WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

 

Косимов Раджабек Бобораджабович

БИОХИМИЧЕСКИЕ  ОСОБЕННОСТИ  ИНГИБИРОВАНИЯ МЕЛАНОГЕНЕЗА  ШЕРСТИ  У  ОВЕЦ

Специальность:  03.00.04 – биохимия

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

       

Душанбе - 2009

Работа выполнена в Таджикском аграрном университете (Душанбе).

Научный консультант:  академик Российской академии 

сельскохозяйственных наук, Академии наук

Республики Таджикистан и Таджикской

академии сельскохозяйственных наук, доктор

сельскохозяйственных наук, профессор

  Алиев Гулям  Алиевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

  Сабурова Анна Мухамадиевна

доктор биологических наук

Крамеров Дмитрий Александрович

  доктор сельскохозяйственных наук,

Рахимов Шарофджон Тохирович.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха

  Российской академии наук.

Защита состоится «19» июня 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 737.004.05 по защите докторских диссертаций при Таджикском национальном университете по адресу: 734025, Республика Таджикистан, г. Душанбе, пр. Рудаки, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Таджикского  национального университета.

Автореферат разослан  «____» _______________2009 года.

Размещен на сайте ВАК www vak. ed. gov.ru

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук З. М. Хамрабаева 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Формирование пигмента меланина в шерсти овец и его ингибирование - весьма сложный комплексный процесс, на течение которого влияет множество факторов. К настоящему времени проведено большое количество исследований, посвященных разработке различных аспектов проблемы депигментации волосяного покрова животных.

  Проанализировав ряд работ (Лях C. П. 1981; Oconto Sachiko, 2001), можно прийти к выводу, что абсолютное и относительное количество эумеланиновых и феомеланиновых гранул в волосах, определяющих окраску, следует рассматривать как окончательный результат деятельности меланоцитов и их взаимодействие с кераноцитами.

  Фирагут Дж. А. с соавторами  (2003) установили, что главные процессы меланогенеза осуществляются в меланоцитах – большая часть факторов, ингибирующих процесс, действует именно на этом этапе. Факторы биохимического и генетического характера, контролирующие количество и качество активных молекул фермента тирозиназы, оказывают прямой эффект на течение меланогенеза. Вероятно, именно эта возможность изменения активности основного фермента реализуется в качестве одного из основных регуляторных механизмов процесса (Farragut J.A.et al., 2003).

  По мнению других ученых (Ватти К.В., 2001; Sealy Roger, 2002), премеланосомы, формирующиеся в комплекс Гольджи, имеют специфическую сложную упорядоченную структуру белкового матрикса, листки которого связываются с определенным числом молекул тирозиназы. Нормальное функционирование этих своеобразных органелл, безусловно, контролируется биохимическими факторами и может ингибироваться какими-либо внешними агентами, поступающими в меланоцит.

  По данным Prota G. (2005), важным регуляторным механизмом, контролирующим эффективность работы меланоцита, следует считать изменение способности клетки поддерживать внутреннюю стабильную химическую среду (например, концентрацию цистеина или глутитиона). Другие ученые (Махмудов М., 1998; Holstein J. et. al., 1971; Lloyd Tom 2005) установили, что недостаток меди в рационах пигментированных животных ослабляет окраску шерсти. Биосинтез меланина ингибируется также при понижении концентрации в клетке свободного тирозина, при недостаточно высокой концентрации тирозиназы, необходимой либо для быстрого превращения тирозина в ДОФА, либо при увеличении содержания в среде конкурентных веществ, например фенилаланина.

  Мы считаем, что для полного выявления факторов, ингибирующих меланогенез шерсти у овец, необходимо исследовать влияние биохимических, молекулярно-клеточных и генетико-селекционных факторов. Большой интерес в качестве объекта для подобных исследований меланогенеза представляет таджикская порода овец, так как селекционировалась она по шерстной продуктивности, что привело к глубоким преобразованиям характера волосяного покрова, формированию новых свойств волосяных фолликулов. Так, при достижении овцами 8-9-месячного возраста в волосяных фолликулах (около 96%) шерстного покрова синтез пигмента меланина приостанавливается.

  Одним из подходов изучения природы факторов, контролирующих ингибирование меланогенеза, является комплексное исследование биохимических механизмов блока пролиферации в меланоцитах. Клетки меланосом приобретают свойства, терминальной дифференцированности, когда определенные участки ДНК, в частности блок генов, контролирующих процессы меланогенеза, прекращают свою функцию, но деление клеток меланосом не прекращается, то есть синтез ДНК протекает нормально.

  Согласно нашей гипотезе, сульфгидрильные соединения (глутитион и цистеин) подавляют активность тирозиназы, так как связывают медь, активирующую этот фермент. Поэтому изменения концентрации SH-групп в среде (в цитоплазме меланоцита) оказывают непосредственное влияние на течение меланогенеза. Этот механизм действует при самых разнообразных обстоятельствах, либо ингибируя, либо интенсифицируя меланогенез. Наблюдаемое в волосяных фолликулах ягнят таджикской породы в течение первых недель-месяцев постнатального онтогенеза почти полное ингибирование меланогенеза обусловлено возрастанием концентрации в крови и тканях сульфгидрильных групп, вследствие увеличения интенсивности роста пуховых и переходных волокон.

Цель исследования. Целью данной работы является комплексное изучение, и выявление регуляторных механизмов меланогенеза шерсти у овец, то есть выявление влияния биохимических, молекулярно-клеточных факторов, ингибирующих меланогенеза и разработка селекционно-генетических методов отбора высокопродуктивных животных.

Конкретные задачи исследования

1. Исследовать блок репликации в клетках меланосомы методом клеточной гибридизации, выяснить зависимость ингибирования синтеза ДНК в ядрах гетерокарионах от пролиферативного потенциала клеток-партнеров и от наличия в них активных онкогенов.

2. Разработать имитацию с помощью вычислительных экспериментов ряда этапов меланогенеза и углубить понимание биохимических механизмов ингибирования пигментации шерсти и его генетического контроля.

3. Изучить некоторые биохимические характеристики депигментации шерсти у ягнят таджикской и гиссарской пород овец, различных генотипов и окрасок. Разработать более целостную картину реализации генотипа и становления фенотипа, дать характеристику более широкому спектру окрасок, изучить взаимодействие генов, контролирующих депигментацию, с генами, определяющими высокую шерстную продуктивность таджикской породы овец.

4. Оценить в производственных условиях генетико-селекционным методом влияние внешних условий, кормления и содержания на характер наследования генов и генотипа баранов-производителей, имеющих более светлую окраску шерстного покрова, на качество шерсти потомства.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Впервые выявлена белковая природа факторов, подавляющих меланогенеза шерсти у овец, и установлено, что эти белки локализованы в цитоплазме клетки.

2 Установлен  новый механизм транспортирования меланосом,  реализирующихся в процессе методического деления пигментных клеток.

3. Разработан клеточный механизм регуляции процесса меланогенеза у овец и установлены биохимические  основы процесса ингибирования меланогенеза.

4. Выявлена  зависимость ингибирования синтеза ДНК в ядрах клеток меланосомы  от пролиферативного потенциала клеток партнера и от наличия в них активных онкогенов.

5.Выявлен комплекс новых биохимических характеристик пигментных клеток и волосяных фолликулов, тесно коррелирующих с содержанием меланина в волосах.

6. Установлен ранее неизвестный тип меланогенеза, при котором синтезируются оба типа пигмента эу- и феомеланина, обладающие промежуточными свойствами.

7. Обоснована в натурных и вычислительных  экспериментах гипотеза об ингибирующем действии на меланогенеза генов, обуславливающих уникальную структуру шерстного покрова.

8. Обнаружено ингибирующее действие на меланогенеза генов, определяющих уникальную структуру, густоту и скорость роста шерсти у овец полугрубого типа.

9. Установлена степень депигментации шерсти у овец в зависимости от окраски ягнят при рождении. Чем светлее покров, тем раньше у ягнят начинается депигментация шерсти.

Научная новизна работы. Впервые проведены комплексные исследования биохимических, молекулярно-клеточных и генетико-селекционных процессов ингибирования меланогенеза, то есть, изучены механизмы депигментации шерстного покрова у овец таджикской породы.

Исследованы биохимические и молекулярно-клеточные основы подавления синтеза пигмента меланина под действием белков-ферментов, основные этапы биохимической и генетической  детерминации пигментации шерстного покрова овец.  Выявлена белковая природа факторов, подавляющих меланогенеза и установлено, что эти белки локализованы в цитоплазме клетки.

Изучено содержание эумеланина и феомеланина в шерсти овец различных пород и генотипов, блокирующих влияние генов на меланогенеза и обусловливающих высокую шерстную продуктивность, биохимические основы  меланогенеза волосяного покрова, молекулярные и клеточные подходы к процессу меланогенеза и оценка баранов по качеству шерсти.

  Биохимическими методами установлено, что взаимодействие аллелей генов А и Е обуславливает проявление многочисленных бурой и рыжей окрасок в фенотипе, контролирует формирование смешанного типа меланогенеза, то есть присутствие обоих типов пигмента в различных соотношениях. В то же время, с уменьшением абсолютного количества пигмента эумеланина, наблюдалось возрастание доли феомеланинового компонента. Показано, что у овец широко распространен ранее неизвестный тип меланогенеза, при котором синтезируются оба типа пигмента (эумеланин и феомеланин), обладающие промежуточными свойствами.

Выявлен комплекс биохимических характеристик пигментных клеток и волосяных фолликулов, тесно коррелирующих с содержанием меланина в волосах. Показано, что плавность перехода от темно-бурой окраски к палевой осуществляется вследствие равномерного снижения концентрации меланосом в волосах и изменения их качественных показателей, то есть определяется постепенным повышением эффективности супрессии процесса меланогенеза в результате взаимодействия аллелей генов А и Е.

  Дана биохимическая, молекулярно–клеточная,  а также генетико-селекционная интерпретация формирования черной, бурой, рыжей и палевой окрасок у полугрубошерстных (таджикских) и грубошерстных (гиссарских) пород овец.

  Выявлен новый механизм транспортирования меланосом, реализующихся в процессе митотического деления пигментных клеток, их миграции из зоны сосочка фолликула и включения в формирующиеся волосы. От периода миграции меланобластов в волосяные фолликулы до получения конечного продукта – гранул меланина, локализованных в волосах, путь очень долог и сложен, к тому же контролируется большим числом генов. Эффективность течения процессов на каждой стадии этого пути может ингибироваться многими внутренними и внешними агентами.

  Установлен характер линий регрессии и управления множественной регрессией, отражающих эффективность процесса меланогенеза, специфичных для каждого генотипа окраски в волосяных фолликулах, формирующих пуховые, переходные и остевые волосы у ягнят различных фенотипов.

Обнаружено ингибирующее действие на меланогенез генов, определяющих оригинальную структуру, густоту и скорость роста полугрубой шерсти у таджикской породы овец. Рекомендовано несколько вариантов ликвидации пигментированных волокон и генетические методы создания депигментированных стад овец.

  Показано, что ингибирование меланогенеза у полугрубошерстных овец таджикской породы происходит в результате преобразования структуры волосяного покрова, то есть в процессе селекции по шерстным характеристикам одна фракция полностью угнетается в результате гиперразвития другой фракции.

Выявлен клеточный механизм регуляции процесса меланогенеза у овец и рекомендованы биохимические методы отбора с целью повышения качества овцеводческой продукции на селекционно-генетической основе. Проведены комплексные исследования по изучению биохимических, генетических и генетико-селекционных основ процесса ингибирования меланогенеза, то есть механизмов депигментации шерстного покрова у овец таджикской породы.

Установлено, что гены-модификаторы, определяющие повышение однородности, густоты, интенсивности и равномерности роста шерсти, ингибируют меланогенез у овец полугрубошерстных пород.

  Выявлены биохимический и клеточный механизмы торможения и восстановления активной функции меланоцитов, имеющие фундаментальное значение для разработки новых методов производства полугрубой белой шерсти и повышения шерстной продуктивности в овцеводстве.

Научно-практическое значение работы. Разработанные биохимические, клеточные и генетико-селекционные подходы к изучению механизма ингибирования меланогенеза у полугрубошерстных и грубошерстных овец могут быть широко использованы в овцеводстве с целью повышения эффективности селекции по шерстной продуктивности и получения качественной шерсти для нужд промышленности. Эффективные способы отбора по шерстной продуктивности и производству полугрубой белой шерсти от овец таджикской породы имеют большое практическое значение в рационализации программ при конструировании депигментированных высокопродуктивных пород овец.

  Сформулирована и обоснована в натурных и вычислительных экспериментах гипотеза об ингибирующем действии на меланогенез генов, обусловливающих уникальную структуру шерстного покрова и высокую шерстную продуктивность полугрубошерстных пород овец.

Выявлено ранее неизвестное явление - высокая митотическая активность меланоцитов определенных генотипов, локализованных в зоне сосочка волосяного фолликула. Обнаружен до сих пор неизвестный биохимический механизм транспортирования гранул меланина волос, в процессе которого значительная часть пигмента приносится мигрирующими из зоны сосочка меланоцитами. Установлена биохимическая и генетическая детерминированность митотической активности меланоцитов и интенсивность включения пигментных клеток в формирующиеся волосы.

  Показана эффективность биохимического метода прогнозирования шерстной продуктивности животных, а также клеточный механизм контроля процесса меланогенеза у овец таджикской породы.

  Результаты проведенных экспериментов позволяют считать, что овцы таджикской породы обладают огромными генетически детерминированными возможностями повышения шерстной продуктивности (белой полугрубой шерсти) и являются наиболее перспективными при интенсивной промышленной технологии выращивания животных.

Разработаны рекомендации по максимальному использованию данных потенциальных возможностей, суть которых заключается в создании оптимальных условий кормления и содержания в осенне-зимне-весенний периоды, целенаправленном интенсивном выращивании племенного молодняка и откорме овец.

Публикации, в которых отражены результаты экспериментов и научные разработки, используются в лекциях по курсам «Биохимия», «Генетика», «Генетика с основами биотехнологии», «Актуальные проблемы генетики и селекции животных» в Таджикском аграрном университете, а также во время проведения спецкурса на кафедре биохимии биологического факультета Таджикского национального университета. Опубликованные материалы также могут быть широко использованы для составления методических указаний по изучению биохимии пигментации и разработки рекомендаций по созданию популяций таджикской и других полугрубых пород овец, в шерсти которых полностью отсутствовали бы цветные волокна.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и получили положительную оценку на республиканских научно-теоретических конференциях молодых ученых и специалистов Таджикской ССР (Душанбе, 1985, 1987), на республиканской научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (Душанбе, 1986), на конференции «Вклад генетики в ускорение научно-технического прогресса в сельском хозяйстве Таджикистана» (Душанбе, 1986), на Х Всесоюзном симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Гродно, 1990), на 5 Всесоюзной школе-семинаре молодых ученых «Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии» (Рига, 1990); на конференции, посвященной 60-летию зооинженерного факультета ТАУ (Душанбе, 2003), на республиканской конференции биохимиков РТ «Адаптационные аспекты функционирования живых систем» (Душанбе, 2007).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликованы одна монография и 35 научных статей в различных изданиях: «Доклады ВАСХНИЛ» (1987), «Вестник сельскохозяйственной науки» (1989), журнал «Цитология» (1991), журнал «Онтогенез» (1990), журнал «Молекулярная биология» (1991), «Вестник Таджикского  национального университета» (2007, 2008), «Вестник сельскохозяйственной академии наук Республики Таджикистан» (2007) журнал «Кишоварз» Таджикского аграрного университета (1998-2007), и других изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 268 страницах машинописного текста и состоит  из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы, состоящего из 313 работ, в том числе 128 иностранных авторов. Она содержит  41 рисунков и 35 таблиц.

ОБЪЕКТЫ  И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили овцы различных генотипов окраски таджикской и гиссарской пород. Для исследования факторов, блокирующих синтез гранул пигмента меланина (депигментации), мы использовали клетки меланоcомы, которые получали из 1,5- месячных эмбрионов овец таджикской породы светло-рыжей или палевой окраски по методу Адамса, (1983) но с некоторыми модификациями. Эти клетки были очищены на градиенте плотности перколла при центрифугировании 26 тыс. об/мин в роторе SV-40 в течение 70 мин при t=31oC. Слияние клеток осуществляли с помощью электроимпульсной установки в ходе центрифугирования. Метод разработан Абидором И.Г. и Сухаревым С.А., (1989). Партнёрами по слиянию послужили эмбриональные фибробласты овец (ЭФО), которые были получены из 1,5 месячных эмбрионов овец таджикской породы светло-рыжей или палевой окраски по методу Адамса (Адамса, 1983), и культура клеток NIH3T3, клеток 3T3myc, клеток NCC2 и клетки SV3T3, которые были любезно предоставлены нам В.С. Прасоловым (Институт молекулярной биологии АН России).

Для проведения исследований по митотической активности меланоцитов, образцы кожи и шерсти брались прижизненно на бочках ягнят. Волосы заливались в парафин и резались на санном микротоме. Толщина срезов составляла 7-8 мкм. Образцы кожи фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвреживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в эпон. Полутонкие продольные серийные срезы волосяных фолликулов толщиной 2 мкм готовили на ультратоме 8800 Vltrotome III фирмы LКВ (Швеция). Срезы помещали на предметное стекло и окрашивали 1% метиленовым синим (в дистиллированной воде), смешанным в соотношении 1:1, окрашивание проводили на гистологической плитке. Для исследования использовали световой микроскоп Оlympus BH 2 (Япония).

Для вычисления количества меланоцитов во всем объеме волоса использовали данные об относительной их площади на срезах и основной принцип стереологии, согласно которому объемную долю какого-либо компонента ткани можно оценить путем измерения площади среза, приходящейся на сечение компонента. Количество митотических меланоцитов и митотических клеток матрикса определяли путем прямого подсчета на всех серийных срезах каждого исследуемого фолликула.

Для качественной и количественной оценки пигментов меланина и установления типа меланогенеза использовали метод ЭПР спектроскопии с некоторыми модификациями (Vsevolodov, 2003). Предварительно образцы шерсти обезжиривали, промывали в мыльно-содовом растворе, высушивали в термостате, снова промывали в гексане и высушивали. Использовали навески шерсти в 30 мг. Регистрация спектров ЭПР проводилась в единообразных, за исключением усиления, условиях. Включены данные по удельной интенсивности спектров ЭПР, приведенные к навеске в 10 мг и одному усилению–5 104. Спектры ЭПР регистрировали на радиоспектрометре SE/X-2544 фирмы “Radio PAN” с рабочей частотой 9 ГГц. Частоту измеряли микроволновым частотомером МСМ-101. Измерение напряженности и калибровку поля проводили всесторонне в приборе ЯМР магнитометром JTM-246.

Исследование содержания эумеланина и феомеланина при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии проводилось по методу Ито и Фуджита (2005), путем химической деградации и последующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (Ito S., Fujita K. 2005). Около 30 мг волос каждого образца гомогенезировалось в 3мл3 воды. Для определения содержания эумеланина в волосах 200мл 1моль. гомогената (2мг волос) переливались в пробирку с пробкой смешивались с 800мл 1моль. Н2SO4 и окислялись 3% KMnO4. Продукт реакции – пиррол-2,3,5-трикарбонксиловая кислота (РТСА) анализировалась методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием ультрафиолетового детектора. Для определения феомеланина 200мл 1моль. гомогената переливали в пробирку с пробкой и подвергали гидролизу при 130оС в течение 24 часов в 500мл 1моль. йодистоводородной кислоты в присутствии Н3РО2. Продукт реакции аминогидроксифенилаланин (АНР) анализировался методом высокоэффективной жидкой хроматографии при использовании электрохимического детектора. 1нг РТСА и 1нг АНР приближенно соответствует 50 нг эумеланина и 5 нг феомеланина.

Типы гемоглобина определяли посредством электрофореза на крахмальном геле, типы постальбумина – на полиакриламидном геле по методике Мауре (1991). Полученный цифровой материал был подвергнут обычной генетико математической обработке с вычислением генной частоты и средней ошибки (р±Sp). Проверку производили с помощью Х2-критерия Пирсона. Анализ корреляции белковых геновариантов и селекционируемых признаков проведено с помощью корреляционного отношения и сравнения при помощи t-критерия Стьюдента.

Для изучения влияния генотипа барана-производителя, имеющего различные оттенки окраски шерсти, влияние условия кормления и содержания животных, мы использовали метод искусственного осеменения с баранами производителями с наименьшим количеством пигментированной шерсти, где имелось незначительное количество переходных волос и ости. Исследование проводили в опытных группах и в условиях естественного содержания животных. Структуру и густоту шерстного покрова овец изучали по общепринятым методикам (А.А. Вениаминов и др., 1996).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биохимические  и клеточные подходы изучения процесса меланогенеза

  Овцеводческим хозяйствам выгодно разводить породы овец, что бы получать белую шерсть, не содержащую пигмента меланина,  что бы для окраски её в любые цветовые тона. В связи с этим довольно широко начали применять биохимические и молекулярно-клеточных методы в селекции овец, направленные на улучшение шерстной продуктивности при выведении новых продуктивных пород овец. В связи с этим выявление факторов, обусловливающих репрессию и дерепрессию меланогенеза, раскрытие биохимического и клеточного механизма торможения и восстановление активной функции меланоцитов имеют фундаментальное значение для разработки новых методов производства полугрубой белой шерсти и повышения шерстной продуктивности в овцеводстве. Одним из подходов изучения природы генов, контролирующих ингибирование меланогенеза, является исследование биохимических, молекулярно-клеточных и  генетических механизмов блока пролиферации в клетках меланоцитов.

Характерные свойства овец таджикской породы заключаются в том, что при достижении 8-9-месячного возраста в волосяных фолликулах (около 96%) шерстного покрова приостанавливается синтез пигмента меланина. Клетки приобретают терминальные дифференцированные свойства, т.е. определенные участки ДНК, в частности блок генов, контролирующих процесс меланогенеза, прекращают свою функцию, но деление клеток - меланосом не прекращается, то есть синтез ДНК протекает нормально.

В литературе существуют данные о природе блока пролиферации различных типов клеток, где выявлены клеточные факторы, контролирующие блокировки пролиферации у клеток перитонального экссудата и других клеток лабораторных животных (Прудовский И.А., Косимов Р.Б., 1991). В экспериментах, проведенных главным образом на лабораторных млекопитающих, установлены общие особенности меланогенеза. Определены основные этапы генетической детерминации пигментации шерстного покрова (Альбертс Б.Д. и др., 2002). Однако на крупных домашних животных глубоких биологических и молекулярных исследований проведено мало.

Мы поставили перед собой цель выявить природу факторов, блокирующих синтез гранул пигмента меланина у отдельных овец таджикской породы, имеющих различные окраски шерстного покрова; выявить биохимические и молекулярные характеристики пигментных клеток и волосяных фолликулов, тесно коррелирующих с содержанием меланина в волосах; исследовать выявление клеточных и других факторов, ответственных за задержку пигментации ягнят таджикской породы, имеющих различные генотипы окраски.

Насколько нам известно, настоящая работа является первым систематическим исследованием на гетерокарионах с клетками меланосомы, проведенным с применением метода электрослияния. В ходе нашей работы были проведены десятки опытов с помощью этого метода и лишь несколько из них дали неудовлетворительные результаты.

Обработка слияния культур клеток меланосомы с клетками культуры, имеющими различные типы блока пролиферации. Слияние клеток меланосомы и клеток ЭФО было проведено с помощью электроимпульсной установки. Метод электрослияния при центрифугировании основан на электропробое мембран контактирующих клеток. С этой целью центрифугируемые клетки подвергались в осадке действию высоковольтных электрических импульсов (2,5 – 3 кВ\см) продолжительностью 30 – 50 мкс. (Абидор И.Г. и др., 1989). После электрообработки клетки меланосомы живут, как правило, не более 14-18 ч, и поэтому через 24 ч можно избежать чрезмерных снабжений клеток-партнеров, которые трудно отличить от слияний. Через 24 ч после слияния с клетками культур ядра клеток меланосомы заметно набухают, но не теряют свою специфически овальную форму. К 48 ч после слияния ядра клетки меланосомы в гетерокарионах подвергаются дальнейшему разбуханию, однако их характерная морфология, как правило, все еще сохраняется. Следует отметить, что для изучения брались только те гетерокарионы, в которых идентификация ядра клеток меланосомы не вызывала затруднений.

О.И.Епифанова приводит убедительные данные о том, что в зависимости от пролиферации клеток они имеют различные клеточные факторы (Епифанова О.И., Терских В.В., 2003). Поэтому для слияния с клетками меланосомы мы использовали клетки культур трех типов: клеток с ограниченной способностью к пролиферации, иммортализованные- незлокачественные клетки и малегнизированные-злокачественные клетки.

Получение гетерокарионов клеток меланосомы и клеток с ограниченной способностью к пролиферации. Один тип клеток с ограниченной способностью к пролиферации - ЭФО (эмбриональный фибробласт овец)-был партнером клетки меланосомы по слиянию. Нам стало интересно, выяснить природу влияния клеточных факторов, имеющих диплоидный эмбриональный фибробласт овец.





Получение гетерокарионов «эмбриональный фибробласт

овцы + клетки меланосомы»

Культуру клетки меланосомы получали из 1,5-месячного эмбриона овцематок таджикской породы, имеющего палевую окраску  кроющие волосы на голове. Предварительные исследования показали, что при инкубации в течение 24 ч в полной культуральной среде с 3Н-тимидином более чем 92 % метка включается в ядра ЭФО и клетки меланосомы. Через 24 ч после слияния клеток меланосомы + ЭФО, примерно в 10% гетерокарионов с ядрами ЭФО, синтезировавшими ДНК,  происходит подавление репликации в ядрах последнего.

Рис. 1. Синтез ДНК в гетерокарионах меланосомы и клеток +ЭФО.

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер ЭФО в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

Более продолжительная инкубация, до 48 ч, не приводит к существенному увеличению индекса подавления синтеза ДНК в ядрах клеток ЭФО. В отдельных опытах обнаружено более сильное подавление синтеза ДНК в ядрах ЭФО. Индекс подавления составлял через 24 ч 82–86%, а к 48 ч существенно не изменялся. Возможно гены, контролирующие блок пролиферации клеток меланосомы, локализованы в одном локусе с генами, подавляющими меланогенез.

Подавление синтеза ДНК в гетерокарионах нельзя объяснить самим процессом клеточного слияния. Действительно, доля меченых ядер в гомокарионах «ЭФО+ЭФО» практически та же, что и среди неслившихся ЭФО. Через 24 часа не было обнаружено подавляющего действия ядра клеток меланосомы на синтез ДНК в ядрах ЭФО.

Рис. 2. Регуляция синтеза ДНК в гетерокарионах клеток меланосомы и частично синхронизованных в S – периоде ЭФО.

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер ЭФО в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

Уже через 48 часов было обнаружено небольшое, но достоверное подавление синтеза ДНК в гетерокарионах. Таким образом, слияние с клетками меланосомы влияет на текущий синтез ДНК в ядрах ЭФО и подавляет вступление последних в S-период. Было необходимо выяснить, влияет ли слияние клеток ЭФО с клетками меланосомы на текущий синтез ДНК в ядрах ЭФО. С этой целью клетки меланосомы сливали с ЭФО частично синхронизованными в S-фазе клеточного цикла (24 часа после сывороточной стимуляции покоящейся культуры). Фиксацию проводили через 2 и 4 ч после слияния. Индекс реактивации в ядрах меланосомы через 2 ч и 4 ч после слияния существенно уменьшался.

Гетерокарионы клеток меланосомы и иммортализованных клеток

Получение гетеркарионов «клеток NIH3T3 + клетки меланосомы, полученные от ягнят светло-палевой окраски». Клетки NIH3T3 являются спонтанно иммортализованными мышиными фибробластами, способными в условиях сывороточного голодания переходить в состояние покоя. Эти клетки «бессмертны», но не злокачественны. Ядра клетки меланосомы, находясь в цитоплазме клеток NIH3T3, восстанавливают утраченную способность к синтезу гранул пигмента меланина, то есть восстанавливают способность к репликации.

Рис. 3. Синтез ДНК в гетерокарионах меланосомы +NIH 3T3.

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер +NIH 3T3 в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

  Индекс реактивации через 24 ч после слияния составлял 30-40%. К 48 часам индекс реактивации увеличивался примерно в два раза. Индекс подавления синтеза ДНК в ядрах NIH3T3 составлял через 24 и 48 ч после слияния 70-80%.

Получение гетерокарионов «клеток 3T3myc + клетки меланосомы, полученные от ягнят светло-палевой окраски». Клетки 3T3myc были получены путем трансформации культуры NIH3T3 вирусным онкогеном v-myc. Клетки эти, подобно NIH3T3, иммортальны, но не злокачественны. Клетки меланосомы при слиянии с клетками 3T3myc вызывали к 24 ч четко выраженное угнетение синтеза ДНК в ядрах последних.

  Рис. 4. Синтез ДНК в гетерокарионах меланосомы и клеток 3T3myc

(24 часа после слияния).

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер 3T3myc в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

Коэффициент подавления составлял 60 -70%, то есть был лишь слегка ниже, чем в гетерокарионах клеток меланосомы + NIH3T3. Вместе с тем индекс реактивации синтеза ДНК в ядрах клеток меланосомы в гетерокарионах с реплицирующими ядрами 3T3myc был через 24 ч выше, чем в гетерокарионах клеток меланосомы +NIH3T3:около 60%.

Итак, данные исследования показали, что как спонтанная иммортализация клеток, так и трансформация иммортализующими онкогенами резко повышают способность реактивировать синтез ДНК в ядрах клеток меланосомы.

Гетерокарионы клеток меланосомы и злокачественных клеток

Гетерокарионы клеток меланосомы+злокачественные клетки NCC2. Представляло интерес выяснить, влияет ли на блок пролиферации слияние клеток меланосомы и культуры злокачественных клеток. Как известно, стимулирующих клеточных факторов у клеток этого типа достаточно много. Злокачественные клетки при слиянии с большинством типов терминально дифференцированных клеток способны вызвать реактивацию в ядре клеток партнера. Высокозлокачественные клетки NCC2 были получены путем трансформации клеток NIH3T3 онкогеном c-Ki-ras. По сравнению с исходными клетками NIH3T3, клетки NCC2 гораздо менее подвержены ингибирующему действию клеток меланосомы в гетерокарионах. Через 24 ч после слияния индекс подавления составлял всего 10-40%.

Рис. 5. Синтез ДНК в гетерокарионах меланосомы и клеток NCC2 (24

часа после слияния).

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер NCC2 в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

Вместе с тем реактивирующий эффект клеток NCC2 не превышал таковой в клетках NIH3T3: индекс реактивации через 24 ч варьировал от 12 до 36%.

Гетерокарионы «клеток SV3T3 + клетки меланосомы». Клетки SV3T3, полученные в результате трансформации клеток 3Т3 Balb\c вирусом SV40, являются высокозлокачественными.

Рис. 6. Синтез ДНК в гетерокарионах меланосомы и клеток SV3T3 (24 часа после слияния). Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер SV3T3 в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

По сравнению с другими клетками они оказались в наименьшей степени подвержены ингибирующему действию клеток меланосомы.

Индекс подавления синтеза ДНК в гетерокарионах был через 24 ч не более 23%. Низкая чувствительность злокачественных клеток SV3T3 к ингибирующему эффекту клеток меланосомы могла объясняться тем, что эти клетки обладают чувствительностью к ингибиторам из SV3T3 лишь в короткий отрезок времени в начале G1- периода. Вместе с тем индекс реактивации клеток меланосомы в этот же срок был весьма высоким –от 35 до 70%. В то же время, индексы реактивации были существенно ниже, чем в гетерокарионах с асинхронными SV3T3: 14-34%. Итак, малигнизация клеток, вызванная онкогенным вирусом SV40 или онкогеном c-Ki-ras, приводит к резкому снижению или исчезновению чувствительности клеток к подавляющему эффекту клеток меланосомы.

Таблица 1. Синтез ДНК в ядрах клеток меланосомы и предварительно синхронизованных клеток SV3T3 в гетерокарионах

Срок после слияния (ч)

Число исследованных ГК

Доля меченых ядер SV3T3 в ГОм окарионах, (%).

Доля меченых среди неслившихся ядер SV3T3 (%).

Доля меченых ядер SV3T3 в ГК (%).

Индекс подавления синтеза ДНК в SV3T3 в ГК (%).

Индекс реактивации ядер меланосом ГК (%).

24

93

89,3±1,8

93,7±1,4

84,1±1,6

8,6

33,7

24

64

87,0±1,0

92,5±1,6

90,6±1,3

2,0

22,4

24

103

87,2±1,0

92,2±1,7

78,6±1,0

14,7

13,6

24

193

89,6±1,6

98,2±1,3

73,6±1,3

25,0

26,0

Вместе с тем способность реактивировать синтез ДНК в ядрах клеток меланосомы выражена у малигнизированных клеток не в большей степени, чем у незлокачественных иммортализованных клеток.

Синтез РНК в гетерокарионах «эмбриональный фибробласт

овец + клетки меланосомы»

Негативный эффект клеток меланосомы на репликацию в ядрах клеток-партнеров мог быть вызван неспецифическим подавлением транскрипционной активности последних и, как следствие, нарушением подготовки к S-периоду. Для проверки этой возможности изучили влияние ядер клеток меланосомы на транскрипцию в ядрах ЭФО в составе гетерокарионов. Для того, чтобы различия в содержании ДНК не вносили слишком большой разнобой при определении уровня транскрипции в ядрах, для слияния с клетками меланосомы использовали синхронизованные ЭФО. В культуре фибробластов, достигшей монослоя, меняли полную культуральную среду на среду с 0,25% сыворотки и инкубировали ее затем в течение пяти суток. Покоящиеся клетки сливали с клетками меланосомы с помощью электроимпульса при центрифугировании.

Рис. 7. Синтез РНК в ядрах ЭФО в гетерокарионах с клетками меланосомы.

П р и м е ч а н и е: по оси абсцисс – количество зерен серебра на ядро ЭФО, по оси ординат - % ядер ЭФО

Известно, что при переходе в покой ЭФО задерживаются в G1 - периоде и содержание ДНК в их ядрах соответствует диплоидному. После слияния клетки переводили в полную среду, помещали в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами и инкубировали в течение двух часов при температуре 37о, с тем чтобы они прикрепились и распластались, после чего добавляли на 15 мин 10 мкКи\мл 3Н-уридин. Через 15 мин. клетки фиксировали смесью этанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 и подвергали авторадиографической обработке. Подсчитывали количество зерен над ядрами ЭФО в гетерокарионах и в моноядерных неслившихся клетках.

Среднее число зерен на ядро составляло для гетерокарионов 86,5±2,6, а для неслившихся клеток-83,5±2,1. Таким образом, оказалось, что клетки меланосомы существенно не влияют на транскрипцию в ядрах ЭФО.

Результаты исследования транскрипции в гетерокарионах ЭФО+клетки меланосомы приведены на рис. 6.

Кариобриды «эмбриональный фибробласт овцы + кариопласт клеток меланосомы». Ядра клеток меланосомы отличаются высокой степенью конденсации хроматина. Можно было предположить, что ядерные белки, ответственные за инактивацию генома клеток меланосомы, вызывают обнаруженное нами подавление синтеза ДНК в гетерокарионах. В связи с этим предстояло выяснить, где, в ядре или в цитоплазме клеток меланосомы, локализованы факторы, подавляющие синтез ДНК в гетерокарионах. Для ответа на этот вопрос клетки меланосомы энуклеировали с помощью цитохалазина В, путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла по Wigler M.H. and Weinstein J. B. (1995). Полученные кариопласты клеток меланосомы содержали ядра, окруженные лишь тонким ободком цитоплазмы. При слиянии кариопластов клеток меланосомы с ЭФО через 24 ч не было обнаружено подавления синтеза ДНК в образующихся кариобридах.

Рис. 8. Синтез ДНК в кариобридах ЭФО + кариопласт меланосомы

(24 часа после слияния).

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер ЭФО в неслившихся клетках культуры  (1),  в  кариобридах  (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3)  по оси ординат время посте слияния.

Полученные результаты позволяют считать, что негативные регуляторы синтеза ДНК локализованы не в ядре, а в цитоплазме клеток меланосомы.

Исследование влияния предобработки клеток меланосомы ингибитором синтеза белка на их способность подавлять репликацию в гетерокарионах. В литературе имеются данные (Rabinovich P. S. and Norwood T.H., 1990) о том, что предобработка стареющих фибробластов человека ингибитором синтеза белка-циклогексимидом -резко снижает ингибирующий эффект этих клеток на синтез ДНК в ядрах молодых фибробластов в гетерокарионах. Был сделан вывод, что негативные регуляторы синтеза ДНК из фибробластов скорее всего являются белками. В связи с этим появилась необходимость провести аналогичные опыты на гетерокарионах с клетками меланосомы.

Рис. 9. Влияние предобработки клеток меланосомы ингибитором синтеза белка на их способность подавлять репликацию в гетерокарионах.

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер ЭФО в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

После обычной процедуры очистки клетки меланосомы инкубировали в течение 4 ч при 37о в полной культуральной среде с 5 мкг\мл циклогексимида. (В контроле проводили аналогичную инкубацию, однако в этом случае среда не содержала циклогексимида). Затем клетки отмывали от циклогексимида и сливали с асинхронными ЭФО. Оказалось, что предобработка клеток меланосомы циклогексимидом снижала более чем в 2 раза ингибирующий эффект клеток меланосомы на синтез ДНК в ядрах ЭФО. Полученные данные позволяют, сделать вывод, что ингибиторы репликации из клеток меланосомы имеют белковую природу и постоянно синтезируются в клетки меланосомы.

Опыты с кариобридами отчетливо указывают на цитоплазматическую локализацию негативных регуляторов в клетках меланосомы. Подавляющий эффект клеток меланосомы на репликацию в гетерокарионах не связан со снижением общей транскрипционной активности в ядрах клеток-партнеров. По–видимому, если он и опосредован снижением экспрессии генов, то только определенных, ответственных за подготовку клеток к S- периоду. Наличие негативных регуляторов в терминально дифференцированных клетках может быть обнаружено путем их слияния с активно пролиферирующими клетками-партнерами и последующего анализа репликации в образующихся гетерокарионах. Ранее другим автором в такого рода опытах in vitro было доказано, что факторы, предотвращающие репликацию, присутствуют в «стареющих» клетках и влияют на клетки находящихся в состоянии искусственно вызванного покоя фибробластах овец (Жилякова В.С., 2001).

Опираясь на результаты этих опытов, мы попытались идентифицировать негативные тормозящие регуляторы пролиферации клеток меланосомы, а также охарактеризовать кодирующие их гены. В литературе данные о блокировке пролиферации пигментных клеток, в частности клеток меланосомы очень скудные.

Большой интерес вызвало проведение частичных анализов регуляции синтеза ДНК в гетерокарионах, образованных активно пролиферирующими клетками и клетками меланосомы, полученными у овец наиболее светлой окраски шерсти. Известно, что у этих животных активность меланосомы уже почти подавлена.

Было установлено, что иммортализованные клетки, в отличие от клеток с ограниченной способностью к пролиферации, способны реактивировать синтез ДНК в ядрах клеток меланосомы, который мог быть связан с активацией онкогенов, ответственных за иммортализацию.

Известно, что онкогены семейства myc, кодирующие белки ядерной локализации и имеющих клеточное происхождение, способны при трансфекции «смертных» клеток иммортализовать последние. Очевидно, для того чтобы пролиферирующие клетки приобрели способность реактивировать синтез ДНК в ядрах клеток меланосомы, им необходимы продукты иммортализующих онкогенов.

Введение в клетки NIH3T3 ядерного онкогена v-mic повышало их реактивирующую способность вдвое. Вместе с тем трансформация NIH3T3 малигнизирующим онкогеном c-Ki-ras существенно не влияла на реактивацию синтеза ДНК в ядрах клеток меланосомы. ( Рис.4)

В гетерокарионах клеток меланосомы и клеток с ограниченной способностью к пролиферации (ЭФО) не было обнаружено достоверного снижения доли синтезирующих ДНК ядер клеток культур, по сравнению с неслившимися клетками (Рис.1).

Предстояло выяснить, блокируют ли клетки меланосомы уже идущий синтез ДНК или же только предотвращают вступление ядер клеток-партнеров в S –период. Клетки NIH3T3 переводили в состояние покоя, затем сливали с эритроцитами стимулировали к пролиферации сывороткой. Клетки меланосомы эффективно ингибировали вступление ядер клеток-партнеров в S–период. Ингибирующий эффект клеток меланосомы был выражен гораздо сильнее, чем в опытах с асинхронными клетками, особенно в случае клетками NIH3T3.  В опытах по слиянию синхронных клеток NIH3T3 с клетками меланосомы синхронизацию проводили путем сбора метафаз после действия нокодазола, поскольку все эти клетки не переходят в состояние покоя. Слияние проводили через 2 ч после метафазы, когда клетки культур находились в G1. Однако в этом случае, как и в опытах с асинхронными клетками, не удалось обнаружить ингибирующего эффекта клеток меланосомы.

Исследование содержания эумеланина и феомеланина в шерсти овец различных пород и генотипов окраски

  У овец довольно нелегко дифференцировать эумеланосомы и феомеланосомы. Нам не удалось оценить окраски меланосом под световым микроскопом (при увеличении в 1000-1500 раз). У овец большинства изученных нами генотипов гранулы меланина имеют черно-коричневую или коричневую окраску, соответствующую эумеланину, то есть присутствие феомеланина с помощью световой микроскопии часто не выявляется. При изучении содержания эумеланина и феомеланина в шерстном покрове ягнят было выявлено, что только ягнята черной и белой окрасок имеют действительно резко отличающихся результаты,по сравнению с другими группами животных.

Из таблицы видно, что наблюдается большая вариабельность в содержании эумеланина и феомеланина в большинстве групп, причем показатели в смежных группах часто перекрываются.

Табл. 2. Содержание эумеланина и феомеланина в шерстном покрове ягнят

Порода

Окраска

n

Данные ВЖХ

Данные ЭПР спектроскопии интенсивность сигнала, мм.

Тип сигнала

эумеланина

феомела-нина

% от веса волос

таджикская (опыт)

белая

3

0.02±0,001

0.01±0,00

2.8±0,4

4

полевая

4

0.03±0.001

0.08±0.002

13.4±03.0

3

cветло рыжая

4

0.08±0.002

0.15±0.006

17.0±03.0

3

рыжая

4

0.15±0.008

0.21±0.004

28.9±03.5

3

темно-рыжая

6

0.33±0.010

0.52±0.010

45.0±03.6

2

бурая

4

0.60±0.02

0.26±0.009

14.3±02.9

2

гиссарская (контроль)

темно-бурая

1

1,54±0.003

0,15±0.005

11,6±0.002

1

черная

3

5.0±0.04

0.01±0.001

243.0±5.52

1

cветло рыжая

4

0.13±0.002

0.19±0.002

56.0±2.5

3

рыжая

5

1.06±0.06

0.19±0.003

61.0±3.5

3

бурая

4

1.8±0.03

0.08±0.06

67.8±2.0

1

черная

3

5.22±0.09

0.01±0.0

329.7±18.4

1

П р и м е ч а н и е:  1-симетричный синглет; 2- триплан; 3 асимметричный синглет: 4-асимметричный синглет низкой интенсивности в один образец из четырех характеризовалась сигналом четвертого типа.

Последнее положение особенно явно проявляется у бурых, рыжих и полевых таджикских ягнят. Это понятно, так как иногда довольно сложно дифференцировать близкие оттенки бурой и рыжей окраски и при визуальной оценке.        Ягнят каждой из двух изучаемых пород можно разделить на две четко дифференцируемые категории, принципиально различающиеся по генетически детерминируемое интенсивности меланогенеза: к первой группе относятся гиссарские – ЕD/ED либо ED/EBI черные «рецессивные» ягнята таджикской породы генотипа АА/АА, ко второй группе-ягнята всех остальных генотипов, обусловливающих коричневую, бурую рыжую и палевую окраску всех оттенков. Эти окраски детерминируются взаимодействием наиболее эффективного ингибитора репигментации - гена АWtАWt c аллелями EBIEBI, EBrEBr и EYEY , которые оказывают противоположное действие, с различной эффективностью индуцируют меланогенеза. Существенное влияние на формирование оттенков и окрасок могут оказывать гены, определяющие тип шерстенного покрова.

Из таблицы  можно видеть, что только ягнята черной и белой окрасок составляют действительно резко отличающиеся от других группы. Результаты анализа данной таблицы показывают, что данные, полученные с помощью метода жидкой хроматографии, имеют наибольшую ценность, так как информация, содержащаяся в них наиболее полная. Достаточно точно установлено содержание в волосах эумеланина и феомеланина, что ранее не могло быть сделано ни одним из существующих мтодов.

ЭПР-спектроскопическое исследование дает в большей мере качественные, чем количественные результаты в рамках нашего эксперимента. Однако этот метод весьма полезен, так как позволяет изучить наиболее интимные свойства вещества на молекулярном уровне. На основе проведённого исследования могут быть сделаны определённые заключения о структуре меланина. Очевидно, разрешение сверхтонкой структуры от атома азота в ЭПР – спектре стало возможным в связи с присутствием в образцах этого типа областей с низкой локальной концентрацией парамагнитных центров. Интенсивность этих сигналов относительно невысока (15-75 мм), что свидетельствует об относительно низкой и общей концентрации парамагнитных центров.        

Нами были изучены образцы шерсти, полученные с бочков животных перед первой стрижкой, для анализа шерсти была использована общепринятая методика. Для решения этого вопроса была детально проанализирована структура шерстного покрова ягнят таджикской породы различных окрасок. Структурный анализ шерстного покрова ягнят таджикской породы показал, что гены, определяющие высокую шерстную продуктивность полугрубошерстных пород овец, могут с различной эффективностью ингибировать меланогенез.

Некоторые авторы высказывают мысль о том, что при формировании фолликулов перед началом новой фазы роста популяция меланоцитов может восстановиться за счет митотического деления зрелых меланоцитов, сохранившихся в фолликулах (Жилякова, 2001; Алиев и др., 1995). Корреляционный анализ позволил нам отобрать основные параметры, которые в наибольшей степени связаны с удельным содержанием пигмента в волосах. В соответствии с результатами этого анализа их можно расположить в порядке значимости в детерминации интенсивности процессов меланогенеза. При проведении корреляционного анализа ставилась задача качественной оценки характера и степени связи между изучаемыми параметрами и выявления признаков, наиболее тесно связанных с вышеназванными характеристиками, критериями результативности процесса пигментогенеза.

Табл. 3. Характер ингибирования меланогенеза в постнатальном онтогенезе ягнят таджикской породы

Окраска ягнят

Номер биопсии

Количество меланоцитов на 1 фолликул

Количество фолликул без мелано-цитов, %

Содержание меланосом,

Баллов

в мелано-цитах

в керати-ноцитах

ость

пух

ость

пух

ость

пух

ость

пух

темно- бурая

и бурая

1

6,4

1,8

10,2

57,3

3,5

2,0

2,1

1,6

2

5,7

1,4

19,8

69,7

3,3

2,4

2,1

1,2

3

4,1

1,4

24,5

69,8

3,1

2,0

1,1

0,7

4

4,4

1,0

39,3

93,2

3,2

2,1

1,1

0,0

темно- рыжая и рыжая

5

6,0

1,7

14,9

62,1

3,3

2,9

1,9

1,3

6

3,7

2,7

53,6

49,4

3,6

2,5

1,2

1,5

7

4,0

1,1

69,2

71,5

2,9

1,6

1,6

1,4

8

1,6

1,2

84,3

95,2

2,9

2,1

0,5

0,0

светло- рыжая и палевая

9

3,1

1,5

51,2

75,6

2,5

2,1

0,5

0,6

10

1,6

1,0

82,5

92,3

2,3

2,2

0,3

0,3

11

3,3

1,2

85,4

91,0

1,9

2,1

0,2

0,0

12

2,5

0,0

92,3

100,0

2,8

2,0

0,0

0,0

Действительно, данные, представленные в таблице 4, позволяют выявить важную закономерность, которая не могла быть установлена без проведения вычислительного эксперимента. Особи с более интенсивным меланогенезом отличаются двумя принципиальными особенностями: они обладают более развитым комплексом биохимических параметров, необходимых для осуществления пигментогенеза и одновременно наиболее эффективно реализуют потенциальные возможности этих параметров.

Так, уравнение множественной регрессии, соответствующее группе черных «рецессивных» ягнят так «преобразовало» входные параметры ягнят других генотипов, что концентрация гранул в волосах повысилась в 1,5-2 раза, при этом рыжая окраска превратилась в бурую, темно-рыжая в темно-бурую. В то же время уравнение множественной регрессии рыжих ягнят неэффективно «преобразовывает» входные параметры и превращает все окраски, в том числе черную, в рыжую.

Табл. 4. Эффективность процесса меланогенеза при различных комбинациях входных параметров и уравнений множественной регрессии

Входные параметры

Тип фолликула

Уравнение регрессии

черно-рыжие

темно-бурые

бурые

Темно рыжие

рыжие

все особи

черно-рыжая

1

347

157

140

189

70

230

2

569

255

271

415

138

178

3

756

427

408

628

177

670

темно- бурая

1

167

120

78

130

69

131

2

352

334

190

127

178

143

3

487

400

299

444

170

430

бурая

1

200

147

70

120

81

141

2

327

255

148

200

104

228

3

351

330

168

238

122

244

темно- рыжая

1

191

138

76

120

77

130

2

218

127

144

168

100

200

3

236

350

203

241

140

271

рижая

1

150

21

83

130

64

90

2

163

78

100

141

100

110

3

121

81

104

118

119

80

светло- палевая

1

203

121

89

128

70

140

2

337

210

165

238

109

259

3

407

300

220

318

124

317

Примечания: 1 – пух, 2 – переходный волос, 3 – ость.

Анализ полученных нами результатов показывает, что наибольшее влияние на результат процесса меланогенеза оказывают такие параметры, как содержание гранулы пигмента меланина в цитоплазме меланоцитов, число меланоцитов в области сосочка и количество митозов пигментных клеток. Глубокое всестороннее изучение механизма меланогенеза обнаруживает существование некоторых своеобразных особенностей у отдельных особей этой породы овец. Показано, что гены–модификаторы и другие гены, определяющие повешение однородности, густоты, интенсивности и равномерности роста шерсти, ингибируют меланогенез у таджикской породы овец. Можно с уверенностью сказать, что обстоятельный и детальный анализ этих вопросов даст возможность выявить влияние внешних и внутренних факторов на шерстную продуктивность этой породы овец. А также можно дать интерпретацию работы других генов, контролирующих окраску шерстного покрова у овец этой породы.

Анализ результатов этого графика убедительно свидетельствует о том, что некоторые различия в относительном содержании отдельных фракций пуха, переходного волоса и ости в основном является случайными. Можно лишь отметить тенденцию к уточнению пуха и некоторому снижению содержания ости в шерсти палевых ягнят. Из рисунка видно, что лишь единичные пуховые волокна пигментированы. Количество переходных и остевых волос, сохранивших пигмент к пятимесячному возрасту, явно намного больше среди черных и бурых образцов по сравнению со рыжими и палевыми. В образцах всех окрасок закономерно возрастает относительное содержание пигментированных волос по мере увеличения их диаметра. Например, значительная часть бурых, темно-рыжих, рыжих и светло-рыжих волос самого большего диаметра (65-100 мкм) остаётся окрашенной при первой стрижке. Следовательно, гипотеза о том, что оттенки буро-рыжей окраски шерсти новорожденных ягнят таджикской породы определяются главным образом генами, контролирующими меланогенез, верна.

Изучение механизма заполнения меланосом меланоцитами и включения их в волосяные фолликулы ягнят различных

пород овец

Проведенное нами исследование срезов волос под световым микроскопом показало, что активный процесс включения меланоцитов в волосы не является уникальным свойством для таджикской породы, а вполне закономерен для волосяных фолликулов ягнят обеих изученных пород и генотипов.

Причем ярко выражена связь между количеством мигрирующих в волосах меланоцитов и интенсивности пигментогенеза у черных ягнят обоих генетических вариантов, число пигментных клеток в волосах на порядок выше, чем у бурых или тем более рыжих и коричневых ягнят. Следует обратить внимание на то, что в рис. 9 представлены данные о количестве меланоцитов, включающихся в волос длиной всего лишь 1 мм – на такую величину вырастают остевые волосы ягнят за 1–3 дня (в зависимости от природы). Очевидно, что в фолликулах всех генотипов должен существовать механизм, компенсирующий потерею пигментных клеток. В противном случае весь запас меланоцитов, локализованных на сосочке, очень быстро бы истощился и снабжение волоса пигментом прекратилась бы. Для правильной интерпретации данного явления важно учитывать, что на гистологических срезах волос или тем более на просветленных специальной обработкой (целых) волосах включенные пигментные клетки выглядят, как скопление гранул. Но на полутонких срезах хорошо видна структура меланоцитов и их несложно идентифицировать - это крупные клетки, существенно большие по сравнению с кератиноцитами.

Рис. 10. Количество меланоцитов в волосе длиной 1мм ягнят различных окрасок.

П р и м е ч а н и е: количество меланоцитов в ости (ряд 1), количество меланоцитов в пухе и переходном волосе (ряд 2)

Меланосомы обычно локализуются на периферии и в отростках, причем их концентрация в несколько раз выше, чем в окружающих кератиноцитах часто можно наблюдать ядрышки, и даже дендриты-атрибуты, свидетельствующие о том что данная структура является пигментной клеткой, а не конгломератом гранул непонятной природы, формирование которого в фолликуле маловероятно также в цитофизиологическом и физико-механическом аспектах.

Результаты наших экспериментов позволяют существенно продвинуться в направлении понимания роли митотического деления меланоцитов в процессе меланогенеза.

Установлено, что у изученных ягнят значительная часть меланина приносится в волосы мигрирующими меланоцитами. Чрезвычайно высокая частота митозов мы наблюдали у доминантных черных гиссарских и таджикских ягнят с наиболее интенсивным меланогенезом.

Надо отметит, что целью данной главы была установление типа и механизма миграции меланоцитов у ягнят таджикской и гиссарской пород различных генотипов окраски. Нам удалось с помощью метода ВЖХ и ЭПР спектроскопии достаточно точно установить содержание в волосах эумеланина и феомеланина, что не позволял сделать ранее ни один из существующих методов.

Изучение ингибирующего влияния на меланогенез генов, определяющих высокую шерстную продуктивность овец

Как было сказано выше, характерные свойства овец таджикской породы заключаются в том, что, по достижении ими 8-9 месячный возраст в волосяных фолликулах (около 96%) приостанавливается синтез пигмента меланина.

Несомненно, что весьма перспективным является глубокое изучение биохимических, молекулярных и морфофизиологических основ жизнедеятельности меланоцитов с кератиноцитами первичных и вторичных фолликул овец полугрубошерстных и грубошерстных пород в разные фазы роста волоса. Очевидно, что активность меланоцитов в волосяных фолликулах различных животных частично зависит от влияния различных внешних и внутренних факторов.

В вычислительных экспериментах имеется возможность более четко продемонстрировать эффекты разнообразных изменений в типе шерстного покрова, моделировать влияние на меланогенез генов-модификаторов, обусловливающих совокупность характеристик шерстного покрова овец различных пород.

Данные натурных экспериментов свидетельствуют о том, что черные “рецессивные” и доминантные особи Аа/Аа и ЕD/ЕD при любой структуре шерстного покрова остаются черными, поскольку меланогенез у них весьма интенсивен и гены модификаторы не оказывают заметного влияния. Прежде всего, следует определить, как изменяется пигментогенез в волосяных фолликулах в случае уменьшения диаметра пуха и огрубления ости. Здесь точкой отечета могут служить пуховые и остевые волосы у наиболее детально изученной нами  таджикской породы.

В таблице 10 представлены результаты вычислительного эксперимента, в котором исследуется влияние изменения объема луковиц на пигментогенезе.

Изменение объема осуществляется в двух направлениях: в сторону уменьшения объема пуховых фолликулов таджикских ягнят или увеличения остевых, в обоих случаях в 2 и 4 раза (это изменение вполне реально, например пуховые и остевые фолликулы различаются по объему в 10 и более раз).

Рис. 11. Моделирование меланогенеза и составление уравнения регрессии в волосяных фолликулах таджикской и гиссарской породы овец. Примечание: пух (ряд 1), переходный волос (ряд 2), ость  (ряд 3), мертвый волос (ряд 4).

Данные этого эксперимента представляют большой интерес. Свойства довольно неожиданного результата заключаются в том, что не произошло заметного уменьшения содержания гранул пигмента в волосах при существенном уменьшении объема луковиц фолликулов так как уменьшение диаметра пуховых волос не приводит к изменению их окраски.

Табл. 5. Моделирование ингибирования меланогенеза в постнатальном онтогенезе ягнят таджикской породы

Густота шерсти, волос/см2

Скорость роста,

см/месяц

Показатели фракций волос

Уравнение регрессии (окраски ягнят)

средние показатели при рождении

1800

1,25

1

2

3

4

120

137

400

темно-бурая

71

151

170

бурая

121

180

230

темно- рыжая

61

100

121

рыжая

показатели ягнят в возрасте 5 мес, худших по шерстным качествам

1800

2,00

1

2

3

4

45

130

155

рыжая

27

58

65

с-рыж

45

71

95

рыжая

25

40

45

полевая

показатели ягнят в возрасте 5 мес, средних по шерстным качествам

2500

2,50

1

2

3

4

16

45

60

светло рыжая

10

25

27

белая

16

25

34

полевая

10

15

17

белая

показатели ягнят, выдающихся по шерстным качествам

3500

3,50

1

2

3

4

4

13

12

белая

3

6

7

белая

6

9

10

белая

3

5

6

белая

Примечания: 1-пух, 2 - переходный волос, 3 –ость; 4-окраска животных.

Из таблицы 5 видно, что моделирование выявило достаточно очевидную биологическую закономерность, то есть уменьшение объема луковицы ниже определенного уровня (того, при котором сосочек уже не имеет капилляров), и снабжение пигментных клеток осуществляется через корневые влагалища фолликула не должно приводить к снижению эффективности меланогенеза, так как для этого действительно нет морфо-физиологических причин.

Другой результат эксперимента мог прогнозироваться априори,но он тем не менее весьма важен: при возрастании объема луковицы в 2-4- раза в 1,5 – 3 раза увеличивается удельная концентрация меланосом в остевых волосах. Это оказывает непосредственное влияние на окраску, превращая темно-бурые и темно-рыжие волосы в черные, бурые в темно-бурые и т.д. Эти данные объясняют результаты наблюдений над окраской гиссарских овец у которых при общем буро-рыжем тоне часто встречаются волосы черного и темно-бурого цвета. Очевидно, у особей одного генотипа окраски, цвет волос является функцией их диаметра. В этом свете становится ясной довольно однородная по всему туловищу окраска животных с полугрубой шерстью и весьма неординарная - у грубошерстных,  особенно диких овец - это является, бесспорно, отражением гораздо большего разнообразия в диаметре остевых волос.

Как видно из рис. 10 наиболее грубошерстные гиссарские овцы при том же генотипе окраски будут заметно темнее таджикских полугрубошерстных овец, ость которых тоньше-то есть подтверждается высказываемая идея о том, что гены, обусловливающие характеристики шерстного покрова, являются модификаторами, влияющими на характер проявления генов, контролирующих меланогенеза.

Причиной ингибирования пигментогенеза является ярко выраженное развитие шерстных качеств в постнатальном онтогенезе ягнят. Оно заключается в возрастании густоты и скорости роста шерсти.

  Из рис. 10 следует, что у лучших по шерстным характеристикам ягнят происходит абсолютное ингибирование пигментогенеза. Среди большинства ягнят, характеризующихся средним для породы развитием шерстного покрова, если они темно-бурые или темно-рыжие, полного подавления меланогенеза не достигается, худшие же по шерстным качеством ягнята остаются пигментированными в различные оттенки рыжей и палевой окраски.

Это надо понимать следующим образом: после первой стрижки (в возрасте 4,5- месяцев) в шерстном покрове ягнят сохраняется некоторое количество пигментированных остевых и переходных волос, которые и могут создать эффект чало-рыжей окраски, в случные светло-рыжей и палевой окрасок пигментация практически не заметна.

Изучение влияния генов-модификаторов на меланогенез у ягнят таджикской породы

Овцы полугрубошерстных пород (в частности таджикская порода) могут рождаться как пигментированными, так и белыми. Очевидно, ингибирующий эффект генов-модификаторов в постнатальном онтогенезе определяет постепенную в течение нескольких недель или даже месяцев депигментацию шерстного покрова.

Ягнята таджикской породы являются великолепным объектом для изучения влияния генов-модификаторов на окраску шерстного покрова овец. Овцы таджикской породы наглядно иллюстрируют характер меланогенеза у новорожденных ягнят. Эти ягнята имеют широчайший спектр буро-рыжих окрасок.

Важнейшим здесь является то, что у ягнят таджикской породы можно наблюдать и изучать переходный этап, когда начинается активный рост пуховых и переходных волос, обусловливающий включение механизимов, угнетающих пигментацию. Этот критический момент может быть исследован на самых разных уровнях: от визуальной оценки волос до цитологического, биохимического и молекулярного изучения процессов, происходящих в клетках меланомы, в меланоцитах, кератиноцитах и других клетках волосяного фолликула.

Исследование образцов шерсти таджикских ягнят показало существование тонких постепенных переходов, стирающих грани между черной, темно-бурой, бурой, светло-бурой, темно-рыжей, рыжей, светло-рыжей и палевой окрасками.

В литературе имеются данные, объясняющие характер действия генов, имеющих плейотропный эффект их влияния на различных этапах онтогенеза, а также форма взаимодействия генов- модификаторов с генами, контролирующими течение меланогенеза (Коновалов В.С. 2004; Конюхов Б.В. 2001; Корочкин Л.И. 2003; Tamate Hidetochi В et. al., 2004). Имеются также данные о том, что гены, контролирующие пигментацию шерстного покрова у полугрубошерстных пород овец, могут с различной эффективностью ингибировать меланогенез (Алиев Г.А. и др., 1987). В связи с этим была поставлена цель установить, только ли аллели генов АА и ЕЕ определяют окраску при рождении у ягнят таджикской породы, или гены-модификаторы также вносят свой вклад в формирование оттенков уже в пренатальном онтогенезе, когда формируются остевые и переходные волосы (пух, тонкий переходный волос), которые начинают интенсивно расти только после рождения ягнят и не вносят вклад в окраску при рождении. Для решение этого вопроса была детально проанализирована структура шерстного покрова 55 ягнят различных окрасок. Изучались образцы шерсти, полученные с бочков животных перед первой стрижкой. Для анализа шерсти была использована общепринятая методика. Препараты с волосами изучались на микроскопах ВН-2 и MPI-5.

При изучении образцов шерсти установлено также, что четкая закономерность, характер депигментации тесно связаны с окраской волос при рождении – чем светлее волосы, тем раньше и полнее осуществляется подавление меланогенеза. Ингибирующая эффективность генов-модификаторов у различных ягнят различна, что вызвано заметными индивидуальными колебаниями в характере шерстного покрова.

Рис. 12. Относительное содержание пигментированных волос во фракциях пуховых, переходных и остевых волос у 5-месячных ягнят таджикской породы

П р и м е ч а н и е:  Пух, диаметр волос 10,0 – 29,9 мкм (ряд. 1), переходный волос, диаметр волос 30,0 – 44,9 мкм (ряд. 2), ость, диаметр волос 45,0 – 100 мкм (ряд 3)

Анализ проводили в депигментированной зоне образцов, то есть исследовали проксимальный участок косицы. Из полученных результатов видно, что к 5- месячному возрасту почти все пуховые и большая часть переходных волос депигментированы. Количество переходных и остевых волос, сохранивших пигмент, явно намного больше в бурых образцах по сравнению с рыжими и светло-рыжими, палевые образцы совершенно не содержат цветных волокон.

В образцах шерсти животных всех окрасок, (кроме палевой) закономерно, по мере увеличения их диаметра, возрастает относительное содержание пигментированных волос.

Таких толстых остевых волос в шерстном покрове таджикских овец немного (0,5- 4,0%), поэтому они мало заметны, а депигментация в первые недели и месяцы постнатального онтогенеза выражена четко. Закономерное возрастание числа пигментированных волос по мере увеличения интенсивности окраски особенно заметна при рассмотрении второго и третьего столбца рисунка 11, где показано содержание окрашенных волос во всех фракциях шерсти. Если у палевых ягнят пигментированных волос нет вообще, у светло-рыжих их лишь 2, 91%, то у бурых содержится уже 7,27% окрашенных волос. Для сравнения приведены результаты анализа образцов шерсти черных ягнят, у которых 96,7% волос пигментированы, то есть меланогенеза очень интенсивен.

Ингибирующее влияние на меланогенеза генов, определяющих высокую шерстную продуктивность овец, до настоящего времени никем не исследовано. В литературе лишь имеются косвенные данные об изучении данного вопроса. В данной главе мы впервые частично излагаем данные о влиянии хозяйственно-производственных факторов на процесс пигментации волос.

Исследование меланогенеза у таджикской полугрубошерстной породы овец, а также изучение литературы привело нас к твердому убеждению, что гены-модификаторы оказывают на меланогенез весьма существенное влияние. Особенно велика их модифицирующая роль при различных комбинациях аллелей генов АА и ЕЕ, определяющих у грубошерстных овец оттенки рыжей и бурой окрасок. Овцы таджикской породы унаследовали этот ген от овец гиссарской породы. Согласно гипотезе академика Алиева Г.А., аллели гена АА угнетают меланогенез с различной эффективностью, а аллели гена ЕЕ, наоборот, способствуют нормальному его течению, блокируя действие аллелей гена АА (Алиев Г.А. и др., 1989, 1995). Результат их «борьбы» обуславливает абсолютное и относительное содержание эумеланиновых и феомеланиновых гранул в волосе, то есть его окраску.

Анализ полученных данных показывает, что один из главных путей, видимо, является резкое повышение концентрации аминокислоты, цистеина в составе корма, необходимой для синтеза пигмента кератина шерсти, и содержание сульфгидрильной группы, связывающей медь, необходимую для активации основного фермента меланогенеза тирозиназы. Возрастание конкуренции между активно функционирующими и размножающимися кератиноцитами и локализованными в пространствах между ними меланоцитами также оказывает угнетающее действие на функционирование меланоцитов.

На основе опытов Алиева Г.А. и Косимова Р.Б., проведенных на культуре клеток меланоцитов, полученных у ягнят таджикской породы, доказано, что подавление митозов в волосяном фолликуле обуславливает переход меланоцитов от синтеза феомеланина к синтезу эумеланина, то есть повышает их активность (Алиев Г.А. и др., 1989).

Очевидно, что даже при сохранении нормальной активности меланоцитов концентрация гранул в клетках волос должна снижаться только за счет ускорения их роста, так как меланоциты, работающие с постоянной интенсивностью, просто не будут успевать снабжать кератиноциты гранулами в том же количестве.

Анализ полученных результатов показывает, что поступление в меланоциты предшественников меланина, необходимых для нормального течения метоболических процессов, затруднено в мелких фолликулах. В пуховые и переходные волосы, у которых сосочки слабо развиты, затруднено поступление гранул меланина. Так как сосочек играет роль «ворот» для поступления биохимического сырья, (аминокислоты, соль тяжелых металлов и др.) лишь в крупных фолликулах с развитой системой сосудов поступление этих веществ облегчено. Мелкие молекулы аминокислоты и молекулы тяжелых металлов поступают в клетки через влагалища. Очевидно, при этом пигментные клетки, локализованные на поверхности сосочка, оказываются в менее благоприятных условиях. Правильность такой трактовки подтверждается тем, что у гиссарской породы овец пух всегда намного светлее ости, лишь у черных овец генотипа Ed(E) или генотипа аа пух тоже растет черным.

В натурном эксперименте, проведенном нами на ягнятах таджикской породы, различающихся по густоте шерстного покрова, было выявлено четко выраженное ингибирующее влияние на меланогенез структуры и скорости роста шерсти, а также на возрастание густоты шерстного покрова. Анализ полученных данных свидетельствует в том, что увеличение скорости роста волос имеет тот же эффект, угнетающий пигментогенез.

Биохимические основы изучения меланогенеза в волосяном покрове овец

В литературе отсутствует более или менее удовлетворительная информация о том, в чем на биохимическом уровне заключается принципиальные различия в комплексе процессов меланогенеза, приводящие к столь существенным различиям в количестве и качестве пигментных гранул в волосяном покрове овец черной, бурой, коричневой, рыжей и палевой окрасок. Очевидно, что основную роль здесь играют пигментные клетки, взаимодействующие с кератиноцитами, формирующими волос.

Джимбов К с соавторами (Jimbow К., et al., 2006) утверждают, что дифференцированные меланоциты могут митотических делиться. Они подчеркивают, что митотическое деление меланоцититов было найдено в коже человека и лабораторных крыс, а также в развивающихся фолликулах цыпленка и мыши. Авторы обращают внимание на то, что присутствие в клетках таких функций свидетельствует о дифференцировке этих клеток. Меланосомы и тирозиназа не препятствуют делению меланоцитов in vivo при нормальных физиологических условиях без внешних стимулов. Быстрое увеличение меланиновой пигментации связано с размножением меланоцитов так же, как с интенсификацией меланогенеза в каждом меланоците. Авторы подчеркивают, что пока не известно, какие биохимические механизмы или процессы связывают митозы с меланогенезом.

Светооптический метод изучения меланогенеза в постнатальном онтогенезе ягнят различных окрасок дает возможность составить посильную биохимическую картину процессов, происходящих в волосяных фолликулах в переходный момент, когда под влиянием генов-модификаторов подавляется пигментация. Меланоциты покидают сосочек и включаются в волос у ягнят всех окрасок, они сохраняются лишь в редких наиболее крупных фолликулах. Установлена совершенно четкая закономерность: чем светлее окраска ягненка при рождении, тем раньше меланоциты освобождают фолликул.

Проведенное исследование срезов волос под световым микроскопом показало, что активный процесс включения меланоцитов в волосы не является уникальным свойством таджикской породы, а вполне закономерен для волосяных фолликулов ягнят гиссарской породы. Причем ярко выражена связь между количеством мигрирующих в волосе меланоцитов и интенсивностью пигментогенеза у черных ягнят обеих пород.

Основным фактором, обуславливающим постепенное ослабление и затем полное прекращение поступления пигмента в волосы, является закономерный, четко наблюдаемый под световым микроскопом уход меланоцитов из зоны обычной их локализации на вершине сосочка фолликула и включение их в строящийся волос.

Рис. 13. Митотическая активность меланоцитов и клеток матрикса в фолликулах ягнят различных генотипов

Из рисунки 12 видно, что высокая митотическая активность меланоцитов локализованных на сосочке волосяного фолликула, закономерна для ягнят большинства изученных генотипов в фолликулах всех категорий. Чрезвычайно высока частота митозов у «доминантных» черных гиссарских ягнят с наиболее интенсивным меланогенезом, селекционируемых по выраженности черной окраски. У «рецессивных» черных ягнят таджикской породы методическая активность пигментных клеток также весьма высока, по мере ослабления интенсивности процесса меланогенеза закономерно понижается митотическая активность пигментных клеток, что довольно четко проявляется при сравнении черных, темно-бурых, бурых и темно-рыжих ягнят. У светло-рыжих и палевых ягнят таджикской породы митозов, меланоцитов не выявлено. Биохимические характерные ферменты из числа пигментов клеток в волосах на порядок выше у черных, чем у бурых или тем более у рыжих. Меланогенная активность начинается в меланоцитах, «активированных» ультрафиолетовыми лучами раньше пролиферации, что означает не только совместимость дифференцированного состояния с митотическим делением, но и то, что эти процессы могут быть связаны каким-то образом. Можно допустить мысль о том, что при формировании новых фолликулов перед началом новой фазы роста популяция меланоцитов может восстановиться за счет митотического деления зрелых меланоцитов, сохранившихся в фолликулах.

Генетико-селекционные подходы улучшения качества шерсти у овец таджикской породы.

После того как мы изучили биохимические и клеточные механизмы ингибирования синтеза пигмента меланина у овец таджикской породы, целесообразно было использовать эти результаты для проведения селекционных работ с целью улучшения качества шерсти овец. Проведённое исследование, на наш взгляд, имеет достаточно важное значение. С одной стороны, такого рода исследование важно в генетическом отношении для выяснения закономерностей наследственной передачи качеств и структур шерсти. С другой стороны изучение шерсти имеет большой практической интерес, так как может дать рекомендации овцеводческим хозяйствам для получения доброкачественной однородной шерсти пригодной для промышленных потребностей.

У овец таджикской породы ягнята рождаются с различными окрасками шерстного покрова-от черно-бурого до светло-рыжего. Степень депигментации после первой стрижки у отдельных животных достигает  96%, но у ягнят, имеющих черную окраску шерсти, степень депигментации волос после первой стрижки очень незначительна. Почти у всех ягнят таджикской породы, родившихся с рыжими оттенками шерстного покрова, после первых 2-3 месяцев поступление пигмента в волосяные фолликулы почти во всех волокнах кроме кроющих волос головы и ног, прекращается. У бурых и черных ягнят этот процесс наступает несколько позднее, то есть у этих ягнят шерсть и после первой, второй и третьей стрижки имеет сероватый оттенок.

Обратимся к  результатам исследования, проведенного нами по изучению влияния генотипа барана-производителя, имеющего светлую окраску кроющего волоса, а также коэффициент наследуемости генотипов баранов-производителей по отношению к их потомкам. Следует отметить, что нами также было исследовано  влияние условия содержания и кормления на окраску шерсти и шерстной продуктивности овец. Исследование проводили в опытных группах и в условиях естественного содержания животных, то есть в экспериментальных условиях в хозяйстве лаборатории генетики и селекции овец в совхозе имени Калинина Ленинского района (ныне дехканские хозяйства имени Таджикистана Рудакинского района).

По нашим наблюдениям,  у ягнят палевых окрасок белая шерсть начинает расти уже через несколько недель после рождения, а у ягнят, родившихся бурыми, шерсть остается слегка сероватой. Депигментация не затрагивает кроющие волокна головы и ног и наиболее толстые остевые волосы, то есть чем толще волосы, тем менее интенсивен процесс торможения меланогенеза. Так у ягнят бурой окраски содержание пигментированных волос после первой стрижки колеблется от 0,15% до 10,76%, которые постепенно уменьшается.

В опытных группах были сформированы 3 подгруппы по 50 голов ярок и баранчиков 7 месячного возраста и 1 подгруппа ярок 18 месячного возраста таджикский породы овец. В период эксперимента их кормили по нормам ВИЖ для мясо-шерстных ягнят со средней живой массой на 20-25 кг превышающей аналогичные величины у контрольных животных, выращенных в обычных хозяйственных условиях.

В своих опытах в основном мы брали бараны-производителей, которые имели кроющие волосы в области головы и ног палевого или светло-рыжего оттенка. Разделение овцематок по окраске кроющего волоса головы не производили. Другой важной особенностью рассматриваемых окрасок, является то, что у ягнят таджикской породы в течение первых недель – месяцев жизни постепенно ослабляется пигментация шерсти и после первой стрижки у большинства ягнят растет белая шерсть. Причем процесс депигментации находится в непосредственной связи с окраской ягнят при рождении: чем светлее ягненок при рождении, тем раньше у него начинается рост депигментированной шерсти и тем она белее у взрослого животного.

Рис. 14. Годовой настриг шерсти (кг) и степень пигментации

  волокон шерсти (%) у овец таджикской породы

В опытных группах от овец племенного ядра таджикской породы получали довольно высокий настриг шерсти у которой уровень депигментации после первой стрижки у отдельных животных, имеющих более светлые кроющие волосы, достигал 97,8 %.

Для выявления настрига шерсти от овцематок таджикской породы различных возрастов мы отобрали 5 групп животных разного возраста. Полученные данные свидетельствуют о том, что шерстная продуктивность овец таджикской породы подвержена возрастным изменениям. Наиболее высокая шерстная продуктивность отмечена у молодых овцематок 2,5-3,5-летного возраста.

Динамика изменения шерстной продуктивности позволяет говорить о наличии тенденции к снижению величины этого показателя. У более старых животных 6,5-7,5-летнего возраста, наблюдается подтверждённое опытным путём снижение шерстной продуктивности и ухудшение ее качества. Результаты этих исследований позволяют считать, что у таджикских овец величина этого хозяйственно - полезного признака зависит также и от половозрастных изменений, от условий кормления и содержания овец.

Овец таджикской породы, как известно, стригут два раза в год. Структура шерстного покрова во многом однотипна: 72,4% пух и менее 2,7% окрашенные волосы это переходные волосы и ости. Для изучения шерстной продуктивности был проведен индивидуальный учет настрига весенней и осенней шерсти более чем у 700 голов животных (таб. 10).

Наивысший настриг шерсти и наименее пигментированные волосы отмечены у годовалых баранов, выращенных в улучшенных условиях кормления и содержания. Необходимо особо отметить, что условия кормления оказывают существенное влияние на шерстную продуктивность.

Многочисленные данные соответствующей научной литературы свидетельствуют, о том, что в овцеводстве успех в генетическом улучшении стада или породы на 80-90% зависит от целенаправленного отбора и подготовки баранов производителей (Алиев и др., 1987). Объясняется это тем, что для племенных целей отбирают самых лучших производителей с консолидированной наследственностью, стойко передающих свои породные, племенные и хозяйственно-полезные продуктивные качества потомству.

В нашу задачу входило изучение генотипа баранов-производителей путем целенаправленной селекции с использованием метода искусственного осеменения производителей потомства с наибольшим количеством пуха и наименьшим количеством пигментации, переходного волоса и ости. Для этой цели мы подбирали в основном бараны, имеющих более светлее, то есть палевые, светло-палевые и рыжие кроющие волосы в области головы и ног.

Для опыта нами были предварительно оценены 8 молодых 1,5- летних и 3 взрослых барана-производителя, имеющих более светлую окраску шерсти кроющего волоса головы и ног, которые были использованы для искусственного осеменения овцематок 6 отар.

Взрослые бараны и молодые производители были оценены биохимическими тестами по происхождению, собственной продуктивности и по качеству их потомства. Все бараны были отнесены к элите. Средняя живая масса взрослых баранов- производителей составляла 125,2 кг с колебаниями от 120 до 128 кг. Годовой настриг шерсти у взрослых баранов в среднем был равен 4,18 кг с колебанием от 4,0 до 4,7 кг. Процент пигментированных волос составлял 2,7 – 3,2%. Степень депигментации шерсти составлял 97,3 - 96,8 % соответственно.

Установлено, что высокие потенциальные возможности овец таджикской породы стойко наследуются потомством и могут быть использованы для улучшения шерстных качеств низкопродуктивных грубошерстных овец. От годовалых ярок и баранов, которые содержались в осеннее-зимне-весенние периоды в улучшенных условиях кормления, получен более высокий настриг шерсти (на 0,42 и 0,72 кг соответственно), чем от их аналогов по возрасту и полу, находившихся в обычных хозяйственных условиях.

Особенно большое различие в настриге шерсти обнаружено у 2,5- летних и взрослых маток, находившихся в разных условиях кормления. Опытные овцематки 2,5-летного возраста, по годовому настригу шерсти превышали контрольных овец на 1,37 и на 2,12 кг соответственно. Взрослые овцематки контрольной группы дали на 2,20 кг меньше шерсти, чем их аналоги по возрасту в опытных группах.

Установлено, что высокие потенциальные возможности овец таджикской породы стойко наследуются потомством и могут быть использованы для улучшения шерстных качеств низкопродуктивных грубошерстных овец. Выявлено, что коэффициент изменчивости настрига шерсти у овец таджикской породы колеблется от 19,98 до 24,06 %, что свидетельствует о наличии довольно значительных потенциальных возможностей улучшения этого хозяйственно- полезного признака.

  Мы считаем необходимым подчеркнуть, что все эти выводы не носят абсолютный характер, они лишь основываются на результатах наших экспериментов над ягнятами изучаемых генотипов (рассматривается взаимодействие аллелей генов А и Е) и относятся только к этим генотипам.

  Обобщая вышеприведенные результаты, можно прийти к такому выводу, что факторы, влияющие как ингибиторы меланогенеза шерсти у овец, могут быть как биохимическими, так и генетико-селекционными.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Разработанные биохимические и генетико-селекционные подходы изучения механизма ингибирования меланогенеза у полугрубошерстных и грубошерстных овец могут быть широко использованы в овцеводстве с целью повышения эффективности селекции по шерстной продуктивности и получения однородной качественной шерсти для нужд промышленности.

2. Установлено, что высокие потенциальные возможности овец таджикской породы стойко наследуются потомством и могут быть использованы для улучшения шерстных качеств низкопродуктивных грубошерстных овец.

3. Разработана  методика устранения цветных волокон, встречающихся в шерсти таджикской породы овец, которая имеет практическую значимость для селекции.

4. Материалы диссертации могут быть использованы во время разработки рекомендаций для создания популяции овец таджикской породы, в шерсти которых отсутствовали бы цветные волокна в овцеводческих хозяйствах Республики Таджикистан и других соседних странах

ВЫВОДЫ

1. Впервые дана биохимическая, молекулярная и генетико-селекционная интерпретация процесса ингибирования шерсти овец. Научно интерпретирован механизм депигментации шести у полугрубошерстных (таджикская) и грубошерстных (гиссарская) пород овец.

2. На модели гетерокарионов выявлена природа клеточных факторов, блокирующих синтез пигмента меланина у отдельных особей таджикской породы овец, имеющих более светлую окраску шерсти. Установлено угнетающее влияние клеточных факторов на различные стадии клеточного цикла  и на синтез пигмента меланина.

3. В цитоплазме клеток меланина установлено наличие белковых факторов, блокирующих репликацию в клетках партнера и выявлены внутриклеточные механизмы, препятствующие репликации при их терминальной дифференцировке.

4. Установлено, что клетки меланосом после утраты способности синтезировать пигмент меланин синтезируют факторы, препятствующие синтезу ДНК в ядре клеток партнера. Выявлены негативные регуляторы клеток меланосомы, которые эффективно блокируют репликацию в ядрах незлокачественных клеток. Установлено, что трансформация незлокачественных клеток малигнизирующим онкогеном c-Ki-ras и myc снижает эффект подавления клетками меланосом синтеза ДНК в ядре клеток партнера.

5. Установлено, что некоторые биохимические показатели сыворотки крови в сочетании с общеприняты­ми зоотехническими методами могут быть использованы в се­лекционно-племенной работе с целью получения полугрубой белой шерсти у овец таджикской породы. Выявлен комплекс биохимических и генетических характеристик пигментных клеток, тесно коррелирующих с содержанием меланина в волосах. Взаимосвязи отобранных параметров между собой и каждого из них с концентрацией гранул меланина в волосах имеют существенные особенности в волосяных фолликулах, формирующих пуховые, переходные и остевые волосы. Характеры линий регрессии и уравнений множественной регрессии, отражающих эффективность процесса меланогенеза, специфичны для каждого генотипа окраски. 

6. Открыто ранее неизвестное, наблюдаемое у ягнят большинства генотипов окраски явление, - регулярное митотическое деление меланоцитов, локализованных в зоне сосочка волосяного фолликула. Доказано, что митотическая и меланогенная активность, характер пролиферации и миграции пигментных клеток в волосы тесно сопряжены и принципально различаются у ягнят исследованных генотипов окраски.

  7. Выявлен новый механизм транспортирования меланосом, реализующийся в процессе митотического деления пигментных клеток, их миграции из зоны сосочка фолликула и включения в формирующиеся волосы.  Установлены основные типы и механизмы миграции меланоцитов у ягнят таджикской и гиссарской пород овец различных генотипов окраски. Определена закономерность и регулярность митозов и миграции меланоцитов в растущие волосы, которая служит одним из нормальных механизмов снабжения их пигментом.  Обнаружено, что значительная часть меланина приносится в волосы мигрирующими меланоцитами.

  8. Показано, что плавность перехода от темно-бурой окраски к палевой осуществляется вследствие равномерного уменьшения концентрации меланосом в волосах и изменения  их качественных характеристик, то есть определяется постепенным возрастанием эффективности супрессии процессов меланогенеза в результате взаимодействия аллелей генов А и Е.

  9. Установлено, что взаимодействие аллелей генов А и Е, обуславливающих формирование многочисленных вариантов бурых и рыжих окрасок, определяет не непосредственный переход к синтезу феомеланина, как традиционно утверждалось ранее, а формирование смешанного типа меланогенеза, при котором в волосы поступают оба типа пигмента в различных соотношениях. В то же время, по мере уменьшения абсолютного количества пигмента, наблюдалось возрастание доли феомеланинового компонента.

  10. В натурных и вычислительных экспериментах исследовано ингибирующее действие на меланогенез биохимических факторов и генов, определяющих уникальную структуру, густоту и скорость роста шерсти овец. У полугрубошерстных овец таджикской породы пигментогенез подавляется в первые недели-месяцы постнатального онтогенеза в процессе некомпенсируемой миграции меланоцитов в формирующиеся волосы. Ингибирование меланогенеза в результате преобразования структуры волосяного покрова овец в процессе селекции по шерстным характеристикам иллюстрирует механизм полного угнетения одной функции в результате гиперразвития другой.

  11. Установлено, что гены-модификаторы, определяющие повышение однородности, густоты, интенсивности и равномерности роста шерсти, ингибируют меланогенез у овец полугрубошерстных пород. Показано, что ингибирование меланогенеза также происходит в результате преобразования структуры волосяного покрова в процессе селекции по шерстным характеристикам.

12. Экспериментально установлено, что селекция овец таджикской породы на увеличение размеров и живой массы окажет положительное влияние на настриг полугрубой шерсти. Установлено, что овцы таджикской породы, обладающие огромным генетически детерминированным потенциалом повышения шерстной (белой полугрубой шерсти) продуктивности, являются наиболее перспективными для производства по интенсивной промышленной технологии. У овец таджикской породы существует опреде­ленная коррелятивная связь между такими производственно-цен­ными признаками, как окраска  и настриг шерсти. Эту взаимосвязь можно использовать в качестве эффективного теста для раннего прогнозирования возможности получения  качественной белой однотонной шерсти.

  13. Рекомендованы способы ликвидации пигментированных волокон в шерсти и генетические пути создания депигментированных пород. Установлено, что генотип баранов-производителей, имеющих светлые кроющие волосы, коэффициент наследуемости у их потомства и улучшение условий кормления и содержания положительно влияют на степень депигментации шерсти и шерстной продуктивности.

  14. Выявлено, что коэффициент изменчивости настрига шерсти у овец таджикской породы колеблется от 19,98 до 24,06 % , что свидетельствует о наличии довольно значительных потенциальных возможностей улучшения этого хозяйственно-полезного признака. Данный потенциал стойко наследуется потомством и может быть использован для улучшения шерстных качеств низкопродуктивных грубошерстных пород овец. На наш взгляд, это один из неиспользуемых резервов таджикской породы, детерминированным в генотипе.        

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в ведущих  рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных Высшей аттестационной комиссией:

1. Алиев Г.А. Оценка влияния окраски при рождении и характера шерстного покрова на процесс ингибирования меланогенеза в волосяных фолликулах ягнят. /Алиев Г.А., Косимов Р.Б., Рачковский М.Л., Черенков С.И. //Доклады ВСХАНИЛ, Москва, № 11, 1987, С. 33

2. Алиев Г.А. Особенности пигментации волосяного покрова овец таджикской породы в онтогенезе. /Алиев Г.А., Косимов Р.Б., Рачковский М.Л // Вестник сельскохозяйственной науки. Москва, № 4, 1989, С. 57 – 64.

3. Зеленин А.В. Исследование природы блока пролиферации в терминально дифференцированных клетках на модели гетерокарионов: различные типы отсутствия пролиферации в клетках при терминальной дифференцировке. /Зеленин А.В., Прудовский И.А., Косимов Р.Б., Гуменюк Р.Р., Егоров Е.Е., Капник Е.М., Федоров Ю.И.  // Онтогенез, Москва, том 21, № 1, 1990, С. 32 – 39.

4. Косимов Р.Б.. Синтез ДНК в гетерокарионах, полученных при слиянии сегментоядерных лейкоцитов и клеток культур, обладающих различным пролиферативным потенциалом. / Косимов Р.Б., Сухарев С.И., Поспелова Т.В., Прудовский И.А., Зеленин А.В.  //Москва, Цитология. Том 33, № 2, 1991, С. 48 – 55.

5. Прудовский И.А. Позитивная и негативная регуляция репликации в гибридных клетках. / Прудовский И.А., Косимов Р.Б., Егоров Е.Е., Гуменюк Р.Р, Ходяков А.Л., Онищенко Г.Е., Тсонг Т.  //Москва, Молекулярная биология, Том 25, № 5, 1991, С. 57 – 64.

6. Косимов Р.Б. Изучение некоторых морфофизиологических параметров волосяных фолликул у овец. /Косимов Р.Б., Файзуллоев А.. А //Вестник Таджикского государственного национального университета, Душанбе, № 3, 2007, С. 170 – 177.

7. Косимов Р.Б., Изучение механизма заполнения меланосом меланоцитами и включения их в волосяные фолликулы ягнят различных пород овец. /Косимов Р.Б., Файзуллоев А.А //Доклады таджикской Академии сельскохозяйственных наук. Душанбе, 2007, № 3 (13).

8. Косимов Р.Б. Биохимические основы раннего прогнозирования однородности шерсти у овец таджикской породы. /Косимов Р.Б. //Вестник Таджикского государственного национального университета,  Душанбе, «Сино» 2008, № 1 (42).

9. Косимов Р.Б., Изучение белкового полиморфизма и его связь с настригом шерсти и окраски шерстного покрова у таджикской породы овец. /Косимов Р.Б., Ибрагимова С.И //Вестник Таджикского государственного национального университета, Душанбе, «Сино» 2008 № 1 (42).

Книги и брошюры:

  10. Методические указания и задания по определению генетического потенциала продуктивности животных и степени его реализации.  /Косимов Р.Б.  Душанбе. 1992. 12 с.

  11. Методические указания к лабораторно-практическим занятиям по курсу «Генетики» для специальности 3107 –зоотехния и 3108 – ветеринарии. Часть I (на таджикском языке). /Косимов Р.Б., Норов А.Н. Душанбе. 1998.  9 с.

  12.  Методические указания к лабораторно-практическим занятиям по курсу «Генетики» для специальности 3107 –зоотехния и 3108 – ветеринария. Часть I I (на таджикском языке). /Косимов Р.Б.,  Амиршоев Ф.С.  Душанбе. 1998. – 13 с.

  13. Учебник  «Генетика» (ирсиятшиносї).  Учебные пособия для студентов сельскохозяйственных вузов (на таджикском языке) /Косимов Р. Б. Душанбе. «Маориф»,  2000 г.  272 с.

  14. Учебник  «Генетика с основами биотехнологии». Учебные пособия для студентов сельскохозяйственных вузов (на таджикском языке) /Косимов Р. Б.  Амиршоев Ф.С., Файзллоев А. А. Душанбе, «Маориф ва фарњанг»,  2008 г.  296

  15. Косимов Р. Б. Молекулярные и клеточные подходы изучения процесса ингибирования меланогенеза шерсти у овец. /Косимов Р.Б. монография Душанбе, «Маориф ва фарњанг», 2008. 122 с

Прочие публикации:

16. Алиев Г.А. Характер ингибирования меланогенеза у ягнят таджикской породы в первые месяцы постнатального онтогенеза. /Алиев Г.А.., Рачковский М. Л., Косимов Р.Б., Бурлаенко О.Е., Крымова М.А // Материалы конференции, посвященной 100 –летию со дня рождения Н.И. Вавилова. Душанбе, 1986, С. 7

17. Алиев Г.А. Пигментация различных типов шерстных волокон в онтогенезе ягнят таджикской породы. /Алиев Г.А.., Рачковский М.Л., Косимов. Р.Б., Алиев Б.А. // Материалы конференции, Вклад генетики в ускорение научно–технического прогресса в сельском хозяйстве Таджикистана. Душанбе, 1986, С. 27 -29.

  18. Алиев Г.А. Характер депигментации шерсти ягнят таджикской породы и её помеси в связи со структурой шерстного покрова и окраской при рождении. /Алиев Г.А., Косимов Р.Б., Рачковский М.Л.  // Тезисы докладов республиканской научно-теоретический конференции молодых ученых и специалистов Таджикской ССР, Душанбе, 1987, С. 26 – 28.

19. Косимов Р.Б. Позитивный и негативный контроль синтеза ДНК в сегментоядерных лейкоцитах (эксперименты на гетерокарионах). /Косимов Р.Б., Сухарев С.И., Прудовский И.А.  //Тезисы Х Всесоюзного симпозиум «Структура и функции клеточного ядра». Гродно, Беларусия, 1990, С. 97 – 98.

20. Косимов Р.Б., Реактивация и ингибирование синтеза ДНК в гетерокарионах сегментоядерных лейкоцитов и клеток культур, обладающих различным пролиферативным потенциалом. /Косимов Р.Б.  //Тезисы IV Всесоюзной школы-семинара молодых ученых «Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии». Рига,  1990, С. 97 – 98.

21. Косимов Р.Б. Автореферат кандидатский  диссертации. 1991

22.  Косимов Р.Б. Биохимические основы некоторых аспектов пигментации овец.  // НПИ Центр № 96, 1997. С 18-24. 

23. Косимов Р.Б. Синтез РНК в гетерокарионах эмбриональных фибробластах овец и клеток, обладающих различным пролиферативным потенциалом. //Экспресс-информация, серия «Генетическая инженерия», Душанбе, № 10,Серия 68,39, 1997 С. 17- 21.

24.  Косимов Р.Б. Влияние доместикации и селекции на меланогенез у овец шерстных пород. // НПИ Центр № 89, 1998, С. 41-47.

25. Косимов Р.Б. Морфофизиологическое исследование ингибирующего влияния генов-модификаторов на меланогенез в онтогенезе овец таджикской породы.  /Косимов Р.Б., Крымова М.А.  // Материалы международной конференции генетиков. Душанбе, 1998, С. 54-56.

26. Косимов Р.Б. О механизмах  формирования пигмента меланина и выявление регуляторных механизмов на модели гетерокарионов. //Научно-производственный журнал «Кишоварз», № 6, ТАУ, 1998, С. 34-37.

27. Косимов Р.Б. Пигментные клетки не тормозят вступление в синтез ДНК ядер незлокачественных пролиферирующих клеток в гетерокарионах. . /Косимов Р.Б., Крымова М.А. // НПИ Центр № 47, 2000, С. 31-36.

28.  Косимов Р.Б. Исследование блока пролиферации у клеток меланомы методом клеточной гибридизации. /Косимов Р.Б., Крымова М.А.  //Научно-производственный журнал «Кишоварз»,ТАУ, 2001, № 1(5), С. 52-57.

29. Косимов Р.Б. Торможение синтеза ДНК в ядрах злокачественных клеток при слиянии с меланомами. /Косимов Р.Б., Крымова М.А. // НПИ Центр № 26, 2001, С. 27-31.

30.  Косимов Р.Б., Синтез ДНК в гетерокарионах меланомы и клеток обладающих различным пролиферативным потенциалом. //Сборник статей, посвященных 60-летию зооинженерного факультета ТАУ, Душанбе, 2003,С. 6

31. Косимов Р.Б.  Изучение механизма заполнения меланосом меланоцитами и включение их в волосяные фолликулы ягнят различных пород овец.  /Косимов Р.Б., Крымова М.А.  //Научно-производственный Журнал «Кишоварз» ТАУ, 2004, № 3-5 (17), С. 5-8

32.  Косимов Р.Б. Биохимические основы изучения меланогенеза в волосяном покрове овец. /Косимов Р.Б., Крымова М.А.  //Научно-производственный журнал «Кишоварз», ТАУ, 2004, №  47. С. 42-46.

33.  Косимов Р.Б.  Исследование блок репликации в клетках меланомы овец методом клеточной гибридизации.  /Косимов Р.Б., Крымова М.А.  //Научно-производственный Журнал «Кишоварз» ТАУ, 2005, № 2 (17), С. 32-35.

34. Косимов Р.Б., Изучение некоторых параметров взаимодействия регуляторных генов А и Е и генов модификаторов в процессе ингибирования меланогенеза у овец таджикской породы. /Косимов Р.Б // Экспресс-информация, «серия Генетическая инженерия», Душанбе, № 2, Серия 69, 2005, С. 21 – 25.

35. Косимов Р.Б. Изучение типа меланогенеза у ягнят различных генотипов и различных пород, разводимых в Таджикистане. /Косимов Р.Б., Файзуллоев А.А. // Душанбе, Кишоварз, № 1, 2007, С. 6 – 8.

36. Косимов Р.Б. Моделирование меланогенеза у пород овец, имеющих фундаментальные различия в структуре шерстного покрова. /Косимов Р.Б., Файзуллоев А.А. //Материалы Республиканской конференции «Адаптационные аспекты функционирования живых систем». Душанбе, 2007, С. 57 – 62.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.