WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

Полтавченко Александр Георгиевич

Бесприборная иммунодиагностика инфекционных заболеваний на основе высокодисперсных корпускулярных маркеров

03.00.23 – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Кольцово – 2008

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор Сергеев Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Офицеров Вячеслав Иванович ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) доктор биологических наук Беклемишев Анатолий Борисович Лаборатория генной инженерии ГУ НИИ биохимии СО РАМН (г.

Новосибирск) доктор медицинских наук, профессор Трунов Александр Николаевич Лаборатория иммунологии репродукции Института клинической и экспериментальной медицины СО РАМН (г. Новосибирск)

Ведущая организация: ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Минздравсоцразвития России, Москва

Защита состоится 3 октября 2008 года в 9 час на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, п. Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан 25 апреля 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Л.И. Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Около 70 % всех регистрируемых болезней человека имеют инфекционную этиологию. В России ежегодно регистрируется до 35 млн. случаев инфекционных заболеваний, а прямые и косвенные потери от них составляют около 15 млрд. руб. (Воробьев А.А., 2002; Шевченко Ю.Л., 2002). Контроль распространения инфекций становится все более трудным при сегодняшних темпах и масштабах миграции. В последние годы реальной угрозой считается возможность преднамеренного использования микробиологических агентов в террористических целях (Щербаков Г.Я., 2002;

Park R., 2003). Эффективная борьба с инфекционными заболеваниями требует быстрой и достоверной диагностики. Большинство инфекционных заболеваний имеет сходную клиническую манифестацию и для правильной постановки диагноза необходимы лабораторные методы, среди которых важное место занимает иммунохимический анализ. Эти тесты обладают высокой чувствительностью и специфичностью и позволяют быстро установить видовую, а в ряде случаев и штаммовую принадлежность возбудителя (Егоров А.М. и др., 1991). В настоящее время сохраняется потребность в разработке новых иммунохимических методов. Это объясняется, с одной стороны, разнообразием задач, решаемых с помощью таких средств диагностики, а с другой стороны, неудовлетворенностью пользователей техническими и/или эксплуатационными характеристиками тестов в той или иной ситуации.

Развитие методик иммуноанализа необходимо для решения следующих задач:

расширения круга определяемых соединений; повышения чувствительности и специфичности; обеспечения способности к одновременному анализу ряда аналитов в одном тесте; упрощения операций и сокращения времени проведения анализа; разработки портативных форматов, не требующих дополнительных реагентов; снижения стоимости тестирования; увеличения стабильности и сроков хранения диагностических наборов; снижения или устранения риска для пользователя и окружающей среды; совершенствования технологии производства тест-систем (Taylor R.F., 2006).

Первыми сталкиваются с инфекционными заболеваниями работники первичных звеньев системы здравоохранения, и от их действий зависит как здоровье пациента, так и дальнейшее распространение болезни. Решение должно быть принято быстро, а транспортирование образцов для исследования в специализированную лабораторию отнимает много времени, а иногда просто невозможно. Первичные учреждения здравоохранения не всегда имеют базу для выполнения сложных анализов и нуждаются в оснащении надежными, но простыми и недорогими бесприборными диагностическими тестами. В России с ее огромной территорией и отдаленностью населенных пунктов такие тесты особенно необходимы. Однако они производятся только по лицензиям зарубежных фирм, имеют ограниченный ассортимент и дороги.

Разнообразные задачи по иммунодиагностике инфекционных заболеваний и индикации биологических агентов не могут быть решены с помощью какого-либо одного универсального метода. Более того, набор разнообразных тестов необходим, поскольку параллельное исследование с использованием нескольких независимых методик значительно повышает достоверность полученных результатов (Kartalov E.P., 2006).

Таким образом, актуально создание комплекса методов для обеспечения иммунохимического тестирования в слабооснащенных медицинских учреждениях или во внелабораторных условиях, что позволит сделать диагностику более своевременной и доступной, а санитарноэпидемиологический контроль более оперативным и эффективным.

Цель исследования. Разработка технологических подходов к созданию и применению бесприборных методов твердофазного иммунохимического анализа на основе высокодисперсных корпускулярных маркеров.

Задачи исследования:

- оценить возможность применения в иммунохимическом анализе неорганических катализаторов как маркеров, альтернативных ферментным препаратам;

- разработать технологию получения и применения каталитических маркеров, обеспечивающую надежный визуальный учет результатов иммуноанализа в микротитровальных планшетах;

- провести комплекс исследований по разработке высокодисперсных корпускулярных маркеров и применению их в быстрых и простых методах иммуноанализа:

- золей серебра, как каталитического маркера, альтернативного коллоидному золоту;

- высокодисперсного активированного угля, как цветного маркера, обладающего универсальными адсорбционными свойствами;

- измельченного угля, импрегнированного серебром, как комбинированного маркера, сочетающего свойства цветной и каталитической метки;

- разработать технологические подходы к изготовлению белковых матриц и выполнению на них многопрофильного дот-иммуноанализа с использованием каталитических маркеров;

- создать прототип автономного набора для многопрофильного анализа, позволяющего выполнять исследования во внелабораторных условиях.

Научная новизна. Впервые предложено и экспериментально обосновано применение золей неорганических катализаторов в качестве маркеров иммунохимического анализа, альтернативных ферментным меткам (Патент РФ № 2092853, приоритет от 12.10.1992). Разработан метод планшетного иммуноанализа с использованием в качестве маркера кобальтсодержащих золей, обеспечивающий надежный визуальный учет результатов.

Отработана технология получения и применения высокодисперсного активированного угля как цветного маркера в дот-иммуноанализе, позволяющая создавать простые и недорогие тесты для проведения исследований во внелабораторных условиях (Патент РФ № 218712, приоритет от 08.02.1999).

Впервые отработаны способы получения и применения в качестве маркера в дот-иммуноанализе высокодисперсного активированного угля, импрегнированного каталитически активными золями серебра, способные повысить чувствительность дот-анализа на пористых подложках за счет проявления золей (Патент РФ N 2133469, приоритет от 02.04.1997).

Отработаны технологические подходы к изготовлению и применению белковых матриц для одновременного выявления ряда антигенов (Патент РФ № 202129206, приоритет от 31.10.02) или антител (Патент РФ № 2296995, приоритет от 20.06.03) в многопрофильном дот-иммуноанализе с использованием золей золота и усиления сигнала физическим проявлением.

Разработан прототип автономного набора реагентов для многопрофильного анализа, позволяющего одновременно определять 8 различных аналитов в каждом образце и пригодного для использования во внелабораторных условиях (Патент РФ № 2298795, приоритет от 29.03.04).

Практическая значимость. В результате проведенных исследований разработан комплекс технологических подходов к созданию и применению твердофазных иммунохимических тестов, пригодных для осуществления диагностики инфекционных заболеваний и специфической индикации патогенов в слабооснащенных медицинских учреждениях и во внелабораторных условиях.

Предложенный принцип применения каталитически активных неорганических маркеров, в частности кобальтсодержащих золей, позволяет создавать планшетные варианты иммуноанализа с надежным визуальным учетом результатов. Такой подход допускает выполнение теста в медицинских учреждениях, не обеспеченных регистрирующим оборудованием.

Отработанная технология получения и применения в дот-иммуноанализе золей серебра, а также корпускулярных маркеров на основе активированного угля и угля, импрегнированного серебром, позволяют создавать простые и недорогие тесты с визуальным учетом результатов, пригодные как для массового скрининга, так и для выполнения индивидуальных анализов. Такие тесты пригодны для выполнения иммунохимического анализа в экстраординарных ситуациях. В ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» эти методы рекомендованы для анализа образцов в полевых условиях и используются при конструировании тест-систем для диагностики чумы, бруцеллеза и туляремии (Акт о внедрении от 07.02.02 г.).

Разработанные технологические подходы к конструированию белковых матриц и выполнению на них одновременного анализа нескольких аналитов позволяют создавать автономные и информативные тест-системы для комплексного иммунохимического обследования. Внедрение теста на белковых матрицах в широкую практику может дать значительный экономический эффект за счет невысокой себестоимости тест-систем, сокращения затрат на проведение анализа и приборное обеспечение. Данные технологические подходы могут также послужить основой для создания белковых матриц с различным спектром специфичности (для контроля переливаемой крови, обследования эпидемиологических очагов и других диагностических задач).

Отработанные в наших экспериментах методы иммуноанализа сочетают высокую чувствительность, надежность, простоту выполнения и скорость получения результатов. В то же время они значительно дешевле существующих аналогов и могут выполняться повсеместно, что делает их более доступными для пациентов. Кроме того, применение таких тестов позволяет оперативно осуществлять эпидемиологический мониторинг и санитарноэпидемиологический контроль, а также проводить быструю оценку ситуации при возникновении биологических угроз.

Описанные выше технологические подходы не требуют дорогого оборудования, универсальны и могут быть использованы при производстве диагностических наборов любой специфичности. Такие подходы могут найти применение не только в диагностике инфекционных заболеваний, но и в других отраслях медицины, а также в ветеринарии, экологических исследованиях и научных экспериментах.

Предложенные технологические подходы защищены 7 патентами РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Новые химические системы и процессы в медицине», (Новосибирск, 2001); Международной научной конференции «Natural infectious diseases» (Улан-Батор, 2002); Международном мультидисциплинарном семинаре «Прогресс в биотехнологии и нейробиологии – интегративная медицина» (Хургада, Египет, 2004); Международной конференции «Актуальные вирусные инфекции – теоретические и практические аспекты» (С-Петербург, 2004); Научно-практической конференции с международным участием «Серебро и висмут в медицине» (Новосибирск, 2005); Международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006); III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006); Научно-практической конференции с международным участием «Нанотехнологии и наноматериалы для биологии и медицины» (Новосибирск, 2007).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 3страницах, содержит 28 таблиц и 68 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и 2 приложений. Список цитированной литературы включает в себя 414 источников, из них 3иностранных.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Разработка планшетного варианта иммуноанализа с визуальным учетом результатов на основе применения в качестве маркеров золей каталитически активных соединений металлов. ИФА в микротитровальных планшетах является одним из наиболее чувствительных и удобных методов иммунодиагностики, но требует сложной и дорогой аппаратуры для учета результатов, поскольку образцы с малым содержанием анализируемого вещества сложно отличить от фона отрицательных проб. Мы посчитали, что если сделать разницу окраски таких образцов более наглядной (при сохранении общей схемы постановки теста) – это поможет расширить круг медицинских учреждений, способных выполнять такой анализ. В основу разработки положена идея использования в иммуноанализе неорганических каталитических маркеров – гидрозолей металлов и их соединений, способных в малых концентрациях вызывать показательные изменения цвета индикаторных растворов. В экспериментах использованы известные методы определения следовых количеств катализаторов в сложных смесях (Крейнголд С.У., 1983;

Мюллер Х и др., 1983). Однако эти методы были разработаны для гомогенных каталитических реакций и не могли дать представления ни об эффективности выявления золей, ни о влиянии биокомпонентов на такое выявление. До настоящего времени принцип каталиметрии в планшетном варианте иммунологических тестов не использовался.

Железосодержащие иммунозоли. Первичную оценку аналитических характеристик метода, каталитических эффектов золей и перспективности использования их в иммуноанализе проводили на примере маркеров, содержащих железо и субстрата с о-фенилендиамином, использующегося в ИФА. Результаты таких исследований позволяли провести прямое сравнение каталитического и ферментного маркеров и получить объективные данные.

В работе использовали три вида маркеров на основе железа: золь гидроокиси железа (ЗГЖ), золь ферри-ферроцианида (ЗФЦ) и золь ферриглицерата аммония (ЗФГА). ЗГЖ получали медленным добавлением в кипящую дистиллированную воду раствора хлорного железа. Для получения ЗФЦ к свежему ЗГЖ добавляли концентрированный раствор железистосинеродистого калия. ЗФГА получали, медленно добавляя раствор аммиака в раствор хлорного железа в 50 %-ом глицерине. Оценку формы и размеров частиц золей проводили методом электронной микроскопии. Во всех случаях золи получались полиморфными и полидисперсными. Фракционирование свежеприготовленных золей проводили методом центрифугирования.

Определение концентрации частиц маркера выполняли методом фильтрации и взвешивания. Полученные значения использовали в расчетах соотношения по массе маркер/иммунореагент при получении иммунозолей. Связывание иммунореагентов (антивидовых иммуноглобулинов, SpA или фракции IgG из иммунных сывороток) с частицами золей проводили методом адсорбции, в несколько приемов добавляя золь в раствор иммунореагента из расчета - 1000:по массе, соответственно. При таком подходе получался неравномерно нагруженный золь, но это не мешало поведению анализа и позволяло избежать длительной и дорогой процедуры очистки конечного продукта от избытка реагентов. Этот способ «дробной нагрузки» применяли и в последующих экспериментах с другими маркерами. Дополнительную блокировку поверхности золя выполняли БСА.

В ходе экспериментов установлено, что более эффективно выявление маркеров в гомогенной индикаторной каталиметрической реакции (ИКА) после перевода маркера в ионную форму путем растворения золя кислотой (рис.1).

ОП42,Рис. 1. Эффективность выявления различных железосодержащих золей в гомогенной (сплошная линия) и гетерогенной (пунктир) каталиметрической реакции окисления 1,о-фенилендиамина перекисью водорода.

Жирной линией выделен золь, связанный с антителами (ЗФГА-IgG).

0,5000 1250 312 78 20 5 1,Масса золей в ячейке, нг ЗГЖ ЗФЦ ЗФГА ЗФГА-IgG Преимущество проявления в гомогенной системе очевидно, как по оптической плотности, так и по скорости достижения максимальной чувствительности. Чувствительность определения золей в гомогенной реакции при 30 мин экспозиции (37оС) составила: для ЗГЖ - 30 мкг/мл, для ФЦЗ - 1,мкг/мл и для ЗФГА - 200 нг/мл. Нагрузка поверхности частиц золя белком (см. рис. 1, образец ЗФГА-IgG) не влияла на чувствительность определения железа.

Оценку чувствительности ИКА при выявлении очищенного вирусного материала с применением ЗФГА и ЗФЦ (0,5 мкм), связанных с IgG из гипериммунных кроличьих сывороток против вирусов осповакцины и ВЭЛ приведены на рисунке 2. Оба иммунозоля показали сходную чувствительность около 1 нг/мл (106 вир/мл) при выявлении ВОВ и около 5 нг/мл (109 вир/мл) при выявлении ВВЭЛ. Замена пероксидазных конъюгатов вторичных антител в наборе "РекомбиБест ВИЧ 1,2" (ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск) и в иммуноферментной тест-системе для выявления противооспенных антител (производства НИИВС, Томск) на препараты ЗФГА-а/IgG (10 мг Fe/мл) и в том, и в другом случаях позволила достигнуть чувствительности, не уступающей показателям коммерческих наборов. Таким образом, железосодержащие золи могут служить в иммуноанализе маркерами, альтернативными пероксидазе, однако они не могут решить проблему надежного визуального учета, поскольку в отношении наглядности результатов они ничем не отличаются от ферментных маркеров.

ОП4Рис. 2. Оценка чувствительности 2,выявления вирусов осповакцины (ВОВ) и Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВВЭЛ) в ИКА с 1,использованием гидрозолей ферриферроцианида (ЗФЦ) и ферриглицерата аммония (ЗФГА) с размерами частиц 0,5 мкм. (n=3, P=0,95).

1,1 и 2 - максимальные уровни контролей для ВОВ и ВВЭЛ соответственно.

0,ЗФЦ-a/ВЭЛ ЗФГА-а/ВЭЛ ЗФГА-а/ОВ ЗФЦ-а/ОВ 0,1280 320 80 20 5 1,25 0,Концентрация вирусов, нг/мл Золи серебра. Золи серебра получали восстановлением металла из растворов азотнокислого серебра боргидридом натрия. После 10-15 минутного созревания золя осуществляли его адсорбционное связывание с кроличьими иммуноглобулинами против IgG человека или SpA. На начальных этапах работы применяли способ максимальной нагрузки золя иммунокомпонентами, отработанный для получения иммунозолей на основе золота (Raska I., 1988).

Однако для удаления из препарата несвязавшихся биокомпонентов вместо ультрацентрифугирования мы применяли метод колоночной фильтрации через гели, предназначенные для разделения соединений с большой молекулярной массой. Такая очистка не менее эффективна и более доступна, чем ультрацентрифугирование. В дальнейшем, чтобы избежать длительной и дорогой процедуры очистки мы использовали метод «дробной нагрузки» при значительном избытке маркера.

Исследование структурно-дисперсных характеристик золей, полученных из растворов с разной концентрацией азотнокислого серебра и стабилизированных БСА, проводили методами малоуглового рентгеновского рассеяния и электронной микроскопии. Измерения малоугловых рентгенограмм проводили на дифрактометре фирмы "Siemens" (Германия) при =0,154 нм. Использовался метод контраста с применением растворителя, сходного про плотности с белковым компонентом золей - БСА (=1,27 г/см3).

Вычисление Dv(R) - функций объемного распределения частиц по размерам выполнялось по ранее описанным алгоритмам (Свергун Д.И. и Фейгин Л.А., 1988). С увеличением концентрации ионов серебра средний размер частиц золя увеличивался от 5 до 12 нм. Даже в наиболее крупных золях основная масса частиц имела размеры в диапазоне, не превышающем 10 нм, что вполне приемлемо в практическом отношении. Данные совпадали с результатами визуальной оценки размеров золя под электронным микроскопом. Наиболее перспективным для использования в качестве маркера мы посчитали золь, полученный из 0,02 %-го раствора нитрата серебра. Он стабилен и после приготовления имеет рН9,0, оптимальный для сорбции иммуноглобулинов.

Такой золь содержит сферические частицы со средним диаметром около 9 нм, способные адсорбировать до 15 молекул IgG.

3,Рис. 3. Функция распределения по размерам (Dv(R)) частиц золя серебра, полученных из растворов с разной 2,концентрацией нитрата серебра (R - диаметр сферических частиц золя).

3 Концентрация AgNO3: 1 - 0,005 %;

1,2 - 0,01 %; 3 - 0,02 %; 4 - 0,05 %.

1 0,1 5 9 13 17 21 Диаметр частиц, нм Оценено стабилизирующее действие на такой золь ряда неионных детергентов, синтетических и биополимеров. По полученным данным, лучшими стабилизаторами серебряных золей служат иммуноглобулины, желатин и ПЭГ - 20 кДа. Декстраны и поливинилпирролидон обладают слабым стабилизирующим действием, а из испытанных неионных детергентов только твин-20 способен стабилизировать золь. В пределах одного класса полимеров защитное число уменьшается с увеличением молекулярной массы стабилизатора.

Высокодисперсные золи серебра даже при их значительном накоплении на прозрачных микротитровальных планшетах трудно зарегистрировать.

Поэтому для визуализации сигнала необходимо его усиление. При выполнении настоящей работы мы опробовали более 20 составов проявителей для каталитического усиления сигнала серебряного золя, иммобилизованного на поверхности ячеек планшетов. Испытанные рецептуры включали растворы химической металлизации, каталитически восстанавливающие медь, никель, кобальт или серебро на активированной серебром поверхности (Шалкаускас М.И. и ВашкялисА.Ю., 1977), и так называемые «физические проявители» - растворы химического серебрения, используемые в фотографической технике для увеличения (проявления) гранул серебра в уже проявленных фотоматериалах путем осаждения серебра из его нестабильных растворов.

Восстановителями в таких растворах служат фотопроявляющие вещества (Джеймс Т.Х., 1980). Большинство из испытанных растворов химической металлизации оказались непригодны для проявления связанных с белком золей в ячейках планшета. Они были либо недостаточно стабильны, либо обладали малой скоростью восстановления, либо требовали высокой температуры проявления, либо содержали токсичные компоненты. Из физических проявителей испытаны рецептуры, содержащие в качестве восстановителей:

р-фенилендиамин, метол и амидол. Результаты представлены на рисунке 4.

ОП42,Рис. 4. Эффективность проявления золей серебра (9 нм) физическими проявителями на основе разных восстанавливающих агентов (n=3, р=0,95).

1,По оси абсцисс – масса золей (нг), внесенных в ячейки планшета.

р-фенилендиамин амидол 0,метол Проявители на основе амидола и р-фенилендиамина давали светлые малоконтрастные отложения и, соответственно, малую оптическую плотность в используемом диапазоне спектра. В отличие от них метоловый проявитель (метол 0,2 %, лимонная кислота 0,5 %, нитрат серебра 0,2 %) за короткое время (5-7 минут) обеспечивал появление на поверхности ячеек планшета отложений, имеющих высокую оптическую плотность. Связывание золей с белками несколько увеличивало индукционный период проявления, но практически не влияло на чувствительность выявления золя.

Сравнительную оценку чувствительности анализа с использованием полученного иммунозоля и пероксидазного конъюгата проводили в ячейках планшета, сенсибилизированного разведениями IgG из нормальных сывороток человека и кролика, а также при выявлении антител к вирусу иммунодефицита человека с использованием набора «РекомбиБест-анти-ВИЧ-1,2». Результаты представлены на рисунке 5. И в том, и в другом случаях иммунозоль обеспечивал чувствительность выявления IgG не ниже, чем с использованием пероксидазного конъюгата.

Таким образом, золи серебра могут служить маркерами иммунологических препаратов, не уступающих по чувствительности 0,0,424120аналогичным пероксидазным конъюгатам. Однако, как и железосодержащие маркеры, золи серебра не демонстрируют наглядного различия между отрицательными и слабоположительными образцами, что не позволяет решить задачу обеспечения надежного визуального учета результатов анализа.

ОП4ОП43,2,А Б 2,1,1,0,0,0 Концентрация IgG, нг/мл Кратность разведения сыворотки Иммунопероксидазный конъюгат Ag-иммунозоль РядРис. 5. Чувствительность выявления антивидовыми пероксидазным конъюгатом и серебряным иммунозолем: (А) IgG человека и (Б) анти-ВИЧ IgG на основе набора «РекомбиБест-антиВИЧ-1,2» (n=3, р=0,95). Пунктиром обозначены максимальные уровни отрицательных контролей.

Кобальтсодержащие золи. В работе использовали золи сульфида и ферроцианида двухвалентного кобальта, приготовленные в условиях избытка катионов или анионов. Образующиеся в таких условиях химческие соединения имеют различную стехиометрию и, таким образом, способ получения золя (при избытке катиона или аниона) может влиять как на эффективность адсорбции белков на поверхности частиц, так и на чувствительность их выявления в ИКР.

Сульфидные золи получали, смешивая 0,02 М растворы нитрата кобальта и сульфида натрия, а ферроцианидные золи – смешивая 0,02 М растворы нитрата кобальта и гексациано-(II)феррата калия. И в том и в другом случае использовали объемное соотношение растворов: при получении золя с избытком катионов - 3:1, а при получении золя с избытком анионов – 1:3, соответственно. Связывание золя с антивидовыми иммуноглобулинами или SpA проводили методом «дробной нагрузки» при массовом соотношении иммунореагентов и золя 1:1000. В дистиллированной воде (рН=5,8) золи с 0,142166450102561E+избытком катиона имели положительный, а с избытком аниона – отрицательный заряд. После связывания с белками все золи в воде были заряжены амфотерно. Под электронным микроскопом такие золи выглядели как крупные скопления полигональных кристаллов с размерами:

- сульфид кобальта, полученный при избытке катиона (СКк) – 20х50 нм, - сульфид кобальта, полученный при избытке аниона (СКа) – 20х30 нм, - ферроцианид кобальта, полученный при избытке катиона (ФКк) – 20х30 нм, - ферроцианид кобальта, полученный при избытке аниона (ФКа) – 15х20 нм.

После стабилизации белками крупные конгломераты в значительной степени диссоциировали, однако во всех препаратах можно было наблюдать агрегаты, содержащие до нескольких десятков частиц.

Для оценки чувствительности определения золей в индикаторных системах разного состава нами выполнены сравнительные эксперименты, основные результаты которых отражены в таблице 1 и на рисунке 12.

Таблица Условия, использованные в экспериментах по выявлению кобальтсодержащих золей, и достигнутая при этом чувствительность Достигнутый предел обнаружения, нг/мл ** Восстановитель Н2ОрН БР* ([С], мМ) [С], М ФКк ФКа СКк СКа Со2+ ФКк CКк -IgG -IgG Ализарин S (9,0) 0,02 11,5 ФБ 13,0 20,0 6,0 10,0 - 80,0 60,1,8) 0,02 11,5 ФБ 6,0 10,0 3,0 5,0 1,0 20,0 15,(0,9) 0,02 11,5 ФБ 1,0 2,0 1,0 2,0 0,5 15,0 10,(0,4) 0,02 11,5 ФБ 0,7 2,0 0,5 1,0 0,24 2,0 2,(0,2) 0,02 11,5 ФБ - - - - 0,2 - (9,0) 0,02 11,5 ТББ 10,0 50,0 2,0 25,0 - 25,0 40,(1,8) 0,02 11,5 ТББ 2,0 30,0 1,0 15,0 1,0 5,0 4,(0,9) 0,02 11,5 ТББ 1,0 12,0 0,8 5,0 0,5 2,0 2,(0,4) 0,02 11,5 ТББ 0,7 2,0 0,7 1,0 0,24 2,0 1,(0,2) 0,02 11,5 ТББ - - - - 0,2 - Ализарин (2,0) 0,15 12,2 ТББ 40,0 - 6,0 - 1,0 - 10,(0,4) 0,15 11,4 ТББ 10,0 - 4,0 - 1,0 - 5,Тайрон (5,0) 0,10 10,5 ФБ 300 600 20,0 60,0 10,0 - 30,ДФК (5,0) 0,12 11,0 ТББ 6,0 - 1,0 2,0 0,7 10,0 2,Тайрон (20,0) ДФК (1,5) 0,12 11,0 ТББ 0,7 - 0,5 0,5 0,25 2,0 1,Тайрон (20,0) ДФК (0,7) 0,12 11,0 ТББ 1,0 - 0,2 0,2 0,2 2,0 0,Тайрон (10,0) Пирокатехин (10,0) 0,05 11,5 ТББ 3,0 15,0 2,5 10,0 0,7 2,0 2,Пирокатехин (10,0) 0,02 10,5 ТББ 3,0 3,0 2,0 10,0 0,7 2,0 2,* БР – буферный раствор: ФБ – 0,1 М Na-фосфатный и ТББ – 0,1 М Na-тетраборатный.

** По общей массе золя без учета связанной воды, за 30 мин проявления при комнатной температуре, по визуально учитываемому переходу окраски индикатора.

ДФК дифенилкарбазон.

Данные, приведённые в таблице 1, являются усредненными результатами нескольких экспериментов. Вместе с тем, они имеют ориентировочный характер, поскольку неизвестны ни точный химический состав золей, ни количество связанной с кристаллами воды.

Использованные в наших экспериментах индикаторы значительно различались по своим свойствам, способности обеспечивать чувствительное выявление золей кобальта и цветовым эффектам, сопровождающим проявление. При каталитическом окислении тайрона развивается яркая оранжево-желтая окраска, которая при значительных концентрациях кобальта в течение нескольких минут сменяется на бледно-желтую. Такой быстрый переход окраски неудобен, поскольку учет результатов потребует большого внимания оператора. Пирокатехин слабо поглощает в видимой части спектра.

При его каталитическом окислении вначале появляется интенсивная оранжевокрасная окраска, которая быстро меняется на желто-бурую. При увеличении концентрации пирокатехина можно повысить наглядность проявления, но чувствительность при этом резко снижается. Следует отметить и такие недостатки пирокатехина, как нестабильность при хранении и токсичность.

Индикаторная реакция с использованием смеси дифенилкарбазонтайрон-перекись водорода является одной из самых чувствительных и селективных для определения кобальта (Долманова И.Ф. и др., 1973). В ходе наших экспериментов цвет этого индикаторного раствора сначала изменялся от фиолетового до оранжевого, а затем до светло-желтого. Используя эту индикаторную систему, нам удавалось обнаруживать золи кобальта в концентрации менее 1 нг/мл, однако контрастность цветового перехода была невысокой, а индикатор в ходе окисления дважды менял окраску.

ОП41,1,0,0,200 60 20 6 2 0,6 0,2 0,06 0,02 0,0концентрация золей, нг/мл ализарин S 9mM,ФБ ализарин S 9mM, ТББ тайрон 5mМ, ФБ пирокатехин 10mM, ТББ ДФК 15mМ, тайрон 20mM, ТББ ализарин 0,8mМ Рис. 6. Эффективность выявления золя сульфида кобальта, полученного при избытке катионов, в разных индикаторных системах (n=3, p=0,95).

При добавлении спиртового раствора ализарина к щелочному боратному буферному раствору он приобретает насыщенную бордовую окраску.

Продукты каталитического окисления ализарина слабо поглощают в видимой части спектра и обеспечивают контрастный переход цвета индикатора. Однако относительно низкая чувствительность определения золя кобальта, делают ализарин неперспективным для использования в качестве индикатора.

Ализарин S - сульфопроизводное ализарина чаще используется в индикаторных растворах на основе тераборатного буферного раствора, обладающего насыщенной бордовой окраской, или на основе фосфатнощелочного буфера, имеющего фиолетовый цвет. Данные таблицы свидетельствуют о том, что в обеих проявляющих системах золи ферроцианида и сульфида кобальта, полученные при избытке катионов, выявляются с большей чувствительностью, чем их анионные аналоги, и более перспективны для использования в качестве маркеров иммуноанализа. Относительно небольшая разница в чувствительности выявления таких золей и растворов нитрата кобальта позволяет сделать вывод о том, что частицы в процессе проявления растворяются и катализ происходит в гомогенной фазе. Ускорению растворимости золей способствует щелочная среда и ионы буферной системы.

В частности известно, что фосфаты эффективно растворяют ферроцианиды кобальта, образуя комплексные ионы (Перельман Ф.М. и Заворыкин А.Н., 1975). Вероятно, более энергичным растворением золей в фосфатном буферном растворе можно объяснить более короткий индукционный период и более высокую скорость проявления золей в фосфатных проявителях на основе ализарина S по сравнению с аналогичными тетраборатными растворами.

Связывание поверхности маркера с белками пролонгирует индукционный период. Возможно, эти явления связаны с блокированием поверхностного слоя катализатора и наличием предварительного этапа диссоциации белков. После окончания индукционного периода скорость проявления чистых и связанных с белками золей примерно одинакова и после 30-40 минут проявления при комнатной температуре они достигают сходной чувствительности. Процесс можно ускорить в 2-3 раза инкубацией при 37оС.

Наиболее подходящими для визуального учета результатов (т.е.

обеспечивающими приемлемое сочетание чувствительности, наглядности и скорости проявления) были индикаторные растворы, содержащие 20 мМ Н2О2 и 1–2 мМ ализарина S в фосфатном или тетраборатном щелочных (рН 11,0-11,5) буферных растворах. Каждый из проявителей имел определенные преимущества и недостатки. Тетраборатный индикаторный раствор обеспечивал чувствительность проявления выше, чем фосфатный, однако проявленные образцы имели более насыщенную желтую окраску. Вследствие этого переход окраски тетраборатного проявителя выглядел менее наглядным, чем фосфатного. Преимуществами фосфатного индикаторного раствора являлись более высокая скорость проявления, и большая контрастность между отрицательными (фиолетовыми) и положительными (светло-желтыми) образцами. Скорость проявления ФКк-IgG и в том и другом индикаторных растворах была заметно выше, чем у СКк-IgG (рис. 7).

ОП41,1,6 Рис. 7. Динамика проявления золей СКк–IgG (пунктир) и ФКк– 1,IgG (сплошная линия) с концентрацией 50 нг/мл в 1,тетраборатном (ТТБ) и фосфатном (ФБ) индикаторных растворах, pH 11,5, содержащих 2 мМ ализарина S и 20 мМ пероксида водорода 0,(n=3, p=0,95).

СКк на ФБ 0,ФКк на ФБ СКк на ТТБ 0,ФКк на ТТБ зона перехода окраски 0,0 3 7 11 15 20 25 30 Время, мин Индикаторные системы на основе ализарина S нетоксичны, нечувствительны к свету и удобны в применении. Без перекиси водорода растворы ализарина S стабильны и могут сохраняться более полугода.

Подобранный состав индикаторного раствора обеспечивает выявление золей при комнатной температуре в течение 20-30 мин, а полученная картина проявления сохраняется в течение нескольких часов (в ряде случаев до 2 суток).

Золи, на поверхности которых иммобилизованы белки, отстают по времени проявления от свободных частиц. Причиной тому могут служить органические компоненты как связанные с поверхностью золя, так и присутствующие в дисперсионной среде. Чтобы проверить их влияние на скорость проявления золей, в ячейках планшета готовили серии десятикратных разведений (от 1 до 0,001 %) наиболее широко использующихся в иммуноанализе компонентов и вносили в них золи. После 30 мин экспозиции добавляли индикаторный раствор и фиксировали результаты каталиметрической реакции через определенные промежутки времени.

Определяли скорость реакции (=ОП/t) в начальном периоде с выраженной динамикой проявления, и строили график зависимости скорости реакции от концентрации компонента. В ходе экспериментов установлено, что ингибирующий эффект добавок менее выражен в фосфатном, чем в боратном проявителе. Блокаторы меньше влияют на проявление золей ферроцианида, чем золей сульфида кобальта. Полиэтиленгликоли и твин-20 в использованных концентрациях практически не влияют на скорость реакции. Из сывороточных белков в меньшей степени тормозят проявление во всех системах иммуноглобулины. Альбумины из сыворотки человека, крупного рогатого скота и лактальбумин в концентрации 0,1% примерно вдвое замедляют проявление золей в фосфатном проявителе. При проявлении сульфида кобальта в боратном проявителе они ингибируют проявление даже в концентрации 0,01 % более чем на 70 %. Можно предположить две основных причины ингибирования проявления. Первая – блокирование поверхности катализатора от контакта с индикаторным раствором. Вторая – закисление индикаторного раствора, поскольку наиболее выраженное тормозящее действие демонстрировали компоненты, обладающие значительной буферной емкостью и кислыми свойствами (глицин, казеин, желатин, лактальбумин), а при рН<11,скорость проявления резко снижается. Вероятно, обе причины вносят свой вклад в отмеченные эффекты воздействия блокирующих компонентов.

При оптимизации составов рабочих растворов установлено, что для выполнения иммунокаталитического анализа с использованием золей кобальта наиболее пригодны растворы для отмывок и разведения золей на основе трис, а добавки в них твин-20 позволяют при выполнении иммуноанализа эффективно снижать неспецифические взаимодействия как органических, так и неорганических компонентов. В условиях наших экспериментов диапазон рабочих концентраций для того и другого золя составлял от 20 до 300 мкг/мл (оптимум – 50-100 мкг/мл). Чувствительность выявления IgG с использованием таких концентраций иммунозолей не уступала ИФА и составляла около 3 нг/мл (рис. 8).

ОП4Рис. 8. Выявление IgG человека (сплошная линия) и кролика 1,(пунктир) с использованием иммунопероксидазного конъюгата и иммунозолей сульфида (СКк) и ферроцианида (ФКк) кобальта на основе иммуноглобулинов против IgG человека (n=3, p=0,95).

СКк-a/IgG-Hum 0,ФКк-a/Ig-GHum ПХ-а/IgG-Hum Зона перехода окраски 300 100 30 10 3 1 0,3 0,Концентрация IgG, нг/мл Оценку эффективности применения кобальтсодержащих маркеров в иммуноанализе проводили с использованием золей, связанных с кроличьими антителами против IgG человека и индикаторного раствора, содержащего 1,мМ ализарина S в фосфатном буферном растворе (pH 11,5). При сравнении пероксидазных конъюгатов и иммунозолей в тест-системах «Токсо-IgG антитела, стрип» (ЗАО ИмДи-спектр, Новосибирск); «РекомбиБест антипалидум стрип» и «РекомбиБест анти-ВИЧ-1+2» (ЗАО Вектор-Бест, Новосибирск); «СИФ-IgG-ДС» (ЗАО МБС, Бердск); «ВИЧ-1, ВИЧ-2 ИФААвиценна» (ЛТД Авиценна, Москва) с применением стандартных и рабочих панелей сывороток мы получили практически полное совпадение результатов ИФА и ИКА. При этом в ИКА все негативные сыворотки имели светло-желтый, а все позитивные – темно-фиолетовый цвет, что обеспечивало надежный визуальный учет результатов. На рисунке 9 показан вид планшета после выявления антител к Helicobacter pylori в одной панели сывороток с использованием иммунопероксидазного конъюгата (ПХ-a/IgG-Hum) и иммунозоля ферроцианида кобальта (ФКк-a/IgG-Hum).

Рис. 9. Вид планшета после параллельного выявления в образцах панели сывороток антител к H. pylori с использованием пероксидазного конъюгата (ПХ-a/IgG) и иммунозоля ферроцианида кобальта (ФКк-a/IgG).

Положительные сыворотки в первом блоке выделены пунктиром.

ПХ-a/IgG ФКк-a/IgG И пероксидазный конъюгат и иммунозоль одинаково определяли наличие специфических антител в сыворотках, однако результаты, полученные с применением иммунозоля, были существенно нагляднее и позволяли без труда визуально регистрировать сигналы низкотитражных сывороток.

Оценка стабильности иммунозолей в условиях длительного хранения в стабилизирующем буфере при 4оС показала, что иммунозоли на основе ферроцианида кобальта при хранении до 1 года (срок наблюдения) не изменяют заметно своих исходных характеристик. Сульфидные золи по истечении месяцев хранения начинают немного медленнее проявляться.

Таким образом, кобальтсодержащие иммунозоли в сочетании с индикаторными растворами на основе ализарина S при сходной с пероксидазными конъюгатами чувствительности и специфичности анализа обеспечивают отчетливое различие оптических сигналов положительных и отрицательных образцов. Это позволяет создавать диагностические тестнаборы с надежным визуальным учетом результатов по принципу «да/нет» для обеспечения иммунодиагностики в лабораториях, не имеющих регистрирующего оборудования. Из других достоинств разработанного теста можно отметить безвредность, стабильность и низкую стоимость используемых компонентов, а также устойчивость картины проявления (при комнатной температуре она сохраняется в течение нескольких часов).

Разработка и усовершенствование быстрых и простых тестов на пористых подложках с применением корпускулярных маркеров. Быстрые и простые тесты, выполняемые на пористых подложках, (такие как иммунофильтрация и поверхностный дот-иммуноанализ) могут обеспечить выполнение анализа и визуальный учет его результатов в полевых условиях, но по чувствительности уступают ИФА. Повышение чувствительности может быть достигнуто либо повышением интенсивности окраски и количества связанного цветного маркера, либо применением химических систем усиления сигнала. При использовании золей золота или серебра сигнал может быть значительно усилен за счет их каталитического («физического») проявления. В то же время, усиление сигнала на пористых мембранах порождает проблему высокого фона из-за частиц маркера, механически застревающих в порах подложки. Другим существенным недостатком быстрых и простых тестов является относительно высокая стоимость анализа. Их себестоимость в 4-10 раз дороже одного анализа на планшете. И пористые мембраны, и золотые конъюгаты, и оснастка тестов имеют высокую стоимость и в этом плане актуально изыскание более дешевых аналогов компонентов теста. В настоящем разделе отражены результаты попыток решения некоторых из перечисленных проблем.

Экспрессное выявление антител и антигенов вируса Эбола (ВЭ) в тесте иммунофильтрации с применением иммунозолей золота и усилением сигнала физическим проявлением. Задачей экспериментов являлось создание иммунофильтрационного теста для экспрессного выявления антигенов и антител вируса Эбола в полевых условиях, оценка его эксплуатационных характеристик, а также возможности повышения чувствительности за счет усиления сигнала физическим проявлением. Обычно в этом тесте процедуру физического проявления не проводят потому, что ионы буферных растворов дезактивируют проявляющий состав.

Элемент для иммунофильтрации представлял собой пластмассовый картридж, заполненный гигроскопичным материалом, в крышку которого вмонтирована нитроцеллюлозная мембрана. В центр мембраны наносили антиген - лизат очищенного ВЭ (Чепурнов А.А. и др., 1994) или моноклональные антитела 4А8 (Казачинская Е.И. и др., 2000) и блокировали мембрану 5 %-ым обезжиренным молоком. Использовали золи золота (20 нм), адсорбционно-связанные с моноклональными антителами 6F7 или белком А Staphylococcus aureus (SpA). Получение и нагрузку золей осуществляли по ранее описанной методике (Raska I., 1988).

При анализе антител через мембрану с антигеном ВЭ последовательно фильтровали исследуемую сыворотку, иммунозоль Au-SpA (20 нм) и отмывочный раствор, а результаты учитывали визуально по наличию или отсутствию розового пятна в месте нанесения антигена. Выявление антител в сыворотках иммунизированных кроликов без дополнительного усиления сигнала не уступало чувствительности ИФА, а с точки зрения экономности расхода антигена при изготовлении теста и скорости выполнения анализа (7-мин) выглядело более предпочтительно.

При выявлении антигена через мембрану с антителами 4А8 фильтровали смесь образца с золем золота, связанным моноклональными антителами 6F7, промывали ее несколькими каплями отмывочного раствора и визуально учитывали результат. После этого усиливали оптический сигнал, используя метод проточного физического проявления. Он заключался в промывке мембраны водой и затем непрерывной подаче на нее метолового физического проявителя в течение 5-7 мин. При таком подходе мембрана контактирует со свежим проявителем, а отработанные его порции уходят в картридж и препятствуют обратной диффузии мешающих ионов. Положительный результат регистрировали по появлению темного пятна в центре мембраны.

Время анализа, с учетом проявления, составляло 15 мин. Результаты эксперимента представлены на рисунке 10.

1000 нг/мл 200 нг/мл 40 нг/мл 8 нг/мл 1,6 нг/мл (15 нг) (3 нг) (0,6 нг) (0,12 нг) (0,024 нг) Рис 10. Сравнительные результаты выявления антигена вируса Эбола в иммунофильтрационном тесте без усиления (верхний ряд) и с усилением сигнала физическим проявлением (нижний ряд). На табличках вверху указаны концентрации, а внизу (в скобках) абсолютные количества тестируемого антигена.

Без усиления сигнала иммунофильтрационный тест выявлял антиген в концентрации 200 нг/мл, а абсолютная чувствительность, с учетом нанесения 15 мкл образца, составляла 3 нг. Усиление сигнала физическим проявлением не только значительно облегчало визуальный учет результатов, но и позволяло повысить чувствительность в 25 раз (выявляемая концентрация антигена нг/мл, а абсолютная чувствительность 0,12 нг). Оценка чувствительности экспресс-теста для определения антигена вируса Эбола с использованием сыворотки крови сотрудника, инфицированного в результате лабораторной аварии, показала, что усиление иммунологического сигнала физическим проявлением позволяет выявить наличие антигена вируса Эбола в крови на 2-й день после инфицирования при уровне вирусемии в сыворотке больного - 1БОЕ/мл.

Прямое выявление антигенов Yersinia pestis в дот-иммуноанализе на белковых матрицах с обратной фазой с применением иммунозолей серебра.

Физический проявитель, использованный для усиления оптического сигнала коллоидного золота пригоден также для выявления золей серебра. Золи серебра на порядок дешевле коллоидного золота и мы посчитали, что такой маркер имеет перспективы применения в дот-иммуноанализе. Проверку этого предположения проводили на примере выявления антигенов возбудителя чумы на белковых матрицах с обратной фазой. Белковые матрицы с обратной фазой представляют собой подложку с нанесенными в определенном порядке образцами. Такие матрицы позволяют проводить одновременный, прямой анализ и сравнение множества проб на наличие одного аналита (Hultschig С. et al., 2006; Janzi М. et al., 2005). Работа была проведена на базе ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» и направлена на создание простого теста для обнаружения антигенов Y. pestis в полевых условиях.

Противочумную сыворотку получали иммунизацией кроликов фракцией I (Вейнблат В.И., 1974) или клетками вакцинного штамма Y. pestis EV.

Иммуноглобулины из иммунной сыворотки изолировали комбинированным методом с использованием каприловой кислоты и сульфата аммония (McKinney М. and Parkinson А., 1987). Золь серебра (9 нм) получали восстановлением из раствора нитрата серебра боргидридом натрия, связывание его со специфическими антителами проводили адсорбционным методом. В работе использовали двадцать два штамма Y. pestis разных подвидов: Y. pestis spp.

pestis, Y. pestis spp.altaica, Y. pestis spp. ulegeica, Y. pestis spp. hissarica и Y. pestis spp. caucasica. Все штаммы были типичны по основным дифференциальным фено- и генотипическим характеристикам. Для оценки специфичности теста использовались референс-штаммы: Y. enterocolitica 0:3 и 0:9; Francisella tularensis; Y. pseudotuberculosis 0:1-0:5; Brucella abortus и Escherichia coli.

Выполнение анализа проводилось при комнатной температуре и включало:

нанесение исследуемых образцов объемом по 3-5 мкл на нитроцеллюлозную мембрану подходящего размера и подсушивание на воздухе в течение 3-5 мин;

блокирование свободных участков мембраны путем погружения ее в 2 %-ый раствор БСА на 10 мин; обработку мембраны иммунозолем серебра (15 мин);

отмывку мембран в двух сменах ТСБ-Т и однократно в дистиллированной воде;

визуализацию связанного иммунозоля путем погружения мембраны на 7-8 мин в раствор метолового физического проявителя; промывку мембраны в воде и визуальный учет результатов. Положительные пробы выявлялись на нитроцеллюлозной мембране в виде отчетливых темно-серых пятен. Общее время анализа составляло 40-45 мин.

Дот-иммуноанализа с использованием иммунозоля серебра обеспечивал выявление растворимых антигенных фракций Y. pestis с концентрацией 5 нг/мл, а цельных клеток проверенных штаммов возбудителя чумы в концентрации 105 м.к./мл. Чувствительность выявления корпускулярных антигенов варьировала в небольшом диапазоне и не зависела от подвида Y.

pestis. Гетерологичные микроорганизмы давали в дот-иммуноанализе слабые сигналы в концентрациях, превышающих 107 м.к./мл. В отрицательных контролях окрашивание отсутствовало.

Таким образом, в ходе исследований показано, что отработанный вариант выявления антигенов Y. pestis на белковых матрицах с обратной фазой с использованием анти-чумных IgG, меченных коллоидным серебром, обладает высокой чувствительностью, специфичностью и позволяет оперативно исследовать множество образцов. Анализ не требует дорогого оборудования и реагентов, а также специального обучения персонала и может быть реализован в полевых условиях.

Прямое выявление специфических антител в дот-иммуноанализе с применением иммуносуспензий на основе углеродных маркеров. Основная идея работы состояла в использовании в качестве маркера дот-иммуноанализа частиц измельченного активированного угля. Активированный уголь, являясь универсальным сорбентом, хорошо связывается с разнообразными белками (как антителами, так и антигенами) и не требует тщательного подбора условий сорбции. С другой стороны, уголь обладает насыщенным черным цветом и при накоплении на светлой поверхности подложки формирует контрастное пятно.

Кроме того, измельченный уголь состоит из легких частиц микронного размера, которые не могут проникать в поры мембраны (что облегчает отмывки), но способны длительно оставаться во взвешенном состоянии.

В работе использовали измельченный в шаровой мельнице активированный уголь марки БАУ-А и норит А (уголь с дисперсностью 4-мкм). Навеску угля увлажняли этанолом, суспендировали в дистиллированной воде и дробно (в три приема с интервалами по 10 минут) при умеренном перемешивании вносили в раствор иммунореагента при весовом соотношении маркер:иммунореагент = 1000:1. Спустя еще 30 мин добавляли в суспензию БСА до концентрации 1% и корректировали рН до 7,2. Обычно, полученная суспензия не требовала дополнительной очистки. Однако, в тех случаях, когда при проведении анализа сигнал выглядел недостаточно интенсивным, иммуносуспензию осаждали центрифугированием, супернатант декантировали и выбрасывали, а осадок ресуспендировали пипетированием и использовали в работе.

Мы разработали простую конструкцию стрипов, позволяющую, наряду с выполнением анализа индивидуального образца, постановку положительного и отрицательного контролей. Для изготовления таких стрипов мембраны типа HA 0,45 мкм (Millipore, США) нарезали на фрагменты с размерами 7х20 мм и короткий край каждого фрагмента укрепляли в оригинальном зажиме из алюминиевой фольги (рис. 11). На стрипы наносили пипеткой по 3 мкл положительной и отрицательной контрольной сыворотки (в разведении 1/40 на 0,01 М фосфатном буферном растворе, рН 7,2), соответственно, в верхнем и среднем сегменте стрипа. Стрипы просушивали, маркировали и хранили до использования при 4оС. При выполнении анализа 3 мкл тестируемой сыворотки в разведении 1/40 наносили на нижний сегмент мембраны и высушивали на воздухе в течение 8-10 мин. Мембраны помещали на 10-15 мин в 2 %-ый раствор БСА, затем переносили в иммуносуспензию и фиксировали в вертикальном положении. В процессе анализа стрип можно было аккуратно вынимать из суспензии и следить за появлением сигнала. Если образец содержал значительные концентрации аналита, сигнал проявлялся за несколько минут. Если он не появлялся в течение 30 мин – пробу считали отрицательной.

Титры сывороток определяли по максимальному разведению, дающему положительный результат. Все операции проводили при комнатной температуре.

Иммуносуспензия К+ К Образец Тест не работает Мембрана Рис. 11. Схема устройства стрипа для дот-иммуноанализа индивидуальных образцов - фрагмент нитроцеллюлозной мембраны с нанесенными контролями, закреплен в зажиме из алюминиевой фольги, предназначенном для удерживания, маркировки и фиксации стрипа в сосуде с иммуносуспензией. Справа приведены варианты результатов анализа.

Дот-анализ с использованием активированного угля был использован для выявления антител к вирусу паротита. При изготовлении иммуносуспензий в качестве иммунореагента использовали антиген вируса паротита (штамм Эндерс) в весовом соотношении с маркером 1:2000, соответственно.

Параллельно с дот-анализом выполняли иммуноферментный анализ в планшетах и реакцию торможения гемагглютинации. Сравнение титров антител в сыворотках лабораторных животных и человека методами дотиммуноанализа и ИФА (табл. 2) показало, что чувствительность метода ИФА была немного выше. В то же время чувствительность разработанного метода значительно превышала чувствительность традиционно используемого для этих целей метода РТГА. С суспензиями в концентрации 5-10 мг/мл максимумальная оптическая плотность сигнала достигалась при инкубации стрипа в течение 90 мин, причем 70-80 % интенсивности за первые 20 мин.

Фольга Маркировка Положительный результат Отрицательный результат Таблица Результаты сравнительных экспериментов по определению чувствительности методов выявления антител к вирусу паротита Метод определения антител Сыворотка ИФА РТГА Дот-иммуноанализ Кроличья сыворотка к штамму Эндерс 1:2560 1:256 1:21вируса паротита Сыворотка реконвалесцента 1:1280 1:256 1:7Нормальная кроличья сыворотка 1:50 1:2 1:Нормальная сыворотка человека 1:50 1:2 1:Оценку эффективности выявления противобруцеллезных антител в сыворотке крови экспериментальных животных с использованием маркеров на основе активированного угля проводили на базе ФГУЗ «Иркутский научноисследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока». При изготовлении иммуносуспензий на основе измельченного угля (БАУ-А) в качестве иммунореагента использовали антигенную фракцию, полученную из клеток вакцинного штамма B. abortus 19 ВА путем солевой экстракции при повышенной температуре (Загоскина Т.Ю., 2004). При приготовлении иммуносуспензии использовали весовое соотношение антиген:БАУ = 1:1000.

Исследуемыми образцами служили гипериммунные противобруцеллезные сыворотки, полученные иммунизацией кроликов растворимыми и корпускулярными антигенами возбудителя. В качестве отрицательных контролей использовали нормальные кроличьи сыворотки различных серий.

Для проверки специфичности анализа использовали гетерологичные кроличьи антисыворотки: кишечные иерсинеозные 0:3 и 0:9, псевдотуберкулезные, лептоспирозные, чумную, холерную и туляремийную. В ходе экспериментов установлено, что во всех 50 исследованных образцах противобруцеллезных сывороток методом дот-анализа зарегистрированы специфические антитела в титрах от 1:50 до 1:800. Все гетерологичные и нормальные сыворотки показали отрицательные результаты. Тест признан перспективным и рекомендован для анализа образцов в полевых условиях.

Для выявления антител к Treponema pallidum в качестве маркера в дотиммуноанализе использовали норит А (Serva, Германия), а в качестве иммунореагента – рекомбинантные аналоги полипептидов T. рalludum с молекулярной массой 15, 17, 42 и 47 кДа (Гражданцева А.А. и др., 1998). С использованием этих компонентов были приготовлены: иммуносуспензия для выявления суммарных антител (связывание маркера производили со смесью равных концентраций (0,1 мг/мл) всех четырех рекомбинантных белков) и препараты на основе отдельных рекомбинантных антигенов (связывание маркера производили с индивидуальными рекомбинантными белками в концентрации 0,2 мг/мл). В качестве объектов исследования использовали образцы сывороток крови от взрослых пациентов дерматовенерологического кабинета Новосибирской районной больницы №1. Параллельно анализ сывороток выполнялся в Новосибирском областном кожно-венерологическом диспансере. Каждую исследуемую сыворотку наносили на 5 стрипов и инкубировали по одному стрипу в каждом препарате иммуносуспензии.

В результате экспериментов в сыворотках больных с различными стадиями заболевания выявлены значительные различия в интенсивности оптических сигналов. Наиболее выраженные различия были получены при исследовании сывороток со стадий первичного и скрытого сифилиса с использованием маркеров, связанных с антигенами р17 и р41. Наиболее показательные примеры приведены на рисунке 12.

Первичный Скрытый Вторичный К+ К- Образец Рис. 12. Результаты дот-иммуноанализа сывороток крови от пациентов с различными стадиями сифилиса, полученные с использованием угольных суспензий, связанных с отдельными антигенами (р15, р17, р41 и р47) T. pallidum.

В каждом блоке представлены результаты исследования одной сыворотки с четырьмя суспензиями, содержащими разные антигены (указаны под стрипами).

Справа приведена схема размещения на стрипе контролей и образца. К+ высокотитражная сыворотка со стадии вторичного сифилиса, К- - негативная сыворотка. Все сыворотки в разведении 1/40 нанесены аликвотами по 5 мкл.

Экспозиция с суспензиями 30 мин при 20оС.

Данные о различиях сигналов, полученных на разных белках, послужили мотивом для более подробного изучения в ИФА спектра антител к отдельным антигенам, разработке модели динамики гуморального иммунитета при сифилисе и панели сывороток с нормированным содержанием IgG к антигенам р17 и р41 T. pallidum (Патент РФ № 2275635, приоритет от 03.06. 04).

Исследование сывороток с использованием угольной суспензии для выявления суммарных антител проводили в сравнении с ИФА тест-системой «СИФ–ДСМ–суммарный» (ЗАО «МБС», Бердск). В качественном отношении получено полное совпадение результатов в дот-иммуноанализе и ИФА. По чувствительности определения титров специфических антител дотиммуноанализ уступал ИФА на 1-2 двукратных разведения.

Получение и применение маркеров на основе угля, импрегнированного серебром. При анализе возможности повышения чувствительности дот-анализа с угольными маркерами, возникла идея – связать часть поверхности угля с каталитически активным металлом, например, серебром или золотом. Такой маркер мог бы сочетать и простоту применения угольных маркеров и высокую чувствительность каталитических меток. Импрегнацию угля серебром мы ррррррррррррвыполняли путем восстановления металла боргидридом в присутствии угольной суспензии. Затем уголь осаждали центрифугированием, ресуспендировали в дистиллированной воде и использовали для связывания с иммунореагентами. Иммобилизацию стрептавидина на частицах маркера проводили из 0,01 М боратного буферного раствора (рН 6,5) при соотношении по массе 1:1000, соответственно. Чтобы избежать стерических помех для блокировки маркера вместо БСА использовали смесь, содержащую 1 % овальбумина и 1 % ПЭГ-6 кДа. Эти же соединения вводили вместо БСА в состав стабилизирующего раствора. В качестве объектов исследования использовали набор биотинилированных белков (Biotinylated SDS-PAGE Standarts) фирмы «Bio-Rad» (США), используемых в качестве маркеров молекулярной массы при проведении электрофореза, а также цитохром С, меченный биотином (20 моль биотина на 1 моль белка). Готовили серии двукратных разведений исследуемых белков и наносили их аликвотами по мкл на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве контроля наносили растворы БСА и казеина. Мембрану с белками фирмы «Bio-Rad» блокировали в 0,02 М трис-HCl буферном растворе (рН 7,2), содержащем 2 % овальбумина и 2 % ПЭГ-6, а подложку с разведениями цитохрома С – 4 %-ым раствором ПЭГ-кДа. При выполнении анализа стрипы инкубировали с иммуносуспензией в вертикальном положении в течение 30 мин при комнатной температуре.

Ополаскивали мембраны трехкратным погружением на 1 мин в дистиллированную воду, визуально фиксировали результаты, после чего погружали стрипы на 7-8 мин в свежий раствор физического проявителя на основе метола. Промывали мембраны дистиллированной водой и визуально учитывали результаты после усиления сигнала. Без усиления сигнала по такой методике удавалось надежно определять белки стандарта Bio-Rad в концентрации 0,5 мкг/мл (2,5 нг в точке) и биотинилированный цитохром С в концентрации 0,25 мкг/мл (около 1 нг в точке). Прирост оптической плотности после проявления и в том и в другом случае позволил повысить чувствительность выявления в 4 раза, и достигнуть уровня 125 нг/мл (0,6 нг в точке) для стандарта «Bio-Rad» и около 60 нг/мл (0,3 нг в точке) для биотинилированного цитохрома С.

При сравнении чувствительности выявления IgG в ИФА и дотиммуноанализе с использованием маркеров на основе коллоидного золота, активированного угля и угля, импрегнированного серебром использовали формат дот-иммуноанализа на белковых матрицах с обратной фазой. При приготовлении иммуносуспензий на основе БАУ и БАУ-Ag, в качестве иммунореагента использовали козьи антитела против IgG человека при весовом соотношении БАУ:антитела = 1000:1. В качестве исследуемого материала использовали IgG человека (Sigma, США). Для выполнения дот-анализа готовили серию двукратных разведений (от 160 до 0,3 нг/мл) IgG и последовательно наносили их аликвотами по 5 мкл на фрагмент нитроцеллюлозной мембраны фирмы «Millipore». Такие же разведения IgG использовали для сенсибилизации ячеек планшетов для ИФА. Блокирование мембран и ячеек планшета осуществляли 2 %-ым раствором БСА в течение мин при комнатной температуре. Для контроля в том и другом методах использовали аналогичные разведения иммуноглобулинов, выделенных из нормальной кроличьей сыворотки. Для сравнения в дот-иммуноанализе использовали золь золота (20 нм), связанный с кроличьими иммуноглобулинами против IgG человека (Sigma, США). Постановку дотиммуноанализа с угольными и золотым конъюгатами выполняли одинаково.

Положительным считали разведение IgG, дающее сигнал в виде ясно различимого пятна в месте нанесения образца. При постановке ИФА в планшетах использовали конъюгат пероксидазы хрена с моноклональными антителами против IgG человека и субстратную смесь с о-фенилендиамином.

Результаты исследований отражены на рисунке 13.

ОП41,180 IgG человека 1,40 IgG кролика 0,0,2,0,1,0,0,0,160 80 40 20 10 5 2,5 1,2 0,6 0,А Б В нг/мл А* Б* Концентрация IgG, нг/мл Рис. 13. Результаты сравнительной чувствительности визуального определения иммуноглобулинов человека в дот-иммуноанализе с использованием иммунозоля золота (А), иммуносуспензии угля, импрегнированного серебром (Б) и иммуносуспензии БАУ (В). Справа (А* и Б*) приведены изображения тех же стрипов после их проявления метоловым физическим проявителем. Цифрами обозначены концентрации нанесенных аликвотами по 5 мкл иммуноглобулинов (нг/мл).

На графике приведены результаты определения IgG человека в ИФА (n=3, p=0,95).

В результате проведения экспериментов с тремя параллельными постановками каждого теста показано, что ИФА позволяет выявлять разведение с концентрацией IgG 10 нг/мл, а чувствительность дот-иммуноанализа с использованием угольных иммуносуспензий и золотого иммунозоля (без усиления сигнала) оказалась одинаковой и составила 40 нг/мл (рис. 13А, Б и В).

При этом угольные препараты обеспечивали более высокую контрастность окраски, по сравнению с золотыми, что облегчало учет результатов.

Дополнительное усиление сигналов золотого иммунозоля метоловым физическим проявителем повышало чувствительность анализа в 32 раза, что позволило выявлять IgG на уровне 1 нг/мл (5 пг/образец) (см. рис. 13А*).

Аналогичное проявление угольного маркера, импрегнированного серебром (см.

рис. 13Б*), позволяло усилить сигнал в 4 раза и достигнуть чувствительности – 10 нг/мл, такой же, как в ИФА (см. график на рис. 13).

Таким образом, измельченный активированный уголь может служить эффективным маркером в анализе на пористых мембранах. Разработанная технология получения иммуносуспензии на основе активированного угля предельно проста, а использованный метод дробной нагрузки угля иммунореагентом позволяет безотходно использовать иммунореагенты и избежать очистки конечного продукта от их излишка. Наиболее эффективно применение угольных маркеров в тестах для выявления специфических антител, где необходимы маркеры, связанные с разнообразными по физикохимическим свойствам антигенами. Такие тесты лишь немного уступают по чувствительности ИФА и пригодны для первичного скрининга сывороток.

Чувствительность анализа с использованием угольных маркеров может быть повышена путем импрегнации этих маркеров частицами каталитически активных металлов таких, как серебро или золото. Наряду с описанными выше достоинствами угольных маркеров, импрегнированный уголь способен восстанавливать на себе серебро из растворов физического проявителя, что позволяет в несколько раз усилить оптический сигнал в дот-анализе и достигнуть чувствительности планшетного варианта иммуноферментного теста.

Разработка технологических подходов к конструированию и применению белковых матриц для многопрофильного иммуноанализа с использованием каталитических маркеров. Часто в патогенезе заболевания участвуют несколько возбудителей – так называемые “микст-инфекции” и возникает необходимость обследования пациентов на наличие нескольких инфекционных процессов. Многопрофильный анализ - новый подход в диагностике, основанный на использовании белковых матриц, при помощи которых в образце можно одновременно выявлять множество специфических антител или антигенов. Несмотря на большое число научных публикаций, посвященных разработке многопрофильного анализа, в настоящее время диагностических тест-систем на основе белковых матриц, рекомендованных для клинического применения нет ни в России, ни за рубежом. Это свидетельствует о сложности задач, а также о необходимости изыскания новых методических и технологических подходов для их решения. Основными принципом при разработке белковых матриц являются максимальная миниатюризация при максимальной информативности анализа. Обычно такие разработки имеют тенденцию к размещению большого числа различных антигенов или антител на миниатюрных подложках, к роботизации процесса изготовления и применения матриц (Cretichet М. al., 2006; Hultschig С. et al., 2006; Kartalov Е.Р., 2006). Такой подход требует разработки новых дорогостоящих технологий, материалов и оборудования. Мы считаем, что тесты для многопрофильной иммунодиагностики инфекционных заболеваний могут быть созданы уже сейчас и более простыми средствами.

Выбор формата многопрофильного теста. Наиболее просто может быть изготовлена двумерная белковая матрица, представляющая собой плоскую подложку, на поверхности которой дискретно нанесены в определенном порядке антитела или антигены различных возбудителей. Плоские матрицы позволяют работать с одним видом метки, а расшифровка результатов после выполнения на них дот-иммуноанализа производится по наличию оптических сигналов в зонах нанесения антигенов. По нашему мнению, на начальном этапе разработки многопрофильных тестов целесообразно создавать белковые матрицы, позволяющие проводить диагностику по отдельным группам инфекционных заболеваний (респираторных, желудочно-кишечных, мочеполовых и т.п.), вызывающих сходные симптомы, или решать конкретные медицинские задачи. Разумное ограничение номенклатуры может значительно упростить изготовление матрицы и интерпретацию полученных на ней результатов анализа, а также облегчить подбор иммунокомпонентов, пригодных не только по специфическим свойствам, но и по сроку их годности.

Поэтому при выборе формата матриц мы сознательно отказались от чрезмерной миниатюризации, ограничив число определяемых антител до 8-10 и размер участков нанесения антигенов на поверхности подложки до пятен диаметром 23 мм. Такие матрицы с малой плотностью нанесения антигенов могут позволить легко контролировать распределение антител на подложке, а также учитывать результаты визуально. С другой стороны, такое число инфекций обычно охватывает список дифференцируемых заболеваний и потому может быть достаточным и удобным для клинической практики.

Для детекции иммунологического связывания в многопрофильном анализе наиболее подходящими нам представлялись хромогенные методы с использованием маркеров на основе ферментов или каталитически активных металлов (золота или серебра) в сочетании с физическим проявлением. При первичной отработке метода многопрофильного анализа мы решили применять серийно выпускаемые конъюгаты на основе фементов и коллоидного золота, чтобы избежать дополнительного фактора неопределенности, связанного с качеством самостоятельно полученных препаратов. Дизайн белковой матрицы и схема нанесения на ней антигенов могут быть самыми разнообразными. Мы выбрали форму и размеры матрицы (рис. 14), позволяющие проводить анализ во флаконах для лекарственных средств, объемом 10-12 мл.

В рабочей зоне матрицы могут быть размещены 8-10 первичных иммунореагенов захвата, положительный контроль (К+), представляющий собой точку нанесения иммуноглобулинов человека, а также зону, свободную от специфических белков (К-). К+ размещен в верхнем левом участке рабочей зоны и кроме контроля работы конъюгата и проявляющей системы служит контролем полноты погружения матрицы в рабочие растворы при проведении анализа. Зона К- служит отрицательным контролем, позволяющим оценивать фоновые сигналы в процессе проявления. Рабочая зона окантована контрастной рамкой, позволяющей позиционировать положение точек при инструментальном учете результатов.

8 мм Маркировка матрицы Рис. 14. Схема конструкции белковой матрицы для многопрофильного анализа антител.

- точка положительного контроля.

Координирующая рамка Участки иммобилизации реагентов захвата Зона К- Многопрофильный анализ антигенов. Первые попытки изготовления и применения белковых матриц были направлены на оценку возможности применения ряда первичных антител в анализе на одной подложке и отработку методических приемов, позволяющих выполнение многопрофильного анализа антигенов. Они были выполнены с использованием имеющихся в наличии материалов и моноклональных антител. В экспериментах мы использовали в качестве подложки белый листовой полистирол (ТУ-10-24-27-90) толщиной 0,мм и первичные моноклональные антитела мыши к Trichomonas vaginalis, Mycoplasma hominis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Gardnerella vaginalis, а также к вирусам простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) и Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ВККГЛ). Эти антитела применялись в производстве ИФА тест-систем, т.е. для них подтверждено сохранение активности после адсорбционного связывания с поверхностью полистирола. Иммобилизацию первичных антител проводили методом физической адсорбции, нанося растворы иммуноглобулинов (10-25 мкг/мл) на подложку аликвотами по 2,5 мкл с последующей инкубацией подложек во влажной камере при 4оС в течение 8 часов. Дополнительную блокировку выполняли 0,2 %-ым раствором казеина. В качестве вторичного иммунореагента использовали смесь человеческих сывороток, содержащих антитела к выявляемым агентам; а в качестве третичного реагента использовали антитела против IgG человека, связанные с пероксидазой или коллоидным золотом. В дот-анализе выявление пероксидазного конъюгата проводили с использованием «Peroxidase substrate kit DAB-Ni» (Vector Lab. Inc., США), а золя золота в физическом проявителе на основе метола. Общее время выполнения многопрофильного анализа антигенов составляло – 90 мин.

Выбранная нами схема анализа приведена на рисунке 15.

Характеристики многопрофильного теста сравнивали с показателями коммерческих тест-систем для ИФА, изготовленных с использованием тех же Рукоятка зона 25 мм Рабочая моноклональных антител. В качестве объектов исследования использовали образцы положительных контролей из этих тест-систем.

Иммунозоль Физический Au-a/IgG-Hum проявитель Ат- Ат-Ag Аг- МкАт-МкАт-Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Этап 1 Этап 2 Этап Этап 4 Этап Инкубация с Инкубация Инкубация с Усиление Учет образцом со смесью иммунозолем сигнала результатов иммунных Au-a/IgG-Hum сывороток человека Рис. 15. Общая схема многопрофильного дот-иммуноанализа антигенов с применением иммунозоля золота и усилением сигнала физическим проявлением.

На примере одновременного выявления хламидий, а также вирусов герпеса и Крымской-Конго геморрагической лихорадки показана высокая специфичность одновременного анализа антигенов этих возбудителей (рис. 16).

К+ (IgG человека) К- HSV- ВККГЛ C. trachomatis 1 2 3 4 Рис. 16. Результаты многопрофильного дот-иммуноанализа образцов контрольных антигенов: 1 - ВККГЛ, 2 - C. trachomatis, 3 - ВПГ-1, 4 – смеси трех антигенов в соотношении 1:1:1, 5 – без антигенов. Слева приведена схема нанесения на матрицу контролей и моноклональных антител.

Сравнение чувствительности ИФА и многопрофильного дотиммуноанализа с применением золотых иммунозолей или пероксидазного конъюгата мы выполняли на контрольных антигенах ВККГЛ и C. trachomatis.

Готовили серии двукратных разведений антигенов и проводили параллельный анализ каждого разведения в трех тест-системах. Результаты приведены на рисунке 17. Эксперименты показали, что многопрофильный дот-иммуноанализ с использованием конъюгата на основе коллоидного золота дает результаты, полностью совпадающие с результатами исследований, полученных на моноспецифических ИФА тест-системах, тогда как многопрофильный анализ с применением перокидазных конъюгатов обладает более низкой чувствительностью. Кроме того, золи золота в сочетании с метоловым Отмывка Отмывка Отмывка Отмывка физическим проявителем генерируют контрастный сигнал, существенно облегчающий визуальный учет результатов.

Титр антигенов в ИФА 1:400 1:C. trachomatis К+ ВККГЛ К- Разведения АГ C. trachomatis ВККГЛ Рис. 17. Результаты сравнительной оценки чувствительности выявления контрольных антигенов (АГ) ВККГЛ и C. trachomatis в дот-иммуноанализе с использованием иммунозолей золота - верхний ряд и прероксидазного конъюгата – нижний ряд. Слева приведена схема нанесения контролей и моноклональных антител на белковую матрицу, вверху – таблица данных, полученных в планшетном варианте ИФА.

На основе имеющегося в наличии набора моноклональных антител мы изготовили белковые матрицы для выявления ряда возбудителей инфекций мочеполового тракта и провели их испытания. При параллельном исследовании клинических образцов вагинальных смывов с применением коммерческих наборов для ИФА и белковых матриц с антителами к шести возбудителям урогенитальных инфекций получены полностью совпадающие результаты. Таким образом, проведенные эксперименты показали, что использованные нами подходы позволяют создавать многопрофильные тесты для одновременного оперативного и эффективного выявления патогенов с визуальным учетом результатов.

Многопрофильное выявление антител. Отработка технологии анализа на белковых матрицах была продолжена на примере создания теста для одновременного выявления антител к возбудителям перинатальных инфекций, более обеспеченного необходимыми материалами.

Выбор и исследование свойств материалов для подложки. Первичный отбор материалов для изготовления подложки белковой матрицы, мы производили по следующим критериям: однородность поверхности по цвету и структуре, неразмокаемость в условиях анализа; наличие известных методов связывания с белками, простота обработки при изготовлении матрицы и удобство при выполнении анализа. Изучены три группы листовых материалов:

пористые матрицы на основе полимерных материалов, непористые органические полимеры, а также синтетическая бумага, сочетающая органические и минеральные компоненты. Морфологические исследования их поверхности выполняли методами атомно-силовой и сканирующей 1/1/1/Исх.

1/41/81/11/2Без АГ электронной микроскопии. Некоторые материалы (в частности, синтетическая бумага) имели с двух сторон различную структуру, поэтому для них наиболее однородную поверхность именовали в дальнейшем "лицевой". При исследовании материалов оценивали три параметра:

- эффективность адсорбции антигенов, о которой судили по интенсивности оптического сигнала в месте нанесения антигена после выполнения анализа с положительной сывороткой;

- способность к неспецифическому связыванию компонентов, о которой судили по наличию или отсутствию фоновых оптических сигналов на несенсибилизированной подложке после выполнения анализа;

- совместимость материала с системой детекции, о которой судили по наличию или отсутствию фоновых или артефактных оптических сигналов на поверхности чистого тестируемого материала после стандартной процедуры физического проявления.

Нитроцеллюлозные мембраны хорошо адсорбируют белки, однако изготовлены из очень хрупкого, ломкого материала, что значительно затрудняет их использование. Поливинилхлоридные мембраны эластичны и не ломаются, однако их сорбционная емкость невелика. Одним из основных недостатков пористых мембран является сложность их отмывки от не связавшихся компонентов реакции, особенно от золей, остатки же неотмытого золота провоцируют неспецифическое проявление. Еще одним существенным недостатком доступных пористых мембран является их относительно высокая стоимость. Таким образом, адсорбирующие фильтры, по нашему мнению, малоперспективны для производства белковых матриц.

Из непористых листовых материалов на основе органических полимеров оценивали образцы полистирола, поливинилхлорида и полиэтилентерифталата (лавсана). Всего исследовано более 60 образцов. Из этой группы материалов лучшими характеристиками обладали образцы белого полистирола. Все исследованные партии полистирола показали хорошую сорбционную способность, но требовали предварительной обработки (очистки) поверхности.

Однако даже тщательно химически очищенная поверхность полистирола имела участки слабо сорбирующие белки и участки, провоцирующие спонтанное осаждение серебра из растворов физического проявителя. По приблизительной оценке такие дефектные участки составляли до 5% поверхности пластмассы.

Синтетическая бумага, изготавливается из полипропиленовой смолы, прошедшей минеральное упрочнение с помощью смеси углекислого кальция (CaCO3) и двуокиси титана (TiO2) для придания белизны и матовости (www.bereg.net). Она устойчива к воздействию воды, тепла, масла и химических реактивов. Бумага марки GB2HG имеет одну глянцевую, а другую матовую сторону. У других доступных марок обе стороны матовые с различной шероховатостью (рис 18). Результаты сравнительного исследования эксплуатационных свойств разных сортов синтетической бумаги показали, что марка GB2HG хуже связывает антигены, вероятно потому, что ее поверхность представлена преимущественно полипропиленом. Все другие образцы одинаково хорошо связывают и удерживают на своей поверхности белки, однако сорт GH-1 имеет более грубую неоднородную поверхность, что негативно отражается на воспроизводимости результатов, а марка «РА-1» обладает выраженной способностью к диффузному спонтанному осаждению серебра при контакте с физическим проявителем. Сорт «GС-3» индифферентен к используемому составу проявителя, обеспечивает эффективную и воспроизводимую иммобилизацию антигенов и, из всех исследованных вариантов, является лучшим материалом для изготовления подложки белковых матриц. При этом антигены эффективней иммобилизуются на лицевой стороне синтетической бумаги марки «GC-3».

Б В А Г Рис. 18. Изображения рельефа «лицевой» поверхности образцов синтетической бумаги «Polylith» марок: (А) GB2HG, (Б) «PА-1», (В) «GH-1», (Г) «GС-3», полученные методом атомно-силовой микроскопии.

Отработка способов подготовки поверхности подложки. Поверхность пластмассы обычно несет на себе остатки компонентов, используемых при производстве материала, и банальные загрязнения. Кроме того, поверхностный слой пластика может содержать участки с дефектами химического состава и полимеризации. Эти загрязнения и дефекты поверхности могут с одной стороны, снижать эффективность иммобилизации антигенов, а с другой – вызывать неспецифическое связывание биокомпонентов и спонтанное проявление. В конечном итоге они влияют на уровни специфических и неспецифических сигналов, а также на воспроизводимость результатов анализа.

Для удаления банальных загрязнений обычно применяют отмывку растворами детергентов или щелочи, для удаления стойких жировых загрязнений – обработку растворителями, а для удаления дефектов поверхностного слоя – травление крепкими растворами кислот. Влияние таких видов обработки на специфический и фоновый сигналы мы и исследовали в настоящей работе.

Картина результатов многопрофильного анализа, выполненного на различно обработанных подложках из синтетической бумаги, приведена на рисунке 19.

Исследования показали, что наиболее технологичным и достаточно эффективным способом подготовки синтетической бумаги для иммобилизации антигенов может служить обработка ее поверхности 1 %-ым раствором детергента SDS с последующей, тщательной промывкой дистиллированной водой.

1 2 3 4 5 6 а б г в Рис. 19. Результаты оценки эффективности сорбции антигенов на подложках из синтетической бумаги «Polylith» марки «GС-3», подвергнутых некоторым видам обработки: 1 - без обработки; 2 - отмывка 1 %-ым раствором SDS; 3 - обработка тампоном с фреоном 113; 4 - отмывка 10 %-ым раствором Triton X-100; 5 - отмывка с мылом; 6 - обработка тампоном с 96 %-ым этанолом; 7 - обработка тампоном с хлороформом. Слева приведена схема нанесения антигенов на подложку: (а) р41 T.

рallidum, (б) р150 ЦМВ, (в) р17 T. рallidum (г) лизат T. gondii.

Подбор антигенов для изготовления матрицы. Для конструирования белковой матрицы были выбраны антигены самых распространённых возбудителей, представляющих наибольшую опасность для здоровья матери и плода. Всего исследовано более 80 партий белков. Оценку каждого антигена осуществляли в ИФА на планшетах и дот-анализе на синтетической бумаге.

При оценке учитывали адекватность взаимодействия антигена с образцами рабочей панели, а также уровень оптических сигналов, полученных при оптимальном разведении антигена. Чистоту и молекулярную массу антигенов оценивали методом SDS-электрофореза в 10 %-ом полиакриламиидном геле.

Перечень исследованных в данной работе антигенов приведен в таблице 3.

Таблица Исследованные антигены возбудителей инфекций Возбудитель Антигены Chlamydia trachomatis Рекомбинантные белки: MOMP, Hsp Toxoplasma gondii Рекомбинантные белки: В 10 и Sag 1, лизат возбудителя Rubella virus Смесь рекомбинантных белков Е 1, Е 2 и С Cytomegalovirus Рекомбинантные белки: p 150, p 56, p 65, лизат возбудителя Herpes simplex virus - 1 Рекомбинантный белок D 1, лизат возбудителя Treponema pallidum Рекомбинантные белки: p 17-в-галактозидаза, p 17-GST, p 41-в-галактозидаза, p 41-GST Mycoplasma hominis Рекомбинантный белок р120, лизат возбудителя Ureaplasma urealyticum Рекомбинантные белки Ure D, МБА 1, лизат возбудителя Gardnerella vaginalis лизат возбудителя Trichomonas vaginalis Рекомбинантный белок Adgesin p 65, лизат возбудителя Neisseria gonorhoeae Рекомбинантный белок мембраны, лизат возбудителя Candida albicans лизат возбудителя Chlamydia pneumoniae лизат возбудителя Trichomonas vaginalis Рекомбинантный белок Adgesin p 65, лизат возбудителя Virus herpes simplex 2 Рекомбинантный белок g 1, лизат возбудителя В результате проведенных исследований для изготовления белковой матрицы отобраны шесть рекомбинантных антигенов: Sag1 - T. gondii; MOMP - C. trachomatis; E1, E2, C - Rubella virus; p17 и р41 - T. pallidum; p150 - Cytomegalovirus; D1 - Herpes simplex virus-1 и два натуральных: Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum (в табл. 3 эти антигены выделены жирным шрифтом). В некоторых экспериментах на матрицы дополнительно наносили лизатный антиген Gardnerella vaginalis.

Выбор способа и условий иммобилизации антигенов на подложке.

Изучение условий иммобилизации антигенов на подложках из синтетической бумаги проводили с использованием трех различных по структуре, составу и молекулярной массе антигенов (p17 T. pallidum, р150 ЦМВ и лизате клеток T.

gondii). Исследовали концентрации антигенов в сорбционной смеси, состав и рН буферных растворов, а также условия инкубации сорбционной смеси на подложках. Сравнивали два режима инкубации: сушка капель (2,5 мкл) сорбционной смеси на воздухе при комнатной температуре и инкубация подложек с сорбционной смесью во влажной камере при 4оС в течение 12 ч.

Эффективность иммобилизации оценивали по уровню оптического сигнала после выполнения дот-иммуноанализа. Установлено, что связывание антигенов на синтетической бумаге наиболее эффективно при значениях рН, близких к нейтральным, рН 7,3-8,0. Причём, в таких условиях иммобилизация одинаково хорошо происходила как при длительной инкубации во влажной камере, так и при быстрой сушке. Последнее обстоятельство имеет существенное значение, так как может значительно упростить технологию производства белковых матриц. Оптимальные концентрации антигенов подбирали путем нанесения на подложку серии двукратных разведений антигенов. После сорбции, блокировки и выполнения дот-анализа сравнивали интенсивность визуальных сигналов и за рабочее принимали наибольшее разведение антигена, обеспечивающее максимальную оптическую плотность. Оптимальный диапазон рабочих разведений для разных антигенов варьирует в области от 5 до 20 мкг/мл. Вне этого диапазона снижение содержания антигенов в сорбционной смеси уменьшает сигнал, а повышение - вызывает появление ореола вокруг места иммобилизации за счет диффузии излишка антигена на окружающие участки подложки.

Отработка автоматизированного способа нанесения антигенов.

Основной задачей автоматического устройства для распечатывания антигенов является раздельное, строго локализованное нанесение на подложку матрицы различных белковых растворов в форме пятен (символов) размером 2-3 мм с четко ограниченными контурами. Эту задачу нам удалось выполнить с использованием перьевого планшетного плоттера MP 4200 (Graphitec, Япония).

Пробные распечатывания проводили на лицевой стороне листов формата Асинтетической бумаги “Polylith” марки «GC-3», отмытых раствором SDS и дистиллированной водой. Формирование дизайна матриц, задание опций печати и распечатывание на плоттере проводили в программе «Splan 50R» (Abacom, Германия). После пробной печати проводили дот-иммуноанализ, по результатам которого оценивали: эффективность распечатки антигенов (интенсивность и равномерность оптического сигнала в месте нанесения антигена), возможность перекрестного загрязнения антигенов в процессе печати и возможность загрязнения антигенами свободных участков матрицы. Подобраны режимы печати и тип штриховки пятна, при которых модифицированным пером с толщиной 0,5 мм удается наносить примерно 1 мкл белковой смеси на пятно диаметром около 2,5 мм, что удовлетворяет поставленной задаче.

Концентрацию антигенов подбирали эмпирически, для рекомбинантных антигенов она составляла 10-20 мкг/мл, а расход каждого антигена на 1 матрицу – 10-20 нг. С использованием такого подхода нам удавалось стандартно распечатывать до 2500 точек в час. Кроме нанесения антигенов плоттер позволял производить необходимую разметку и маркировку матриц с помощью фломастеров с водостойкими чернилами.

Выбор системы детекции. В настоящей части исследований проводилась сравнительная оценка эффективности применения в многопрофильном анализе трех хромогенных маркеров (пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и коллоидного золота) и систем их проявления с целью подбора наиболее подходящей (чувствительной, быстрой и простой в применении) системы детекции. Для сравнения взяты коммерческие проявляющие системы: для пероксидазы - «Peroxidase substrate kit DAB», «Peroxidase substrate kit DAB-Ni» (Vector Lab. Inc., Burlingame, США); субстрат на основе хлорнафтола из тестсистемы «Immuno-blot kit» (Sigma, США) и биотинилтирамидная система амплификации пероксидазного сигнала «Super Card» (Bhattacharya R. et al., 1999); для щелочной фосфатазы - NBT/BCIP-субстрат из тест-системы «Immunocomb Chlamydia-IgG» (Orgenics, Израиль); для коллоидного золота - «Silver enhancer kit» (Sigma, США) и самостоятельно приготовленные физические проявители на основе гидрохинона и метола. В дот-анализе с использованием разных конъюгатов и проявляющих систем оценивали следующие параметры: интенсивность оптических сигналов в местах нанесения антигенов и положительного контроля, чувствительность и полноту выявления спектра антител, специфичность выявления спектра антител, а также возможность неспецифического связывания конъюгатов с подложкой или спонтанного проявления свободными участками матрицы.

Результаты исследования показали, что системы с использованием пероксидазных конъюгатов не обеспечивают необходимой чувствительности.

Применение биотинилтирамидной амплификации (Super Card) существенно увеличивает чувствительность, но требует применения нестандартных, более дорогих, короткоживущих компонентов и увеличивает время анализа примерно на 20 мин. Система с применением щелочной фосфатазы была более чувствительна, чем пероксидазная, однако формируемый в ней сигнал отличался невысокой контрастностью, что затрудняло визуальную оценку низкотитражных антител. Детекция с использованием коллоидного золота и физического проявителя позволяла выявлять весь спектр антител в образце и обеспечивала более яркий и контрастный сигнал, чем система со щелочной фосфатазой. Применение коммерческого набора «Silver enhancer kit» не позволяло достигать высокой интенсивности окраски, а проявители на основе метола и гидрохинона обеспечивали в течение 7-8 мин появление насыщенных оптических сигналов. При этом состав с метолом давал более яркую картину результатов анализа c относительно чистым фоном и, по нашему мнению, является лучшей проявляющей системой для визуализации результатов многопрофильного иммуноанализа.

Оптимизация состава и условий применения физического проявителя.

Физический проявитель на основе метола нестабилен и готовится непосредственно перед применением путем смешивания трех растворов. Такая процедура неудобна для использования во внелабораторных условиях. Задачей настоящей части исследований являлась отработка способа применения проявителя, пригодного для использования в автономных тест-наборах.

В состав физического проявителя входят три компонента: метол 0,2 %, лимонная кислота 0,5 % и нитрат серебра 0,2 %. В лабораторной практике они готовятся в виде отдельных растворов и смешиваются при необходимости.

Раствор нитрата серебра стабилен и может храниться в склянке из темного стекла более года. Раствор метола может эффективно использоваться только в течение 1-2 суток. Мы экспериментально установили, что в виде сухой смеси с лимонной кислотой метол может более 2 лет (срок наблюдения) храниться при комнатной температуре без потери активности. Проблема комплектации в этом случае заключалась в малой дозировке порций этих компонентов. Доза на 1 мл проявителя составляет для метола – 2 мг, а для лимонной кислоты 5 мг. Весовая или объемная дозировка таких порций сопряжена с высокой погрешностью, вероятно, способной негативно сказаться на результатах анализа. При экспериментальной проверке было показано, что даже двукратное превышение или снижение концентрации метола и лимонной кислоты не приводят к значительным изменениям активности проявителя, но заметно снижают его стабильность. На практике это выглядело как быстрое потемнение раствора за счет диффузного восстановления серебра в его объеме. Особенно дестабилизация раствора была заметна при повышении рН, поэтому мы сочли целесообразным использование в проявителе не лимонной кислоты, а цитратной буферной системы, способной обеспечить стабильный показатель рН 2,5. Подобрано весовое соотношение компонентов сухой смеси: метол – 2, лимонная кислота – 9, цитрат натрия (5,5 водный) – 1. Компоненты измельчали и перемешивали в шаровой мельнице, а затем изготавливали тритурационные таблетки путем формования увлажненной спиртом смеси во фторопластовой матрице с последующей сушкой. Эта технология проста, не требует специального оборудования и подходит для решения поставленной задачи.

Путем подбора матрицы мы получили таблетки из метолово-цитратной смеси массой 12 мг. Таким же способом удавалось изготавливать таблетки массой мг, содержащие 2 мг метола и 5 мг лимонной кислоты. Оба варианта таблеток были пригодны для приготовления 1 мл проявителя. Погрешность дозирования при таком подходе не превышала 8-10 % и не сказывалась на результатах проявления. Способ применения вышеуказанных компонентов включал растворение (2-3 мин) таблетки сухой смеси в 0,5 мл дистиллированной воды и добавление равного объема 0,4 %-го раствора нитрата серебра. Такая схема позволяет использовать физический проявитель в автономных тест-системах.

В ряде случаев при высыхании проявленной матрицы изначально черносерые сигналы приобретали буро-рыжую окраску и теряли контрастность. Для того чтобы стабилизировать результаты и одновременно повысить интенсивность сигналов мы погружали отмытые после проявления матрицы на мин в щелочной раствор тиомочевины (1 % тиомочевины и 1 % гидроокиси натрия в дистиллированной воде). При этом образовывался черный сульфид серебра, обладающий высокой устойчивостью к внешним воздействиям.

Матрицы перед такой обработкой отмывали от остатков проявителя, иначе на ней появлялась вуаль.

Оптимизация условий выполнения анализа. Многопрофильный анализ антител включает несколько стадий (рис. 20).

Время выполнения операций (мин) Общее время 20 2х2 20 3х2 7 1 1 анализа 60 мин Этап Этап 4 Этап Этап Этап Инкубация с Инкубация с Стабилизация Учет Усиление иммунозолем образцом окраски результатов сигнала Au-SpA сыворотки Y Y Аг-Аг-1 Y Y Ag Ag2S Au Y Ат- Щелочной Иммунозоль Физический раствор проявитель Au-SpA тиомочевины Рис. 20. Общая схема многопрофильного дот-иммуноанализа антител с применением иммунозоля золота, усилением сигнала физическим проявлением и стабилизацией окраски щелочным раствором мочевины.

На первом и втором этапах анализа мы оптимизировали составы рабочих растворов, кратность рабочих разведений образца и конъюгата, режимы инкубации и отмывок. Сравнивали два варианта базовых буферных растворов (фосфатного и трис-HCl), в которые для приготовления растворов для разведения сывороток и конъюгата, а также растворов для отмывок вводили одинаковые дополнительные компоненты. Оценка показала, что обе буферные системы могут быть использованы при проведении анализа, но растворы на основе трис-HCl обеспечивают немного более заметную разницу между положительными и отрицательными образцами. Для снижения возможности появления ложноположительных результатов мы применяли щелочные (рН 9,5 Отмывка Отмывка Отмывка Отмывка 9,8) растворы для разведения сывороток и вводили в их состав детергенты и мочевину, препятствующие связыванию низкоаффинных компонентов, и/или так называемый «концентрат блокирующего раствора», представляющий собой лизат клеток E. coli. Для предотвращения неспецифического связывания с подложкой и блокирующим белком в состав растворов вводили небольшие (0,05 %) количества казеина и неионного детергента твин-20. В качестве консерванта использовали азид натрия. Оптимальные концентрации иммунозоля золота подбирали опытным путем.

В ИФА инкубацию, как с образцами, так и с конъюгатом, осуществляют при 37оС в течение 30 мин. Этот режим подходит и для многопрофильного иммуноанализа. Однако, в целях создания оперативного и автономного теста, нами были предприняты попытки сокращения время инкубации с образцами и конъюгатом и выполнения анализа в условиях комнатной температуры.

Результаты экспериментов позволили сделать вывод о том, что при постановке многопрофильного анализа в условиях комнатной температуры, достаточно 20-минутного взаимодействия матрицы, как с образцами, так и с конъюгатом, а также ее двукратной отмывки по 2 мин после каждой из этих операций. Для промывки матрицы перед проявлением и стабилизацией сигналов достаточно погрузить ее на 1 мин в дистиллированную воду. Таким образом, отработанная процедура многопрофильного анализа антител включает 11 последовательных операций и может быть выполнена в течение 60 мин при комнатной температуре.

Испытания лабораторного образца теста для многопрофильного анализа антител. В результате проведенной работы был создан лабораторный образец, который может быть использован в качестве прототипа при организации производства многопрофильного теста для определения антител к возбудителям перинатальных инфекций. Этот образец включал белковые матрицы с положительным контролем (IgG-Hum), шестью рекомбинантными (T. gondii; C. trachomatis; Rubella virus; T. pallidum; ЦМВ; ВПГ-1) и двумя натуральными (M. hominis, U. urealytica) антигенами, а также рабочие растворы. При лабораторных испытаниях прототипа теста анализ сывороток выполняли в индивидуальных полипропиленовых пробирках объемом 3 мл (LKB, Швеция). Учет результатов осуществляли визуально.

Оценку чувствительности и специфичности многопрофильного теста при определении антител к ЦМВ, ВПГ-1, C. trachomatis и T. pallidum проводили с использованием соответствующих панелей сывороток, производства ЗАО «Медико-биологический союз» (Бердск). Результаты исследований приведены в таблице 4. Оценка чувствительности и специфичности теста при определении антител к вирусу краснухи и T. gondii осуществлялась на произвольных выборках из образцов рабочей панели сывороток с использованием референстестов. Результаты представлены в таблице 5.

При выявлении антител к токсоплазмам данные, полученные с использованием референс-тестов и многопрофильного анализа, полностью совпадают, а при выявлении антител к вирусу краснухи многопрофильный тест позволяет определять меньше позитивных сывороток, чем тест-системы фирм «Medac» и «Вектор-Бест». Возможно, это связано с особенностями антигенов, используемых в разных тестах, поскольку результаты многопрофильного теста и тест-системы «ИмДи-спектр», изготовленных с использованием одинаковых антигенов, совпадают.

Таблица Оценка чувствительности и специфичности многопрофильного теста с использованием панелей сывороток, производства ЗАО «МБС» (Бердск) Инфекция ЦМВ Герпес Хламидиоз Сифилис ОСО-42-28-360 ОСО-42-28-373 ОСО-42-28-313 Панель Панель серия 001 серия 001 серия 0серия 0Чувствительность 95 % 95 % 94 % 100 % Специфичность 94 % 86 % 95 % 100 % Таблица 5.

Результаты оценки показателей многопрофильного теста при выявлении IgG к возбудителям токсоплазмоза и краснухи относительно референс тест-систем.

Относительные диагностические Инфекция Референс тест-система показатели, % Чувствительность Специфичность Toxoplasma gondii IgG 100 1«Sentinel CH», Италия Токсоплазмоз Токсоплазмоз IgG-антитела 100 1«ИмДи-спектр», Новосибирск Rubella IgG – ELISA 96 f. Medac, Германия ВектоРубелла-IgG-стрип Краснуха 92 «Вектор-Бест» Новосибирск Краснуха IgG-антитела 100 1«ИмДи-спектр» Новосибирск Результаты сравнительного анализа образцов рабочей панели сывороток, с использованием многопрофильного теста и моноспецифических тест-систем, производства ООО «ИмДи-спектр», изготовленных с применением идентичных антигенов, представлены в таблице 6. Данные, полученные с использованием одинаковых рекомбинантных антигенов в ИФА и многопрофильном анализе, совпадали на 97-100 %. На антигенах, представленных лизатами натуральных возбудителей (M. hominis и U. urealyticum), многопрофильный анализ выявлял больше позитивных сывороток, чем ИФА. Анализ с использованием лизатных антигенов сопровождался относительно высоким уровнем фона. При проведении ИФА антител к M. hominis и U. urealyticum фоновые сигналы определялись в диапазоне 0,150-0,300 ОЕ. В варианте многопрофильного анализа такие сигналы визуализируются в виде слабо окрашенных, но отчетливо различимых пятен и могут интерпретироваться как положительный результат.

Таблица Результаты сравнительного анализа рабочей панели сывороток (150 образцов) с использованием многопрофильного теста и ИФА тест-систем ООО «ИмДи-спектр» Совпадений результатов Патоген Число % Chlamydia trachomatis 150 1Toxoplasma gondii 147 Rubella virus 149 Cytomegalovirus 145 Herpes simplex virus-1 149 Treponema pallidum 149 Mycoplasma hominis 133 Ureaplasma urealyticum 138 Сходная картина наблюдалась и при сравнительной оценке аналитической чувствительности этих тестов. Титры специфических антител параллельно определяли в многопрофильном дот-иммуноанализе и на соответствующих моноспецифических тест-системах для ИФА (ООО "ИмДиспектр"). Белковые матрицы и тест-системы были изготовлены с применением идентичных антигенов. Данные, полученные с использованием рекомбинантных антигенов, в ИФА и многопрофильном анализе совпадали, тогда как на антигенах, представленных лизатами натуральных возбудителей матрицы выявляли антитела в большем разведении, чем ИФА.

Таким образом, чувствительность и специфичность анализа антител на белковых матрицах определяются в основном качеством применяемых в них антигенов. Все использованные нами рекомбинантные антигены обеспечивают достаточно высокие показатели чувствительности и специфичности анализа.

Антигены на основе лизатов натуральных возбудителей провоцируют высокий уровень фоновых сигналов, что затрудняет правильную интерпретацию результатов. Поэтому необходим поиск более качественных аналогов белков этих возбудителей.

Для проверки воспроизводимости результатов многопрофильного анализа матрицы распечатывали на нескольких листах синтетической бумаги (по 1стрипов на листе). Из разных мест каждого листа вырезали по 6 матриц и параллельно проводили на них анализ одного и того же образца сыворотки.

Результаты учитывались визуально. Отмечены незначительные различия в интенсивности визуальных сигналов на отдельных матрицах, однако все они идентично выявляли спектр антител в образце. Для проверки стабильности белковые матрицы, упакованные в полиэтиленовые пакеты, хранили при температурах 4оС и 40оС и периодически исследовали их работоспособность и чувствительность. Полученные данные показали, что при температуре 40оС матрицы сохраняют исходную активность в течение 30 дней (срок наблюдения), а при 4оС они адекватно выявляют весь спектр контролируемых антител и не теряют чувствительности как минимум 12 месяцев.

Разработка средств инструментального учета результатов теста. Для того чтобы избежать трудностей при субъективной оценке сигналов, нами разработана компьютерная программа, которая позволяет анализировать изображение матрицы, полученное с помощью сканера, цифрового аппарата или WEB-камеры. Эта программа способна распознавать области нанесения антигенов и определять их оптическую плотность. По каждой из этих областей она позволяет задавать и вычитать отсекаемые значения фоновых сигналов, интерпретировать результаты как положительные или отрицательные, сохранять результаты в банке данных и выдавать на распечатку протокол анализа.

Разработка прототипа набора реагентов для многопрофильного анализа. Проведенные исследования позволили сформулировать общее представление о том, что должен представлять собой набор реагентов для многопрофильного анализа антител и его потенциальных преимуществах перед существующими средствами серодиагностики. Наиболее перспективным нам представляется набор, включающий в свой состав: комплект белковых матриц, многоячеечную аналитическую ванну, компоненты физического проявителя и диск с программой учета. Общий вид прототипа набора реагентов для многопрофильного анализа (20 тестов на 8 инфекций) представлен на рисунке 21.

Рис. 21. Общий вид прототипа набора для многопрофильного анализа антител.

Матрицы могут быть выполнены в виде плоского гребня, каждый зубец которого является аналитическим устройством. Матрицы могут использоваться как по одной (для индивидуальных анализов), так и в виде целого гребня (для массовых обследований). Аналитическая ванна изготавливается из химически инертной пластмассы и предназначена для последовательных инкубаций белковых матриц в рабочих растворах. Она заполняется готовыми растворами и герметизируется. При выполнении анализа в первый ряд ячеек ванны вносят исследуемые образцы и, затем, всю гребенку или отдельные матрицы последовательно инкубируют в ячейках каждого ряда.

Проявитель готовят непосредственно перед использованием. После выемки матрицы из последней ячейки визуально учитывают результаты. При необходимости с диска устанавливают компьютерную программу и выполняют инструментальный учет.

Описанный выше набор по внешним признакам сходен с моноспецифическими тест-системамами «ImmunoComb» франко-израильской фирмы «Orgenics», но значительно отличается от них по используемым материалам и техническому исполнению. Кроме того, в отличие от них, предлагаемый набор позволяет проводить одновременное комплексное обследование на 8 инфекций, а также содержит вместо системы детекции со щелочной фосфатазой, золотосеребряную систему детекции, позволяющую повысить чувствительность анализа и существенно снизить себестоимость теста.

Сравнительные расчеты материальных затрат на производство ИФАнаборов, а также многопрофильных тестов, использующих системы детекции со щелочной фосфатазой и коллоидным золотом, показали, что затраты на материалы для изготовления многопрофильных тестов с коллоидным золотом примерно в 4 раза ниже, чем для тестов со щелочной фосфатазой, а стоимость одного такого анализа на 8 инфекций только в 1,5 раза превышает стоимость одного ИФА в планшете. При выполнении комплексного обследования за счет снижения затрат клинической лаборатории анализ на белковой матрице с антигенами обойдется пациенту примерно в 7-8 раз дешевле, чем эквивалентное число тестов в ИФА. Кроме того, предлагаемый набор полностью укомплектован, автономен, не требует особой квалификации оператора и позволяет оперативно выполнять многопрофильные исследования во внелабораторных условиях. Производство наборов для многопрофильного анализа не требует дорогого оборудования и может быть развернуто на небольших производственных площадях. Один из возможных вариантов организации производства таких наборов приведен в приложении к диссертации.

Таким образом, проведенные исследования по применению в иммуноанализе высокодисперсных корпускулярных маркеров позволили решить поставленную задачу – разработать технологические подходы к созданию комплекса чувствительных, простых, быстрых и недорогих твердофазных иммунохимических тестов, способных обеспечить иммунодиагностику инфекционных заболеваний и специфическую индикацию патогенов в слабооснащенных медицинских учреждениях или во внелабораторных условиях. Отработанные в наших экспериментах методы иммуноанализа сочетают высокую чувствительность, надежность, простоту выполнения и скорость получения результатов. В то же время они значительно дешевле существующих аналогов и могут выполняться повсеместно, что делает их более доступными для пациентов. Кроме того, применение таких тестов позволяет оперативно осуществлять эпидемиологический мониторинг и санитарно-эпидемиологический контроль, а также проводить быструю оценку ситуации и принимать необходимые меры при возникновении биологических угроз. Описанные выше технологические подходы не требуют дорогого оборудования, универсальны и могут быть использованы при производстве диагностических наборов любой специфичности. Такие подходы могут найти применение не только в диагностике инфекционных заболеваний, но и в других отраслях медицины, а также в ветеринарии, экологических исследованиях и научных экспериментах.

ВЫВОДЫ Выполнены исследования по разработке высокодисперсных корпускулярных маркеров для создания комплекса методов твердофазного иммунохимического анализа с визуальным учетом результатов, пригодных для проведения исследований в слабооснащенных лабораториях и в полевых условиях в результате чего:

1. Впервые экспериментально обосновано применение в планшетном варианте иммуноанализа неорганических катализаторов на основе соединений железа, серебра и кобальта как маркеров, альтернативных пероксидазе хрена, а также принципа каталиметрии для их выявления.

2. Установлено, что применение в планшетном варианте иммуноанализа каталитических маркеров на основе кобальтсодержащих золей и субстратов с ализарином S при сходной с пероксидазными конъюгатами чувствительности и специфичности анализа обеспечивает отчетливое различие положительных и отрицательных образцов и позволяет визуально проводить надежный учет результатов теста.

3. Показано, что гидрозоли серебра могут служить альтернативой маркерам на основе коллоидного золота, а дот-иммуноанализ с использованием золей серебра и визуализацией результатов физическим проявлением позволяет выявлять антигены возбудителя чумы в концентрации 5 нг/мл.

4. Отработана технология получения и применения в дот-иммуноанализе высокодисперсного активированного угля. Применение угольных маркеров позволяет создавать простые и быстрые тесты для массового скрининга и исследования индивидуальных серологических образцов, лишь в 2-4 раза уступающие по чувствительности ИФА.

5. Впервые установлено, что импрегнация высокодисперсного активированного угля серебром позволяет повысить чувствительность дотиммуноанализа с его использованием до уровня чувствительности планшетного варианта иммуноферментного теста.

6. Разработаны основы технологии изготовления и применения белковых матриц для одновременного выявления ряда антигенов или антител в многопрофильном дот-иммуноанализе. Показано, что многопрофильный анализ при сходной чувствительности имеет преимущества перед планшетными иммуноферментными тестами по информативности, оперативности, трудоемкости и удельной стоимости. Этот метод допускает как визуальный учет результатов, так и компьютерную обработку оцифрованных данных с помощью специальной программы.

7. Создан прототип набора реагентов для многопрофильного анализа на белковых матрицах, позволяющий одновременно определять до 8 различных аналитов в каждом образце. Набор полностью укомплектован, а его применение не требует энергообеспечения и высокой квалификации оператора.

Список работ, опубликованных то теме диссертации 1. Полтавченко А.Г., Сенькин Ю.И., Караваев В.С. Использование каталитических свойств железосодержащих золей в иммуноанализе // Вопр.

вирусол. – 1997. - № 2. - С. 82-85.

2. Полтавченко А.Г., Лавриненко И.А., Костровский В.Г.,Тузиков Ф.В., Караваев В.С. Применение серебряных иммунозолей для выявления ВИЧантител в микротитровальных планшетах // Вопр. вирусол. – 1997. - № 3. - С. 120-123.

3. Полтавченко А.Г., Караваев В.С., Тузиков Ф.В. Использование золей серебра как маркеров иммуноанализа на микротитровальных планшетах // ЖМЭИ. – 1998. - № 2. - С. 108-111.

4. Полтавченко А.Г., Агафонов А.П., Ничеухина С.П. и др. Использование иммуносуспензий на основе углеродных маркеров для определения антител к вирусу паротита методом поверхностного дот-иммуноанализа // Биотехнология. – 1999. - № 3. - С. 110-113.

5. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Перспективы использования коллоидного серебра как маркера в иммуноанализе // Сибирь-Восток. – 2002. - № 3. – С. 10-12.

6. Полтавченко А.Г., Тузиков Ф.В., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю.

Получение серебряных золей - маркеров для иммуноанализа // СибирьВосток. – 2002. - № 4. - С. 18-20.

7. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Стабилизация коллоидного серебра // Сибирь-Восток. – 2002. - № 6. - С. 17-18.

8. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Проявление золей серебра в микротитровальных планшетах // Сибирь-Восток. – 2002. - № 9. - С. 7-9.

9. Загоскина Т.Ю., Полтавченко А.Г., Докорина А.А., Меринов С.П., Марков Е.Ю., Голубинский Е.П. Обнаружение противобруцеллезных антител в сыворотках крови экспериментальных животных в дот-иммуноанализе с антигенной фракцией бруцелл, маркированной частицами активированного угля // Сибирь-Восток. – 2002. - № 8. - С. 7-9.

10. Полтавченко А.Г., Лавриненко И. А., Костровский В.Г., Полтавченко Д. А., Загоскина Т.Ю. Получение и оценка чувствительности серебряных иммунозолей при постановке иммуноанализа в микротитровальных планшетах // Сибирь-Восток. – 2002. - № 12. - С. 14-17.

11. Zagoskina T.Yu., Markov E.Yu., Nikolaev V.B., Balakhonov S.V., Andreevskaya N.M., Poltavchenko A.G., Dokorina A.A., Golubinsky E.P. The use of silver immunosols for detection of Yersinia pestis antigens in dot immunoassay // The Center for infectious diseases with natural foci. Scientific journal (Mongolia). – 2002. - № 10. - Р. 53-55.

12. Poltavchenko A.G., Poltavchenko D.A., Zagoskina T.Yu. Colloid silver as perspective marker of immunoassay // The Center for infectious diseases with natural foci. Scientific journal (Mongolia). – 2002. - № 10. - Р.84-87.

13. Загоскина Т.Ю., Голубинский Е.П., Меринов С.П., Полтавченко А.Г.

Марков Е.Ю. Современные подходы к конструированию диагностических тест-систем с использованием неорганических корпускулярных меток (обзор) // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2004. - № 1. - т. 2.- С. 175-179.

14. Полтавченко А.Г., Рыбаков А.Н., Надточий О.Н. Изучение гуморального иммунного ответа на белки р17 и p41 Treponema pallidum на ранних стадиях сифилиса // ЖМЭИ. – 2004. - № 3. - С. 52-57.

15. Полтавченко А. Г., Филатов П. В., Яковченко А.М., Рыбаков А. Н. Изучение динамики гуморального иммунного ответа на белки р17, p41 и рTreponema pallidum на ранних стадиях сифилиса // Иммунология. – 2005. - № 5. - С. 101-107.

16. Полтавченко А.Г., Филатов П.В., Зайцев Б.Н. Применение золей на основе соединений Co(II) как маркеров при иммуноанализе в микротитровальных планшетах с визуальным учетом результатов. 1. Получение и проявление кобальтсодержащих иммунозолей // Биотехнология. – 2005. - № 3. - С. 7989.

17. Полтавченко А.Г., Филатов П.В. Применение золей на основе соединений Co(II) как маркеров при иммуноанализе в микротитровальных планшетах с визуальным учетом результатов. 2. Оптимизация условий проведения иммунокаталитичесого анализа // Биотехнология. – 2005. - № 4. - С. 70-77.

18. Полтавченко А.Г., Филатов П.В. Применение золей на основе соединений Co(II) как маркеров при иммуноанализе в микротитровальных планшетах с визуальным учетом результатов. 3. Применение кобальтсодержащих золей в иммунокаталитическом анализе // Биотехнология. - 2005. - № 5. - С. 72-77.

19. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А. Многопрофильная иммунохимическая индикация возбудителей инфекционных заболеваний // Клиническая лабораторная диагностика. – 2006. - № 5. - С. 39-42.

20. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А., Зайцев Б.Н.

Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 1. Выбор формата белковых чипов и материала для изготовления подложки // Биотехнология. – 2006. - № 5. - С. 77-87.

21. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 2. Иммобилизация антигенов на подложке белкового чипа // Биотехнология. - 2007.- № 1. - С. 86-94.

22. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А., Карпышев Н.Н.

Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний.

3. Визуализация результатов анализа // Биотехнология. – 2007. - № 2. – С. 63-71.

23. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 4. Лабораторные испытания многопрофильного теста // Биотехнология. – 2007. - № 3. – С. 88-94.

24. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А., Рыбаков А.Н.

Разработка панели с нормированным содержанием IgG к Treponema pallidum // Вестн. дерматологии и венерологии. – 2007. - № 3. – С. 5-13.

25. Чепурнов А.А., Федосова Н.И., Егоричева И.Н., Полтавченко А.Г., Элх Ф.

Разработка метода экспресс-выявления антител и антигена вируса Эбола // Вопр. вирусол. – 2007. - № 3. – С. 41-43.

26. Дроздов И.Г., Сергеев А.Н., Нетесов С.В. … Полтавченко А.Г. и др.

Практическое руководство. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. / Под редакцией Г.Г. Онищенко. – М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006. - 288 с.

Публикации в материалах конференций 27. Полтавченко А.Г., Зайцев Б.А., Полтавченко Д.А. Перспективы использования каталитически активных неорганических гидрозолей в качестве маркеров иммуноанализа. - В сб. мат. Межрегион. научно-практ.

конф. с международн. участием «Новые химические системы и процессы в медицине» (Новосибирск, 21-22 декабря, 2001 г.). - Новосибирск: СибУПК, 2002. - С. 232-236.

28. А. Г. Полтавченко, А. В. Голубятникова, П.А. Белавин, А. Н. Рыбаков, М.А. Лунев: Изучение динамики гуморального иммунного ответа на белки р17, p41 и р47 Treponema pallidum на ранних стадиях сифилиса. - В сб. тр.

международн. мультидисциплинарного семинара «Прогресс в биотехнологии и нейробиологии – интегративная медицина» (Hurgada, Egypt, February 14-24, 2004.). - М.: МАКС Пресс, 2004. – С. 107.

29. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А., Серпинский О.И.

Иммуночипы для диагностики TORCH-инфекций. - В сб. тр. международн.

мультидисциплинарного семинара «Микробициды для здоровья и репродукции человека, медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций» и международн. конф. «Актуальные вирусные инфекции – теоретические и практические аспекты» (Санкт-Петербург, 2-ноября 2004 года). - М.: МАКС Пресс, 2004. – С. 134-135.

30. Полтавченко А.Г., Кривенчук Н.А., Рыбаков А.Н., Филатов П.В., Яковченко А.М. Панель сывороток с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и р41 Treponema pallidum. - В сб. тр.

международн. мультидисциплинарного семинара «Микробициды для здоровья и репродукции человека, медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций» и международн. конф. «Актуальные вирусные инфекции – теоретические и практические аспекты» (СанктПетербург, 2-5 ноября 2004 года). - М.: МАКС Пресс, 2004. – С. 135-136.

31. Яковченко А.М., Полтавченко А.Г., Кривенчук Н.А., Серпинский О.И.

Использование серебра в многопрофильной иммунодиагностике инфекционных заболеваний. – В сб. материалов научно-практической конф.

с международным участием: «Серебро и висмут в медицине». – Новосибирск: СибУПК, 2005. - С. 68-32. Полтавченко А.Г., Филатов П.В. Применение золей на основе соединений Со(II) как маркеров иммуноанализа с визуальным учетом результатов. - В сб. мат. международн. конф. «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 21-июня 2006 г.). – Ульяновск: ГСХА, 2006. - С. 123-126.

33. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М. Многопрофильная иммунодиагностика инфекционных заболеваний. - В сб. мат. международн. конф.

«Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 21-23 июня 2006 г.). - Ульяновск:

ГСХА, 2006. - С. 126-128.

34. Яковченко А.М., Полтавченко А.Г. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. - В сб. мат. III Российской научн. конф. с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск 27-сентября 2006 г.). - Новосибирск: ЦЭРИС, 2006. - С. 305-306.

35. Полтавченко А.Г. Применение кобальтсодержащих золей как маркеров иммуноанализа с визуальным учетом результатов. – В сб. мат. научнопракт. конф. с международным участием «Нанотехнологии и наноматериалы для биологии и медицины» (Новосибирск, 11-12 октября 2007 г.) /В 2-х томах/. – Новосибирск: СибУПК, 2007. – Том 1. – С. 234-237.

Патенты 1. Полтавченко А.Г., Сенькин Ю.И., Караваев В.С. «Иммунодиагностикум и способ твердофазного иммуноанализа на его основе». - Патент РФ № 2092853, приоритет от 12.10.1992, опул. 10.10.97, Бюл. № 28.

2. Полтавченко А.Г., Серпинский О.И. «Маркер для иммунохимического и гибридизационного анализа». - Патент РФ № 2133469, приоритет от 02.04.1997, опубл. 20.07.99, Бюл. № 20.

3. Полтавченко А.Г., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Полтавченко Д.А.

«Иммунодиагностикум для определения сывороточных антител к инфекционным агентам методом дот-иммуноанализа на пористых стрипах».

- Патент РФ № 2187121, приоритет от 08.02.1999, опубл. 10.08.2002, Бюл.

№ 22.

4. Полтавченко А.Г., Серпинский О.И., Карпышев Н.Н. «Изделие и способ для многопрофильного иммуноанализа сывороток». - Патент РФ № 2242762, приоритет от 31.10.02, опубл. 20.12.2004, Бюл. № 35.

5. Полтавченко А.Г., Кривенчук Н.А., Рыбаков А.Н., Филатов П.В., Яковченко А.М. «Панель сывороток с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и р41 Treponema pallidum и способ ее получения». - Патент РФ № 2275635, приоритет от 03.06.2004, опубл.

27.04.2006, Бюл. № 12.

6. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А., Серпинский О.И., Лунев М.А. «Набор для многопрофильного анализа сыворотки крови с целью одновременного выявления специфических антител к возбудителям TORCH-инфекций методом дот-иммуноанализа». – Патент РФ № 2298795, приоритет от 29.03.04, опубл. 10.05.2007, Бюл. № 13.

7. Полтавченко А.Г., Кривенчук Н.А., Серпинский О.И., Тюнников Г.И.

«Способ многопрофильного иммунохимического выявления антигенов в жидких образцах». - Патент РФ № 2296995, приоритет от 20.06.03, опубл.

10.04.2007, Бюл. № 10.

Список использованных сокращений БАУ – березовый активированный уголь БАУ-Ag – березовый активированный уголь, импрегнированный серебром БСА – бычий сывороточный альбумин ВПГ – вирус простого герпеса ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВККГЛ – вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки ВОВ – вирус осповакцины ВВЭЛ – вирус Венесуэльского энцефаломиелита лошадей ВЭ – вирус Эбола ДАБ (DAB) - диаминобензидин ЗФЦ – золь ферри-фероцианида ЗГЖ – золь гидроокиси железа ЗФГА – золь ферриглицерата аммония ИКА – иммунокаталитический анализ ИКР – индикаторная каталиметрическая реакция ИФА - иммуноферментный анализ К+ - положительный контроль К- - отрицательный контроль м.к. – микробные клетки ОП - оптическая плотность ОПкрит - критическое значение оптической плотности ОСО - отраслевой стандартный образец ПЭГ - полиэтиленгликоль РНГА - реакция непрямой гемагглютинации СКк - золь сульфида кобальта, полученный при избытке катионов СКа - золь сульфида кобальта, полученный при избытке анионов ТББ – тетраборатный буферный раствор ФБ – фосфатный буферный раствор ФКк - золь ферроцианида кобальта, полученный при избытке катионов ФКа - золь ферроцианида кобальта, полученный при избытке анионов ЦМВ – цитомегаловирус a/IgG-Hum – антитела против иммуноглобулинов класса G человека BCIP/NBT - bromo-chloro-indolyl phosphate/ nitro blue tetrasollium GST – глутатион-S-трансфераза IgG – иммуноглобулины класса G SDS – додецилсульфат натрия SpA – белок А Staphylococcus aureus




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.