WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Перунова Наталья Борисовна

БИОРЕГУЛЯЦИЯ МИКРОСИМБИОНТОВ В МИКРОСИМБИОЦЕНОЗЕ КИШЕЧНИКА ЧЕЛОВЕКА

  03.02.03 –  «Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Оренбург – 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза  УрО РАН

Научный консультант:

Член–корреспондент РАН, академик РАМН,

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор  Бухарин Олег Валерьевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук,

профессор  ГБОУ ВПО

Оренбургский государственный

университет

Брудастов Юрий Авенирович 

Доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Челпаченко Ольга Ефимовна

Заслуженный деятель науки РФ и РБ, доктор медицинских наук, профессор

Башкирский государственный

медицинский университет

Габидуллин Зайнулла Гайнулинович

Ведущая организация:  ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия»  Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «29» декабря  2011 г.  в 12  часов на заседании диссертационного совета Д  208.066.03. при Оренбургской государственной медицинской академии  по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург,  ул. Советская, д. 6, телефон: (3532) 40-35-62, факс (3532) 77-24-59, E-mail: ogma_ds1@esoo.ru, зал заседаний диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке  ОрГМА

Автореферат разослан «___» ______________ 2011 г, автореферат и текст объявления размещен на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

Ученый секретарь

диссертационного совета

д. м. н., профессор  Немцева  Наталия Вячеславовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В концепции ассоциативного симбиоза, включающей три вектора («хозяин – доминант»; «хозяин – ассоциант»; микросимбиоценоз), одним из наименее изученных является микросимбиоценоз, функционирующий как полимикробное сообщество одновременно взаимодействующее с организмом хозяина, и определяющее, в конечном итоге, его функциональное состояние. При заселении биотопов человека между микроорганизмами складываются различные взаимоотношения, которые определяются качественной и количественной характеристикой микробного пейзажа (Несвижский Ю.В. и др., 1997). Популяции микроорганизмов, вступая в сложные взаимоотношения – конкурентные или кооперативные, при заселении различных биотопов  макроорганизма формируют специфический «микросимбиоценоз» (Проворов Н.А., 2001; Бухарин О.В. и др., 2006).  Под микросимбиоценозом понимается открытая саморегулирующаяся система, представленная совокупностью популяций микроорганизмов аутохтонных и аллохтонных видов, находящихся в сложных взаимосвязях, исход которых определяет гомеостаз хозяина.

Как любая живая система – микросимбиоценоз является как открытой системой, где микросимбионты осуществляют обмен веществ и энергии с окружающей средой, так и самоуправляемой, саморегулирующейся системой, перерабатывающей информацию для поддержания своей структуры и управления процессами метаболизма  (Новосельцев В.Н., 1978).

Микробиота желудочно-кишечного тракта по праву является уникальной моделью для изучения межмикробных взаимоотношений при ассоциативном симбиозе, поскольку является динамической равновесной системой организма хозяина и населяющей его доминантной и ассоциативной микрофлорой. В кишечнике человека доминантную микрофлору представляют бифидобактерии, которые занимают одно из  лидирующих по численности положений среди представителей индигенной микрофлоры (Gomes A.M.P., Malcata F.X., 1999; Guarner F., Malagelada J.-R., 2003), формируя колонизационную резистентность хозяина за счет продукции антимикробных субстанций и стимуляции факторов врожденного  и приобретенного иммунитета хозяина против патогенов  (Deplancke  B. et. al., 2002; Macfarlane  S. et. al.,  2002).

Вторжение посторонней (чужеродной) ассоциативной микрофлоры может нарушить гомеостаз хозяина за счет изменения межмикробных взаимоотношений в микросимбиоценозе, что приводит к формированию хронических очагов персистирующей инфекции.

Как известно, взаимоотношения между микросимбионтами при формировании микросимбиоценоза базируются на различных каналах связи, включающие: клеточные взаимодействия (Kolenbrander P. E., 2000; Palmer R. J. et. al., 2001), генетический обмен (Li J. et. al., 2001) и выработка сигнальных метаболитов (Кrisanaprakornkit S. et. al., 2000; Fong K. P. et. al., 2001; Burgess N. A.et. al., 2002).

Однако открытым остается вопрос о механизмах межмикробных взаимоотношений доминантных бактерий с ассоциантами. Не выяснены основные физиологические функции микрофлоры, определяющие  системообразующий фактор микросимбиоценоза. Как удается представителям индигенной микрофлоры распознать «чужеродную информацию» ассоциантов, нарушающих гомеостаз инфицированного хозяина при ассоциативном симбиозе? Наконец, какова роль регуляторных сигнальных метаболитов микросимбионтов, участвующих в поддержании колонизационной резистентности организма?

Указанные моменты и предопределили тематическую направленность  наших исследований, которые могли бы способствовать раскрытию патогенетических механизмов межмикробных взаимоотношений в микросимбиоценозах организма человека и изысканию новых подходов к поиску препаратов пригодных для борьбы с персистирующей патогенной микрофлорой.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - изучить механизмы регуляторных взаимодействий микросимбионтов, определяющие функционирование микросимбиоценоза дистального отдела толстого кишечника человека.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

  1. Выявить информативные биологические характеристики микроорганизмов («биомишени» их взаимодействия) в условиях  ассоциативного симбиоза человека и определить системообразующий фактор формирования микросимбиоценоза по информативным биологическим параметрам микросимбионтов.
  2. Охарактеризовать взаимодействия микроорганизмов в системе «доминант-ассоциант» под контролем важнейших биологических характеристик адаптации микросимбионтов.
  3. Разработать способ определения «свой-чужой» на основе особенностей взаимодействия доминантных и ассоциативных микросимбинтов в микросимбиоценозе дистального отдела толстого кишечника человека.
  4. Изучить роль мембранотропных ауторегуляторов в формировании адаптивных реакций микроорганизмов в микросимбиоценозе  дистального отдела толстого кишечника человека.
  5. Оценить распространенность и выраженность способности  микроорганизмов взаимодействовать с про- и противовоспалительными цитокинами.
  6. Определить хронобиологические особенности взаимодействия микроорганизмов в микросимбиоценозе под контролем их ростовых свойств и персистентных характеристик.

Новизна исследования. Сформулировано определение, согласно которому, микросимбиоценоз единая динамическая система, обладающая выраженной способностью к ауторегуляции и аутостабилизации, состоящая из многовидовых консорциумов микроорганизмов, образующих симбиотические связи между собой и макроорганизмом с целью создания благоприятных условий для своей жизнедеятельности и оказывающих непосредственное влияние  на состояние здоровья организма хозяина.

Установлено, что рост/размножение, биопленкообразование и антилизоцимная  активность, как базовые физиологические характеристики адаптации микроорганизмов при ассоциативном симбиозе человека, наиболее значимы в функционировании микросимбиоценоза, определяя его  системообразующий фактор.

Показана универсальность персистентных признаков микросимбионтов, включая биопленкообразование, что определяет использование их в качестве «биомишени» как для исследования межмикробных взаимоотношений в условиях микросимбиоценоза, так и для изучения и отбора биопрепаратов, пригодных для борьбы с патогенами.

Регуляторная функция экзометаболитов бифидофлоры при взаимодействии с ассоциантами основана на их плейотропном действии: способности в зависимости от их концентрации либо изменять рост/размножение условно-патогенных микроорганизмов, либо модифицировать их персистентные свойства, стимулируя основные физиологические функции у представителей нормофлоры, и угнетая у  микроорганизмов, характерных для дисбиоза кишечника человека.

Рассмотрение межмикробных взаимоотношений с позиции ассоциативного симбиоза выявило способность доминантной микрофлоры (бифидобактерий) модифицировать персистентный потенциал ассоциантов,  отражая их взаимодействие внутри микросимбиоценоза и с организмом хозяина.

Экспериментально выявлен феномен микробного распознавания «свой – чужой» на основе оппозитных (усиление/подавление) взаимодействий на ростовые и персистентные свойства пары микросимбионтов («доминант – ассоциант») в условиях микросимбиоценоза. Разработанный алгоритм микробного распознавания в микросимбиоценозе кишечника человека позволил построить математическую модель, с помощью которой была  осуществлена как межвидовая, но и внутривидовая дифференцировка «своих» и «чужих» штаммов микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант».

Определено влияние мембранотропных эндогенных метаболитов  (гомологов алкилоксибензолов)  на диссоциацию популяции индигенных бактерий биотопа дистального отдела толстого кишечника человека, как один из механизмов адаптации доминантной микрофлоры к стрессовым воздействиям (изменение условий их окружения в микросимбиоценозе). Обнаруженная видонеспецифичность алкилоксибензолов - свидетельство возможности их использования микроорганизмами как во внутривидовых, так и в  межвидовых взаимоотношениях симбионтов в условиях микросимбиоценоза.

Впервые определена антицитокиновая активность (АЦА) микроорганизмов и выявлена ее регуляторная роль в отношении как про- так и противовоспалительных цитокинов. Более высокие значения АЦА были характерны для доминантов (бифидобактерий и лактобацилл), в сравнении с ассоциантами, что может обуславливать адаптацию представителей нормофлоры в организме хозяина.

Изменение ритмометрических показателей микроорганизмов при воздействии экзометаболитов ассоциантов – показатель адаптивной реакции микрофлоры в условиях микросимбиоценоза.

Практическая ценность работы. Получены новые данные, расширяющие теоретические представления о симбиотических взаимодействиях доминантов с ассоциантами в микросимбиоценозе дистального отдела толстого кишечника человека. Эти материалы позволяют использовать важнейшие физиологические функции выживания микроорганизмов не только для исследования механизмов формирования микросимбиоценоза, но и для отбора препаратов пригодных для коррекции дисбиотических изменений биотопов.

Полученный  штамм бактерий Klebsiella pneumoniae  ГИСК № 278 – продуцент ингибитора лизоцима (Патент РФ на изобретение №  2321632,  опуб. 10.04.2008) используется в качестве тест культуры при изучении межмикробных взаимодействий в микросимбиоценозе и оценке влияния препаратов на персистентный потенциал патогенов в работе научно-исследовательских лабораторий.

Разработана математическая модель микробного распознавания микросимбионтов с использованием в качестве тестовых культур бифидобактерий (штаммов B. longum), может быть использована для дифференциации «своих» и «чужих» видов микроорганизмов при ассоциативном симбиозе человека.

Определение популяционной структуры микроорганизмов под действием биотических и абиотических факторов пригодно для изучения межмикробных взаимоотношений при ассоциативном симбиозе человека, а также для отбора и тестирования различных препаратов в экспериментальных исследованиях.

Результаты работы по изучению влияния алкилоксибензолов на популяции микроорганизмов можно использовать для решения прикладных задач биотехнологии с целью повышения эффективности культивирования и сохранения производственных штаммов  пробиотических бактерий.

Представленные данные - составная часть темы открытого плана НИР ИКиВС УрО РАН «Изучение механизмов взаимоотношений симбионтов и их регуляции в различных биологических системах» (№  гос. регистрации 0120.0 600145) и «Лекарственная регуляция персистентного потенциала микроорганизмов»  (№ гос. регистрации 0120.0 853339); программы Президиума РАН №21 «Фундаментальные науки – медицине» «Механизмы формирования и регуляция ассоциативного симбиоза  человека» (09-П-4- 1007); целевой программы интеграционных проектов УрО РАН «Выявление биомишеней и разработка способов регуляции персистентного потенциала микроорганизмов» (09-И-4-3001).

Фундаментальные результаты диссертационного исследования включены в итоговые отчеты УрО РАН и Отделения биологических наук РАН (2007-2010 гг.)

Положения, выносимые на защиту

  1. Системообразующий фактор микросимбиоценоза, обеспечивающий выживание (функционирование) микросимбионтов при ассоциативном симбиозе человека включает комплекс биологических характеристик микросимбионтов -  ростовые свойства, антилизоцимную активность и биопленкобразование.
  2. Феномен микробного распознавания «свой – чужой» на основе оппозитных (усиление/подавление) взаимодействий пары «доминант – ассоциант», под контролем их ростовых и персистентных свойств, позволяет осуществлять  межвидовую и внутривидовую дифференцировку «своих» и «чужих» штаммов микросимбионтов, определяя важнейший механизм функционирования микросимбиоценоза.
  3. Адаптационные механизмы функционирования микросимбиоценоза контролируются низкомолекулярными внеклеточными метаболитами бактерий (гомологами алкилоксибензолов), антицитокиновой активностью микрофлоры и синхронизацией ритма базовых физиологических функций микросимбионтов, определяющих их «динамическую адаптацию».

Апробация работы.  Материалы диссертации доложены и обсуждены  на I - V Всероссийских конгрессах по медицинской микологии (2002 - 2007 гг.) (г. Москва);  III - V Российской научной конференции “Персистенция микроорганизмов» (2003 - 2009 гг.) (г. Оренбург);  4-й и 6-й Российской конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии»  (Москва, 2003, 2005 гг.,); международном конгрессе «Стратегия и тактика борьбы с внутрибольничными инфекциями на современном этапе развитии медицины» (Москва, 2006 г.);  международной конференции «Новые технологии в военно-полевой хирургии и хирургии повреждений мирного времени» (С-Пб., 2006 г.); VI Всеармейской международной конференции «Инфекция в хирургии мирного и военного времени (Москва, 2006 г.); I, II Междисциплинарном микологическом форуме  (Москва, 2009, 2010 гг); X и XII Международном конгрессе по антимикробной терапии МАКМАХ/ESCMD по антимикробной терапии (Москва, 2008, 2010 гг);  Всероссийских научно-практических конференциях по медицинской микологии (X - XIII Кашкинские чтения) (С.-Петербург, 2007 - 2010 гг.).

Разработка «штамм бактерий Klebsiella pneumonia № 278 – продуцент ингибитора лизоцима» экспонирована на Х Московском международном салоне инноваций и инвестиций (г. Москва, 7-10 сентября 2010 г.) и удостоена серебряной медали (О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 36 научных работ, из них 19 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 1 монография и  2 патента РФ. Изданы 2 пособия для врачей.

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 272 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 4 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 91 отечественных и 249  зарубежных источников. Иллюстрации представлены 20 таблицами и 31 рисунками.

____________________СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ:______________________

Материалы и методы исследования

Определение биомишеней функциональных взаимодействий микросимбионтов в условиях микросимбиоценоза оценивали с использованием модели кишечной микрофлоры, поскольку в данном биотопе четко определяются пары «доминант-ассоциант» (Шендеров Б.А., 1999; Mitsuoka T., 1990; Biavati B. et al., 1991).

С целью выявления информативных признаков оценки межмикробных взаимодействий микроорганизмов в микросимбиоценозе кишечника человека  была проведена оценка динамики видового состава и биологических свойств микрофлоры пациентов (от 18 до 45 лет) при обследовании на дисбиоз кишечника. Всего было изучено 20 микросимбиоценозов (10 – эубиоз и 10 – дисбиоз), изолировано 143 штамма микроорганизмов, представителей облигатно- и факультативно анаэробной микрофлоры. Исследование микробиоценоза кишечника осуществлялось в соответствии с «Методическими рекомендациями по применению бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника» (М., 1986). Выделение и идентификация анаэробных микроорганизмов проводились в соответствии с руководством «Wadsworth-KTL anaerobic bacteriology manual» (2002). Идентификация выделенных штаммов микроорганизмов-симбионтов проводилась общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных и культуральных  свойств (Биргер М.О. и др., 1982). Биохимический профиль изучаемых культур микроорганизмов оценивали с помощью коммерческих тест-систем фирмы «Lachema» (Чехия) и «BioMereux» (Франция).

Определяли уровень бактериальной обсемененности (Шапиро А.В., Фельдман Ю.М., 1984), видовой состав возбудителей и их биологические свойства: плазмокоагулазную, гемолитическую активности по общепринятым методикам (Биргер М.О., 1982), антагонистическую активность штаммов бифидобактерий методом отсроченного антагонизма в агаре (Muriana P. и Klaenhammer T.,1987), липолитическую активность -  чашечным методом (Slifkin M., 2000), ДНК-азную активность - по методу Power D.A., McCuen P.J. (1988), антилизоцимную, антикомплементарную, «антиинтерфероновую», антилактоферриновую и антикарнозиновую  активности фотометрическим методом (Бухарин О.В. с соавт., 1999, 2004), способность формировать биопленки фотометрическим методом (O`Toole G.F. et al., 2000).

Изучение способности  супернатантов микроорганизмов вызывать изменение концентрации цитокинов проводили путём соинкубирования экзометаболитов микроорганизмов с очищенными рекомбинантными цитокинами («Sigma»).  Определение концентрации проводили иммуноферментным анализом («Цитокин»; СП-б, Россия), учет результатов проводили на фотометре Multiskan Labsystems (Финляндия) при длине волны 492 нм. Антицитокиновую активность выражали в процентах (%) инактивации цитокинов супернатантом исследуемых бактерий в опыте по сравнению с контролем.

Модельные эксперименты по изучению регуляции проводили на клинических изолятах микроорганизмов типичных для микросимбиоценоза толстого кишечника человека и эталонных штаммах бактерий и грибов коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Американской коллекции типовых культур микроорганизмов (АТСС). В качестве доминантной микрофлоры были использованы культуры Bifidobacterium spp., а в качестве ассоциантов - микроорганизмы родов Escherichia, Klebsiella, Staphylococcus, Enterococcus, Candida.

Исследование биологических свойств бифидобактерий и условно-патогенных представителей кишечной микрофлоры в условиях межмикробных взаимодействий проводили при добавлении стерильных супернатантов (продуктов жизнедеятельности микроорганизмов) микроорганизмов-симбионтов в питательный бульон по алгоритму,  описанному в ряде работ (Елагина Н.Н., 2001; Семенов А.В., 2009; Иванова Е.В., 2010). Регуляцию биологических свойств микроорганизмов оценивали на 216 вариантах ассоциаций микросимбионтов.

Распознавание «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» микросимбионтов определяли по разработанной методике. Полученную математическую модель оценивали в динамике (на 1-й и 14-30 день) на 20 микросимбиоценозах биотопа дистального отдела кишечника человека, изолированных при обследовании на дисбиоз кишечника у пациентов от 18  до 45 лет.

В качестве микробных ауторегуляторов использовали  химические аналоги алкилоксибензолов (АОБ) С7-АОБ и С12-АОБ (Sigma). Получение диссоциантов осуществляли путем рассева микроорганизмов на агаризованные среды с получением не менее 100 колоний. Индекс диссоциации популяции определяли как долю (%) колоний определенного фенотипа к общему числу колоний. 

Исследования по влиянию АОБ на биологические свойства популяции  микроорганизмов были проведены на эталонных штаммах В. bifidum №791 («Бифидумбактерин»), Lactobacillus acidophilus № 1 («Лактобактерин»), K. pneumoniae ГИСК № 278, B. cereus ГИСК № 279  (ГИСК им. Л.А. Тарасевича) и клинических изолятах E. coli № 111, S. aureus № 104.

Биоритмы пролиферативной активности микроорганизмов в ассоциации изучали многократно в течение суток с 3-часовым интервалом, начиная с 08.00 часов по методике Тимохиной Т.Х с соавт. (2009).

Данные по видовому составу и биологическим свойствам микрофлоры  кишечника были подвергнуты статистической обработке в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Excel 2003 и программы «Биостат» (Гланц С., 1999) путем подсчета средней арифметической (M) и средней ошибки средней величины (m). Кластерный анализ биологических свойств микросимбионтов – с использованием программы «STATISTICA 6.0». Данные по определению регулирующего влияния экзометаболитов бифидобактерий и микроорганизмов-симбионтов на их биологические свойства были подвергнуты статистической обработке непараметрическим методом с применением критерия Манна-Уитни и параметрическим методом с применением t-критерия Стьюдента. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р<0,05. Для установления связи между параметрами использовали метод ранговой корреляции по Спирмену (Гланц С., 1999).  Для создания математической модели распознавания «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант»  использованы автоматизированные системы программ «Факторный анализ» и «Дискриминантный анализ». Для оценки амплитудно-фазовых характеристик экспериментальных серий была применена автоматизированная система «Косинор-анализ», адаптированная к микробиологическим исследованиям (Тимохина Т.Х., Санников А.Г., 2009).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы, исходя из того, что микросимбиоценоз – это биологическая система ассоциативного симбиоза, а для любой живой системы характерны внутренняя целостность, структурность (видовая, пространственная и функциональная),  иерархичность, саморегуляция, с помощью которой  поддерживается в целом существование системы (состав и структура, внутренние связи и преобразования в пространстве и во времени) (Геодакян В.А. 1970; Новосельцев В.Н., 1978; Аверьянов А.Н., 1985; Сурмин Ю.П., 2003), было сформулировано определение микросимбиоценоза.

Микросимбиоценоз - единая динамическая система, обладающая выраженной способностью к ауторегуляции и аутостабилизации, состоящая из многовидовых консорциумов микроорганизмов, образующих симбиотические связи между собой и макроорганизмом с целью создания благоприятных условий для своей жизнедеятельности и оказывающих непосредственное влияние  на состояние здоровья организма хозяина.

Объединение микроорганизмов в систему, называемую микросимбиоценозом, обусловлено наличием системообразующего фактора  – совокупности признаков, благодаря которым элементы системы объединяются и функционируют как единое целое. В связи с этим были выявлены наиболее информативные и универсальные признаки микросимбионтов, характеризующие системообразующий фактор функционирования микросимбиоценоза.

Одним из таких универсальных признаков является рост/размножение микросимбионтов, поскольку для выживания любого вида составляющие его особи должны достигнуть определенной массы, без чего невозможно выполнение ими всех жизненных функций (Новосельцев В.Н., 1978). В данном случае в большей степени интерес представляло  размножение микроорганизмов, поскольку оно определялось по конечному результату - количеству колониеобразующих единиц в исследуемом материале.

Анализ биологических свойств микроорганизмов показал, что среди следующей группы признаков – персистентных свойств микроорганизмов, определяющих выживание микросимбионтов в организме хозяина и отражающих адаптацию микрофлоры в макроорганизме, частота встречаемости биопленкообразования и антилизоцимной активности микрофлоры  преобладали среди других факторов персистенции микросимбионтов как при эубиозе, так и при дисбиозе кишечника. Пенетрантность биопленкообразования микроорганизмов при эубиозе составляла 98,3%, при дисбиозе – 96,4%, а АЛА – 91,5% и 95,2% соответственно (рис. 1).

Распространенность других факторов персистенции была менее выражена, варьировала в зависимости от видового состава  микросимбиоценоза и состояния биотопа дистального отдела толстого кишечника человека и ранжировалась следующим образом: АЛфА>АКА>АИА>АКрА (при эубиозе), АКА>АЛфА>АИА>АКрА (при дисбиозе).

Что же касается факторов патогенности, то их распространенность, как и следовало ожидать, возрастала при дисбиозе кишечника, в сравнении с эубиозом, отражая, таким образом, наличие в микросимбиоценозе патогенных видов микроорганизмов и характеризуя формирование патологического, дисбиотического микросимбиоценоза, что было отмечено в работах отечественных и зарубежных авторов (Пинегин Б.В. и др., 2004; Бондаренко В.М. и др., 2008; Kuhbacher T. et.al. 2006; Chow J.,  2010).

Рис. 1 – Пенетрантность биологических свойств микроорганизмов в микросимбиоценозе (при эубиозе и дисбиозе) дистального отдела толстого кишечника человека.

Условные обозначения: БПО – биопленкобразование; АЛА – антилизоцимная активность; АКА – антикомплементарная активность; АИА – «антиинтерфероновая» активность; АЛфА – антилактоферриновая активность; АКрА – антикарнозиновая активнсоть; ГА – гемолитическая активность; ДА – ДНК-азная активность; ЛипА – липолитическая активность; ЛизА – лизоцимная активность; ПК – плазмокоагулаза; АБР – полиантибиотикорезистентность (к 5 и более антибиотикам)

Проведение кластерной дифференцировки биологических свойств микроорганизмов, изолированных  из  различных  микросимбиоценозов, показало, что существует коридор, в пределах которого наиболее значимыми при изучении микросимбиоценоза являются рост/размножение микроорганизмов, их АЛА и БПО (К = 0,9 – 1).  Ко вторым по значимости биологическим свойствам микросимбионтов (в коридоре К = 0,6-0,9) было отнесено большинство других секретируемых бактериями факторов персистенции: АКА, АЛфА, АИА, АКрА.  К слабовыраженным факторам (К = 0,3-0,6) были отнесены патогенные свойства микроорганизмов (гемолитическая, липолитическая, ДНК-азная, пазмокоагулазная активности), лизоцимная активность и полиантибиотикорезистентность, характеризующие патогенных виды микросимбионтов, характерные преимущественно для дисбиоза кишечника.

Таким образом, подход к инфекции с позиции симбиологии позволил  определить параметры важнейших физиологических функций выживания микроорганизмов, таких как размножение и персистенция (антилизоцимная активность и биопленкобразование), составляющих системообразующий фактор микросимбиоценоза кишечника. Указанные характеристики микросимбионтов оказались универсальными, так как встречались практически с одинаковой частотой при эубиозе и дисбиозе кишечника и имели высокий коэффициент кластерной дифференцировки, по сравнению с другими биологическими параметрами микроорганизмов.

На следующем этапе работы были охарактеризованы взаимодействия микроорганизмов в системе «доминант-ассоциант» под контролем системообразующего фактора микросимбиоценоза.

Известно, что для каждого биотопа существует свой «ключевой» (основной) вид(ы) нормальной микрофлоры, обладающий универсальным набором характеристик микробного антагонизма в защите этого биотопа. Выбор в качестве доминантов Bifidobacterium spp. обусловлен тем, что именно бифидобактерии являются важнейшими представителями облигатной микрофлоры кишечника (Гончарова  Г.И., 1987; Roy D., 1992; Vasiljevic T. et al., 2008). Функции бифидофлоры разнообразны, одной из которых является  поддержание нормального микроэкологического статуса занимаемого биотопа  (Шендеров Б.А., 1996, 1998).

При оценке влияния бифидобактерий на рост/размножение ассоциантов выявлены  различные типы взаимодействий микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант», характер которых зависел от видовой принадлежности микросимбионтов.

Супернатант бифидобактерий в 72,2 – 86,1% случаев подавлял рост/размножение ассоциантов, представителей дисбиотической микрофлоры, за исключением грибов рода Candida (p<0,05). Напротив,  угнетение  ростовой функции представителей нормофлоры под влиянием экзометаболитов Bifidobacterium spp. встречалось реже (в 44,4 - 47,2% случаев) и даже был отмечен стимулирующий эффект (в 19,5 – 30,6% случаев) (p<0,05) (рис. 2).

Снижение концентрации экзометаболитов бифидобактерий в среде культивирования до субингибиторных не влияло на рост/размножение микросимбионтов, но оказывало модифицирующее действие на их персистентные свойства.

Оказалось, что в данной концентрации экзометаболиты бифидофлоры преимущественно (в  55,6 – 80,6 % случаев) ингибировали образование биопленок условно-патогенных бактерий и дрожжевых грибов, характерных для дисбиоза кишечника и, напротив, чаще (в 33,3 – 50% случаев) стимулировали биопленкообразование микроорганизмов представителей нормофлоры  (лактозопозитивных негемолитических кишечных палочек и энтерококков) (p<0,05) (рис. 3).

Таким образом, на примере используемой модели пары «доминант-ассоциант» (под контролем  изменения биопленкообразования ассоциантов)

Рис. 2 – Изменение роста/размножения условно-патогенных микроорганизмов при соинкубировании с экзометаболитами Bifidobacterium spp.

Условные обозначения: * - p<0,05 (различие между представителями нормофлоры и видами микроорганизмов, характерных для дисбиоза кишечника)

Рис. 3 – Изменение биопленкообразования условно-патогенных микроорганизмов при соинкубировании с экзометаболитами Bifidobacterium spp.

Условные обозначения: * - p<0,05 (различие между представителями нормофлоры и видами микроорганизмов, характерных для дисбиоза кишечника)

показано, что доминантный микросимбионт оказывал позитивное воздействие: с одной стороны, - стимулируя ассоциативные микросимбионты, характерные для эубиоза кишечника человека, а с другой – ингибируя виды микроорганизмов, часто обнаруживаемые при дисбиозе кишечника, что может иметь значение при реализации бифидобактериями колонизационной резистентности биотопа. 

Дальнейшая оценка межмикробных взаимодействий микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант» с использованием другой характеристики (антилизоцимной активности микроорганизмов) - составляющей системообразующего фактора микросимбиоценоза, показала результаты, сходные с изменением биопленкобразования микросимбионтов.

Установлено, что доминантная микрофлора (бифидобактерии) чаще (в 50 – 66,6% случаев) стимулировала антилизоцимную активность лактозопозитивных негемолитических (лак «+» гем «-») E. coli и непатогенных E. faecium, образуя с ними микросимбиоценоз характерный для эубиоза кишечника (p<0,05) (рис. 4).

Напротив бифидобактерии в 61,1 – 77,8% снижали антилизоцимную активность лактозонегативных гемолитических (лак «-» гем «+») E. coli, K. pneumoniae и  C. albicans (p<0,05). Исключение составили исследуемые культуры S. aureus, на  АЛА которых экзометаболиты  Bifidobacterium spp. оказывали разнонаправленное воздействие.

Рис. 4 – Изменение антилизоцимной активности условно-патогенных микроорганизмов при соинкубировании с экзометаболитами Bifidobacterium spp.

Условные обозначения: * - p<0,05 (различие между представителями нормофлоры и видами микроорганизмов, характерных для дисбиоза кишечника)

Полученные данные подтверждены клинико-бактериологическими материалами о частоте высеваемости ассоциаций условно-патогенных бактерий с разнообразными видами бифидофлоры у пациентов различных возрастных групп при эубиозе и дисбиозе кишечника (Бондаренко В.М. с соавт., 1998; Барановский А.Ю. с соавт., 2008; Амерханова А.М.,  2009; Reuter G., 2001; Collado  M.C. et al., 2008).

Обобщение полученных результатов позволило определить антилизоцимную активность микросимбионтов, как «биомишень», через которую осуществляются межмикробные взаимоотношения в их ассоциации, что раскрывает один из механизмов функционирования микросимбиоценоза при дисбиозе и эубиозе биотопа дистального отдела толстого кишечника человека. Кроме того, АЛА микроорганизмов, отвечает основным признакам, характеризующим «биомишень»: «качество», «распространенность», «специфичность», «разработка метода анализа» (Арчаков А.И., Иванов А.С., 1996; Дубанов А.В.,  2001; 1999; Hodgson J, Marshall A., 1998).

Целесообразность использования антилизоцимного признака бактерий отмечена  в работах по изучению взаимоотношений  между доминантными и ассоциативными симбионтами при формировании микробиоценоза женской репродуктивной системы (Черкасов С.В., 2006; Бухарин О.В. и др., 2007) и при межклеточных взаимоотношениях бактериально-грибкового сообщества в микросимбиоценозе кишечника человека (Бухарин О.В. и др., 2006).

Ранее использование АЛА бактерий было применено для исследования механизма действия различных препаратов (антибиотиков, гормонов и др.) и оценки эффективности  лечебных мероприятий, что нашло отражение в ряде экспериментальных и клинических работ (Бухарин О.В., 1999; Кириллов Д.А., 2004; Фадеев С.Б., 2009).

Таким образом, изучение роста/размножения и обеих часто обнаруживаемых у микроорганизмов персистентных характеристик (БПО и АЛА), включенных в системообразующий фактор микросимбиоценоза, показало сходные изменения  данных признаков при взаимоотношениях микросимбионтов в паре «доминант-ассоциант».

Полученные данные о взаимодействии микросимбионтов в паре «доминант-ассоциант» свидетельствуют, что экзометаболиты бифидобактерий, обладают плейотропным эффектом и способны осуществлять  регуляторную функцию: в высоких концентрациях угнетать рост/размножение условно-патогенных микроорганизмов, а в субингибиторных – модифицировать их персистентные свойства (антилизоцимную активность и биопленкобразование). Тем самым бифидобактерии либо напрямую оказывают  антимикробное действие на микрофлору, либо опосредованно, через снижение биологических свойств микросимбионтов, сочетано с иммунной системой макроорганизма, способствуя  элиминации патогенов из организма хозяина.

В других работах также показано, что метаболиты микросимбионтов могут обладать плейотропным эффектом и в  субингибиторной концентрации выступают в качестве сигнальных молекул при регуляции внутри- и межвидовых взаимоотношений микроорганизмов  (Fajardo A., Martinez J. L., 2008): снижают экспрессию  генов SOS-ответа (Mesak L. R.,  Miao V., Davies J., 2008), уменьшают биопленкообразование (Starner T. D. et. al.,  2008), влияют на ростовые свойства (Kolenbrander P. E.  et. al.,  2002), а также изменяют выраженность вирулентных свойств  у разных видов бактерий  (Linares J. F. et. al.,  2006; Skindersoe M. E. et. al.,  2008).

Проведенные предварительные эксперименты наводят на мысль, что в регуляции межмикробных взаимоотношений при функционировании микросимбиоценоза важную роль играют микробные метаболиты, оказывающие регуляторное действие на биологические свойства микросимбионтов. К сходным выводам пришли Shank A. E. and Kolter R. (2009), которые связывали регуляторные взаимодействия микроорганизмов с составом экзометаболитов микрофлоры, а именно, с наличием в супернатанте «сигнальных» молекул. С одной стороны, фенотипические изменения микробных популяций и изучение биомодуляции между микроорганизмами  свидетельствуют, что представители микрофлоры  могут общаться  с помощью малых микробных молекул, а с другой - данные микробные молекулы могут быть использованы в качестве индукторов новых метаболитов-посредников в  результате межвидового взаимодействия симбионтов при ассоциативном симбиозе.

Вот почему полученные результаты по взаимодействию микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант»  характеризовали лишь тенденцию изменений изучаемых признаков при прямом воздействии  экзометаболитов  доминантов на  ассоцианты. В связи с этим, был изменен алгоритм эксперимента, при котором определение влияния экзометаболитов бифидобактерий на рост/размножение, антилизоцимную активность и биопленкобразование микроорганизмов проводили после предварительного соинкубирования культур бифидобактерий с супернатантами  микросимбионтов (рис. 5). Проведение такого рода экспериментов было основано на предположении, что в условиях микросимбиоценоза экзометаболиты ассоциантов способны модифицировать  биологические свойства бифидобактерий, индуцируя у них выработку вторичных экзометаболитов, что способствует изменению взаимодействия  бифидофлоры с микросимбионтами и может оказаться полезным при микробном распознавании «свой-чужой».

Проведенные эксперименты позволили выявить способность доминантов в ответ  на  воздействие  супернатантов ассоциантов  более  четко  усиливать или

Рис. 5 - Алгоритм микробного определения «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант».

Условные обозначения: РС – ростовые свойства (рост/размножение); АЛА – антилизоцимная активность; БПО – биопленкобразование

угнетать эффекты влияния бифидофлоры на физиологические функции  ассоциантов. Внесение в среду культивирования субингибиторных концентраций экзометаболитов ассоциантов не увеличивало численность Bifidobacterium spp., что позволило заключить, что последующее влияние метаболитов доминантов на микросимбионты  не было связано с изменением численности бифидобактерий, а являлось следствием изменения их функциональной активности.

Предварительные опыты по изучению влияния экзометаболитов бифидобактерий на ассоцианты под контролем их ростовых свойств и персистентных характеристик выявили преимущественное  ингибирующее (62,5±2,1%) воздействие доминантов на ассоцианты, характерные для  дисбиоза кишечника (клебсиеллы, гемолитические лактозонегативные эшерихии и др.), и, напротив – чаще стимулирующий (41,7±9,6%) или индифферентный (32,9±4,4%) тип влияния на бактерий, представителей нормофлоры (лактозопозитивные негемолитические эшерихии, энтерококки)  (p<0,05). Использование описанного алгоритма микробного распознавания  показало, что предварительное соинкубирование бифидобактерий с супернатантами видов микроорганизмов, представителей дисбиотической микрофлоры способствовало нарастанию распространенности ингибирующего эффекта влияния доминантов на ростовые свойства ассоциантов с 59,7±5,3 % до 100%  (рис. 6 А) (p<0,01). В тоже время, было отмечено уменьшение (с 45,8±4,9% до 12,5±2,3%) распространенности ингибирующего  типа воздействия доминантов на бактерий, представителей нормофлоры (p<0,01). Супернатанты бифидобактерий, предварительно соинкубированных с супернатантами лактозопозитивных негемолитических эшерихий и энтерококков, увеличивали пенетрантность стимулирующего эффекта воздействия Bifidobacterium spp. на представителей нормофлоры с 25±2,7% до 62,5±5,9% (p<0,01).

Аналогичные данные были получены и при определении влияния экзометаболитов бифидобактерий на биопленкобразование микроорганизмов (рис. 6 Б). Культуральная жидкость доминантов, полученная от  бифидобактерий предварительно обработанных супернатантами ассоциантов, приводила к нарастанию ингибирующего эффекта влияния доминантов на БПО ассоциантов, характерных для дисбиоза кишечника человека с 66,7±7,1% до 98,1±1,9%  (p<0,01). У ассоциантов, представителей нормофлоры,  отмечено исчезновение ингибирующего влияния доминантов на ассоцианты и увеличение распространенности стимулирующего эффекта воздействия супернатанта Bifidobacterium spp.  с 41,7±4,8% до 76,9±7,3% (p<0,01). 

Сходная закономерность была отмечена и  при определении влияния супернатантов бифидобактерий (предварительно обработанных  СН ассоциантов и без таковой) на антилизоцимную активность микросимбионтов.

Рис. 6 – Изменение ростовых свойств (А) и биопленкообразования (Б) микроорганизмов под действием бифидобактерий, предварительно соинкубированных с супернатантом микросимбионтов.

Условные обозначения: I – эффекты влияния бифидобактерий на условно-патогенные микроорганизмы (УПМ); II – эффекты  влияния бифидобактерий, предварительно соинкубированных с супернатантом УПМ.

Кроме того, в 49 – 62,6% случаев выявлено усиление эффекта влияния доминантов на ассоцианты:  снижение экспрессии  РС,  БПО и  АЛА  у микроорганизмов, представителей дисбиотической микрофлоры, под действием СН бифидобактерий и усиление экспрессии данных признаков у представителей нормофлоры (табл. 1).

При проведении экспериментов мы обратили внимание, что выраженность «ответа» бифидофлоры на присутствие в среде СН микросимбионтов  не зависела  от  изучаемых свойств (РС, АЛА, БПО) микросимбионтов, а была связана с видом бифидобактерий, убывая в ряду B. longum > B. adolescentis > B. bifidum. 

В связи с тем, что использование  в качестве тест-культуры доминантов B. longum позволяло получать более четкие результаты, а так же учитывая, что данный вид бифидобактерий  часто обнаруживается при эубиозе дистального отдела кишечника человека, мы использовали B. longum для осуществления

распознавания «свой-чужой» при взаимодействии микроорганизмов в системе «доминант-ассоциант» в микросимбиоценозе кишечника человека. 

Поскольку, как было установлено выше, предварительное соинкубирование бифидобактерий с супернатантами ассоциантов, позволяло оценить распознавание бифидофлорой данных ассоциантов по изменению их основных физиологических функций, то дальнейшие эксперименты были проведены по схеме, представленной на рис. 5.

Разработанный алгоритм микробного распознавания в микросимбиоценозе кишечника человека, позволил экспериментально выявить оппозитный феномен (усиление/подавление) важнейших физиологических функций выживания микросимбионтов (рост/размножение, биопленкобразование и антилизоцимная активность) и дифференцировать «свои» и «чужие» виды микроорганизмов в парах «доминант-ассоциант».

В табл. 2, приведены полученные данные, из которых видно, что СН культуры B. longum, предварительно соинкубированной  с СН лактозопозитивной негемолитической эшерихии, не изменял выраженности ее ростовых свойств и увеличивал экспрессию АЛА и БПО (p<0,01), в связи с чем,  данная кишечная палочка могла быть отнесена к «своим» видам микросимбионтов.

Также к «своему» виду был причислен штамм E. faecium (используемый в качестве  компонента пробиотиков), воздействие СН которого на культуру B. longum приводило к увеличению экспрессии РС,  АЛА  и  БПО  данного  энтерококка под  действием  СН бифидобактерий (p<0,01).

Предварительное соинкубирование B. longum с супернатантами клебсиелл, золотистого стафилококка, лактозонегативной гемолитической кишечной палочки и  грибов рода Candida (с каждым в отдельности), способствовало  снижению 

супернатанты доминантов

физиологичес-кие функции ассоциантов

изменение физиологических функций ассоциантов под влиянием супернатантов доминантов, предварительно обработанных супернатантами этих же  ассоциантов (%)

E.  coli lac «+» hem «-»

n=4

E. coli lac «-» hem «+»

n=4

K. pneumonia

n=4

E. faecium

n=4

S. aureus

n=4

C. albicans

n=4

B.  longum

n=3

рост

+ 31,5±4,4%

- 30,4±2,9%

- 42±2,4%

+ 45,5±2,8%

- 31,8±4,1%

- 44±2,3%

АЛА

+ 27±2,5%

- 35,8±2,7%

- 48±4,4%

+ 17,5±0,5%

- 45±3,9%

- 34,1±2,5%

БПО

+ 39±2,5%

- 26,3±3,3%

- 32±1,8%

+ 32±2,5%

- 39±1,8%

- 31±1,9%

B. adolescentis

n=3

рост

+ 37,9±7,2%

- 34,5±2,7%

- 29,1±3,6%

+ 29,2±4,1%

- 20,5±3,2%

- 39±1,9%

АЛА

+ 32±2,5%

- 24,5±2,1%

- 30±2,2%

+ 23,8±2,1%

- 23±1,4%

- 22,7±1,3%

БПО

+ 25±1,7%

- 25±2,2%

- 25±2,1%

+ 25±1,7%

- 33±2,0%

- 22,5±1,5%

B. bifidum

n=3

рост

+ 15,3±5,1%

- 12,1±1,8%

- 11,8±1,6%

+ 13,3±3,1%

- 23,8±2,2%

- 17,5±1,9%

АЛА

+ 13±1,5%

- 14,7±1,6%

- 23,9±2,2%

+ 23,8±2,1%

- 18,5±1,6%

- 29,2±2,2%

БПО

+ 17±1,7%

- 24±2,2%

- 19,9±2%

+ 11±1,1%

- 20,5±3,2%

- 22,3±1,5%

Табл. 1 – Изменение экспрессии физиологических функций ассоциантов под действием бифидобактерий, предварительного соинкубированных с супернатантом данных ассоциантов. 

Условные обозначения: «+» - увеличение экспрессии свойств ассоциантов; «-» - снижение  экспрессии свойств ассоциантов; в % указано различие в экспрессии между воздействием на ассоциантов супернатантов бифидобактерий без предварительного соинкубирования с супернатантом микроорганизмов и после такового.

  супернатант доминанта

физи-ологи-ческие функ-ции ассо-цианта

изменение физиологических функций ассоциантов под влиянием супернатантов доминантов, предварительно обработанных супернатантами этих же  ассоциантов (%)

E.  coli

лак «+»

гем «-»

E. coli

лак «-» гем «+»

K. pneumoniae

E. faecium

S. aureus

C. albicans

B.  longum

рост

нет изменений

- 36,5%

- 35%

+ 27,3%

- 23,9%

- 73,6%

АЛА

+ 31%

- 18,8%

- 51%

+ 18,2%

- 35%

- 57,1%

БПО

+ 24%

- 21,7%

- 19,3%

+ 41%

- 29,4%

- 28%

«свой»

«чужой»

«чужой»

«свой»

«чужой»

«чужой»

Табл. 2 – Оценка  взаимодействия  пар «доминант-ассоциант» для распознавания «свой-чужой» в микросимбиоценозе.

Условные обозначения: «+» - увеличение экспрессии свойств; «-» - снижение  экспрессии свойств

экспрессии  РС,  БПО и АЛА  микроорганизмов, на основании чего они были отнесены к «чужим» видам микросимбионтов (p<0,01).Разработанный способ оценки микробного распознавания «свой-чужой» позволил проводить такую «диагностику» не только на межвидовом, но и внутривидовом уровне.  Иллюстрацией  внутривидового распознавания могут служить данные по влиянию бифидобактерий на кишечную палочку –  лактозопозитивную негемолитическую и лактозонегативную гемолитическую (табл. 2). Лактозонегативные гемолитические эшерихии (характерные для патобиоценоза) активировали антагонизм бифидобактерий против себя, в результате чего происходило снижение РС, АЛА и БПО данных эшерихий;  лактозопозитивные E. coli (нормоценоз), воздействуя  на бифидобактерии, способствовали усилению РС, АЛА и БПО кишечных палочек (p<0,01).

Известно, что при антагонистическом типе взаимодействия  микроорганизмов может происходить модификация антагонистической активности продуцента в связи с активным воздействием на него симбионта: модификация обмена веществ  или морфологические и функциональные изменения микросимбионтов (Shank A. E., Kolter R., 2009). Изучение этих вопросов важно для понимания механизмов формирования и функционирования микросимбиоценозов,  через регуляцию антагонизма  доминантных микроорганизмов ассоциативными микросимбионтам.

Проведенные выше эксперименты и данные кластерного анализа подтвердили возможность  использования роста/размножения микроорганизмов, их биопленкообразования и антилизоцимной активности в качестве системообразующего фактора микросимбиоценоза. Изменение данных признаков микросимбионтов в паре «доминант-ассоциант» имел уровень значимости 98% и позволял оценивать функциональные взаимосвязи микросимбионтов в 96 % случаев (p<0,01). 

В связи с этим полученные данные об изменении базовых физиологических функций  микроорганизмов были обработаны с помощью  программы «Дискриминантный анализ». Это позволило создать математическую модель дифференцировки штаммы микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант»,  изолированных из микросимбиоценоза кишечника человека. По результату взаимодействия ассоциантов с бифидофлорой получено адекватное математическое выражение:

Д = х1а1 + х2а2 + х3а3 + С,

где Д - дискриминантная функция,  характеризующая искомый вариант распознавания микросимбионтов бифидофлорой; х – различие между значением свойства ассоцианта в опыте (под действием супернатанта бифидобактерий, предварительно соинкубированных с экзометаболитами данного ассоцианта) и контроле (без влияния бифидобактерий) в %; а - коэффициент показателя; С - поправочная константа.

В табл. 3 представлены  коэффициенты  для  каждого  показателя и поправочные константы. 

 

ростовые свойства

АЛА

БПО

С

«свой»

2.78710

8.43545

7.23118

-272.13568

«чужой»

-3.74074

-10.87087

-6.50287

-358.01895

Таблица 3 - Коэффициенты показателей  и  поправочные константы  для дифференциации «свой-чужой» бифидобактериями при взаимодействии с ассоциантами.

Для установления принадлежности исследуемых микросимбионтов к «своему» или «чужому» штамму, находили разницу полученных у ассоциантов количественных значения по показателям в опыте (под действием супернатанта  бифидобактерий, предварительно соинкубированных  с экзометаболитами данного ассоцианта) и контроле (без влияния бифидобактерий), переводя их в проценты и используя для расчета дискриминантной функции по приведенной формуле. Расчет проводили по всем строкам соответствующей таблицы.

Наибольшая величина дискриминантной функции из всех полученных будет в 95% случаев соответствовать обозначенному на данной строке результату (типу) распознавания.

Пример 1. Исследуемый штамм E. coli характеризовался следующими признаками: РС – 0,92 OD630, АЛА – 0,73 мкг/мл* OD, БПО – 0,12 ед., после воздействия экзометаболитов бифидобактерий исследуемые свойства E. coli изменились:  РС – 1,3 OD630, АЛА – 1,37 мкг/мл* OD, БПО – 0,34 ед. Разница между опытным и контрольными значениями в процентах составила: РС – (+41,3%), АЛА - (+87,7%), БПО – (+183,3%). Расчет по формуле с использованием представленных в таблице коэффициентов показал, что:

Д1 = 2.78710 х 41,3 + 8.43545 х 87,7 +7.23118 х 183,3 + (-272.13568) = 1907,9

Д2 = (-3.74074) х 41,3  + (-10.87087) х 87,7  + (-6.50287) х 183,3  +  (-358.01895) = - 2657,9

В результате проведенного расчета максимальная величина дискриминантной функции установлена на первой строке (Д1), что позволило отнести исследуемую культуру E. coli к «своему» штамму бактерий.

Пример 2. Исследуемый штамм C. albicans характеризовался следующими признаками: РС – 1,53 OD630, АЛА – 1,78 мкг/мл* OD, БПО – 0,21 ед., после воздействия экзометаболитов бифидобактерий исследуемые свойства C. albicans  изменились:  РС – 0,9 OD630, АЛА – 1,15 мкг/мл* OD, БПО – 0,11 ед. Разница между опытным и контрольными значениями в процентах составила: РС – (- 41,2%), АЛА - (- 35,4%), БПО – (- 47,6%). Расчет по формуле с использованием представленных в таблице коэффициентов показал, что:

Д1 = 2,78710 х (-41,2) + 8,43545 х (-35,4) +7,23118 х (-47,6) +  (-272,13568) = - 1029,8

Д2 = (-3,74074) х (-41,2) + (-10,87087) х (-35,4)+(-6,50287) х (-47,6) + (-358,01895) = 490, 5

В результате проведенного расчета максимальная величина дискриминантной функции установлена на второй строке (Д2), что позволило отнести исследуемую культуру C. albicans  к «чужому» штамму микроорганизмов.

Для проверки математической модели был проведен анализ видового состава микросимбиоценозов дистального отдела толстого кишечника человека у 20 пациентов в динамике (на 1-й и 14-30 день). Решение вопроса о принадлежности ассоциантов к «своему» или «чужому» виду проводили с использованием разработанной модели оценки распознавания  «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант». Полученные результаты показали эффективность разработанной модели в 90±6,9% случаев. Микроорганизмы, которые по результату воздействия на них бифидобактерий были отнесены к категории «чужой», при повторном исследовании микросимбиоценоза кишечника через 14-30 дней снижали свою численность либо не обнаруживались, тогда как «свои» виды микросимбионтов достоверно не изменяли свою численность и сохранялись в ассоциации с бифидофлорой на протяжении данного времени.

Таким образом, полученные результаты показали, что при ассоциативном симбиозе не только сам хозяин в состоянии организовать собственную защиту от ассоциантов, различая «чужаков» при помощи рекогносцировочных механизмов врожденного иммунитета (ПРР клеток), но и при помощи своей нормофлоры, которая, судя по приведенным результатам биорегуляции микросимбионтов, способна реализовать принцип «микробного распознавания» ассоциантов в системе «свой – чужой». Другими словами, на основании экспериментальных данных выявлен феномен оппозитного (усиление/подавление) влияния микроорганизмов на их биологические свойства (антагонистические, персистентные) пары «доминант – ассоциант» в условиях микросимбиоценоза, когда «свои» поддерживают «своих», но проявляют нетерпимость к «чужим» микробным видам. Вероятно, в этом заложен определенный биологический смысл защиты хозяина через его колонизационную резистентность, реализуемую в условиях микросимбиоценоза при помощи нормофлоры хозяина.

На заключительном этапе работы были оценены некоторые механизмы адаптации микроорганизмов в условиях ассоциативного симбиоза. Среди них было рассмотрено значение микробных экзометаболитов адаптогенов (алкилоксибензолов), влияние микрофлоры на про- и противовоспалительные цитокины и хронобиологические особенности взаимодействия микроорганизмов в ассоциации.

В связи со значимостью алкилоксибензолов (АОБ) как метаболитов микроорганизмов, обеспечивающих защитные эффекты микробной клетки (Эль-Регистан Г.И., 2005; Николаев Ю.А., 2006), было оценено их влияние на изучаемые базовые физиологические функции микросимбионтов – размножение и персистенцию бактерий. Учитывая, что вклад в адаптацию также вносит и внутрипопуляционная фенотипическая вариабельность, от которой зависит результативность симбиозов, замещение и поддержание продуктивных вариантов (Головлев Е.Л., 1998;  Проворов Н.А., 2000; van der Woude M.W. et al., 2004), изучение данного явления проводили с позиции изменения популяционной структуры микроорганизмов.

Проведенные исследования позволили установить, что низкомолекулярные внеклеточные регуляторные метаболиты бактерий  контролируют  развитие адаптивных реакций как доминантных, так и ассоциативных бактерий, влияя на их популяционную гетерогенность по антилизоцимному признаку. При этом влияние АОБ на микроорганизмы было видонеспецифическим и зависело от  химического строения и  концентрации препарата в среде культивирования. 

Установлено, что количество алкилоксибензолов 1 мкг/мл в среде являлось пороговой концентрацией, при которой отмечалось изменение популяционной структуры микроорганизмов разных групп в сравнении с контролем.

Отмечена стимуляция ростовых свойств доминантной микрофлоры и угнетение признака у ассоциативных микросимбионтов. Этот эффект выявлен у гексилрезорцина, при действии которого отмечено увеличение оптической плотности культур бифидобактерий и лактобацилл на 34±2% (p<0,05) и снижение – у штаммов S.aureus, B. cereus и гемолитических E. coli в среднем на 40±3,1% (p<0,05).

Оказалось, что оба химических аналога алкилоксибензолов  стимулировали биопленкобразование B. bifidum (рис. 7 А). В эксперименте также была выражена концентрационная зависимость действия химических аналогов алкилоксибензолов. Максимальные изменения в популяции наступали при концентрации АОБ 10 мкг/мл, когда большинство  клонов (90-95%) находилось в области средних и высоких показателей биопленкообразования, а низкие значения признака отсутствовали. В целом отмечалось увеличение среднепопуляционного уровня биопленкообразования бифидобактерий в 1,25 раза в сравнении с контролем. Аналогичные данные были получены в отношении популяции лактобацилл.

Напротив, у K. pneumoniae, как и других представителей ассоциативных бактерий,  изменение структуры популяции сопровождалось снижением доли клонов с высоким и средним значением изучаемого признака и увеличение клонов с низкой способностью к образованию биопленок. При действии метилрезорцина выявлено снижение среднего уровня признака на 31,2 – 43 % в сравнении с контролем. При влиянии гексилрезорцина среднепопуляционный уровень способности к образованию биопленок не изменялся за счет сохранения клонов с высоким уровнем признака.

Исследование антилизоцимной активности бактерий на примере популяции K. pneumoniae № 278 показало, что увеличение концентрации С-7 АОБ (амфифильный, метилрезорцин) до 10 мкг/мл приводило к образованию только двух основных фенотипов в популяции: нетипичных вариантов, не обладающих АЛА (40±4,9%) и диссоциантов с низкими значениями антилизоцимной активности (60±4,9%) (рис. 7 Б). Аналогичные изменения наблюдались при воздействии метилрезорцина на другие виды условно-патогенных бактерий (S. aureus, B. cereus, гемолитические E. coli).  При этом среднепопуляционное значение признака бактерий уменьшилось на 22 – 75 % в сравнении с контролем (p<0,05).

Рис. 7 – Изменение популяционной структуры бактерий по биопленкообразованию (А) и антилизоцимному признаку  (Б) под влиянием алкилоксибензолов.

Условные обозначения: I – контроль (без влияния АОБ);  II -  под влиянием С-7 АОБ в концентрации 10 мкг/мл; III - под влиянием С-12 АОБ в концентрации 10 мкг/мл

В отличие от ассоциативной микробиоты, у доминантных бактерий (бифидобактерий и лактобацилл) внесение в среду культивирования метилрезорцина, наряду с появлением фенотипических вариантов без антилизоцимной активности и увеличением доли диссоциантов с низким уровнем АЛА, способствовало сохранению клонов со средними значениями антилизоцимного  свойства  (в  20±4,0%  случаев),  а  изменение среднепопуляционного уровня АЛА снизилось на 30±4,6% (p<0,05) от исходного уровня признака.

Возможно, что в условиях микросимбиоценоза, при повышении плотности популяции бактерий и, как следствие, увеличении количества амфифильных АОБ в среде, популяция доминантных бактерий будет обладать большим адаптивным потенциалом в отношении факторов врожденного  иммунитета (лизоцима),  нежели ассоциативные  микроорганизмы,  за счет сохранения в структуре популяции вариантов экспрессирующих средние значения АЛА.

При соинкубировании бактерий с С12-АОБ (гексилрезорцином), который отличался большей длиной алкильного радикала, отмечалась диссоциация популяции бактерий, в результате которой, наряду с появлением вариантов (35 - 45%) не обладающих антилизоцимным признаком, происходило увеличение доли диссоциантов (45 - 50%) с высоким уровнем АЛА. Кроме того, в популяции выявлено сохранение доли клонов со средним уровнем способности инактивировать лизоцим. При этом среднеопуляционный уровень антилизоцимной активности микроорганизмов не изменялся. Очевидно, что гексилрезорцин, в сравнении с метилрезорцином, обладал большим адаптогенным эффектом на микроорганизмы, поскольку при диссоциации популяции под действием  С-12 АОБ, несмотря на наличие клонов, не обладающих АЛА, присутствовали варианты с различной степенью выраженности признака, что в итоге уравнивало среднепопуляционный уровень антилизоцимной активности бактерий. Установленные изменения были характерны как для представителей доминантной, так и ассоциативной микрофлоры и не зависели от строения их клеточной стенки.

Таким образом, проведенные исследования позволили определить влияние мембранотропных ауторегуляторных метаболитов  (гомологов алкилоксибензолов)  на диссоциацию популяции индигенных бактерий биотопа дистального отдела толстого кишечника человека, что, вероятно, является одним из механизмов адаптации доминантной микрофлоры к условиям их окружения. Можно предположить, что присутствие С12-АОБ в окружающей среде способствует усилению колонизации бифидобактериями желудочно-кишечного тракта, что важно для формирования нормобиоценоза при эубиозе кишечника человека.  Полученные данные, по-видимому, объясняют  один из механизмов формирования ассоциативного симбиоза в условиях дисбиоза и эубиоза кишечного биотопа. 

При рассмотрении инфекции как результата паразит-хозяинных отношений очевидно,  что инфекционный процесс – это модельная система ассоциативного симбиоза, где организм хозяина и его микрофлора образуют взаиморегулируемую систему (Бухарин О.В. и др., 2007, 2010), контролирующуюся посредством цитокиновой сети, определяющей  направленность иммунного ответа (Черешнев В.А., 2001). Патогенные микроорганизмы, чтобы ослабить действие иммунной системы, могут модифицировать продукцию определенного вида цитокинов (Романова Ю.М., 2001, 2002;  Horvat R., 1989; Leidal K.G., 2003). К сожалению, данные о распространенности и выраженности способности доминантных и ассоциативных микроорганизмов, представителей микрофлоры дистального отдела толстого кишечника человека к деградации/связыванию различных видов цитокинов единичны и не позволяют в полной мере оценить значимость этого свойства во взаимоотношениях микроорганизмов и человека.

Проведенные исследования выявили наличие антицитокиновой активности у 58,1±11,9% исследуемых штаммов бактерий в отношении про- и противовоспалительных цитокинов.

Высокие значения АЦА в отношении провоспалительного  цитокина ФНО- были характерны для доминантов - культур Bifidobacterium spp. и Lactobacillus spp. и в среднем составляли  62±8,7%, 67±9,8% соответственно. Низкие значения данного свойства отмечены у экзометаболитов ассоциативных S. aureus (28±6,1 %) и K. рneumoniaе (26±6,2 %) (рис. 10).

Снижение концентрации провоспалительного цитокина ИЛ-6 происходило под действием всех изученных ассоциантов (стафилококков и клебсиелл) (р<0,05), однако экспрессия данного признака в среднем составляла не более 19,5±4,1%.  АЦА регистрировалась при взаимодействии ИЛ-6 с экзометаболитами  культур Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. и клебсиелл (11 – 19,5%).

Супернатанты  представителей  нормальной  микрофлоры (бифидобактерии и лактобациллы) обладали  высоким уровнем экспрессии антицитокиновой активности в отношении противовоспалительного цитокина ИЛ-10 (р<0,05), которая в среднем составлял 70±9,6 % и 35±5,1 % соответственно. У исследуемых видов ассоциативных микроорганизмов  обнаруживались более низкие значения АЦА  в диапазоне 14 – 25 %.  Таким образом, полученные в работе результаты свидетельствуют о  наличии АЦА у доминантных и ассоциативных  микроорганизмов. Полученные данные о снижении концентрации цитокинов при воздействии супернатантов микроорганизмов в известной степени согласуются имеющимся сведениям о протеолитической модификации цитокинов различными видами бактериальных протеаз, содержащихся в супенатантах микроорганизмов (Leidal K.G., 2003; Kubica M., 2008; Sheets S.M., 2008; Potempa J., 2009). 

Рис. 10 – Экспрессия антицитокиновой активности (АЦА) микроорганизмов в отношении про- (ФНО-) и противовоспалительного (ИЛ-10) цитокинов.

Условные обозначения: 1 - Bifidobacterium spp., 2 - Lactobacillus spp., 3 – S. aureus,  5 - K. рneumoniae

*- р<0,05 (достоверность различия между уровнем АЦА доминантной и ассоциативной микрофлоры).

Высокая экспрессия АЦА в отношении как провоспалительного цитокина - ФНО-, так и противовоспалительного цитокина - ИЛ-10 у  доминантов (бифидобактерий лактобацилл), в сравнении с ассоциативной микрофлорой, расширяет  наши представления о регулирующем влиянии нормальной микробиоты на цитокиновый статус организма человека, что может обуславливать адаптацию микросимбионтов в организме хозяина и участие в формировании иммунологической толерантности к индигенной микрофлоре, посредством изменения концентрации цитокинов в микроокружении клеток (Jump R.L., 2004; Silva M. F., 2010;  Tanoue T., 2010). 

Определение некоторых адаптационных механизмов, описанных выше в большей степени касалось выявления биорегуляторных механизмов  «статической адаптации» микроорганизмов, отражающее их устойчивость к условиям среды (уровень  адаптированности) и оценивающееся по параметрам окружающей среды в конкретный момент времени. Однако  существует «динамическая адаптация», которая отражает процесс приспособления биосистемы к меняющимся условиям среды во времени и раскрывающая механизмы приспособления, их особенности и принципы регулирования (Казначеев В.П.,1980).

Для функционирования живых систем и их выживания в изменяющейся окружающей среде постоянно требуется координация и регуляция разнообразных процессов сложной интегрированной симбиотической системы, обеспечивающей приспособление, что возможно лишь при  изменении хроноструктуры физиологической активности биологических характеристик микроорганизмов под действием экзометаболитов ассоциативной микрофлоры. В связи с этим на модели S. aureus, E. coli, P. aeruginosa и C. albicans мы провели эксперименты по изучению биоритмов физиологических функций микроорганизмов в ассоциациях.

Результаты исследования позволили выявить изменение профиля ритма роста/размножения, антилизоцимной активности и биопленкообразования микросимбионтов в ассоциации.

Изменение ритмометрических показателей  ростовых свойств S. aureus происходило под влиянием экзометаболитов грамнегативных микроорганизмов, тогда как динамику роста/размножения грамнегативной микрофлоры (E. сoli и P. aeruginosa) в большей степени изменяли продукты метаболизма C. albicans  и S. аureus (p<0,05).

На рис. 11 показано изменение роста/размножения исследуемых культур стафилококков и кишечной палочки в ассоциации.

Рис. 11 – Изменение биоритма роста/размножения S. aureus и E. coli в их ассоциации.

Представленные данные свидетельствуют об изменении профиля ритма микросимбионтов при их взаимодействии. У  штаммов S. aureus и E. coli сохранялись ультрадианные ритмы ростовых свойств под воздействием экзометаболитов микробов-ассоциантов, но дополнительно появлялись циркадианные ритмы изучаемого показателя, что свидетельствовало о возможном усилении адаптивных функций популяции.

Анализ ритмометрических показателей  биопленкообразования S. aureus под влиянием экзометаболитов микробов-ассоциантов выявил стабильность циркадианного ритма данного персистентного фактора возбудителя. Наиболее выраженное изменение ритмометрических показателей было выявлено в отношении биопленкобразования при воздействии  экзометаболитов C. albicans на культуру P. aeruginosa. Под влиянием экзометаболитов S. aureus, E. coli, C. albicans в спектральном составе появился дополнительно стабильный циркадианный ритм с возрастанием амплитуды в 2-3 раза. В то же время экзометаболиты C. albicans  нивелировали ультрадианный ритм и достоверно снижали мезор (р<0,05).

Воздействие экзометаболитов ассоциативной микрофлоры изменяло профиль ритма антилизоцимной активности и способствовало появлению у всех исследуемых штаммов  24-часового ритма АЛА, что можно объяснить тем, что лизоцимная активность как один из факторов неспецифической резистентности макроорганизма проявляет циркадианную активность (Матияш И.Н.,1983), а способность микроорганизмов инактивировать лизоцим хозяина сформировалась в результате симбиотических отношений с макроорганизмом (Бухарин О.В.,1999).

Таким образом, выявленные изменения (синхронизация) ритмометрических параметров биологических ритмов роста/размножения, БПО и АЛА микроорганизмов под действием экзометаболитов ассоциативной микрофлоры, вероятно, могут иметь адаптивное значение для изучаемых микроорганизмов, как одна из приспособительных реакций - лабильность ритма физиологических функций (Комаров Ф.И., 1989; Романов Ю.А., 2002; Смирнов В.М., 2002).

В итоге проведенной работы следует выделить три основных момента:

  • Системообразующий фактор микросимбиоценоза, включающий  рост/размножение микроорганизмов, их антилизоцимную активность и способность образовать биопленки, определяет функционирование микросимбиоценоза, обеспечивая выживание микросимбионтов при ассоциативном симбиозе человека
  • Основу микробного распознавания «свой-чужой» в условиях микросимбиоценоза составляет оппозитный феномен (усиление/подавление) важнейших физиологических функций выживания микросимбионтов (размножение и персистенция), выявляемый в паре «доминант-ассоциант».
  • Адаптационные механизмы функционирования микросимбиоценоза контролируются низкомолекулярными внеклеточными регуляторными метаболитами бактерий (гомологами алкилоксибензолов), антицитокиновой активностью микрофлоры и синхронизацией ритмометрических параметров базовых физиологических функций микросимбионтов.

ВЫВОДЫ:

  1. Микросимбиоценоз - единая динамическая система, обладающая выраженной способностью к ауторегуляции и аутостабилизации, состоящая из многовидовых консорциумов микроорганизмов, образующих симбиотические связи между собой и макроорганизмом с целью создания благоприятных условий для своей жизнедеятельности и оказывающих непосредственное влияние  на состояние здоровья хозяина.
  2. Подход к изучению взаимоотношений микроорганизмов в микросимбиоценозе с позиции ассоциативного симбиоза позволил  выявить  важнейшие физиологические функции выживания микроорганизмов – рост/размножение и персистенцию (антилизоцимная активность и биопленкобразование), встречающиеся одинаково часто как при эубиозе, так и дисбиозе кишечника. Высокий коэффициент кластерной дифференцировки этих характеристик, по сравнению с другими биологическими параметрами микроорганизмов, позволил выделить их в системообразующий фактор микросимбиоценоза.
  3. Антилизоцимная активность микрофлоры – «биомишень», посредством которой удается реализовать биологическую регуляцию микросимбионтов, отражая как их взаимодействие внутри микросимбиоценоза, так и их взаимоотношения с организмом хозяина.
  4. Установлена регуляторная функция экзометаболитов бифидофлоры в отношении аллохтонных микроорганизмов, основанная на их плейтропном действии: способности в высоких концентрациях угнетать размножение условно-патогенных микроорганизмов, а в субингибиторных – модифицировать их персистентные свойства (антилизоцимную активность и биопленкобразование), что в сочетании с иммунной системой хозяина,  может способствовать элиминации патогенов из организма.
  5. При изучении межмикробных взаимодействий в паре «доминант-ассоциант» выявлен оппозитный феномен (усиление/подавление) важнейших физиологических функций выживания микросимбионтов, что позволило  разработать математическую модель для определения «своих» и «чужих» видов микроорганизмов в микросимбиоценозе дистального отдела толстого кишечника человека.
  6. Механизмом адаптации доминантной микрофлоры (бифидобактерий и лактобацилл) при действии микробных ауторегуляторов (алкилоксибензолов) является перестройка популяции бактерий, характеризующаяся сохранением диссоциантов со средними значениями антилизоцимной активности, увеличением доли клонов с высокими значениями биопленкообразования и стимуляцией их размножения, что обеспечивает  индигенной микрофлоре селективное преимущество в микросимбиоценозе кишечника.
  7. Выявлено регулирующее влияние доминантов (бифидобактерий и лактобацилл) на цитокиновый статус организма человека, что связано с наличием у них антицитокиновой активности в отношении провоспалительного (ФНО-) и противовоспалительного (ИЛ-10) цитокинов, участвующих в  адаптации микросимбионтов при инфекции.
  8. Формирование ассоциаций микроорганизмов сопровождается изменением профиля ритма базовых физиологических функций микросимбионтов, что можно рассматривать как  один из механизмов их «динамической адаптации» в условиях микросимбиоценоза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Монографии:

  1. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Перунова Н.Б., Усвяцов Б.Я., Черкасов С.В.  Симбиоз и его роль в инфекции / Екатеринбург: УрО РАН, 2011. 301 с. ISBN 978-5-7691-2180-7

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:

  1. Бухарин О.В., Чайникова И.Н., Смолягин А.И., Валышев А.В., Перунова Н.Б. и соавт. Показатели местного иммунитета и микробиоценоза кишечника больных сальмонеллезной инфекцией // Вестн. Оренбургского государственного университета. 2005.  № 5. С. 4-8.
  2. Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Эль-Регистан Г.И., Николаев Ю.А. и соавт. Влияние химического аналога внеклеточных микробных ауторегуляторов на антилизоцимную активность бактерий // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.  2007. № 6. С. 3-6.
  3. Бухарин О.В., Валышев А В., Иванова Е.В.,  Чайникова И.Н., Перунова Н.Б. Взаимодействие возбудителя с ассоциативными бактериями при сальмонеллезной инфекции // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2008.  № 3. С. 3-6.
  4. Тимохина Т.Х., Паромова Я.И., Леонов В.В., Перунова Н.Б. и соавт. Влияние экзометаболитов ассоциативной микрофлоры на временную организацию музейных штаммов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa // Медицинская наука и образование Урала. 2008. № 2. С. 89-90.
  5. Кретинин С.В., Фадеев С.Б., Перунова Н.Б., Явнова С.В. и соавт. Динамика биологических свойств Klebsiella pneumonia  при лечении экспериментального сепсиса комбинацией окситоцина и цефотаксима // Медицинская наука и образование Урала. 2008. №6. С. 61-64.
  6. Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Явнова С.В.  Изменение популяционной структуры бактерий по антилизоцимному признаку под влиянием гексилрезорцина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2008. № 6. С. 7-10.
  7. Тарасенко В.С., Кретинин С.В., Фадеев С.Б., Перунова Н.Б., Явнова С.В., Бухарин О.В.  Применение комбинации окситоцина и цефотаксима в лечении экспериментального сепсиса // Хирург. 2008 №8. С. 11 – 15. 
  8. Иванова Е.В., Перунова Н.Б.,  Валышев А.В., Валышева И.В., Бухарин О.В. Видовая характеристика и факторы персистенции бифидофлоры кишечника в норме и при дисбиозах // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2009. № 2. С. 89-93.
  9. Иванова Е.В.,  Перунова Н.Б. Влияние бифидобактерий на антилизоцимную активность микроорганизмов и их способность к образованию биопленок // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2009. № 4. С. 46-49.
  10. Бухарин О.В., Иванова Е.В., Перунова Н.Б.,  Гордеева С.В.,  Андрющенко С.В.  Антагонистическая активность бифидофлоры кишечного биотопа в норме и при дисбиозах //  Медицинская наука и образование Урала. 2009. №3. С. 35-37.
  11. Перунова Н.Б.  Механизмы формирования ассоциативного симбиоза в бактериально-грибковых сообществах человека // Медицинская наука и образование Урала. 2009 № 3. С.45-46.
  12. Перунова Н.Б., Гордеева С.В.,  Бухарин О.В.  Ростовые свойства, образование биопленок и антилизоцимная активность Bifidobacterium bifidum при воздействии химических аналогов алкилоксибензолов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010. № 5. С. 49-53.
  13. Перунова Н.Б., Иванова Е.В., Бухарин О.В. Микробная регуляция биологических свойств бактерий кишечного микросимбиоценоза человека // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010. № 6. С. 76-80.
  14. Фадеев С.Б., Немцева Н.В., Перунова Н.Б., Бухарин О.В.  Формирование биопленок возбудителями раневой инфекции и флегмон мягких тканей // Хирург. 2010. №1. С. 11-18.
  15. Скоробогатых Ю.И., Перунова Н.Б., Курлаев П.П., Бухарин О.В. Экспериментальное изучение комбинации ципрофлоксацина с окситоцином на образование биопленок условно-патогеными бактериями // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010. № 6. С. 3 - 7.
  16. Тимохина Т.Х., Николенко М.В., Варницына В.В., Перунова Н.Б., Бухарин О.В. Модификация инфраструктуры Candida albicans под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011. № 3. С. 67-70.
  17. Тимохина Т.Х., М.В. Николенко, В.В. Варницына, Н.Б. Перунова, Бухарин О.В. Временная организация биологических свойств Candida albicans // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2011. № 2. С. 226-228.
  18. Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Чайникова И.Н., Иванова Е.В., Смолягин А.И.  Антицитокиновая активность микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011. № 4. С. 56-61.

Публикации в других изданиях:

  1. Чайникова И.Н., Кириллов Д.А., Перунова Н.Б., Валышев А.В., Бухарин О.В. Влияние иммуномодулятора полиоксидония на факторы персистенции возбудителей инфекционно-воспалительных процессов // Russian Journal of Immunology. 2004. V. 9. №. 1.  P. 153.
  2. Чайникова И.Н., Валышев А.В., Перунова Н.Б. и соавт. Состояние местного иммунитета при кандидозном дисбиозе у больных сальмонеллезом // Russian Journal of Immunology. 2004. V. 9. № 1. P. 153.
  3. Перунова Н.Б. Модифицирующее влияние эфирных масел растений на биологические свойства Candida albicans // Проблемы медицинской микологии. 2006. T.8. №2. С. 75.
  4. Иванова Е.В., Валышев А.В., Перунова Н.Б. Влияние экзометаболитов бифидобактерий на антилизоцимную активность некоторых дрожжевых грибов  // Проблемы медицинской микологии.  2007. Т. 8. № 2. С. 59.
  5. Перунова Н.Б., Николенко М.В., Варницына В.В., Янина М.В., Тимохина Т.Х.  Характеристика временной организации штаммов Candida spp., выделенных из клинического материала // Медицинская наука и образование Урала. 2008. № 2. С. 58-59.
  6. Иванова Е.В., Перунова Н.Б., Валышев А.В. Влияние внеклеточных  метаболитов бифидобактерий на  липолитическую активность Candida spp. и  Rhodotorulla spp. // Проблемы медицинской микологии.  2008. Т. 10.  № 2. С. 44.
  7. Фадеев С.Б., Явнова С.В., Перунова Н.Б. Формирование биопленок клиническими штаммами возбудителей флегмон мягких тканей // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2008. Т. 10. №2. С. 40-41.
  8. Бухарин О.В., Явнова С.В., Перунова Н.Б. Модификация ростовых свойств Candida albicans под действием алкилоксибензолов // Проблемы медицинской микологии. 2008. Т.10. № 2. С. 30.
  9. Фадеев С.Б., Немцева Н.В., Перунова Н.Б., Тарасенко В.С., Бухарин О.В. Способность возбудителей флегмон мягких тканей формировать биопленки // Инфекции в хирургии. 2009. Том 7. №2. С.41-45.
  10. Фадеев С.Б., Перунова Н.Б., Тимохина Т.Х., Паромова Я.И., Бухарин О.В. Оценка суточной динамики чувствительности к цефтриаксону и меропенему грамотрицательных возбудителей нозокомиальной хирургической инфекции // Медицинская наука и образование Урала. 2009. № 3. С. 16-19.
  11. Иванова Е.В., Гордеева С.В., Перунова Н.Б., Андрющенко С.В. Влияние экзометаболитов бифидобактерий на способность формировать биоплёнки штаммами Candida albicans //  Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2009.  №1. С.  21-22.
  12. Гордеева С.В.,  Иванова Е.В., Перунова Н.Б., Фадеев С.Б. Образование биоплёнок клиническими штаммами Candida albicans при дисбиозе кишечника //  Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2009.  №1. С.  20-21.
  13. Гордеева С.В., Иванова Е.В., Андрющенко С.В., Перунова Н.Б. Влияние иммуномодулирующих препаратов на образование биопленок дрожжевыми грибами // Проблемы медицинской микологии. 2009. Т. 11. № 2. С. 66.
  14. Гордеева С.В., Перунова Н.Б., Иванова Е.В. Образование биоплёнок в популяции Candida albicans под влиянием аутоиндукторов анабиоза //  Проблемы медицинской микологии.  2010. Т. 12. № 2. С. 79.
  15. Иванова Е.В., Перунова Н.Б., Гордеева С.В., Андрющенко С.В. Влияние дрожжевых грибов на антагонистическую активность бифидобактерий // Иммунопатология, аллергология,  инфектология.  2010.  №1. С.  219-220.
  16. Фадеев С.Б., Перунова Н.Б. Способность внебольничных и госпитальных штаммов метициллинорезистентных золотистых стафилококков формировать биоплёнки // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2010.  Т. 12. № 2. С. 51.
  17. Иванова Е.В., Борисова О.С., Кузнецова М.С., Перунова Н.Б. Характер межмикробных взаимоотношений при ассоциативном симбиозе дрожжевых грибов и бифидобактерий // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2010. №1.  С.  104.

Патенты

  1. Бухарин О.В., Кириллов Д.А., Кириллов В.А., Перунова Н.Б., Еремин М.Н.  Штамм бактерий Klebsiella pneumonia № 278 – продуцент ингибитора лизоцима. Патент РФ № 2321632, 2008. Бюл. № 10. 4 с. 
  2. Кашуба Э.А., Тимохина Т.Х., Курлович Н.А., Николенко М.В., Варницына В.В., Паромова Я.И., Козлов Л.Б., Перунова Н.Б., Губин Д.Г., Тверскова О.П.  Способ выявления Candida albicans по биоритмам: Патент РФ № 2319747, 2008. Бюл. № 8. 4 с.

Пособия для врачей:

  1. Чайникова И.Н., Смолягин А.И., Скачков М.В., Валышев А.В., Калинина Т.Н., Валышева И.В., Перунова Н.Б., Брудастов Ю.А., Бухарин О.В. Прогнозирование и санация реконвалесцентного сальмонеллезного бактерионосительства: пособие для врачей // Оренбург: Издательский центр ОГАУ, 2006. – 32 с. ISBN 5-88838-342-2
  2. Фадеев С.Б., Тарасенко В.С., Бухарин О.В., Немцева Н.В., Перунова Н.Б.  Применение эвкалиптового масла в лечении гнойных ран // Пособие для врачей, Оренбург, Изд-во НФПП «Наука», 2010 - 55 с. ISBN 976-5-904910-04-4

Список сокращений:

АТСС – American Type Culture Collection (американская

коллекция типовых культур)

КОЕ – колониеобразующая единица

БПО – биопленкообразование

АЛА – антилизоцимная активность

АКА – антикомплементарная активность

РС – ростовые свойства(рост/размножение)

СН – супернатант микроорганизмов

АЦА – антицитокиновая активность

АЛфА – антилактоферриновая активность

АКрА – антикарнозиновая активность

АИА – «антиинтерфероновая» активность

ГА – гемолитическая активность

ДА – ДНК-азная активность

ЛипА – липолитическая активность

ЛизА – лизоцимная активность

ПК – плазмокоагулаза

АБР – полиантибиотикорезистентность

АОБ – алкилоксибензолы

УПМ – условно-патогенные микроорганизмы

r – коэффициент ранговой корреляции Спирмена

ч.к. – чистая культура микроорганизмов

УПМ – условно-патогенные микроорганизмы

ПЕРУНОВА

НАТАЛЬЯ БОРИСОВНА

БИОРЕГУЛЯЦИЯ МИКРОСИМБИОНТОВ В МИКРОСИМБИОЦЕНОЗЕ

КИШЕЧНИКА ЧЕЛОВЕКА

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2003

Подписано в печать 12.  09.  2011 г.

Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 2,0. Печать оперативная.

Бумага офсетная. Гарнитура Times.

Тираж 100 экз.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.