом микробный уровень биотестирования позволял определить вероятность клеточного опустошения у многоклеточных на основе нестохастической наследуемой клеточной летальности, что является первопричиной тканевых, органных, системных нарушений. Прогнозировано развитие микроэлементозов на растениях и животных, по типу медьдефицитного состояния и Cu/Ni-дисбаланса.

Выводы

  1. По данным многолетнего экомониторинга зоны влияния газоперерабатывающих предприятий, динамика изменений микроэлементного состава почв и кормов сводится к кумуляции металлов в почвах, загрязнению кормов. Экоанализ исследованной территории выявил приоритетные поллютанты сточных вод, почв, растений ЗПО, обладающие наибольшим потенциалом повреждающего действия по признакам биологического поглощения, устойчивости их комплексных соединений с биолигандами, при этом являющиеся потенциальными индукторами мутационной и эпигенетической изменчивости. По данным натурных исследований и корреляционного анализа, таковыми являются соединения меди, никеля, цинка.
  2. В систему биотестов для скрининга генетически активных веществ и индукторов эпигенетической изменчивости целесообразно включить: 1) тесты на мутагенность; 2) тесты на выявление структурно-метаболических клеточных повреждений, в том числе нестохастических наследуемых клеточно-летальных эффектов; 3) тесты на выявление индуцированных морфофизиологических аномалий и морфометрических реакций организмов на воздействие. Интегрированная оценка полученных данных позволяет дать объективный прогноз отдаленным последствиям воздействия на биоту поллютантов, представленных в окружающей среде в относительно малых дозах.
  3. В классических тестах на мутагенность поллютантов установлено, что сточные воды ОГХК вызывают генные мутации у бактерий и в генеративных клетках животных, геномные мутации в соматических клетках растений и животных; водные вытяжки почв ЗПО индуцируют геномные мутации в клетках меристемы растений. С использованием предложенных новых методов эпигенетической оценки выявлена способность сточных вод ОГХК вызывать клеточные структурно-метаболические, морфофизиологические, морфометрические нарушения в растениях и наследуемые клеточно-летальные эффекты в колониях микроорганизмов; выявлена эпигенетическая активность водных вытяжек почв ЗПО в фитотестах. Результаты биотестирования свидетельствует о слабой токсикогенетической активности сточных вод, почв, однако представленных концентраций загрязнителей достаточно для индукции деструктивных изменений в метаболизме клеток микроорганизмов, растений, животных, что является основой для развития эффектов последействия в онтогенезе и в репродукциях. 
  4. Химический анализ и модельные эксперименты выявили, что основу мутагенной активности сточных вод и почв ЗПО и их способности вызывать эффекты последействия несут соединения никеля и меди. Установлена роль меди как фактора, повышающего вероятность проникновения токсикантов за счет нарушения мембранного потенциала клеток и ее доминирующая роль в индукции морфозов в фитотестах.
  5. Экспериментально на растениях и грызунах доказана объективность развития патологий по типу микроэлементозов, что может быть использовано в биотестировании и прогнозировании развития этих заболеваний в популяциях организмов, находящихся в зоне влияния предприятий газохимической промышленности.
  6. Разработаны новые подходы биотестирования, заключающиеся, во-первых, в выявлении компонентов сред, индуцирующих цито- и морфофизиологические реакции, необратимые структурно-метаболические повреждения, во-вторых, в использовании кривых фактического распределения морфометрических показателей растений, отражающих тенденцию развития популяции под влиянием изучаемого индуктора при прогнозировании адаптированности фитопопуляций к условиям среды.
  7. Возможность экстраполяции данных биотестирования для прогнозирования отдаленных последствий воздействия техногенных факторов на микробные, растительные и животные объекты, включающие интегрированную оценку наследуемых генетических изменений и эпигенетических эффектов на основе необратимых клеточных структурно-метаболических повреждений ускоряет процедуру объективной оценки опасности загрязнителей.
  8. Предложенная система комплексной эколого-генетической и эпигенетической оценки потенциальных загрязнителей позволяет повысить объективность скрининга токсикантов и подготовить методическую базу для выявления индукторов последействия в экспресс-методах, основанных на представлениях о нестохастической наследуемой клеточной летальности.

практические рекомендации

1. Для краткосрочной диагностики веществ-индукторов эпигенетической изменчивости рекомендуется применение дрожжей S. cerevisiae–гаплоидов, на колониях которых фиксируют снижение репродуктивного потенциала клеточной популяции; явление нестохастической наследуемой клеточной летальности, фиксируемое на популяции дрожжей, следует экстраполировать на многоклеточные организмы, так как клеточная летальность является основой для развития вторичных морфометрических и морфофизиологических изменений, а первопричины клеточной летальности универсальны для всех живых объектов.

2. В целях оптимизации скрининга токсикантов предлагается вести учет повреждающего эффекта в фитотестах начиная с малых концентраций, вызывающих стимуляцию ростовых процессов, так как стимулирующие метаболизм клеток компоненты сред способны вызывать морфофизиологические аномалии, как на растительных, так и животных организмах.

3. В комплексную оценку загрязнителей следует включить анализ цитогенетических, структурно-метаболических, морфофизиологических нарушений на растительных объектах. Для контроля за структурно-метаболическим состоянием клеток использовать показатели: количество клеток с тремя и более ядрышками в ядре, длительность мацерации корешков луковиц A. сера. При интегрированной оценке нарушений прогнозировать способность веществ вызывать эффекты последействия, возникающие на основе конформационных изменений клеточных биополимеров и компенсаторных реакций клеток на стресс.

4. Для решения задачи объективного прогнозирования популяционных изменений под влиянием техногенного фактора, средств рекультивации деградирующих и загрязненных почв, применения регуляторов роста, адаптогенов, а также прогнозирования адаптированности сортов растений к конкретным почвенным условиям использовать принцип выявления факторов стабилизирующего и дизруптивного отбора в популяциях. В частности, анализ распределения морфометрических показателей растений проводить с сопоставлением теоретического (ориентировочного) и фактического распределений признаков в контроле и опытном варианте. При этом сравниваемые показатели выборки должны соответствовать нормальному распределению.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК для соискателей

степени доктора биологических наук

  1. Гарипова Р.Ф. Калиев А.Ж. Биотестирование водных вытяжек почв, подвергшихся воздействию выбросов Оренбургского газохимического комплекса. // Вестник ОГУ. 2004. №4. С. 90-92.
  2. Гарипова Р.Ф., Калиев А.Ж. Динамика микроэлементного состава почв и растений, подверженных воздействию сбросных вод газоперерабатывающей промышленности. // Вестник ОГУ. 2004. №10. С. 110-112.
  3. Гарипова Р.Ф. Влияние предприятий газоперерабатывающей промышленности на состояние агроландшафтов. // Земледелие. 2006. №5. С. 10-11.
  4. Гарипова Р.Ф. Нестохастическая наследуемая клеточная летальность в практике биотестирования техногенных загрязнителей как индукторов эффектов последействия. // Генетика. 2007. №3. C. 337-342.
  5. Гарипова Р.Ф. Пробит-анализ в токсикологической оценке сточных вод газоперерабатывающей промышленности, используемых для получения растениеводческой продукции. // Вестник ОГУ. 2007. № 75. С. 74-76.
  6. Гарипова Р.Ф. Новые технологии биотестирования вод, почв, биологически активных веществ на дрожжевых культурах и в фитотестах. // Проблемы региональной экологии. 2008. № 3. С. 101-106.
  7. Гарипова Р.Ф., Калиев А.Ж. Цитогенетический анализ в мониторинге почв при техногенном загрязнении микроэлементами. // Вестник ОГУ. 2009. № 5. С. 94-97.
  8. Гарипова Р.Ф. Анализ эффектов последействия в фитотестах при микроэлементном загрязнении окружающей среды. // Известия ОГАУ. 2009. №2. С. 305-308.
  9. Гарипова Р.Ф. Реакция микробиальных и растительных систем на загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами. // Известия ОГАУ. 2009. №3. С. 192-195.
  10. Гарипова Р.Ф. Мутагенность стоков Оренбургского ГХК и растворов солей тяжелых металлов в тестах на дрозофиле. // Известия ОГАУ. 2009. №4.  С. 201-203.
  11. Гарипова Р.Ф. Метод биотестирования вод, почв, подверженных техногенному загрязнению. // Проблемы региональной экологии. 2009. №5. С. 112-116.
  12. Гарипова Р.Ф. Прогнозирование микроэлементного загрязнения территории с использованием методов статистического анализа и биотестирования. //Известия ОГАУ. 2010. №3. С. 213-216.

Статьи в других научных изданиях, патентные документы

  1. Гарипова Р.Ф., Ряснянский И.В. Влияние облучения на уровень метаболической активности дрожжей по отношению к фосфору (32Р-фосфата натрия): материалы научно-практической конференции, посвященной 60-летию образования УзНИВИ.- Самарканд: УзНИВИ, 1986. – С. 19–21.
  2. Гарипова Р.Ф., Киляков В.А. Исследование мутагенной активности стоков Оренбургского газоперерабатывающего завода на растительных объектах: материалы 47-й итоговой научно-практической конференции им. Ф.М. Лазаренко. - Оренбург, 1992. – С. 9-10.
  3. Калиев А.Ж., Ибрагимов Ф.Ф., Гарипова Р.Ф. Использование охранной зоны Оренбургского газоперерабатывающего комплекса для производства кормов: Информационные материалы Оренбургского центра научно-технической информации. – Оренбург: ОЦНТИ, №78-93. - 3 с.
  4. Гарипова Р.Ф., Калиев А.Ж. Действие сточных вод Оренбургского ГПК на живые организмы: Информационные материалы Оренбургского центра научно-технической информации. – Оренбург: ОЦНТИ, № 279-93. - 3 с.
  5. Гарипова Р.Ф., Калиев А.Ж. Способ оценки эффекта малых доз мутагена среды: Информационные материалы Оренбургского центра научно-технической информации. – Оренбург: ОЦНТИ, № 280-93. – 3 с.
  6. Гарипова Р.Ф., Калиев А.Ж. Действие сточных вод и солей никеля, меди, цинка на рост и развитие проростков пшеницы: Информационные материалы Оренбургского центра научно-технической информации. – Оренбург: ОЦНТИ, № 4-95. –  4 с.
  7. Гарипова Р.Ф., Калиев А.Ж. Действие сточных вод и солей никеля, меди, цинка на корешки лука: Информационные материалы Оренбургского центра научно-технической информации. – Оренбург: ОЦНТИ, № 5-95. - 3 с.
  8. Калиев А.Ж., Бигалиев А.Б., Гарипова Р.Ф. Солевой режим южных черноземов при длительном орошении сточными водами газоперерабатывающей промышленности. //Вестник Национальной Академии Наук Республики Казахстан. 1995. № 3. С. 4-8.
  9. Калиев А.Ж., Бигалиев А.Б., Гарипова Р.Ф. Влияние атмосферных выбросов газоперерабатывающего комплекса на почву и растения. //Известия Национальной Академии Наук Республики Казахстан. Серия биологическая. – 1995. - №3. - С. 20-24.
  10. Гарипова Р.Ф., Бигалиев А.Б., Калиев А.Ж. Оценка общетоксического действия и генотоксичности выбросов газоперерабатывающего комплекса в эксперименте. //Известия Национальной Академии Наук Республики Казахстан. Серия биологическая. 1995. № 3. С. 8-12.
  11. Гарипова Р.Ф. Влияние сточной воды Оренбургского ГПК и ее компонентов на частоту соматических мутаций и рекомбинаций у дрозофилы: материалы региональной конференции ученых и специалистов. – Оренбург: ИПК ОГУ, 1995. - С. 26-28.
  12. Гарипова Р.Ф. Мутагенность сточных вод Оренбургского газоперерабатывающего комплекса в краткосрочных тестах: материалы региональной конференции ученых и специалистов. Ч.2. – Оренбург: Изд-во ОГАУ, 1997. - С. 17-18.
  13. Калиев А.Ж., Гарипова Р.Ф. Прогноз влияния выбросов газоперерабатывающей промышленности на окружающую среду. / Сертификация и управление качеством экосистем на Южном Урале: материалы региональной научно-технической конференции. – Оренбург: ИПК ОГУ, 1997. – С. 6-7.
  14. Гарипова Р.Ф., Калиев А.Ж. К вопросу о мутагенности сточных вод газоперерабатывающей промышленности. / Сертификация и управление качеством экосистем на Южном Урале: материалы региональной научно-технической конференции. – Оренбург: ИПК ОГУ, 1997. – С. 8-9.
  15. Калиев А.Ж., Гарипова Р.Ф. Оценка наземных и водных экосистем в условиях техногенного загрязнения: материалы научно-технической конференции, посвященной 100-летию И.А. Кузника. - Саратов, 1998. – С. 20-21.
  16. Гарипова Р.Ф. Оценка генотоксичности сточных вод Оренбургского ГПК в системе Эймса сальмонелла/микросомы: материалы региональной научно-практической конференции ученых и специалистов. Ч.1. – Оренбург: ИПК ОГУ, 2001. - С. 9-11.
  17. Гарипова Р.Ф. Исследование эффекта слабых доз гамма-излучения на гаплоидной форме дрожжей-сахаромицетов: материалы XLI научно-технической конференции Челябинского ГАУ. Ч.3. – Челябинск: Изд-во ЧГАУ, 2002.  С. 45-46.
  18. Гарипова Р.Ф. Изменение уровня обменных процессов дрожжей-сахаромицетов дикого типа под влиянием гамма-излучения: материалы научно-практической конференции ученых и специалистов. - С-Петербург, 2002. -  С. 23-25.
  19. Гарипова Р.Ф. Комплексная многоступенчатая мелиорация – способ восстановления экологической полноценности почв, подверженных слитогенезу. / Эволюция и деградация почвенного покрова: материалы II-ой Международной конференции.– Ставрополь: изд-во СтавГАУ, 2002. С. 34-36.
  20. Гарипова Р.Ф. Перспективы использования растительных объектов в биотестировании факторов окружающей среды: материалы региональной конференции ученых и специалистов. – Оренбург: ИПК ОГУ, 2002. – С. 30-31.
  21. Гарипова Р.Ф. Биотестирование техногенных загрязнителей окружающей среды: Брошюра. - Оренбург: ИПК ОГУ, 2002. 31 с.
  22. Гарипова Р.Ф. Радиобиологическая оценка обменных процессов штаммов дрожжей-гаплоидов, интродуцированных из дикой популяции: материалы региональной конференции ученых и специалистов.– Оренбург: ИПК ОГУ, 2003. – С. 24-26.
  23. Гарипова Р.Ф., Машенков М.И. Определение цитотоксичности водных вытяжек почв ЗПО ОГПК в фитотестах. / Повышение устойчивости биоресурсов на адаптивно-ландшафтной основе: материалы Международной научно-практической конференции. Ч.1. - Оренбург: Изд.Центр ОГАУ, 2003. -  С. 262-266.
  24. Гарипова Р.Ф., Хилько Л.Н. Оценка фитотоксичности почв ЗПО ОГПК.  / Повышение устойчивости биоресурсов на адаптивно-ландшафтной основе: материалы Международной научно-практической конференции. Ч.1. - Оренбург: Изд.Центр ОГАУ, 2003. - С. 296-298.
  25. Гарипова Р.Ф. Мутагенность сточных вод Оренбургского ГПК. / Повышение устойчивости биоресурсов на адаптивно-ландшафтной основе: материалы Международной научно-практической конференции. - Оренбург: Изд.Центр ОГАУ, 2003. - С. 267-270.
  26. Гарипова Р.Ф. Отдаленные последствия действия сточных вод газоперерабатывающей промышленности, используемых для получения кормов, на организм лабораторных животных. //Известия ОГАУ. 2004. № 2. С.146-148.
  27. Гарипова Р.Ф., Машенков М.И. Морфофизиологическая изменчивость различных сортов лука – А. сера, индуцированная экологическими условиями Оренбуржья. //Известия ОГАУ. 2004. № 2. С. 97-98.
  28. Гарипова Р.Ф. Использование эффектов наследуемой клеточной летальности в практике биотестирования слабых доз мутагенов. / Социально-экономические, политические и экологические проблемы в сельском хозяйстве России и стран СНГ: история и современность: материалы Международного симпозиума. Ч.1. - Оренбург: Изд.Центр ОГАУ, 2004. - С. 274-278.
  29. Гарипова Р.Ф. Токсикологическая оценка сточных вод газоперерабатывающей промышленности, используемых на ЗПО. / Социально-экономические, политические и экологические проблемы в сельском хозяйстве России и стран СНГ: история и современность: материалы Международного симпозиума. Ч.2. - Оренбург: Изд.Центр ОГАУ, 2004. - С. 345-347.
  30. Гарипова Р.Ф. Индикация малых доз мутагенов на дрожжевых культурах.  // Естественные и технические науки. 2004. №4. С. 77-83.
  31. Гарипова Р.Ф. Опыт использования сточных вод газоперерабатывающей промышленности при эксплуатации земледельческих полей орошения: материалы региональной научно-практической конференции почвоведов, агрохимиков и земледелов.– Уфа: Изд. БГАУ, 2006. С. 14-16.
  32. Грошев И.В., Гарипова, Р.Ф. Экологическая оценка загрязненности почв, вызванной развитием нефтегазовой промышленности Оренбуржья: материалы региональной науч-практ. конф. почвоведов, агрохимиков и земледелов. - Уфа: Изд. БГАУ, 2006. - С. 17-19.
  33. Гарипова Р.Ф. Практика устройства земледельческих полей орошения как способ утилизации хозяйственно-бытовых, промышленных стоков и проблема техногенного загрязнения. // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. – КубГАУ. -  2006. - №23(07). (http://ej.kubagro.ru/a/viewaut.asp?id=379).
  34. Гарипова Р.Ф. Кривые нормального распределения и  t-критерий Стьюдента при оценке адаптированности растений к почвенным условиям. // Плодородие. Приложение. 2007. №3 (36). С. 19-21.
  35. Гарипова Р.Ф. Принципы эколого-генетического тестирования, особенности действия слабых доз мутагенов и перспективы использования их фенотипических эффектов при комплексной оценке опасности загрязняющих веществ.  // Известия ОГАУ. 2007. №3. С. 45-47.
  36. Гарипова Р.Ф. Биотестирование техногенных загрязнителей биоресурсов. / Наука и технологии. Секция 5. Новые технологии: сборник трудов XXVII Российской научно-практической школы. – Екатеринбург: УрОРАН, 2007. - С. 21-23.
  37. Гарипова Р.Ф. Использование сортов пшеницы Саратовская 59 и Людмила в качестве тест-систем для эколого-генетического мониторинга. / Устойчивое развитие агропромышленного комплекса и сельских территорий: материалы Международной научно-практической конференции. Т.2. – Курган: Изд.Центр Кург.ГСХА, 2008. – С. 59-64.
  38. Гарипова Р.Ф. Токсикогенетическая оценка сточных вод газоперерабатывающей промышленности: Государственный доклад (приложение). / Охрана окружающей среды Оренбургской области. – Оренбург: Комитет по охране окружающей среды и природных ресурсов Оренбургской области, 2008. - С. 149-155.
  39. Гарипова Р.Ф. Биотестирование в экологическом мониторинге с использованием эпигенетической оценки. Методические рекомендации. – Оренбург: Изд.центр ОГАУ, 2011. - 28 с.
  40. Патент на изобретение № 2319959. Российская Федерация, МПК G01N 33/18, G01N 33/24, C12Q 1/02, C12R 1/865. Способ биотестирования воды, почвы, биологически активных веществ. / Р.Ф. Гарипова, Оренбургский ГАУ. - №  2006108152/13; заявл. 15.03.2006; опубл. 10.10.2007, Бюл. № 8.
  41. Патент на изобретение № 2322669 Российская Федерация, МПК G01N 33/18, G01N 33/24, G01N 33/15. способ комплексного биотестирования воды, почвы, биологически активных веществ в фитотестах. / Р.Ф. Гарипова, Оренбургский ГАУ. - №  2006108180/13; заявл. 15.03.2006; опубл. 20.04.2008, Бюл. № 11.



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.