WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

КРЫЖАНОВСКАЯ ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА В ВЕТЕРИНАРИИ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Щелково - 2008 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и тех­нологическом институте биологической промышленности (ВНИТИБП), Кубан­ском государственном медицинском университете (г. Краснодар) совместно с ЗАО «Биопрогресс».

Научный консультант:        доктор биологических наук, профессор,

Албулов Алексей Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Тихонов Игорь Владимирович

доктор ветеринарных наук, профессор Смоленский Владимир Иванович

доктор ветеринарных наук, профессор Балашов Владимир Михайлович

Ведущая организация:        Всероссийский научно-исследовательский

институт  экспериментальной  ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ)

  Защита состоится 26 декабря 2008 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности:

141142, Мо­сковская область, Щелковский р-н, п/о Кашинцево, пос. Биокомбината, ВНИТИБП; тел. /факс: 526-43-74; E-mail:vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП.

Автореферат разослан «        »        2008г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук        Ю.Д. Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Биологически активные вещества (БАВ), неспе­цифические средства, которые производятся из компонентов различного при­родного происхождения (морепродукты, микроорганизмы, животные, расте­ния и т.д.), используются в качестве подкормки для животных, птиц, насекомых и растений, оказывают стимулирующий иммунитет, антимик­робное, сорбционное, антиоксидантное воздействие, улучшают качество об­рабатываемого продукта  и  находят все более широкое применение в ветерина­рии.

Биологически активные вещества (БАВ), обладающие способностью воздействовать на иммунокомпетентные системы, делятся на экзогенные и эндогенные. Подавляющее большинство первых - это вещества микробного происхождения (бактериального и грибкового). БАВ эндогенного происхож­дения условно разделяют на две группы: иммунорегуляторные пептиды и цитокины. Пептиды представляют собой, в основном, экстракты из органов иммунной системы (тимуса, селезенки) или продукты их жизнедеятельности (костного мозга). Под цитокинами понимают всю совокупность биологиче­ски активных белков, продуцируемых лимфоцитами и макрофагами: интерлейкины, монокины и интерфероны.

Незаразные болезни молодняка сельскохозяйственных животных в первые дни жизни широко распространены в животноводстве и являются од­ной из основных проблем ветеринарной практики. Болезни молодняка сель­скохозяйственных животных имеют повсеместное распространение и их ле­чение, и профилактика являются неотложными задачами ветеринарии.

Из незаразных заболеваний молодняка наиболее часто регистрируют желудочно-кишечные болезни, которые составляют у молодняка до 10-дневного возраста 60-90%. Связано это, прежде всего с нарушением техноло­гии содержания и кормления животных, а также несовершенством естест­венной защиты их организма к воздействию неблагоприятных факторов

внешней среды. Желудочно-кишечные болезни телят наносят огромный ущерб животноводству вследствие высокой заболеваемости и падежа (до 100%), затрат на лечебные мероприятия, снижения продуктивных качеств и племенной ценности животных. Хотя изучение данной проблемы посвящено много работ, и для лечения этой группы заболеваний предложено много схем, все же до настоящего времени не удается достигнуть 100% сохранно­сти молодняка. Гительсон С.С. (1974), Ежиков А.А. (1970), Зароза В.Г. (1984) и др. (1984) установили, что наибольшее распространение среди болезней те­лят имеет диспепсия, заболеваемость которой на молочных фермах и ком­плексах составляет 80%-95%, а летальность от 15% до 70%. Причем, заболе­вание имеет сложную этиологию, что создает трудности в диагностике и ле­чении. При заболеваниях в ранний период жизни регистрируется высокая ле­тальность в связи с тем, что болезни чаще протекают на фоне иммунодефицитов.

Проблема иммунной недостаточности у молодняка сельскохозяйствен­ных животных выходит на первое место, особенно при переводе хозяйств на промышленную основу и создания комплексов с большой концентрацией по­головья животных на малой территории. Это способствует тому, что у жи­вотных создается недостаточный иммунный фон и возможно снижение на­пряженности иммунитета. Болезни органов пищеварения у молодняка, как правило, протекают на фоне пониженной резистентности организма. Поэто­му разработка новых препаратов и схем лечения желудочно-кишечных забо­леваний у молодняка, способствующих повышению неспецифической рези­стентности, является перспективным направлением.

В связи с вышеизложенным, проблема поиска новых биологически ак­тивных препаратов для профилактики и лечения желудочно-кишечных забо­леваний молодняка весьма актуальна.

Хитозан в настоящее время используется в различных областях народ­ного хозяйства. Особого внимания заслуживает применение его в ветерина­рии и медицине. Установлено, что хитозан является слабым аллергеном, об-

ладает достаточно низкой токсичностью и пирогенностью (Скрябин К.Г., Вихорева Г.А., Варламов В.П., 2002; Быкова В.М., Немцев СВ., 2002; Allan G.G., Peyron M., 1989).

Хитозан способен образовывать гели в слабокислых растворах (рН 5-6). Кроме того, он может создавать пленку на коже и раневых поверхностях, а также на слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, обладает высо­кой адсорбционной емкостью, способен выводить токсичные вещества, сти­мулирует клеточных и гуморальный иммунитет (Албулов А.И., Самуйленко А.Я., Шинкарев СМ., Фролова М.А., 2001; Червинец В.М., Бондаренко В.М., Комаров Б.А., 2002; Muzarelli r.a.a., 1988). Эти свойства хитозана могут быть использованы для создания средств лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных, приносящих большой экономический ущерб.

В зависимости от содержания в составе препарата фракций с различ­ными молекулярными массами хитозан может проявлять в той или иной сте­пени сорбционные, иммуномодулирующие, бактериостатические, фунгиста-тические, противовоспалительные и другие свойства (Ильин Л.А., Андриано­ва И.Е., Глушков В.А., 2003; Червинец В.М., Албулов А.И., Червинец Ю.В., 2006).

Туберкулез наносит значительный экономический ущерб животновод­ству страны, что связано с широкой распространенностью болезни, необхо­димостью убоя реагирующих на туберкулин животных в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах и населенных пунктах (Смолья-нинов Ю.И., Донченко А.С и др., 2005.). Поэтому поиск новых препаратов для антимикробной терапии туберкулеза и других заболеваний является на сегодняшний день актуальной задачей (Капков Л.Г., Smith J., Wood E., Domish M., 2004).

Принимая во внимание уникальные свойства хитина и хитозана, в по­следние годы значительно возрос интерес к изучению и практическому при­менению этих природных полимеров во многих областях, в том числе вете-

ринарии и медицине. Это определило интерес к изучению молекулярного механизма действия липолитических ферментов и поиску соединений, влияющих на липидный обмен. Хитозан, благодаря уникальной структуре и положительному заряду, является полифункциональным соединением, обла­дающим целым рядом уникальных свойств: высокой совместимостью с жи­вотными тканями, биодеградируемостью, отсутствием токсичности и др., что определяет перспективы его использования в качестве ингибитора липолити­ческих ферментов (Sumiyoshi M., Mhurchu С).

Изучение биоактиоксидантов показало их существенную роль в под­держании уровня свободно радикальных реакций и регулировании обмена липидов в мембранах клетки. Важно, что существование системы регуляции было обнаружено практически для всех изученных внутриклеточных и кле­точных мембран клеток животных, растительных организмов и микроорга­низмов.

Важнейшим элементом поддержания здоровья животных а, значит, продуктиности и сохранности) являются доброкачественные корма, т.е. кор­ма, свободные от чужеродных вредных для организма веществ. Одни из са­мых опасных чужеродных примесей - микотоксины (ядовитые низкомолеку­лярные метаболиты плесневых микроскопических грибов). Даже следы микотоксинов в кормах (30-100 мкг/кг) приводят к потере продуктивности, снижению иммунитета и воспроизводительных функций. Особо актуальна проблема микотоксинов у тех видов, у которых основу рациона составляет зерно и продукты его переработки у птиц.

Ужесточение требований к экологической безопасности продукции животноводства заставило пересмотреть многие методические подходы к во­просам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болезней, воз­будителями которых является условно-патогенная микрофлора, и признать необходимость разработки нового поколения экологически безопасных пре­паратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспече­нию биологической защиты животных (Сафонов Г.А., Калинина Т.А., Романова В.П., 1992; Панин А.Н., Серых Н.И., 1993; Сидоров М.А., Субботин В.В., 1988; Тихонов И.В., Гаврилов В.А., 2003).

На основании литературных данных известно, что к числу высокоэф­фективных лечебно-профилактических средств специалисты относят пробио-тики (Воронин Е.С., 1989; Панин А.Н., 2000; Fuller R., Gibson G., 2000 и др.). По мнению многих специалистов, основополагающим принципом при созда­нии пробиотиков является использование микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры животных (Бовкун Г.Ф., 1999; Сидоров М.А., 2000; Berg R., 1998 и др.).

Наиболее полно этим требованиям могут отвечать пробиотические препараты, в состав которых входят живые бактерии из числа основных представителей нормального кишечного биоценоза, такие как лактобациллы, бифидобактерии, стрептококки. Использование пробиотиков в ветеринарии затрагивает довольно широкий круг проблем, начиная от коррекции кишеч­ного биоценоза и распространении на коррекцию иммунной, гормональной и ферментной систем молодняка животных (Вилыпанская Ф.Л., 1987; Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б., 1995; Грачева Н.М., Партий О.С, Ле­онтьева Н.И., 1996; Парфенов А.И., 1998; Малик Н.И., 2002).

Широкое применение в медицине и ветеринарии препаратов на основе лактобацилл и бифидобактерии при острых кишечных инфекциях и дисбак-териозах показало их эффективность и перспективность (Малик Н.И., 2000; Субботин В.В., и др., 2001).

Одной из первых отраслей сельского хозяйства, перешедших на про­мышленную основу производства, является птицеводство. Доля препаратов для птиц составляет 95% мирового рынка лечебных препаратов для живот­ных (более 7 млрд. долларов в стоимостном выражении).

В связи с этим все более актуальной становится проблема профилакти­ки, лечения и нормализации микробного баланса в пищеварительном тракте, минимизации последствий антибиотикотерапии, повышения эффективности выращивания и сохранности птицы, улучшения качества конечного продукта. Один из способов ее решения - разработка и применение биологически активны веществ (БАВ) нового поколения, которые характеризуют высокой биодоступностью и положительно влияют на микробиоценоз желудочно-кишечного тракта птицы, что приводит к оздоровлению всего организма в целом и снижению микробизма окружающей среды. К их числу относят эубиотики - пробиотики и пребиотики (Антипов В.А., 1991; Тихонов И.В., Грязнева Т.Н., 2003; Данилевская Н.В., Субботин В.В., 2005).

Наиболее перспективным является создание симбиотиков - комплексов про- и пребиотиков.

Многие из симбиотиков влияют на гуморальный и клеточный иммуни­тет, зоотехнические показатели, могут служить естественными стимулятора­ми роста и обладать токсико- и радиопротективным действием, снижающим влияние неблагоприятных экологических факторов.

Продовольственная проблема, связанная с недостатком биологически полноценных продуктов, со временем не только не теряет своей остроты, но и становится одной из актуальнейших. Эффективность решения этой про­блемы определяется использованием качественно новых методов производ­ства продуктов питания, а также привлечением новых сбалансированных ис­точников пищевого белка, одним из которых является белок микроорганиз­мов. Работы многих ученых посвящены вопросам изучения возможности ис­пользования микроорганизмов как источников белковых веществ (Коновалов В.А., 1975; Беликов В.М., 1977; Шкляр Б.Х., 1977; Латов В.К., 1990; Римарева Л.В., 1993; Иванова Л.А., 1998; Неклюдов А.Д., 2000; и др.).

Наиболее перспективным источником пищевого белка является дрож­жевая биомасса, что объясняется полноценностью белковых веществ, амино­кислотный набор которых приближается к животному белку, а также безо­пасностью и абсолютным отсутствием токсичности дрожжей. Кроме того, наличие витаминов, ценных полисахаридов и микроэлементов позволяет рас­сматривать дрожжи как перспективные субстраты для получения биологиче­ски активных добавок.

Природные цеолиты обладают уникальными свойствами адсорбции, ионообменной, каталитической и детоксикационной способностью. Благода­ря своему кристаллохимическому строению цеолиты биохимически активны и кислотоустойчивы. Поэтому их применение в различных отраслях посто­янно расширяется.

В настоящее время животноводство и птицеводство в России испыты­вает большую потребность в кормовых белковых продуктах для своего раз­вития и становления. Особенный дефицит кормовых белковых продуктов стал заметно ощущаться в настоящее время, так как в 90-х годах были оста­новлены крупнотоннажные заводы БВК, производящие кормовые дрожжи на основе углеводородов «паприн» (Ермишина И.Г. и др., 2005). Кормовые бел­ковые продукты, полученные на основе микробиологического синтеза, по своему химическому составу и питательной ценности не уступают традици­онным белковым кормам, таким, как соевый шрот, мясокостная мука, рыбная мука и др.

Сложившаяся в мире ситуация с потреблением мяса и мясных продук­тов требует рационального использования сырья, повышения эффективности производства и улучшения качества готовой продукции. Для решения выше­указанных проблем необходимо разрабатывать и внедрять в производство новейшие методы обработки мяса с целью использования при производстве различных мясопродуктов не только высокосортного сырья, но и сырья, об­ладающего повышенной жесткостью и требующего длительной термообра­ботки (Рогова Н.В., Снегур Ф.М. и др., 2007)

При разработке методов обработки низкосортного сырья, содержащего большой процент соединительной ткани, необходимо учитывать, чтобы ме­тод не приводил к потере массы, не ухудшал органолептические свойства и технологические характеристики готового продукта и позволял интенсифи­цировать процесс производства мясопродуктов, отличающихся высокой пи­щевой и биологической ценностью.

Следовательно, исследования, теоретическое обоснование и разработ­ка новых биологически активных веществ (БАВ) для нужд ветеринарии яв­ляются актуальными.

1.2.Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований

- разработка теоретического обоснования и практического применения су­ществующих и разработка принципиально новых биологических веществ с использованием современных методов биотехнологии для нужд ветеринарии. Для решения цели исследований были поставлены следующие задачи:

1 .Теоретически обосновать использование БАВ в ветеринарной практике. 2.Исследовать влияние хитозана на механизм гомеостаза и гуморальную и неспецифическую защиту организма у животных.

3.Изучить антибактериальную активность хитозана к штаммам микобак-терий и, в частности, для профилактики и лечения туберкулеза.

4.Провести работы по активации хитозана для повышения его сорбцион-ных свойств при использовании в качестве кормовых добавок для КРС. 5.Исследовать антиметастическую активность олигомеров хитозана и его применение в сочетании с экстрактом противоонкологического фитосбо­ра.

6.Изучить антиоксидантную активность и ранозаживляющую способность хитозана при использовании на  животных.

7.Обосновать использование коллагеназы, пробиотиков, синбиотиков для профилактики и лечения в ветеринарии.

8.Изучить возможность использования в качестве кормовых добавок и компонентов питательных сред цеолита, автолизата хлебопекарных дрожжей, яично-дрожжевого гидролизата для использования в различных отраслях сельского хозяйства.

9.Осуществить практическое использование рассмотрение БАВ в ветери­нарии.

10.Рассчитать предполагаемую экономическую эффективность от широ­кого применения исследованных БАВ в ветеринарии.

1.3. Научная новизна. Применение препаратов низкомолекулярного сукцината хитозана вызывает усиление функционирования механизмов го-меостаза у животных (телят), усиливает антителогенез и увеличивает титры циркулирующих в крови антител, а также активирует факторы, характери­зующие гуморальную и неспецифическую защиту организма.

Впервые экспериментально подтверждено, что хитозан обладает бакте-риостатическим и ранозаживляющим действием по отношению к патогенным возбудителям забо­леваний животных и птиц и при нанесении им химических и термических ожогов.

Впервые разработана методика активации хитозана, которая позволила получить сорбент с емкостью на 40-60% больше, чем у исходного полимера. Показано, что акцинат и сукцинат хитозана со степенью деацетилирования 87-97% и молекулярной массой 50-250 кДа обладает максимальной сорбционной емкостью (80-10 мг/г) и успешно испытан на животных и птицах.

Показано, что повышенная удельная активность радиоцезия в рационе животных обусловливает ряд негативных изменений, таких как снижение числа эритроцитов, гемоглобина в крови по сравнению с нормой. Скармли­вание дополнительно к основному рациону препаратов хитозана оказало ра-диопроекторное действие.

Опыты по добавке низких доз хитозана к кормовому рациону молодняка сельскохозяйственных животных показали достоверное повышение привесов на 5-6% у животных опытных групп по сравнению с контролем.

Антиметастатический синергизм действия в фитохитодезтерапии возмо­жен при сочетании олигомерной фракции хитозана с компонентами сложного состава экстракта противоонкологического фитосбора. Кроме этого, обнару­женный эффект может быть косвенным подтверждением наличия синергети-ческого антиоксидантного (и, по-видимому, поливакцинного) действия экс­трактов лекарственного сырья, особенно для многокомпонентных фитосбо­ров и при сочетании с полиэлектролитами природного происхождения.

Разработана технология получения фитохитодезов - биологически актив­ных добавок к пище, состоящих из сухих экстрактов сбора лекарственных растений и хитозана полифракционного состава в виде его водорастворимой формы.

Впервые в результате анализа полученных экспериментальных данных установлено, что использование ферментного препарата коллагеназы улучшает качественные характеристики готового продукта при внесении его в мясное сырье.

Впервые разработанный кормовой белок-добавка - синбиотик «Правита» по сравнению с другими кормовыми белковыми продуктами обладает более высокой питательной ценностью и биопротекторными свойствами в качестве кормовой добавки для птиц.

Результаты исследования кормовой биологической добавки (цео-лит+культура Echerichia coli VL 613) подтвердили ее эффективность взамен дорогого кристаллического лизина.

Разработанная кормовая добавка с использованием цеолита при добавлении в питательную среду была успешно использована при культивировании клеток перепелиных эмбрионов глубинным способом, позволила увеличить конечную концентрацию клеток.

Все изготовленные серии препарата для борьбы с личинками кровосо­сущих комаров Aedes aegipty с использованием культуры B.thusingiensis H-14 шт. 1501 и автолизата хлебопекарных дрожжей в качестве компонента пита­тельной среды по биологической активности соответствовали требованиям НТД и оказались эффективными.

Применение яично-дрожжевого гидролизата в качестве лечебно-профилактической добавки для подкормки пчел, обеспечивает профилактику заболевания пчел - нозематоза, компенсации белковой недостаточности и ус­корения процессов жизнедеятельности пчелиных семей.

Впервые установлено, что бактерии L.planturum, шт. М-30 и B.subtilis,

шт. В-1948, обладают достаточным уровнем антогонистической активно­стью к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам. Кроме того, они обладают достаточным уровнем устойчивости к широкому кругу анти­биотиков, что позволяет сочетать антибиотическую и пробиотическую тера­пию в случае эпидемии в хозяйствах.

       1.4. Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований были использованы при совершенствовании технологий производства хитозана, биопрепаратов, используемых для профилактики, лечения, а также повышения резистентности и продуктивности животных. Аттестовано производство и получено Свидетельство о государственной регистрации лекарственного средства для животных. Зарегистрировано в Российской Федерации. Утверждено заместителем Руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосаниарному надзору Е.А.Непоклоновым 15 мая 2007г.

               1.5. Апробация работы. Основные положения работы были представлены на следующих конференциях:

-        Международной научно-практической конференции «Научные осно­вы производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИТИБП,
Щелково, 2007г.;

-        Ш Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству, Мо­сква, 2007г.

       1.6.        Основные положения и результаты, выносимые на защиту.

  1. Теоретическое обоснование и практическое использование хитозана для гуморальной и неспецифической защиты организма животных, по антибактериальной активности, сорбционных свойств, антиметастической активности и оксидантной активности для профилактики и лече­ния в ветеринарии.
  2. Использование ферментного препарата коллагеназы для улучшения ка­чественных характеристик мяса и мясных продуктов.
  3. Теоретическое обоснование и практическое применение пробиотиков, синбиотиков в сельском хозяйстве.
  4. Исследование и практическое применение различных кормовых доба­вок и компонентов питательных сред при выращивании бройлерных цыплят, препаратов против кровососущих, нематоза пчел, антибиотико- и пробиотикоскопию и повысить эффективность фитопрепаратов на основе хитозана в случае угрожающей ситуации в сельском хозяй­стве.

  1.7. Публикации. По результатам диссертации опубликовано работ, в
том числе        статей в научных журналах,        докладов в сбор­никах научных конференций.

1.8. .Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изло­жены на 192 страницах машинописного текста и состоит из следующих

разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсужде-

ние полученных результатов, выводы и данные о практическом использова­нии научных выводов, список использованной литературы  348 источников, в

том числе  217 отечественных  и 131 зарубежных. Работа содержит 18 таблиц, 9 рисунков, 52 страницы  приложений.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена за период с 2000 по 2007 гг. во Всероссийском науч­но-исследовательском и технологическом институте биологической про­мышленности (РАСХН) совместно с центром «Биоинженерия» (РАН), ЗАО «Биопрогресс» (Щелково, Россия), Кубанским государственным медицин­ским университетом (г.Краснодар) ГосНИИСинтезбелок по программе «Со­ставить руководящие и информационно-справочные документы по обеспече­нию качества лекарственных средств для животных на этапах их разработки, апробации и производства в соответствии с Национальным Законодательст­вом и Международными Требованиями» (per. № ИС-01.200.2.08792) и в со­ответствии с планом НИР и ОКР ВНИТИБП отраслевых научных программ и Федеральной целевой научно-технической программы «Ветеринарное благо­получие (2001-2005 гг.).

Изучение влияния низкомолекулярного сукцината хитозана на иммунный ответ телят на фоне их плановой иммунизации против пастереллеза телят прово­дили в 2006 году на базе МТФ ООО «Автобан» в Краснодарском крае. Титр специ­фических антител определялся методом непрямого ИФА, а фракции хитозана разделялись мембранным методом. Исследования сывороток крови на содержа­ние иммуноглобулинов различных классов проводились методом радиальной иммунодиффузии (РИД) в лаборатории иммунологии ВИЭВ под руководством члена корреспондента РАСХН Ю.Н.Федорова.

Опыты по определению антимикробного эффекта кислоторастворимого хи­тозана и выживаемости микобактерий проводили со следующими штаммами: типичными -Mycobacterium avium (штамм IEKBM УААН), Mycobacterium bovis и атипичными - M. fortuitum, M.smegmatis M. intracellulare предоставленными ННЦ «ИЗКВМ», Г. Харьков. Атипичные микобактерии, как и возбудители тубер­кулеза, вызывают сенсибилизацию к туберкулину крупного рогатого скота. Они широко распространены во внешней среде и попадая в организм, обуславлива­ют повышенную чувствительность к туберкулину у млекопитающих. Данные бактерии часто используют как тестовые при разработке дезинфицирующих пре­паратов при туберкулезе.

В работе использовали крабовые кислоторастворимые хитозаны с ММ 58 и 87 кДа, а также водорастворимые: сукцинат хитозана с молекулярной массой 380,0 кДа, и низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой 38 кДа, произ­водства ЗАО "Биопрогресс" (Щелково, Россия).

Определение антиоксидантной активности осуществляли с помощью прибора для определения антиоксидантной активности лекарственных препа­ратов, продуктов питания и биологически активных веществ «Яуза AAA 01» на базе ОАО «НПР «Химавтоматика» по величине окислительно-восстановительного потенциала, определяемого амперометрическим титрова­нием. В качестве маркера для количественной оценки использовали дигидро-кверцитин.

Раневые покрытия готовили следующим образом: хитозан производства ЗАО «Биопрогресс» растворяли в 1% янтарной кислоте, добавляли масляный раствор анестезина, эмульгировали в присутствии лецитина, частично осаждали из раствора содой и сшивали янтарным ангидридом. Полученный гель высушивали на воздухе при 25-300С и получали пленки.

В качестве опытных животных использовали белых беспородных крыс с массой тела 180-200 г, которым под эфирным наркозом воспроизводили термический и химический ожоги на депилированной поверхности тела площадью 2 см.

В работе по изучению влияния ферментного препарата коллагеназы на мясопродукты препарат вводили в концентрациях 0,03%, 0,05% и 0,1% до стадии термообработки мясопродуктов.

Качество продукции оценивалось по следующим показателям: содер­жание влаги, содержание сухих веществ, содержание связанной влаги, потеря массы, общая органолептическая оценка.

Пребиотик «Авистим» для птиц приготовлен на основе культуральной жидкости высшего гриба Fusarium sambucinum MKF 2001 -3 и исследована его антиоксидантная активность при защите птиц.

При разработке технологии получения лечебно-профилактических кор­мовых белковых добавок-синбиотиков для птиц использовалась биомасса

дрожжей-сахаромицетов, в которую добавлялась биомасса гриба Fusarium Sanbucinum МКГ-2001-3, пробиотики Bac.subtilis и молочнокислые бактерии.

Препарат под наименованием «Провит» был испытан на бройлерных цыплятах.

В качестве наполнителя кормовой биологической добавки для цыплят был использован цеолит Хотынецкого месторождения Орловской области в виде мелкозернистой крошки размером частиц до 1 мм и биомасса E.coli VL 613, синтезирующая одну из незаменимых аминокислот - лизин в ор­ганизме цыплят.

Для производства препарата для борьбы с личинками кровососущих ко­маров Aedes aegipty использовался автолизат энтопатогенной культуры Bacillus thuringiensis Н-14 штамм ИПМ-1501 содержащей эндотоксин. Выра­щивание культуры Bac.thuringiensis осуществлялась в биореакторе АНКУМ-2 емкостью 10 л на питательной среде, содержащей автолизат хлебопекарных дрожжей.

Четыре опытные серии яично-дрожжевого гидролизата и подкормки пчел в сухом и жидком виде исследованы по основным физико-химическим характеристикам и прошли испытания на пасеке учхоза «Леоновский» Мос­ковской области, совхозе «Малынь» Шекинского района, Тульской области и пчелосовхоза «Беканский» Северная Осетия.

Исследования in vitro антогонистической активности и чувствительно­сти к антибиотикам проводились по отношению бактерий L.plantarum,

шт.М-30, B.subtilis, шт.В-1975 и методом острогенного антагонизма в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов - S.tuphimurium, S.dublin, S.gallinfrum, 3- штаммов E.coli: К-88, К-99, А-20 и полевого изолята E.coli, выделенного от больной птицы. Об антогонистической активности штаммов судили по величине зоны задержки роста тест-культуры.

Для обеспечения качества и безопасности производства биологически активных веществ в биотехнологии необходимо соблюдать Международные правила GMP, требовании ИСО и анализа рисков БАССР.

Для анализа и статистической обработки экспериментальных данных использовались методы дискретного распределения, t-распределения Стью-дента, %2- распределения, корреляционный анализ, одно и многофакторная регрессия, критерий значимости и доверительные интервалы (Н.Джонсон, Ф.Лион «Статистика и планирование эксперимента в технике и науке. Мето­ды обработки данных. М.: Мир, 1980 - 611 с).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

З.1.Применение низкомолекулярного сукцинита хитозана в качестве им-муномодулятора при вакцинации телят против пастереллеза

Разработан способ мембранного разделения фракции (ультрафильтра­ция) низкомолекулряного хитозана, позволяющий получать полимер с задан­ной молекулярной массой. По сравнению с хроматографическими методами фракционирования ультрафильтрация дает возможность получать достаточно высокий выход продукта с более низкой себестоимостью.

Результаты исследования на токсичность фракций хитозана, полученных мембранным разделением по данной методике, представлены на рис.1.

Рис.1.  Зависимость токсичности хитозана от молекулярной массы при внутрибрюшинном введении белым мышам

Анализ уровня антител в сыворотке крови подопытных животных по­казал, что при введении хитозана у телят наблюдалось увеличение титра спе­цифических антител, выявленных в непрямом ИФА, в сравнении с контро­лем. Средние титры антител у животных опытной и контрольной групп пред­ставлены в таблице 1.

Таблица 1

Средний титр антител при вакцинации телят против пастереллеза в сочетании с препаратом хитозана

Группы животных

Титры антител

Через 14 дней

Через 21 день

Через 60 дней

Опыт

1:700

1:1400

1:1700

Контроль

1:666

1:733

1:1200

Через 14 суток после вакцинации разница между титрами антител у животных опытной и контрольной групп составила 0,95%. Через 21-е сутки после вакцинации содержание антител у телят опытной группы прогрессивно возрастало на 52,63% по сравнению с контролем. На 60-й день после вакци­нации титры антител в обеих группах составляли 1:1700 и 1:1200 соответст­венно, т.е. у животных, вакцинированных совместно с хитозаном, титр анти­тел на 70% выше, чем у контрольных животных, которым этот препарат не вводили (рис.2)

Титр антител

дни

Фон 14 день  21 день  60 дней

Рис.2.Динамика титров антител в  сыворотках крови КРС на фоне вакцинации  совместно с хитозаном

Таким образом, на всех этапах исследования отмечена выраженная тенденция к повышению уровня выработки антител при применении хитозана по сравнению с контролем.

Результаты исследования сывороток крови на содержание иммуногло­булинов различных классов представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Содержание иммуноглобулинов отдельных изотипов в крови телят опытной и контрольной групп

Группы

IgG, мг/мл

Ig M, мг/мл

Ig А, мг/мл

Через 14 суток после вакцинации (т=5)

Опыт

20,50±1,73

2,73 ±0,28

0,24± 0,1

Контроль

20,30 ±1,36

2,47±0,14

0,22±0,01

Через 21 после вакцинации (п=5)Опыт

Опыт

21,14±2,01

3,35 ± 0,3

0,21 ±0,03

Контроль

21,36 ±0,54

3,32 ±0,54

0,23 ± 0,04

Изучение влияния хитозана на иммунобиологический статус молодня­ка КРС при вакцинации против пастереллеза показало, что применение дан­ного полимера в качестве иммуномодулятора обусловило индукцию развития долгосрочного иммунитета, повышенную выработку специфических антител и образование иммунного ответа на месте введения вакцины. Таким образом, выявлено наличие иммуномодулирующих и адъювантных свойств исполь­зуемого препарата хитозана при сочетанном его введении крупному рогато­му скоту с пастереллезной вакциной.

Приведенные исследования показали, что использование препаратов хитозана может вызвать оптимизацию механизмов гомеостаза у животных, усиливать антителогенез и увеличивать титры циркулирующих в крови анти-

тел.

Обобщая данные, полученные в результате проведенных эксперимен­тов, можно заключить, что введение хитозана 4-х месячным телятам одновре­менно с вакцинацией против пастереллеза обусловило:

-увеличение титра специфических антител в сравнении с контролем, выявленных в непрямом ИФА;

- предотвращение снижения уровня гемоглобина и повышение коэф­фициента метаболической активации нейтрофилов крови к 14 суткам после вакцинации;

-активацию механизмов, обеспечивающих поглощение чужеродного материала нейтрофилами к 21 суткам после вакцинации.

3.2 Антимикробный эффект влияния кислоторастворимого хитозана против возбудителей туберкулеза

В работе использовали крабовые низкомолекулярные водорастворимые хитозаны с молекулярной массой (ММ), равной 4;7;8;5;11;24 кДа и степенью деацетилирования (СД) 85%, N-сукцинил хитозан с ММ 396 кДа, и кислоторастворимые хитозаны с ММ 96, 177 и 380 кДа, полученные на базе ЗАО «Био­прогресс» (Щелково, Россия). Образцы низкомолекулярного хитозана были получены ферментным гидролизом с помощью хитонолитического комплек­са Streptomyces kurssanovi и из хитина восковой моли Colleria mallonella.

Для изучения чувствительности клеток к антимикробному действию хитозана готовили 0,025; 0,05; 0,75; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 1,0 % растворы хитозана в питательной яичной среде, после чего коагулировали при температуре 90°С в течение 60 минут. Затем высевали 0,5 мл микробной суспензии на чашку Петри с питательной средой в присутствии хитозана или без хитозана (кон­троль). Посевы с клетками культивировали в течение 28 дней при температу­ре 37°С, учет роста культур на средах проводили каждые 7-10 дней.

Работу проводили с штаммами микобактерий Mycobacterium smegmatis шт 211 (предоставлен лабораторией «Биотехнология стероидов», Центра «Биоинженерия» РАН), штаммы Mycobacterium avium (штамм Vailee) пре­доставлены ННЦ «ИЭКВМ), г. Харьков.

Зависимость процента гибели микобактерий от ММ хитозана приведе­на в таблице 3 и на рис.3.

Таблица 3

Влияние кислоторастворимого хитозана с различной ММ на гибель микобактерий M.smegmatis при экспозиции в течение 1 часа,

t=37°C и рН=6,8 ед.рН

№пп

ММ, кДа

X=lgx

Y % гибели микобактерий

1.

4

0,60

80

2.

7

0,84

77

3.

8,5

0,93

75

4.

11

1,04

68

5.

24

1,38

57

6.

96

1,98

37

7.

177

2,25

18

8.

396

2,60

4

Оценка зависимости процента гибели бактерий от кислоторастворимо­го хитозана с различной ММ и времени экспозиции проводились методами регрессионного и корреляционного анализа.

Предварительные исследования и аналитические соотношения позво­ляли считать % гибели микробных клеток линейной функцией от логарифма молекулярной массы (ММ) хитозана. При этом регрессионная задача сводит­ся к оценке параметров в уравнении

где Х – lgx (молекулярная масса хитозана)  (1)

Y - % гибели клеток

Y,%

100

80

  60

  40

  20

х

  0  24 96  177 396 х, ММ, кДа

Рис. 3. Зависимость процента гибели микобактерий M.smegmatis

молекулярной массы хитозана через 1 час при t=37°C и рН- 6,8 ед.рН

График зависимости % гибели микобактерий от ММ хитозана представлен на рис. 4.

Yo%

100

80

60

40

20

0  0,5  1,0  1,5 2,0 2,5 3,0  lgх

 

Рис.4 . Линеризованная зависимость % гибели микобактерий от lg (MM) хитозана согласно уравнения (4).

Коэффициент корреляции R рассчитывался из уравнения вида:    (2)

      R= 0,9

  Данные значения R свидетельствуют о тесной линейной связи между % гибели микобактерий и ММ кислоторастворимого хитозана, который осо­бенно эффективен при низких значениях ММ = 4,7,8,5,11.

  Первоначально опыты по определению выживаемости микобактерий были проведены на атипичном тестовом штамме M.smegmatis.bGieTKH M.smegraatic инкубировали с хитозаном краба с ММ-4-396 кДа и хитозаном восковой моли с ММ от 7-177 кДа в концентрациях 0,1% при температуре

370 С, на качалке. После этого пробы титровали и высевали на чашки Петри. В качестве контроля использовали клетки, не обработанные хитозаном. По истечении 72 часов инкубации определяли количество жизнеспособных кле­ток (КОЕ).

Из рис.3 следует, что процент гибели клеток М. smegmatis после 60 мин экспозиции при 37°С и рН 6,8 оставлял 0-76% в зависимости от ММ ис­пытанных хитозанов. Наименьшей чувствительностью клетки обладали к вы­сокомолекулярным образцам хитозана с ММ 96 и 177 кДа. Высокомолеку­лярный крабовый хитозан с ММ 396 кДа в концентрации 0,1 % не обладал антибактерийным действием. Максимальной активностью в отношении кле­ток микобактерий обладали низкомолекулярные хитозаны с ММ 4-8,5 кДа.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что хитозан обладает бактериостатическим действием по отношению к возбудителю туберкулеза ви­дов M.bovis и М. avium, что указывает на перспективность дальнейших исследо­ваний с целью применения его для лечения и профилактики туберкулеза сель­скохозяйственных животных и птиц.

  Наиболее выраженный антимикробный эффект в отношении всех изу­чаемых тест-культур показали препараты кислоторастворимого хитозана с молекулярной массой (ММ) 58 и 87 к Да и степенью деацетилирования 80-80,3% (см.табл. 4).

Таблица 4

Антимикробный эффект хитозана в отношении изучаемых тест-культур

Конц, %

Хитозан, ММ 87 кДа

Хитозан, ММ 58 кДа

0,025

М. avium

М. Bovis

М. fortuitum

М. intracellulare

М. avium

М. Bovis

М. fortuitum

М. intracellulare

0,0 5

+

++++

++++

++++

+

++++

++++

++++

0,075

++++

++

++

++++

++++

++++

0,1

-

+++

++

++

-

+++

++++

++++

0,2

       

++

++

++

       

++

++++

+++

0,3

-

-

+

+

-

-

++++

+

0,5

-

-

+

+

-

-

++++

+

Проведенное исследование позволило сделать вывод, что изучаемые хитозаны, обладающие свободными аминогруппами, оказывали влияние на рост микобактерий. Наличие NH2-rpynn хитозана придает полимеру положи­тельный заряд, в результате чего он способен взаимодействовать с анионны­ми группами поверхности клетки и за счет электростатических и ионных взаимодействий формировать полиэлектролитные комплексы с компонента­ми бактериальной поверхности, вызывая их гибель.

На рис. 5 показано, что при концентрации в среде 0,1% хитозана 58 кДа гибель клеток составила 40% и 50% в случае контакта клеток с хитоза-ном 87 кДа.

Гибель клеток, %

  мол.масса

Рис. 5. Влияние образцов хитозана с различной ММ на гибель клеток М. avium и М. Bovis.

Низкомолекулярный кислоторастворимый хитозан с низким значением ММ обладал антибактериальной активностью по отношению к штаммам ми-кобактерий M.smegmatis и может быть использован в дальнейших исследо­ваниях для инактивации (гибели) других патогенных и непатогенных микро­организмов.

  3.3. Сорбционные свойства хитозана и его применение при

выращивании молодняка сельскохозяйственных животных

Полученный активированный хитозан с высокой абсорбционной емко­стью был испытан как препарат «Энтеросорбент» вначале на лабораторных, а затем на молодняке сельскохозяйственных животных и птицы. По результа­там научно-хозяйственных опытов в хозяйствах Московской, Тульской, Брянской и Курской областей, в том числе в зонах высокого загрязнения поч­вы продуктами распада тяжелых металлов, была проведена оценка лечебного воздействия хитозана при желудочно-кишечных заболеваниях телят и поро­сят, а также его радиопротекторного действия.

Влияние препаратов хитозана на морфологический состав крови телят в условиях плотности загрязнения почв радиоцезием (Брянская область), представлены в таблице 5.

Таблица 5

Влияние применения препарата хитозана на содержание клеток крови и гемоглобина в эритроцитах у молодняка крупного рогатого скота

Группы

Эритроциты,

10.2/л

Гемоглобин, г/л

Гемоглобин в эритроци­тах, г* 109/л

Лейкоциты,

109/л

Гематокрит,

%

Перед началом опыта (п=12)

7,44±0,21

120,50±3,28

16,35±0,66

10,54±0,70

Через 63 суток использования препаратов (п=6)

1.

6,45±1,7

107,10±4,75

1б,66±0,75

10,43±2,31

34,17±0,70

2.

6,26±0,16

104,42±5,16

16,73±0,85

7,56±0,76

35,33±0,76

3.

7,28±0,54

109,00±6,24

15,34±1,37

8,02±0,88*

32,83±1,35

Через 85 суток использования препаратов при убое (п=3)

1.

7,35±0,19

138,67±17,34

18,82±2,12

7,63±1,25

37,00±2,08

2.

8,34±0,19

146,67±20,74

17,51±2,32

10,47±2,14

43,00±1,53

3.

7,22±0,79

110,33±10,41

15,88±3,11

8,70±1,28

36,67±3,71

Опыты по добавке низких доз хитозана к кормовому рациону молодняка сельскохозяйственных животных показали достоверное повышение привесов на 5-6 % у животных опытных групп по сравнению с контролем. Данные о влиянии скармливания хитозана и фитохитодеза (водорастворимого хитозана с экстрактом лекарственных растений) на динамику живой массы телят пред­ставлены на рисунке 6.

Живая масса

  1 2 3

Возрастные группы телят

  Рис.6..Динамика роста живой массы телят при скармливании хитозана и фитохитозана

Проведенные исследования показали, что повышенная удельная активность радиоцезия в рационе животных обусловила ряд негативных изменений, таких как снижение числа эритроцитов, гемоглобина в крови по сравнению с нор­мой. Скармливание дополнительно к основному рациону препаратов хитозана препятствовало развитию этих процессов, т.е. оказало радиопротекторное дей­ствие.

  Высокомолекулярная фракция хитозана обладает бактериостатическим действием, пролонгирует действие растительного экстракта в составе препа­рата, связывает и выводит из организма токсины и ионы тяжелых металлов.

  Олигомеры хитозана, всасываясь в кровь, быстро разносятся по всем органам и тканям, оказывая стимулирующий эффект на иммунную систему и неспе­цифические факторы резистентности организма, в первую очередь посредст­вом активации Т- и В-клеток иммунной системы. Фракции с ММ 50 Кда в ус­ловиях топкого кишечника переходят в коллоидное состояние, в котором усиливаются хелатообразующие и комплексообразующие свойства хитозана оказывают детоксицирующее действие на организм.

3.4.Антиметастатическая активность олигомеров хитозана в фитохитодезтерапии

Исследована антиметастатическая активность олигомеров хитозана. Смесь глюкозамина и его димера (~ 50%) использовалась в качестве адъюванта в комбинированной терапии с цитостатиками в низких дозах в эксперименте по изучению антиметастатической активности на L-карциноме. В опытах были использованы мыши-гибриды BDF, весом 21-22 г. Инокулум составлял (106) опухолевых клеток, вводимых подкожно (табл. 6.).

Таблица 6 Антиметастатическая активность олигомеров хитозана

Препарат

Разовая доза, мг/кг

НИМ.

Глюкозамин + димер

200

35,0

Циклофосфан

30,0

40,0

Цисплатин

1,2

2,0

Циклофосфан + цисплатин

30,0+1,2

57

(Циклофосфан + цисплатин) + (глюкозамин + димер)

(30,0+1,2)+ (200)

98

Как видно из таблицы 6, циклофосфан и цисплатин использованы в низ­ких, неэффективных дозах. Антиметастатический эффект (индекс ингибирования метастазов = ИИМ, %) в этих случаях составлял 40 и 2 %, соответст­венно, а для смеси циклофосфана с цисплатином и этих же количествах (30 + 1,2)  ИИМ= 57. При добавлении олигомеров хитозана этот показатель возрас­тал до 98 %.

Антиметастатический синергизм действия возможен при сочетании оли-гомерной фракции хитозана с компонентами сложного состава экстракта противоонкологического фитосбора. Кроме этого, обнаруженный эффект может быть косвенным подтверждением наличия синергетического антиок-сидантного (и, по-видимому, поливалентного) действия экстрактов ле­карственного сырья, особенно для многокомпонентных фитосборов и при со­четании с полиэлектролитами природного происхождения.

3.5. Изучение биологической антиоксидантной активности хито­зана и его производных

Таблица 7

Антиоксидантная активность различных образцов сырья

природного происхождения

№ п/п

Величина АОЕ

Галоген

Содержание антиоксидантов

Исследуемые образцы сырья

1.

мг на 1 купон

Вг

0,024

Пектин цитрусо­вый

2.

мг на 1 купон

Вг

0,048

Хитозан

3.

мг на 1 купон

Вг

0,0001

Розвератроп

4.

мг на 1 купон

Вг

0,325

Кверцетин

В таблице 7 представлены результаты определения суммарной антиок­сидантной емкости (АОЕ) различных образцов сырья природного происхож­дения кулонометрическим титрованием, которое является методом количест­венной оценки антиоксидантных свойств различных продуктов.

Представленные выше данные свидетельствуют о значительно более высокой антиоксидантной активности хитозана по сравнению с биологически активными веществами растительного происхождения (в 2 раза выше, чем у пектина и в 266 раз, чем у розевератропа).

3.6. Ранозаживляющее свойство хитозана.

Из существующего в настоящее время широкого ассортимента полимерных покрытий на раны и ожоги, рассасывающиеся покрытия в наибольшей степени отвечают всем медико-биологическим требованиям, могут быть полезны как на ранних стадиях лечения ран и ожогов, так и на более поздних стадиях. Следовательно, разработка рассасывающихся прилипающих полимерных покрытий с различными сроками биодеструкции является в настоящее время  актуальным направлением создания эфективных аппликаций на раны и ожоги.

Природный полисахарид хитозан обладает широким спектром действия. Его производные регулируют пролиферацию фибробластов и стимулируют нормальную регенерацию кожи. Болеутоляющее и антимикробное действие обусловлены уникальной способностью хитозана неспецифически взаимодействовать с болевыми рецепторами и клеточной стенкой микроорганизмов. Одной из причин эффективного влияния хитозана на заживление ран является стимулирующее воздействие на иммунную систему, т.к. его можно рассматривать как аналог липополисахаридов клеточных стенок микроорганизмов, выполняющих роль активаторов макрофагов. Существенной проблемой послеожоговых участков являются рубцы, образующиеся в местах регенерации кожи. Использование хитина и его производных позволяет значительно снизить гиперразрастание гранулляционной ткани. Известно, что производные хитина имеют структурные характеристики подобные глюкозаминам кожи и могут служить подложкой для роста кератиноцитов и фибробластов.

Начиная с 3 дня после нанесения ран ежедневно накладывали хитозановые пленки (1 опытная группа крыс), 200 мг левомиколя (2 опытная группа крыс) и физраствора (контрольная группа). Раневую поверхность оценивали планиметрически в день образования ожога, после 3,6,11 и 15 обработок препаратами.

Результаты изучения скорости выхода анестезина в водную среду из хитозановой пленки представлены на рис.7. Как видно из представленных экспериментальных данных выход анестезина происходит не сразу. За первые 2 часа выходит около 35%. Далее в течение последующих 10 часов выход постепенно снижается. Кинетика выхода носит диффузионный характер. Полученная зависимость позволяет говорить о том, что в пленке анестезин распределен совместно с хитозаном, который и пролонгирует выход.

Полученные данные позволяют полагать, что биоактивный слой покрытия с анестезином и хитозаном позволит пролонгировать анестезирующее действие раневого покрытия.

Рис. 7. Кинетика выхода анестезина из пленочного слоя хитозана

Результаты планиметрической оценки раневой поверхности при химическом и термическом ожогах представлены в таблицах 8 и 9. После 3-х кратных аппликаций хитозана и левомиколя гиперемия и отечность отсутствовали, раневая поверхность уменьшилась на 54% по сравнению с контролем (табл.8). Еще более значительные результаты были достигнуты после 6 аппликаций, а полное заживление ран и полноценное восстановление волосяного покрова наступало соответственно к 10 и 12 дню лечения. При этом образовавшаяся при регенерации ткань была очень похожа на интактную кожу. В контрольной группе полное восстановление раневой поверхности происходило только к 15 дню, волосяной покров восстанавливался не полностью.

На начальном этапе лечения химического ожога процент уменьшения раневой поверхности в группе животных, где применяли хитозановую пленку составил 8-11%, а к 11 дню лечения – 60% по сравнению с контролем. Полное заживление наступало на 15 сутки лечения, а в контроле – на 21 сутки.

Таблица 8

Динамика сокращения раневой поверхности после термического ожога

Группы

Количество аппликаций

3

6

11

Хитозан

45,7±3,8

17,0±2,7

0

Левомиколь

44,9+2,6

25,8+4,8

7,3+1,1

Контроль

96,7±4,5

64,1+3,8

27,0+2,1

Р<0,05

  Таблица 9

Динамика сокращения раневой поверхности после химического ожога

Группы

Количество аппликаций

3

6

11

15

Хитозан

80,7+1,8

42,0±2,3

18,9+1,7

0

Левомиколь

78,9+2,1

45,2+1,8

27,0+1,3

9,0+1,2

Контроль

90,7+2,5

51,4+1,8

33,7+2,4

14,8+2,3

Р<0,05

       По данным, представленным в табл.9 видно, что стимулирующее действие хитозана и левомиколя в начале лечения существенно не отличается. Но к 11 суткам лечения эффективность хитозана возрастает до 23% по сравнению с левомиколем, а полное восстановление кожного покрова происходит на 3 суток быстрее.

       

3.7. Влияние ферментного препарата коллагеназы на функционально-технологические свойства мясопродуктов

Учитывая актуальность проблемы рационального использования мясного сырья, были проведены исследования по изучению влияния ферментного препарата коллагеназы различной концентрации на функционально-технологические свойства таких мясопродуктов, как голяшки говяжьи коп­чено-вареные и зельц.

В работе использован ферментный препарат коллагеназа. Изучали влия­ние препарата на функционально-технологические свойства сырья и готового продукта. Фермент вводили в концентрациях 0,03%, 0,05% и 0,1% до стадии термообработки (образцы №1,2 и 3 соответственно).

  Оценивалось качество продукции по следующим показателям: содержа­ние влаги, содержание сухих веществ, содержание связанной влаги, потеря массы, общая органолептическая оценка.

Полученные данные представлены в таблицах 10 и 11 .

Из таблицы 10 следует, что до термообработки лучшие результаты по сравнению с контрольным образцом, выявлены у ферментированного сырья с 0,03% концентрацией коллагеназы, а именно, у образца №1 отмечено боль­шее на 8,2% и 6,7%, соответственно содержание общей и связанной влаги.

Таблица 10

Функционально-технологические свойства голяшек говяжьих копчено-вареных с добавлением ферментного препарата коллагеназа

Показатели

До термообработки

После термообработки

Контроль

1

2

3

контроль

1

2

3

Содержание вла-ги,%

62,7

70,9

70,6

68,7

28,7

32,5

32,1

37,7

Содержание су­хих веществ, %

32,0

25,0

28,9

21,5

-

-

-

-

Содержание свя­занной влаги, % к фаршу

64,4

71,1

71,3

73,9

Содержание свя­занной влаги, % общей  влажно­сти

94,6

94,8

86,2

94,1

Потеря массы, %

-

-

-

-

18,0

31,8

37,0

38,5

Общая органо­лептическая оценка, балл

3,9

4,2

3,9

3,7

Образцы №2 (0,05%о) и №3 (0,1%), в свою очередь, также имели на 7,9% и 6,0% большее содержание влаги по сравнению с контрольным образ­цом без ферментативного воздействия, но наряду с такой положительной ди­намикой у них были отмечены большие потери массы после термообработки и меньшее содержание связанной влаги (на 19,0-20,5%) и 0,6-8,4% соответст­венно).

С увеличением концентрации вносимого ферментного препарата у го­тового продукта отмечалось появление мажущейся консистенции. Данную тенденцию, по нашему мнению, можно использовать при производстве паш­тетных масс и ливерных колбас.

Таблица 11

Функционально-технологические свойства зельца с добавлением ферментного препарата коллагеназы

Показатели

До термообработки

После термообработки

Контроль

1

2

3

контроль

1

2

3

Содержание вла-ги,%

63,3

68,2

63,8

66,3

69,1

71,2

72,1

72,3

Содержание су­хих веществ, %

49,9

46,2

48,1

52,5

-

-

-

-

Содержание свя­занной влаги, % к фаршу

48,2

51,7

50,7

46,8

Содержание свя­занной влаги, % общей  влажно­сти

96,0

99,0

97,7

97,7

Потеря массы, %

-

-

-

-

40,0,0

46,7

53,3

56,7

Общая органо-лептическая оценка, балл

4,1

4,3

4,3

4,5

Анализируя данные исследований применения коллагеназы при произ­водстве зельца (таблица 11) можно сделать вывод, что, как и в случае с го­ляшками говяжьими, лучшими функционально-технологическими свойства­ми отличался образец с 0,03% концентрацией ферментного препарата.

Таким образом, в результате анализа полученных экспериментальных данных установлено, что использование ферментного препарата коллагеназы улучшает качественные характеристики готового продукта при внесении его в мясное сырье в 0,03% концентрации и значительно сокращает длительность термообработки в среднем на порядок.

Обработку мясного сырья большими концентрациями препарата целесо­образно применять при производстве ливерных колбас и паштетных масс, так как это позволяет хорошо размягчать низкосортное сырье с высоким содер­жанием соединительной ткани и внедрить безотходные технологии для ра­ционального использования сырья в мясоперерабатывающей промышленно­сти.

  Органолептическая оценка показала, что внесение ферментного препарата в концентрации 0,03% в сырье при производстве продуктов из говядины не оказывало существенного влияния на вкус, запах, внешний вид и т.д., то есть не ухудшало органолептические характеристики исследуемого готового про­дукта. Голяшки говяжьи с 0,05% и 0,1% концентрацией ферментного препа­рата немного уступали контрольному и опытному (0,03% фермента) образ­цам.

3.8. Производство лечебно-профилактических кормовых белковых добавок-синбиотиков для сельского хозяйства

Биомасса дрожжей и, прежде всего сахаромицетов вполне соответству­ет понятию «пребиотик» и влияет не только положительно на развитие мик­роорганизмов пробиотиков в кишечнике животного или птицы, но составляет основу белкового питания самого животного. Комплексы пробиотиков с пре-биотическими веществами можно комбинировать, создавая новые биологи­чески активные препараты «синбиотики», в которых живые микроорганизмы сочетаются с субстратами, стимулирующими их рост.

В кормовой продукт «Провит» входит и мицелий гриба Fusarium

sambucinum, который также обладает высокой питательной ценностью и це­лебными свойствами.

Образцы кормовых белковых добавок-синбиотиков были направлены в институт птицеводства для испытаний на цыплятах бройлерах.

В результате этих испытаний было установлено, что в процессе роста в течение 35 суток в опытной группе живая масса птицы достигла 2090,6 г, то­гда как в контрольной - 1991,47, т.е. на 5,0% ниже.

Среднесуточный прирост в опытной группе превысил контроль на 5,1%. При этом затрата корма на 1 кг прироста в опыте на 6,9% ниже.

В результате испытаний сохранность птицы была высокой и в опыте и в контроле, однако в опыте она составила 100%, а в контроле только 98,6%.

В настоящее время штамм S.cerevisiae diastaticus ВКПМ-у-1218 вне­дрен в качестве продуцента кормового белкового продукта «Провита», кото­рый выпускает Новополоцкий завод БВК (Республика Беларусь).

Актуальность проблемы позволяет проводить исследования по созда­нию новых пробиотиков, профилактических и терапевтических биопрепара­тов на их основе, в т.ч. полученных с помощью методов генной инженерии.

3.9. Кормовая биологическая добавка для выращивания цыплят бройлеров

Биологическая кормовая добавка (цеолит + культура Echerichia coli VL 613) была испытана для замены кристаллического лизина в кормовом рацио­не при выращивании цыплят бройлеров. Суточная доза кормовой добавки состояла из 2% цеолита от разовой дачи комбикорма и 200 млн культуральных микроорганизмов на 1-го цыпленка в день.

После высушивания контактно-конвекционным способом полученная смесь представляла собой сыпучий порошок, который легко перемешива­ется с комбикормом. Препарат расфасовывали в стерильные пластмассовые флаконы или полиэтиленовые пакеты и затем герметично их укупоривали.

В период выращивания учитывали основные зоотехнические показате­ли: сохранность поголовья, потребление корма, среднесуточный привес цып­лят, вес тушки после откорма. В 21-и -дневном возрасте средняя масса  одного цыпленка в опытной группе составил 780 г, в контрольной - 760 г, что на 2,6% ниже, чем в опытной. Полученные результаты подтверждают эффек­тивность кормовой добавки.

Во второй период выращивания добавки кристаллического лизина в рационе контрольной группы были выше и составляли 260 г на 100 кг корма. В опытной группе доза кормовой добавки остава­лась без изменения.

На 37-е сутки живая масса тушки контрольной и опытной групп была 2150г. и 2100г., соответственно. Снижение живой массы тела в опытной группе на 50г по сравнению с контрольной связано с недостаточным количе­ством поступающего  в этот период лизина в организм цыплят. Чтобы его восполнить до необходимой величины, требуется в период с 21 по 37-й день увеличить количество микробных клеток Echerichiacoli VL 613.

Следовательно, кормовая добавка (цеолит+E..coli) может служить заме­ной кристаллического лизина и подтверждены ее эффективность при выра­щивании бройлерных цыплят.

3.10. Испытание автолизата хлебопекарных дрожжей в составе питатель­ной среды при производстве препарата «Ларвиоль -паста»

Проведены испытания опытных образцов автолизатов хлебопекарных дрожжей, изготовленных по разработанной во ВНИТИБП технологии, в со­ставе питательной среды при производстве препарата «Ларвиоль - паста». Препарат предназначен для борьбы с личинками кровососущих комаров, соз­дан на основе энтомопатогенной культуры Bacillus thuringiensis (штамм ИПМ - 1501), содержит действующее начало - кристаллы дельта - эндотоксина.

По разработанному технологическому режиму было изготовлено 4 опытно - промышленные серии автолизата. Физико-химические характери­стики изготовленных серий представлены в таблице 12 .

Таблица 12

Физико-химические показатели опытных серий автолизата хлебопекарных дрожжей

п/п

Наименование показателя

Серия препарата, №

1

2 3

4

1

Внешний вид

аморфный порошок от светло-кремового до свет­ло-коричневого цвета

2

Массовая доля влаги, %

4,30

4,02

3,92

3,92

3

Массовая доля аминного азота, %

3,0

3,02

3,03

2,87

4

Количество, кг

107

121

122

137

Было изготовлено 5 партий препарата «Ларвиоль - паста» объемом от 115 л до 400 л. Биологическая активность каждой партии препарата была определена в соответствии с требованиями технической документации на тест - объекте - личинках комаров Aedes aegipty. Результаты исследований полученных партий препарата «Ларвиоль - паста» представлены в таблице 13.

Таблица 13

Биологическая активность препарата «Ларвиоль - паста» на

личинках комаров Aedes aegipty

№ партии

Объем партии, л

РН

ЛК50, мл/л

1

117

4,7

0,00025

2

115

4,8

0,00023

3

350

4,8

0,00035

4

395

4,7

0,00038

5

400

4,6

0,00032

Все  изготовленные  серии  отвечают  требованиям  нормативно-технической документации (рН 4,5-5,0, биологическая активность

  < 0,0004 мл/л).

3.11. Яично-дрожжевой гидролизат в качестве лечебно-профилактической подкормка для пчел

Была разработана технология и изготовлены 4 опытные серии яично-дрожжевого гидролизата по 2,4; 3,6; 5,2 и 6,9 кг, каждая. Все изготовленные

серии были исследованы по основным физико-химическим характеристикам (см.табл.14).

При испытании препарата на пасеке учхоза «Леоновский» Московской области было установлено, что для компенсации белковой недостаточности в весенне-летнее время необходимо давать 30-50 мл препарата на 1 л сиропа или 1 кг канда, а при подкормке на зиму по 10 мл на 1 л сиропа. Подкормка пчел на зиму сиропом, содержащим яично-дрожжевой гидролизат, обеспечи­вает 100% профилактику нозематоза.

Применение препарата в совхозе «Малынь» Щекинского района Туль­ской области позволило получить на пасеке в среднем на семью по 10 кг то­варного меда, при этом подопытная группа пчелиных семей превосходила контрольную по этому показателю на 6-8 кг меда.

Таблица 14

Физико-химические показатели качества опытных

серий яично-дрожжевого гидролизата

№ п/п

Наименование показателя

Серия препарата

1

2

3

4

1

Внешний вид

Тонкодисперстный порошок от светло - бежевого до темно -

бежевого цвета

2

Остаточная влажность, %

6,2

3,2

6,0

8,2

3

Массовая доля

аминного азота,

%

5,2

5,6

7,0

5,7

4

рН 1%-ного рас­твора

5,6

5,7

5,9

5,8

5

Количество, кг

2,4

3,6

6,9

5,2

Опытные серии гидролизата в сухом и жидком виде прошли испытания на пчелах для профилактики и лечения нозематоза, повышения устойчиво­сти к заболеваниям, ускорения наращивания силы семей, при выходе маток, получении маточного молочка, пыльцы и пчелиного яда, а также для компен­сации белковой недостаточности в весенне-летнее время.

3.12. Исследование in vitro антагонистической активности и чувстви­тельности к антибиотикам бактерий-пробиотиков L.Plantarum

шт. М-30 и B.Subtilis mm. B-1948

Наиболее значимыми, с точки зрения терапевтической эффективности и технологичности, параметрами штаммов микроорганизмов для производства пробиотиков являются экологическая принадлежность и принадлежность к физиологическим симбионтам, устойчивость к лизоциму, желчи и пищева­рительным сокам, к антимикробным препаратам, высокая адгезивность и ан­тагонистическая активность по отношению к патогенным и условно патоген­ным микроорганизмам.

Во ВНИТИБП разработан комплекс препаратов для птицеводства «Ави-лакт-форте», содержащий препарат «Авилакт-1К» (пробиотик на основе Lactobacillus acidophilus) и «Авистим» (пребиотик на основе культуралыюй жидкости высшего лечебного гриба Fuisarium sambucinum).

В 2006 году начаты исследования по разработке высокоэффективного синбиотического комплекса для птиц на основе препарата «Авилакт-форте» путем введения в его состав симбионтов ЖКТ (Lactobacillus plantarum M-30 и Bacillus sublilis B-1948) и азотобактерии (Azolobacler chroococcum).

С этой целью в рамках доклинических испытаний исследована in vitro антагонистическая активность и чувствительность к антибиотикам бактерий L.plantarum, шт. М-30, и B.subtilis, шт. В-1948.

Антагонистическую активность пробиотиков in vitro исследовали ме­тодом отсроченного антагонизма в отношении патогенных и условно пато­генных микроорганизмов: S.tuphimurium, S. dublin, S. gallinarum, 3-х штам­мов E.coli: IC88, K-99, A-20, а также полевого изолята E.coli выде­ленного от больной птицы в условиях опытного птицехозяйства.

Об антагонистической активности штаммов судили по величине зоны задержки роста тест-культур. Полученные результаты представлены в таб­лице 15.

Таблица 15

Результаты определения антагонистической активности бактерий B.subtilis  и L.plantarum шт. М-30 

Патогенные микроорганизмы

Зона задержки роста, мм (п=3)

B.subtilis

L.plantarum

S.tuphimurium

13-15

5-7

S. dublin

16-18

7-9

S. gallinarum

21-25

7-9

E.coli: K-88

18-22

6-8

E.coli: K-99

18-20

7-9

E.coli:A-20

21-25

6-8

E.coli: (полевой изолят)

19-21

10-12

Величина зоны угнетения определяет чувствительность микроба к: дан­ному антибиотику. Диаметр зоны задержки роста бактерий измеряли линей­кой с точностью до 1 мм, оценка результатов представлена в таблице 16.

Таблица 16

Расшифровка результатов опытов

Ключ к расшифровке результатов опыта

Диаметр зоны задержки

поста, мм

Чувствительность микроорганизма

25

высокочувствительный

15-25

чувствительны

11-15

умеренно чувствительный

11

устойчивый

Результаты определения чувствительности бактерий-пробиотиков  к ряду широко применяемых антибиотиков приведены в таблице 17.

  Таблица 17

Результаты определения чувствительности бактерий-пробиотиков к ряду широко применяемых антибиотиков

№ п/п

Антибиотик

Диаметр зоны задержки роста (мм)*

Вид пробиотика

L.plantarum

B.sublilis

1.

Кламоксил

50

24

2

Левомицетин

39

4

3

Тетрациклин

37

8

4

Цефазолин

29

22

5

Ампициллин

28

4

6

Рифампицин

27

16

7

Гентамицин

22

4

8

Офлоксацин

12

12

9

Ципрофлоксацин

12

12

10

Энрофлоп (5%)

12

9

11

Флавомицин

11

8

12

Линкомицин

11

9

Показано, что лактобактерии являются высокочувствительными к кла-моксилу, левомицетину, тетрациклину, цефазолину, ампициллину, рифампи-цину и гентамицину; умеренно чувствительными к офлоксацину, ципролок-сацину, энрофлону, флавомицину и линкомицину.

Наилучшие экономические показатели были получены при использова­нии пробиотика в сочетании с однократным применением антибиотиков за счет повышения сохранности на 3,0-3,3%, выхода мяса - на 0,7-1,3%. При этом рентабельность производства мяса бройлеров в этих группах составила 57,5 и 58,3%, что на 0,1-0,8 выше.

3.13. Обеспечение качества и безопасности производства биологиче­ски активных веществ в биотехнологии

Разработка и изготовление многих биологически активных веществ от­носится к потенциально опасным технологиям, так как сырьем в некоторых случаях служат микроорганизмы различной степени патогенности и вещест­ва белковой природы, обладающие сенсибилизирующим действием на био­систему.

Для обеспечения безопасности производства БВК необходимо разработать и использовать документацию и методики согласно требованиям GMP и ИСО:

-        методика анализа и обеспечения антиконтаминантной защиты техноло-
гических процессов производства БВК с учетом требований GMP;

-сформулировать исходные требования к технологическому оборудова­нию по обеспечению стерильности при производстве БАК;

-        проанализировать и определить стадии БВК с использованием очистных
помещений, согласно норм на микробиологическую чистоту и классов зон в
зависимости от стадии производства.

Важным аспектом деятельности биологического предприятия является охрана окружающей среды, для чего создаются барьерные технологии, по­зволяющие минимизировать или предотвратить выделение микроорганизмов не только в производственную среду, но и за пределы производства. Эту ра­боту проводят с учетом рекомендаций МС серии 14000 (экологический ме­неджмент).

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

       1. Использование хитозанов и его производных для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных (Св. о гос.регистрации лекарственного средства от 15.05.2007г.).

       2. Получен аттестат ФГУ «ВГНКИ» на лекарственное средство для животных «Хитозан» от 11.02.2008г.

       3. Разработаны и утверждены Технические условия «ТУ -9289-008-11734126-05» на хитозан.

       4. Разработана и утверждена Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору инструкция по применению «Хитозана» для профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка с/х животных от 15.05.2007г.

       5. В результате проведенных исследований получены 3 патента, отчеты о результате изучения эффективности введения в рацион телят хитозана и фитохитозана, акты о применении низкомолекулярного хитозана на телятах и цеолита в сочетании c E.coli  VL 313 при выращивании циплят бройлеров (материалы патентов, отетов и актов прилагаются).

5. ВЫВОДЫ

1. Мембранное разделение и использование препаратов низкомолеку­лярного хитозана стимулирует механизмы гомеостаза у животных, усиливает антителогенез и увеличивает титры циркулирующих в крови антител, а также

активирует факторы, характеризующие гуморальную и неспецифическую защиту организма.

  1. Низкомолекулярный хитозан обладает высокой антибактериальной активностью по отношению к штаммам микобактерий. Антимикробные свойства хитозана позволяют рекомендовать его с целью применения для профилактики и лечения туберкулеза в медицине и ветеринарии, в частности, в птицеводческой отрасли.
  2. Для повышения сорбционных свойств хитозана проведена его акти­вация и получен сорбент емкостью на 40-60% выше исходного полимера, оп­ределены оптимальные условия его растворения, переосаждения, концентри­рования и режимы высушивания. Полученные данные свидетельствуют, что скармливание хитозана и фитохитоза телятам обуславливает их увеличение живой масы к 101-суточному возрасту более, чем на 5% по сравнению с кон­тролем.
  3. Исследована антиметастатическая активность олигомеров хитозана, которая проявляется при сочетании олигомерной фракции хитозана с компо­нентами сложного экстракта противоонкологического фитосбора.
  4. Показано, что высокомолекулярная фракция хитозана обладает ан-тиоксидантной активностью, пролонгирует действие растительного экстракта в составе препарата, связывает и выводит из живого организма токсины и ионы тяжелых металлов.
  1. Хитозан ускоряет регенерацию поврежденных тканей кожии направляет процесс по органотипичному пути при заживлении ран после термического и химического ожогов.
  2. Экспериментально установлено, что использование ферментного препарата коллагеназы в 0,03% концентрации улучшает качественные харак­теристики мясных продуктов и сокращает длительность термообработки.

8.        Для нужд животноводства и птицеводства разработаны, успешно ис­пытаны и налажено производство синбиотиков - лечебно-профилактических
кормовых добавок.

9. Показана возможность при выращивании цыплят бройлеров при
замене в кормовой биологической добавке дорогого кристаллического лизина на цеолит + Echerichia coli VL.

  1. Доказано, что автолизат хлебопекарных дрожжей может быть ис­пользован в составе питательной среды при производстве препарата против кровососущих (личинок комаров Aedes aegipty).
  2. Установлено, что яично-дрожжевой гидролизат является эффектив­ным препаратом для применения его в пчеловодстве в качестве лечебно-профилактической подкормки против нематоза.
  3. Установлено, что бактерии L.plantarum, шт. М-3,0, B.subtilis, шт. В-1948, обладают достаточной устойчивостью к широкому кругу антибиоти­ков, что позволяет сочетать антибиотико- и пробиотикотерапию в случае уг­рожающей ситуации в сельском хозяйстве.
  1. Проведенные исследования позволили повысить эффективность фитопрепаратов на основе хитозана полифракционного состава, как надеж­ных многоцелевых препаратов, практически не вызывающих осложнений и нежелательных побочных явлений.
  2. Основной задачей производств, выпускающих БАВ является обес­печение качества препарата, безопасности изготовителя, потребителя и ок­ружающей среды.
  3. Использование хитозана, препаратов на его основе в качестве добавок к питательным средам позволило разработать и практически осуществить современную технологию производства вакцин (Болезни Марека) и гипериммунных сывороток против гемофиллеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней.

6. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Албулов А.И., Шинкарев СМ., Фролова М.А., Крыжановская Е.В., Чул­ков А.К., Гринь А.В., Шмидт Е.В. Сорбционные свойства хитозана и их примене­ние при выращивании молодняка сельскохозяйственных животных и птиц. //Сборник научных трудов ГОУ Прикаспийского зонального. научно-исследовательского ветеринарного института «Основные проблемы ветеринар­ной медицины и стратегия борьбы с заболеваниями с/х животных в современных условиях», Махачкала. - 2007. - С.251-254.

2.Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Крыжанов­ская Е.В., Чулков А.К. Поствакцинальные антитела как критерий напряженности иммунитета птиц к болезни Марека /Мат. Ш межд.ветеринарного конгресса по птицеводству, - Москва,. - С. 121-125.

3. Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Крыжановская Е.В., Чулков А.К. Сухая бивалентная вакцина против болезни Марека // /Мат. Ш межд.ветеринарного конгресса по птицеводству, - Москва,. - С. 125-129..

4.Матвеева И.Н., Сивков Г.В., Гринь С.А., Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Кры­жановская Е.В., Чулков А.К. Концентрирование и очистка вируса аденовирусной инфекции крупного рогатого скота //Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биоло­гических препаратов», Щелково. -2007. -С. 129-131.

5.        Ярыгина Е.И., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Крыжановская Е.В., Чул­ков А.К. Вакцинация стимулирует усиление вирулентных свойств вируса болезни
Марека // /Мат. Ш межд.ветеринарного конгресса по птицеводству, - Москва, -
С.131-134.

  1. Ярыгина Е.И., Румянцева И.В., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Крыжановская Е.В., Чулкова А.К. Антигенные свойства неинфекционных препаратов вируса герпеса индейки // /Мат. Ш межд.ветеринарного конгресса по птицеводству, - Москва, - С.135-136.
  2. Сивков Г.В., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А., Матвеева И.Н., Крыжановская Е.В., Чулков А.К. Разработка компонентов тест-системы ИФА для определения уровня антител к возбудителю аденовирусной инфекции крупного рогатого скота //Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щел­ково.-2007.-С. 132-137.
  3. Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А., Матвеева И.Н., Крыжановская Е.В., Чулков А.К. Разработка тест-системы ИФА для изучения иммунологической активности вакцин против пастереллеза животных //Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринар­ных биологических препаратов», Щелково. -2007. -С.234-238.

9.Гринь С.А., Школьников Е.Э., Коломнина Г.В., Меныненин В.В., Крыжа­новская Е.В., Чулков А.К., Скородумов Д.И., Ставцева Л.Я., Малик Е.В. Получе­ние гипериммунной сыворотки против гемофилеза, стрептококкоза и пастерелле-

за на свиньях-продуцентах //Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических пре­паратов», Щелково. -2007. -С.250-253.

10. Албулов А.И., Клюкина В.И., Крапивина Е.В., Иванов Д.В., Кузнецов П.А., Шмидт Е.В., Крыжановская Е.В. Эффективность применения хитозана на фоне вакцинации телят против пастереллеза //Материалы международной науч­но-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково. -2007. -С.266-270.

       11.Голуб Ю.С., Албулов А.И., Шмидт Е.В., Фролова М.А., Шинкарев СМ., Гринь А.В., Крыжановская Е.В. Изучение антимикробного эффекта хитозана в отношении возбудителей туберкулеза // Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биоло­гических препаратов», Щелково. -2007. -С.270-275.

  1. Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Еремец Н.К., Еремец В.И., Самуй-ленко А.Я., Крыжановская Е.В. Исследование in vitro антагонистической актив­ности и чувствительности к антибиотикам бактерий-пробиотиков // Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производ­ства ветеринарных биологических препаратов», Щелково. -2007. -С.284-289.

13.Скичко Н.Д., Школьников Е.Э., Гуславский А.И., Крыжановская Е.В. Кормовые биологические добавки для выращивания бройлерных цыплят // Мате­риалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково. -2007. -С.292-295.

14. Албулов А.И., Фролова М.А., Гасанова Л.А., Соколова Э.И., Кулиева И.М., Крыжановская Е.В.  Результаты испытания автолиза хлебопекарных дрож-

жей в составе питательной среды при производстве препарата «Ларвиоль-паста» // Материалы международной научно-практической конференции «Научные ос­новы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково. -2007. -С.295-297.

15Албулов А.И., Фролова М.А., Гасанова Л.А., Тюрина М.Ю., Крыжанов­ская Е.В. Яично-дрожжевой гидролизат - эффективная лечебно-профилактическая подкормка для пчел» // Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биоло­гических препаратов», Щелково. -2007. —С.314-316.

  1. Воробьева Г.И., Максимова Г.Н., Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Еремец В.И., Самуйленко А.Я., Крыжановская Е.В. Производство лечебно-профилактических кормовых белковых добавок-синбиотиков для сельского хо­зяйства // Материалы международной научно-практической конференции «Науч­ные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково. -2007. -С.373-376.
  2. Кузнецов П.А., Албулов А.И., Клюкина В.И., Гринь С.А., Крапивина Е.Б., Иванов Д.В., Крыжановская Е.В. Изучение иммуномодулирующих свойств сукцината хитозана // Ветеринария и кормление, №5. -М.:, 2007. - С. 12-13.
  3. Албулов А.И., Шмидт Е.В., Варламов В.Г., Останина Е.С., Голуб Ю.С., Голуб О.Ю., Крыжановская Е.В. Противотуберкулезная активность хитозана // Ветеринария и кормление, №5. -М.:, 2007. - С. 10-12.
  1. Крыжановская Е.В., Албулов А.И., Рубан Е.А., Самуйленко А.Я., Шинкарев СМ., Фролова М.А, Еремец Н.К., Бондарева Н.А., Хабаров В.Б., А.В. Гринь. Антимикробный эффект кислоторастворимого хитозана // Вете­ринария и кормление, №5. -М.:, 2007. - С.
  2. Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Еремец Н.К., Самуйленко А.Я., Крыжановская Е.В., Чулков А.К. Вопросы обеспечения безопасного производства иммунобиотехнологических ветеринарных препаратов //Тезисы доклада Ш Меж­дународного ветеринарного конгресса по птицеводству. М.2007. - С.59-60.
  3. Крыжановская Е.В., Албулов А.И., Самуйленко А.Я.,.Шинкарев СМ, Фролова М.А., Гринь А.В., Хабаров В.Б. Сорбционные и адъювантные свойства хитозана. /Журн. «Ветеринария и кормление» № 4. – 2008. – С. 34-35.
  4. Крыжановская Е.В. Биологически активные вещества в ветеринарии //Достижения науки и техники агропромышленного комплекса, №8. –М.-2008.-С.30-31.
  5. Крыжановская Е.В, Гринь А.В., Шинкарев СМ., Фролова М.А., Албулов А.И., Бондарева Н.А., Хабаров В.Б., Еремец Н.К., Рахманина Е.В., Бараковский И.А.. Изучение антимикробного действия низкомолекулярных фракций хитозана на микобактерии. /Журн. «Ветеринария и кормление» № 6. – 2008. – С.31-33.

24.        Скичко Н.Д., Гуславский А.И., Самуйленко А.Я., Школьников
Е.Э., Красуткин С.Н., Чипиус Ю.Г., Висящая Т.Ф., Гринь С.А., Крыжановская Е.В., Чулков А.К.. Способ увеличения выхода культуры клеток из пе­репелиных эмбрионов.

  1. Школьников Е.Э., Коломнина Г.Ф., Гринь С.А., Самуйленко А.Я., Шегидевич Э.А., Ставцева Л.Я., Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Крыжа­новская Е.В.. «Способ получения гипериммунной сыворотки против гемо­филеза и пастереллеза свиней». Заявка на патент № 2006131443 от 1.09.2006г.Н.Д. Заявка на патент № 2006131443 от 1.09.2006 г.
  2. Школьников Е.Э.,.Коломнина Г.Ф, Самуйленко А.Я.,.Гринь СА, Шегидевич Э.А., Ставцева Л.Я., Сидоров М.А.,.Скородумов Д.И., Панин А.Н., Малик Е.В., Крыжановская Е.В., Чулков А.К.. «Способ получения ги­периммунной сыворотки против гемофилеза, стрептококоза и пастереллеза свиней». Заявка на патент № 2007123692 от 20.06.2007г.
  3. Крыжановская Е.В., Шинкарев С.М., Фролова М.А., Еремец Н.К., Гринь С.А., Люлькова Л.С., Албулов А.И., Рубан Е.А. Изучение влияния хитозана на микроорганизмы //Ветеринария и кормление, №4. – М.:2008. –С.34-35. /Журн. «Достижения науки и техники в АПК» № 11. – 2008. – С. 45-46.
  4. Крыжановская Е.В., Варламов В.П., Самуйленко А.Я., Албулов А.И., Шинкарев С.М., Фролова М.А., Еремец Н.К., Бондарева Н.А., Хабаров В.Б., Гринь А.В. Изучение антимикробного действия хитозана //Сельскохозяйственная биология, №6. -2008.
  5. Антонов С.Ф., Крыжановская Е.В., Филиппов Ю.И., Шинкарев С.М., Фролова М.А. Изучение ранозаживающих свойств хитозана //Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук, -№6. – 2008. –С.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.