WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ПЛОТНИКОВА Елена Генриховна

Бактерии-деструкторы ароматических углеводородов

и их хлорпроизводных: разнообразие, особенности метаболизма, функциональная геномика

03.02.03 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Пермь - 2010

Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

чл. – корр. РАН, профессор Демаков Виталий Алексеевич 

доктор биологических наук Евтушенко Людмила Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук  Октябрьский Олег Николаевич

доктор биологических наук Донова Марина Викторовна

доктор медицинских наук  Несчисляев Валерий Александрович

Ведущая организация: Институт микробиологии  им. С.Н. Виноградского РАН, Москва

Защита состоится «__»__________ 2010 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342) 2446711.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан «__ » ___________  2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук  Максимова Юлия Геннадьевна

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.  Проблема очистки наземных и водных экосистем, загрязненных токсичными, устойчивыми к разложению и представляющими опасность для здоровья человека химическими соединениями, занимает центральное место в ряду актуальных задач современной экологии. Среди поллютантов, обладающих канцерогенными и мутагенными свойствами, а также тенденцией к биоаккумуляции, наиболее распространенными являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), бифенил и его хлорированные производные (Hall, Grover, 1999; ATSDR, 2000). ПАУ поступают в окружающую среду с разливами нефти, отходами коксохимических, газоперерабатывающих производств и химических предприятий, образуются при неполном сгорании топлива и бытовых отходов (Seo et al., 2009). Полихлорированные бифенилы  (ПХБ) широко применялись в течение нескольких десятилетий при производстве лакокрасочных материалов, пластификаторов, пестицидов, в электротехнической промышленности. В настоящее время производство и использование ПХБ, как особо стойких органических загрязнителей, запрещено Стокгольмской Конвенцией (http://www.unep/org). Наряду с задачами по восстановлению экосистем, загрязненных этой группой токсикантов, остро стоит проблема детоксикации больших объемов невостребованных коммерческих смесей, созданных на основе хлорбифенилов (Васильева, Стрижакова, 2007; Pieper, Seeger, 2008). Биоремедиация почв и других объектов окружающей среды с использованием микроорганизмов-деструкторов (хлор)ароматических соединений имеет ряд известных преимуществ по сравнению с другими методами экобиотехнологии (Sutherland et al., 1995; Pieper, 2005; Cao et al., 2009).

К настоящему времени обнаружены и описаны бактерии различных эволюционных групп, способные разлагать нафталин, фенантрен, антрацен, другие высокомолекулярные ПАУ (Боронин и др., 1989; Бабошин и др., 2005; Kanaly, Harayama, 2000; Jones et al., 2003; Reng et al., 2008). Способность к трансформации ПХБ описана для широкого круга бактерий – протеобактерий (Acinetobacter, Alcaligenes, Cupriavidus, Pseudomonas, Sphingomonas), актинобактерий (Rhodococcus, Arthrobacter), споровых (Bacillaceae) (Bedard, Haberl, 1990; Furukawa, Fujihara, 2008; Pieper, Senger, 2008). Однако известны лишь единичные штаммы, исключительно представители протеобактерий (Burkholderia, Enterobacter, Pseudomonas и Ralstonia), которые могут полностью разлагать моно- и дихлорбифенилы  (Kim, Picardal, 2001; Adebusoye et al., 2008).

Большинство известных штаммов-деструкторов трансформируют ПХБ до соответствующих хлорбензойных кислот (ХБК). Последующие этапы деградации хлорбензоатов в ПХБ-деградирующих микробных системах осуществляют обычно другие группы организмов (Unterman, 1996). Среди них значительная роль принадлежит бактериям, осуществляющим отщепление галогена на первых этапах разложения хлорбензоатов, в результате чего образуются менее токсичные соединения, доступные для использования в качестве субстрата для многих почвенных микроорганизмов (Карасевич, 1982;  Scholten et al., 1991; Fetzner, 1998; Field, Sierra-Alvarez, 2008).

Развитие молекулярно-генетических методов и исследования в области структурной и функциональной геномики бактерий-деструкторов способствовало пониманию молекулярных механизмов биодеградации вышеназванных соединений. Показано, что генетические детерминанты (гены/опероны) бактериальной деструкции ПАУ, бифенила/ПХБ и ХБК локализованы в хромосоме и высокомолекулярных плазмидах, и могут присутствовать в клетке в нескольких копиях  (Boronin, 1992; Sanseverino et al., 1993; Reineke, 1998; Shimizu et al., 2001; Dennis, Zylstra, 2004; Basta et al., 2005; Chain et al., 2006; Iwasaki et al., 2006). Имеются сведения о горизонтальном переносе генов биодеградации в составе мобильных генетических элементов (плазмид, транспозонов, интегронов), в том числе между бактериями различных филогенетических групп (Fulthorpe, Campbell, 1992; Herrick et al., 1997; Nishi et al., 2000; Gartemann, Eichenlaub, 2001; Habe, Omori, 2003; Reng et al., 2008). Установлена важная роль диоксигеназ на начальных  этапах  аэробной деструкции ПАУ и бифенила/ПХБ (McKay et al., 1997; Gibson, Parales, 2000; Seeger et al., 2001; Jakoncic et al., 2007; Schuler et al., 2009). Ферменты этой группы способны осуществлять трансформацию многих полиароматических соединений, что определяет их важную роль в развитии различных биотехнологий (Harayama, 1997; Boyd et al., 2001; Bamforth, Singleton, 2005; Shindo et al., 2007; Cao et al., 2009).

Функциональные особенности бактерий-деструкторов в комплексе с данными по структурной и функциональной геномике находятся в фокусе внимания современной микробной экологии, а также активно развивающейся системной биологии. Концепции системной биологии и синергия экологических подходов и технологий геномики, метагеномики, протеомики и метаболомики являются, с точки зрения современной науки, наиболее перспективным подходом к пониманию механизмов адаптации и (микро)эволюции индивидуальных микроорганизмов и микробных сообществ к условиям изменяющейся природной среды, особенно в условиях многофакторного негативного воздействия (Trigo  et al., 2009). Изучение микроорганизмов, обитающих в определенных эколого-географических условиях и подверженных одновременному воздействию различных антропогенных факторов (в т.ч. высокий уровень токсичных поллютантов и повышенная минерализация среды), вызывает особый интерес. Актуальность таких исследований, наряду с теоретическими аспектами, обусловлена также и практическими задачами экобиотехнологии. Основной среди них является разработка новых стратегий биоремедиации, в том числе в связи с неэффективностью технологий, созданных на основе не адаптированных к соответствующим условиям микроорганизмов.

Имеющиеся сведения о микроорганизмах, способных к деструкции полиароматических углеводородов в условиях высокой  солености, немногочисленны и касаются, в основном, грамотрицательных или «морских» бактерий родов Pseudomonas, Сycloclasticus, Vibrio, Lutibacterium, Neptunomonas (Garsia-Valdes et al, 1988; Dyksterhouse et al., 1995; Geiselbrecht et al., 1998; Hedlud et al., 1999, 2001; Chung, King, 2001; Kasai et al., 2002; Garca et al., 2005; Abed et al., 2006), а также спорообразующих бактерий (Paenibacillus) (Daane et al., 2002). Крайне слабо изучены механизмы адаптации бактерий к таким условиям существования (Roberts, 2005; Oren, 2008), а также взаимодействия внутри микробных сообществ: регуляция их состава, метаболической активности и  устойчивости к высокому содержанию солей. До начала наших работ практически отсутствовали сведения о разнообразии и функциональных особенностях грамположительных бактерий - резидентов наземных экосистем, в которых ведущими факторами формирования микробиоценозов являются соленость среды и токсичный поллютант. Все вышесказанное определяет актуальность и перспективность фундаментальных и прикладных исследований в этом направлении.

        Цель и задачи исследования. Целью работы было исследование таксономического, генетического, функционального разнообразия аэробных бактерий-деструкторов ПАУ и ПХБ, а также создание и изучение бактериальных штаммов и ассоциаций с заданным биодеградативным потенциалом.

Основные задачи исследования:

  1. Выделение бактерий-деструкторов нафталина, фенантрена, бифенила/ПХБ, ХБК из почв/грунтов, загрязненных отходами химических и соледобывающего производств.
  2. Изучение генотипических и фенотипических характеристик изолятов и определение их таксономического положения с использованием принципов полифазной таксономии.
  3. Характеристика экологических особенностей и биодеградативного потенциала выделенных бактерий.
  4. Изучение разнообразия ключевых генов деструкции нафталина, бифенила/ПХБ и ХБК у бактерий.
  5. Конструирование метаболических путей деструкции хлорированных соединений на уровне бактериальной клетки и ассоциации бактерий.
  6. Выделение и изучение галотолерантных нафталинметаболизирующих консорциумов бактерий.

Научная новизна. Получены новые сведения о разнообразии микробных  сообществ, обитающих в условиях повышенной солености, высокого уровня загрязнения среды токсичными поллютантами. Детально охарактеризовано 90 штаммов-деструкторов ПАУ, бифенила/ПХБ и ХБК - представителей классов  Proteobacteria (роды Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium), Actinobacteria (Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas, Microbacterium, Rhodococcus, Dietzia, Janibacter, Kocuria, Streptomyces) и семейства Bacillaceae (Bacillus, Paenibacillus). Выявлены бактерии, разлагающие токсиканты в широком диапазоне температур (от +4 до 40С), рН среды (от 5 до 9) и при повышенной солености среды (до 90 г/л NaCl). Впервые описаны грамположительные бактерии, осуществляющие полное разложение ряда моно- и дихлорбифенилов: Microbacterium sp. В51 – ортомоно(ди)ХБ; Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896) – (орто)пара-моноХБ и 2,4’диХБ. Впервые выделены в культуру и охарактеризованы галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ (нафталина и фенантрена), относящиеся к родам Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas. На основании филогенетической обособленности и фенотипических отличий от ближайших таксонов валидно описаны новый род Salinicola, включающий вид S. socius, а также новые виды рода Brevibacterium – В. permense, B. antiquum и В. aurantiacum; выявлены новые виды «Rhodococcus naphthalenivorans» sp. nov., «Thalassospira permensis» sp. nov. и ряд других видов.

Обнаружены и изучены ключевые гены начального этапа разложения бифенила/ПХБ у бактерий-деструкторов родов Arthrobacter, Janibacter, Rhodococcus. Впервые клонированы и изучены fcb-гены A. globiformis КЗТ1,  контролирующие  гидролитическое дегалогенирование 4ХБК. Путем клонирования fcb-генов в клетки P. putida впервые сконструирован рекомбинантный путь полной деградации 4ХБК, более эффективный в отношении утилизации субстрата в сравнении с природными штаммами. В результате селекции на высоких концентрациях 4ХБК рекомбинантного штамма P. putida КЗ-6R (pPC3) получены супердеструкторы 4ХБК. Впервые у бактерий рода Rhodococcus обнаружены и охарактеризованы fcb-гены, кодирующие компоненты 4ХБК-дегалогеназы. Клонированы и изучены новые ohb-гены P. aeruginosa 142, контролирующие окислительное орто-дегалогенирование 2-/2,4-хлорбензоатов. ohb–Гены фланкированы IS1396-подобными последовательностями, содержащими предполагаемые гены транспозазы А (tnpA) и ДНК топоизомеразы I/III (top).

Впервые выделены и исследованы ассоциации бактерий, способные к росту и утилизации нафталина в условиях высокой солености среды (до 8 - 9 % NaCl). Показано, что в состав ассоциаций входят галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ порядка Actinomycetales, а также галотолерантные и умеренно галофильные бактерии, не способные к разложению нафталина. Экспериментально подтверждено присутствие протокооперативных взаимоотношений в консорциуме SMB3 между деструкторами нафталина и бактериями-спутниками. Впервые получены данные о положительном влиянии экзогенных осмопротекторных соединений, продуцируемых галофильными/галотолерантными бактериями исследуемых микробных ассоциаций, на разложение ПАУ штаммами-деструкторами в условиях повышенной солености среды. Для представителей рода Rhodococcus (деструкторов нафталина из консорциума SMB3) впервые описана комбинация осмопротекторов: глутамат, эктоин и гидроксиэктоин.

На основе выделенных и детально охарактеризованных штаммов-деструкторов ПХБ и ХБК предложены и экспериментально обоснованы новые подходы к созданию бактериальных ассоциаций, способных эффективно осуществлять утилизацию  различных конгенеров ПХБ (как индивидуальных, так и в составе коммерческих смесей).

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные о способности аэробных бактерий разлагать ароматические соединения при повышенной солености среды расширяют представления о системах биодеградации ПАУ и могут быть использованы для создания новых эффективных биотехнологий восстановления окружающей среды. Выделенные и детально охарактеризованные уникальные штаммы-деструкторы ПХБ, в частности, Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896)  (Патент РФ №2262531), могут применяться для восстановления почв и водоемов, загрязненных ПХБ, а также в технологиях детоксикации промышленных смесей, содержащих  хлорбифенилы. Полученные путем селекции галотолерантные нафталинметаболизирующие консорциумы являются перспективными для биоремедиации загрязненных ПАУ почв и водоемов в условиях засоления. Данные по механизмам функционирования консорциумов  могут быть использованы для усовершенствования методов биоремедиации засоленных экосистем. Результаты изучения D-плазмид галотолерантных бактерий-деструкторов найдут применение при конструировании рекомбинантных штаммов для создания биотехнологий ремедиации антропогенных экосистем. 

Конструирование рекомбинантного пути полной деградации 4ХБК в клетках P. putida определило новые подходы к созданию штаммов микроорганизмов, способных к эффективной деструкции и/или детоксикации различных ксенобиотиков-поллютантов. Полученные рекомбинантные штаммы и плазмиды, содержащие fcb- и ohb-гены, были использованы в совместных исследованиях в  Центре микробной экологии Мичиганского университета (г. Лансинг, США). На основе fcb- и ohb-генов был создан ряд генноинженерных штаммов, осуществляющих полную утилизацию орто- и пара-хлорбифенилов. Полученные рекомбинантные штаммы-деструкторы хлорированных бензойных кислот и бифенилов могут быть использованы при создании инновационных технологий защиты окружающей среды от токсичных галогенароматических соединений.

Новые данные о разнообразии бактерий и генетическом потенциале микробного сообщества района солеразработок (г. Березники, Пермский край) являются основой для разработки критериев мониторинга этого уникального микробиоценоза. Результатом изучения таксономического разнообразия явились  усовершенствованные системы классификации и идентификации бактерий ряда  групп - важными для микробиологической практики и в связи с вопросами интеллектуальной собственности. 

Создана обширная рабочая коллекция бактерий-деструкторов (галоген)арома-тических соединений и галотолерантных/галофильных бактерий, доступных для фундаментальных и научно-прикладных исследований специалистами разного профиля. Большинство штаммов включены в фонд Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ, ИБФМ, г. Пущино) и Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (ИЭГМ УрО РАН, г. Пермь). Дубликаты типовых штаммов описанных новых видов депонированы в ВКМ и Биологических ресурсных центрах мира (в Германии, Бельгии, Франции, Японии), а также включены в международную  поисковую систему Straininfo (http://www.straininfo.net). Сведения о последовательностях генов 16S рРНК и функциональных генов (fcb, ohb, har, bph) штаммов-деструкторов включены в GenBank (Национальный центр биологической информации, США; http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) и сопряженные базы данных (EMBL, DDBJ, EzTaxon) других стран. 

Материалы диссертации используются в лекционных курсах Биологического факультета (на Кафедрах микробиологии и иммунологии; ботаники и генетики растений) Пермского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Бактерии родов Arthrobacter, Rhodococcus, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas преобладают среди культивируемых аэробных галотолерантных бактерий-деструкторов ПАУ из микробиоценозов района разработок Верхнекамского месторождения солей (г. Березники, Пермский край). Бактерии содержат разнообразные генетические детерминанты (D-плазмиды, гены/опероны), контролирующие ключевые этапы разложения нафталина и фенантрена.
  2. Полное разложение ряда моно- и дихлорбифенилов (феномен ранее не известный для грамположительных бактерий) осуществляют штаммы  Microbacterium sp. В51 [(орто-моно(ди)ХБ] и Rhodococcus ruber Р25 [(орто)пара-моноХБ и 2,4’диХБ]. Другие активные штаммы бактерий характеризуются разной окислительной способностью по отношению к орто- и пара-хлорированным бифенилам. Бактерии-деструкторы моно(ди)хлорбифенилов, относящиеся к родам Arthrobacter, Rhodococcus, Janibacter и Pseudomonas, содержат  структурно различающиеся гены, контролирующие начальный этап разложения бифенила/ПХБ.
  3. Впервые клонированы и изучены fcb-гены A. globiformis KЗТ1, контролирующие  реакцию гидролитического дегалогенирования 4ХБК. В клетках P. putida с использованием fcb-генов сконструирован рекомбинантный путь полной деградации 4ХБК и получены супердеструкторы, характеризующиеся  высокой стабильностью признака утилизации этого соединения. Клонированы и охарактеризованы новые ohb-гены P. aeruginosa 142, контролирующие окислительное орто-дегалогенирование 2-/2,4-хлорбензоатов.
  4. В условиях повышенной солености среды (до 8-9% NaCl) эффективная деструкция и утилизация в качестве источника углерода нафталина может осуществляться консорциумами бактерий, включающими галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ порядка Actinоmycetales, а также галотолерантные и умеренно галофильные бактерии, не способные к разложению нафталина. В галотолерантных нафталинметаболизирующих ассоциациях микроорганизмов присутствуют протокооперативные взаимоотношения.
  5. В составе микробиоценозов района разработок Верхнекамского месторождения солей присутствуют галофильные и галотолерантные бактерии новых таксонов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 110 печатных работ, включая 24 экспериментальные статьи в реферируемых зарубежных, центральных и региональных журналах, 1 обзор, 1 патент, 1 учебное пособие (в соавторстве), 12 статей в сборниках научных статей, 70 тезисов докладов и сообщений на российских и международных конференциях и симпозиумах.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 310 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц и 50 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав экспериментальных исследований, отражающих результаты исследований, а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 560 литературных источников, из них 60 на русском и 500 на английском языках. В Приложении приведены нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и функциональных генов (fcb, ohb, har, bph) исследуемых штаммов, депонированных в международной базе данных GenBank.

Связь работы с крупными научными программами. Работа выполнена в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН, тема «Биохимические и генетические системы трансформации сложных органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологии» (№ гос. рег. 0120.0406511), а также в рамках Программ фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные основы воспроизводства и оптимизации генофондов растений, животных и человека»;  Программы интеграционных фундаментальных исследований Президиума УрО РАН, выполняемых в содружестве с учеными СО РАН; проектов РФФИ №000449056-а, №02-04-49043-а, РФФИ-Урал №02-04-96404_а, №04-04-96042_а, №070496078_а,  №070497625р_офи.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены и обсуждены на международных симпозиумах и конференциях: III Международном симпозиуме «Pseudomonas» (Триест, 1991), Конференции Американского общества микробиологов «Анаэробное  дегалогенирование» (Атенс, 1992), Съездах Американского общества микробиологов (1993; 1994; 1996), X Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Париж, 2002), I Конгрессе Европейского микробиологического общества (Любляна, 2003), Международных конференциях «Загрязнение окружающей среды» (Москва, 1998; Волгоград-Пермь, 2001; Пермь, 2008), IV и V Международных семинарах-презентациях инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2000» и «Биотехнология-2001» (Пущино, 2000; 2001), Международном семинаре «Научно-технический потенциал Западного Урала в области конверсии военно-промышленного комплекса» (Пермь, 2001), Международном Байкальском симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2003), Международной конференции «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и растений с техногенными загрязнителями окружающей среды» (Саратов, 2003), II и III Международных конференциях «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь, 2005; 2008), Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), IV и V Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005, 2007), Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007), Международных научных конференциях «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2004, 2008), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), Международной научной конференции «Актуальные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Кишинев, 2009) и других.

Благодарность. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному консультанту, заведующему лабораторией химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН, чл.-корр. РАН В.А. Демакову - за многолетнюю помощь и поддержку при выполнении работы; научному консультанту, заведующей отделом ВКМ Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, д.б.н. Л.Н. Евтушенко - за консультативную помощь при выполнении таксономических исследований. Автор признателен коллегам лаборатории, участвовавшим в проведении исследований, чей вклад отражен в совместных публикациях - к.б.н. О.В. Ястребовой, к.б.н. Д.О. Егоровой, к.б.н. Л.Н. Ананьиной, к.б.н. Е.С. Шумковой, к.б.н. А.В. Назарову, а также другим сотрудникам ИЭГМ УрО РАН, способствовавшим успешному выполнению работы. Особую благодарность автор выражает Т.В. Цой и О.В. Мальцевой; сотрудникам ИБФМ РАН к.б.н. И.А. Кошелевой, д.б.н. Л.А. Головлевой, д.б.н. И.П. Соляниковой и другим сотрудникам института за искреннюю поддержку и всестороннюю помощь в проведении исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Микроорганизмы и плазмиды. Исследуемые бактериальные штаммы были изолированы из образцов почв, грунтов и донных отложений, отобранных с трех локальных территорий, загрязненных отходами предприятий химической промышленности, территории завода конденсаторов г. Серпухова Московской области; территории предприятия ОАО «Галоген» г. Перми; производственных площадок соледобывающего производства ОАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край). При изучении генетических систем раннего дегалогенирования ХБК использовали штаммы Arthrobacter globiformis КЗТ1, P. putida КЗ6 (Зайцев, Карасевич, 1981, 1984, 1985), P. aeruginosa 142 (Романов и др., 1993), а также P. putida mt-2 (Bagdasarian et al., 1981) и Pseudomonas sp. B13 (Dorn et al., 1974). Для проведения генетических исследований (определение размера Dплазмид, конъюгационные эксперименты) штаммы P. putida BS394 (cys-, nah-, sal-), P. putida PpG7 (Dunn, Gunsalus, 1973) и pRK2013,  NPL-1, NAH7, pASN1, pDK8 были получены из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН. При клонировании и изучении функциональных генов использовали рекомбинантные штаммы E. coli: JM109 (Yanish-Perron et al., 1985), DH5F' («Bethesda Research Laboratories», США), 925 (F+ minA minB thr leu thi) (Stoker et al., 1984) и векторные плазмиды pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985), BlueScript («Stratagene», США), pSP329 (Schmidhauser, Helinski, 1985), pRK415(Keen et al., 1988). Для сравнительного изучения использовали типовые культуры из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ РАН, г. Пущино), Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (ИЭГМ УрО РАН, г. Пермь) и из зарубежных коллекций.

Методы. Для выделения и роста бактерий-деструкторов были использованы жидкие и агаризованные минеральная среда К1 (Зайцев, Карасевич, 1981) и минеральная среда Раймонда (Розанова, Назина, 1982). В качестве полноценных сред использовали среду LB (Маниатис и др., 1984), а также модифицированную среду Раймонда при добавлении 5 г/л триптона и 2.5 г/л дрожжевого экстракта в качестве ростовых субстратов. Чистые культуры бактерий хранили в глицерине при -80°С и в лиофильно высушенном  состоянии. Для получения биомассы с целью измерения активностей и очистки ферментов проводили культивирование бактерий в среде К1 методом периодического культивирования, используя нафталин, фенантрен, салицилат, 4ХБК в качестве единственного источника углерода и энергии. Определение количества биомассы проводили спектрофотометрически при =540 нм. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли методом серийных разведений с последующим высевом и подсчетом колоний бактерий на чашках с полноценной агаризованной средой. Кинетические характеристики растущей периодической культуры определяли согласно рекомендациям (Перт, 1978).

Морфологические и физиолого-биохимические признаки бактерий изучали по стандартным методикам (Методы общей бактериологии, 1983). Состав аминокислот и сахаров в препаратах клеточных стенок (Schleifer, Kandler, 1972) определяли хроматографически (Suzuki et al., 1993). Определение состава жирных кислот целых клеток и хинонов определяли с использованием методов ГЖХ и масс-спектрометрии (Zhilina et al., 1997; Suzuki et al., 1993).

Выделение тотальной ДНК проводили методом, описанным (Current protocols in molecular biology, 1995). Нуклеотидный состав ДНК определяли по температуре ее тепловой денатурации (Owen, Lapage, 1976). Выявление клонов и предварительную группировку штаммов бактерий осуществляли методами ДНК типирования (REP-ПЦР, BOX-ПЦР и ARDRA) как описано ранее (Versalovic et al. 1994; Scortichini et al., 2002). Амплификацию 16S рРНК генов проводили по описанным методам с использованием универсальных бактериальных праймеров (Weisburg et al., 1991). Определение нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и функциональных генов проводили с применением набора реактивов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе MegaBASE 1000 в соответствии с рекомендациями производителя («JSC GE Healthcare», США). Для филогенетического анализа использовали последовательности 16S рРНК генов, депонированные  в GenBank (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzTaxon (http://www.eztaxon.org).  Последовательности 16S рРНК генов выравнивали с помощью программы Clustal W (Thompson et al., 1994). Построение филогенетических древ производили с помощью пакета программ Treecon (Van de Peer, DeWachter, 1994).

Плазмидную ДНК выделяли стандартными (Marco et. al., 1982; Бабыкин и др., 1984) и оригинальными методами. Электрофорез в агарозном геле, обработку ДНК эндонуклеазами рестрикции, щелочной фосфатазой,  нуклеазой  Bal31, фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I E.coli,  лигазой фага Т4 проводили в соответствии с рекомендациями (Маниатис и др., 1984). Коньюгационный перенос плазмидной ДНК осуществляли, используя модифицированный метод (Dunn, Gunsalus, 1973). Элиминация бактериальных плазмид проводилась согласно стандартной методике (Rheinwald et al., 1973). Трансформацию плазмидных ДНК в клетки E. coli  и P. putida осуществляли по общепринятой методике (Dagert, Ehrlich, 1979), а также методом электропорации на приборе E. coli Gene Pulser («Bio-Rad Laboratories», США). Клонотеки генов A. globiformis КЗТ1 и P. aeruginosa 142 конструировали при использовании плазмидных векторов pUC19, BlueScript, pSP329 в клетках E. сoli JM109 и E. сoli DH5F'. Для обнаружения рекомбинантных клонов, содержащих fcb- и ohb-гены, использовали оригинальные подходы с применением методик (Резников и др., 1970; Parke, 1992). Реакцию ник-трансляции, перенос ДНК на нитроцеллюлозные фильтры, гибридизацию ДНК-ДНК осуществляли по (Rigby et al., 1977; Southern, 1975). Получение мини-клеток E.coli  и включение 35S-метионина проводили в  соответствии  с  рекомендациями  (Stoker et al.,1984). Электрофорез белков проводили по (Laemmli, 1970), используя 12.5% полиакриламидный гель. 

Структуру ассоциации бактерий SMB3 исследовали методом ДГГЭ фрагментов гена 16S рРНК, амплифицированных с применением эубактериальных праймеров 27F и 518R (Tiirola et al., 2002). Электрофорез был выполнен на DcodeTM Universal Mutation System («Bio-Rad Laboratories», США) согласно протоколу (Muyzer et al., 1993)

Для амплификации fcb-генов использовали праймеры, сконструированные на основе гомологичных последовательностей fcb-генов штамма A. globiformis КЗТ1 (Rodrigues et al., 2001). При изучении bph-генов штаммов деструкторов бифенила/ПХБ применяли вырожденные праймеры, подобранные к участкам генов, кодирующих -субъединицы известных ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ (Witzig et al., 2006).

Продукты бактериального разложения ПАУ и 4ХБК определяли методами ТСХ и ВЭЖХ. Анализ метаболитов деструкции ПХБ проводили спектрофотометрически при длине волны 390  450 нм и методом ВЭЖХ (Maltseva et al., 1999). Динамику дегалогенирования ПХБ и ХБК контролировали по содержанию ионов хлора в культуральной жидкости, освобожденной от клеток (Резников и др., 1970).

Определение активности ферментов проводили спектрофотометрически. Удельные активности нафталин и фенантрен диоксигеназ определяли согласно (Dua, Meera, 1981), салицилат и 1гидрокси-2-нафтоат гидроксилаз - (Кiyohara, Nagao, 1978), катехол 2,3- и 1,2-диоксигеназ - (Feist, Hegeman, 1969 и Ornston, 1966), гентизат диоксигеназы - (Crawford et al., 1975). Единицу активности определяли как количество фермента, катализирующее превращение 1 мкМ субстрата или образование 1 мкМ продукта в минуту. Относительную активность рассчитывали, принимая за 100% активность с незамещенным субстратом. Концентрацию белка определяли по модифицированному методу Брэдфорда (Schlomann et al., 1990).

Выделение осмопротекторов проводили из галофильных и галотолерантных бактерий, выращенных в минеральной среде Раймонда с разной соленостью и глюкозой в качестве субстрата. Спектры ЯМР регистрировали на импульсном Фурье-спектрометре ЯМР типа WP80SY («Bruker», Германия) (Хмеленина и др., 2000).

Повторность экспериментов, как минимум, трехкратная. При статистической обработке определяли среднюю арифметическую, стандартное отклонение, доверительный интервал, достоверность результата. Для обработки результатов использовали статистический модуль Exсel 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

       1. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов 

Методом накопительного культивирования из техногеннозагрязненных почв, грунтов и донных отложений было выделено 240 штаммов-деструкторов нафталина и фенантрена, из них детально охарактеризовано 48 штаммов. Данные анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, морфологических, физиолого-биохимических и хемотаксономических особенностей изолятов позволили установить их принадлежность родам Arthrobacter, Brevibacterium, Dietzia, Kocuria, Rhodococcus, Streptomyces, Janibacter, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas. Ниже приводятся характеристики 3-х групп бактерий-деструкторов ПАУ: актинобактерий порядка Actinomyсetales (роды Arthrobacter и Rhodococcus); спорообразующих бактерии родов Bacillus и Pаenibacillus; протеобактерий рода Pseudomonas. Ряд этих бактерий входит в состав нафталинметаболизирующих комплексов (см. раздел 4.1.).

    1. Бактерии-деструкторы рода Arthrobacter

Результаты генотипирования 9 штаммов рода Arthrobacter, выделенных из  почв района солеразработок, показали, что штаммы B901, B904, B905 составляют одну геномогруппу. Штаммы SF27, DF14, SN17, SMB145 и SMB11 отличаются как от данной группы, так и между собой по BOX-ДНК профилям. Пять штаммов (B905, SMB11, SMB145, SF27 и DF14) были наиболее близки по нуклеотидным последовательностям 16S рРНК генов с типовым штаммом вида A. сrystallopoietes (уровень сходства 99.7%), а SN17 - с типовым штаммом вида  A. arilaitensis (уровень сходства 99.8%). На рисунке 1 представлена дендрограмма, отображающая положение исследуемых штаммов в системе рода Arthrobacter.

Большинство исследуемых артробактерий являются галоалкалотолерантными организмами: растут при щелочных значениях рН (до 9.0), а также в присутствии до 110 г/л NaCl на полноценных средах и до 60 г/л соли на минеральной среде с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии. Штаммы SMB145 и В905 растут на нафталине в присутствии до 90 г/л NaCl, а штамм SF27 - на фенантрене при содержании до 60 г/л соли.

Рис. 1. Филогенетическое древо, построенное с использованием метода “neighbor-joining”, отображающее положение исследуемых штаммов в системе рода Arthrobacter. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap”анализа 1000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 50%).

У бактерий выявлены разнообразные пути метаболизма ПАУ. Штаммы B901, B904, B905, SMB11 и SMB145 осуществляют катаболизм нафталина с образованием салицилата и катехола как ключевых интермедиатов. Анализ деструктивных особенностей другой группы штаммов (штаммов SF27, DF14 и SN17) указывает на наличие у них двух путей разложения салицилата - через катехол и гентизат (Yen, Serdar, 1988; Grund et al., 1992). Штаммы SF27 и DF14 эффективно растут на фенантрене и возможных продуктах его метаболизма – 1гидрокси-2-нафтоате и орто-фталате. Три других штамма B901, B904 и SMB11 способны к слабому росту на фенантрене и не растут на орто-фталате. На основании анализа метаболитов и изучения ферментативных активностей можно предположить, что утилизация фенантрена штаммами SF27 и DF14 идет по ортофталатному пути, как описано для нескольких деструкторов рода Arthrobacter (Бабошин и др., 2005; Seo et al., 2006), а штаммы SMB11, B901 и B904 осуществляют деструкцию фенантрена с образованием 1-гидрокси-2-нафтоата, 1,2дигидрокси-нафталина и салицилата при участии ферментов пути утилизации нафталина (Iwabuchi, Harayama, 1998). Штаммы SN17, В905, B901 и B904 обладают широкой субстратной специфичностью и способны к деструкции не только нафталина, фенантрена, но и бифенила, фенола, алифатических углеводородов.

Результаты исследований на наличие экстрахромосомальной ДНК показали, что штамм SN17 содержит плазмиду размером ~85 т.п.н., в штаммах DF14 и SF27 зарегистрированы плазмиды размером ~120 т.п.н., в штаммах B901, B904 и B905 – размером ~100 т.п.н. При обработке клеток штамма SF27 митомицином С были получены элиминанты, которые не росли на нафталине, фенантрене и 1гидрокси2-нафтоате, но сохраняли способность к росту на салицилате. Полученные данные позволяют предположить, что ферменты первичной атаки ароматического кольца фенантрена и 1-гидрокси-2-нафтоата, а также ферменты утилизации нафталина до салицилата у штамма SF27, кодируются плазмидными генами. Факт локализации генов, ответственных за разложение ароматических соединений, в плазмидах описан для многих бактерий (Hayatsu et al., 1999; Eaton, 2001; Sandu et al., 2005).

 

Рис. 2. Электрофореграммы плазмидных ДНК: (А) 1 – рВ905; 2 – NAH7 (83 т.п.н.); 3 – –pB904; 4 – pB901. (Б) 1 – рSF27; 2 – рDF14; 3 – рSN17; 4 – NAH7 (83 т.п.н.).

  1  2 3 4  1 2  3 4

  А В

1.2. Бактерии-деструкторы рода Rhodococcus

Исследовано двенадцать бактерий-деструкторов рода Rhodococcus, одиннадцать из которых выделены из района солеразработок. По результатам типирования выявлено пять геномогрупп, и у десяти штаммов определены нуклеотидные последовательности 16S рРНК генов. Анализ фрагментов генов 16S рРНК размером около 560 п.н. этих бактерий с аналогичными  последовательностями типовых штаммов рода Rhodococcus показал 100% сходство со штаммами R. wratislaviensis 13082 T (штаммы G10, B13, В14),  R. ruber DSM 43338T (штаммы DB11, SN31), R. erythropolis ATCC 4277T (штамм I25). Штаммы SMB37, B2-1 и B1-4, по всей вероятности, относятся к новому виду, наиболее близкому к R. pyridinivorans  (уровень сходства 97.3%), а штамм SMB38 скорее всего представляет новый вид, близкий к R. marinonascens (уровень сходства 98.9%).

Все родококки, выделенные из накопительных культур при повышенной солености среды (30-60 г/л NaCl), способны расти при содержании хлорида натрия до 90-120 г/л в полноценной среде и до 60-90 г/л - в минеральной среде с нафталином. Штаммы SMB37, SMB38, B2-1, B13, B14 и B1-4 растут в пределах рН 6.0-9.0, штаммы G10, I17, I17а - при рН 7.0-9.0, штаммы I25, I31 - при рН 7.0-8.0 и штамм SN31 – при рН 6.0-7.0.

Бактерии росли на нафталине, бифениле, салицилате, гентизате и протокатехате в качестве источника углерода, большинство из них способны расти на бензоле, толуоле, феноле, бензоате и дизельном топливе.  Штаммы SMB37, B21, B13, B14 и B14 осуществляли разложение хлорароматических соединений  (ХБК и 2,4-Д). Рост штаммов на салицилате и гентизате дает основание предполагать, что разложение нафталина изученными штаммами осуществляется по гентизиновому пути, описанному для ряда представителей этого рода (Grund et al., 1992; Di Gennaro et al., 2001; Kulakov et al., 2005).

У двух изученных штаммов были обнаружены плазмиды разного размера (рис. 4): у SN31 – одна плазмида (~100 т.п.н), а у G10 - две плазмиды (~85 т.п.н. и 70 т.п.н.). В то же время, необнаружение плазмид у других изученных штаммов родококков не дает основания считать, что экстрахромосомальная ДНК у них  отсутствует, так у представителей этого рода плазмиды часто имеют значительно большую молекулярную массу и для их выявления необходимо использование специальных методов выделения и детекции (Shimizu et al., 2001).

1.3. Спорообразующие бактерии родов Bacillus и Paenibacillus

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК генов семи спорообразующих штаммов из района солеразработок показал, что штаммы I12b, I23 и I27 являются представителями разных 16S рРНК-групп рода Bacillus (Ash et al., 1991) (рис. 3). Штаммы I23 и I27 входят в кластер «B. pumilus» (уровни сходства 100% и 99.3%, соответственно, с B. pumilus DSM27T). Штамм I12b наиболее близок к B. hwajinpoensis SW-72T (уровень сходства 98.8%). Полученные данные не позволяют однозначно отнести ни один из вышеперечисленных штаммов к какому-либо известному виду; два из них (I12b и I27), по всей вероятности, представляют собой новые виды. Анализ генов 16S рРНК штаммов I10b и SN501 выявил принадлежность штаммов к роду Paenibacillus (рис. 3), виды которого ранее входили в одну из филогенетических групп  Bacillus (Ash et al., 1993). Штамм I10b наиболее близок к P. amylolyticus NBRC 15957T (уровень сходства 16S рРНК генов 99.8%), а штамм SN501 - c P. naphthalenovorans PR-N1T (уровень сходства 99%).

Бактерии являются галоалкалотолерантными организмами, способны к росту в щелочных условиях (до pH 9.0) и при содержании 90-110 г/л NaCl в среде культивирования. Утилизируют дизельное топливо, ряд индивидуальных ароматических и алифатических углеводородов. Paenibacillus sp. SN501 обладает широкой субстратной специфичностью: растет на нафталине, фенантрене, салицилате, орто-фталате, а также феноле и октане. Так как штаммы-деструкторы SN501 и I10b не растут на гентизате и 2метилсалицилате, и не образуют полуальдегид оксимуконовой кислоты (продукт мета-расщепления катехола), можно предположить, что деструкция салицилата данными штаммами осуществляется с образованием катехола и расщеплением последнего по орто-пути (Mutzel et al., 1996; Alquati  et al., 2005). Paenibacillus sp. SN501 растет в минеральной среде с нафталином как единственном источнике углерода и энергии при концентрации соли в среде культивирования до 50 г/л.

Рис. 3. Филогенетическое древо, построенное с использованием метода “neighbor-joining”, отображающее положение исследуемых штаммов в системе родов Bacillus и Paenibacillus. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrapанализа” 1000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 80%).

1.4. Бактерии-деструкторы рода Pseudomonas

       Грамотрицательные бактерии-деструкторы (штаммы SN11, SN21, SN101, DN13, G51) были выделены при культивировании на минеральной среде К1 с нафталином в качестве источника углерода, без добавления NaCl. У штаммов G51, DN13 и SN11 определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК размером около 600 п.н., анализ которых подтвердил принадлежность штаммов к роду Pseudomonas. Наибольшее сходство сравниваемых нуклеотидных последовательностей с таковыми типовых штаммов рода Pseudomonas: для штамма G51 - с P. putida (98%), для штамма DN13 - с P. plecoglossicida (98%) и для штамма SN11 - с P. oryzihabitans (99%).

Все штаммы росли на нафталине и салицилате - промежуточном продукте разложения нафталина, и были способны к росту на 5-метилсалицилате - что предполагает наличие у них ферментов орто- и мета-пути расщепления катехола (Timmis, Lehrbach, 1985; Yen, Serdar, 1998). Следует также отметить, что после продолжительного культивирования на фенантрене, изученные псевдомонады приобретали способность к росту на этом субстрате, а также на 1гидрокси2нафтоате (промежуточном продукте биодеградации фенантрена). Возможность модификации генетических систем биодеградации нафталина при  длительном инкубировании на фенантрене была показана для штамма P. putida BS3703, который приобретал способность к конститутивному синтезу ферментов "верхнего пути" окисления ПАУ и к росту на фенантрене и 1-гидрокси-2-нафтоате (Балашова и др., 1997).

У Pseudomonas sp. SN11 были определены активности ферментов деградации нафталина и фенантрена. В связи с тем, что ферменты катаболизма нафталина у большинства бактерий индуцируются салицилатом (Barnsley, 1975), измерение активности ключевых ферментов биодеградации проводили как в отсутствие, так и в присутствии салицилата. Полученные данные подтверждают факт утилизации нафталина по пути диоксигеназного расщепления ароматического кольца с образованием салицилата и последующим его расщеплением через катехол. Индукция салицилатом фенантрен диоксигеназной активности и 1гидрокси-2-нафтоат гидроксилазы свидетельствует о возможности утилизации фенантрена штаммом Pseudomonas sp. SN11 с участием ферментов биодеградации нафталина (Балашова и др., 1997). Низкая активность гентизат 1,2-диоксигеназы при индукции салицилатом свидетельствует о возможности окисления данным штаммом салицилата до гентизиновой кислоты, как описано на примере штамма Pseudomonas sp. U2 (Fuenmayor et al., 1998). Установлено, что салицилат является индуктором ферментов пути деградации нафталина: нафталин диоксигеназы, салицилат гидроксилазы и катехол 1,2-диоксигеназы, а также индуктором фенантрен диоксигеназной активности и 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилазы, необходимых для утилизации фенантрена с участием ферментов деградации нафталина. Фермент мета-пути расщепления катехола – катехол 2,3диоксигеназа имеет высокую конститутивную активность и не индуцируется салицилатом.

Все исследованные штаммы рода Pseudomonas содержат плазмиды размером ~85 т.п.н. (рис. 4). Для доказательства плазмидной локализации генов, участвующих в разложении ПАУ, проведены эксперименты по элиминации плазмид из штамма SN11 и конъюгационному переносу. Так, перенос плазмиды рSN11 в реципиентный штамм P. putida BS394 (cys- nah- sal-) приводил к образованию трансконъюгантов с фенотипом Cys- Nah+ Sal+ Phn+. Полученные результаты свидетельствуют, что плазмида рSN11 является конъюгативной и содержит гены разложения нафталина и салицилата; деградация фенантрена штаммом SN11 также контролируется плазмидой. Аналогичные эксперименты по конъюгационному переносу плазмид были проведены с использованием штаммов SN101 и G51. Как и в случае плазмиды pSN11, плазмиды из этих штаммов являются конъюгативными и содержат гены деградации нафталина. Рестрикционный анализ с использованием эндонуклеазы рестрикции EcoRI показал, что плазмиды из штаммов SN11 и G51 имеют одинаковый набор рестрикционных фрагментов, что позволяет предположить идентичность данных плазмид.

  1 2 3  4  5  6 7

Рис. 4. Электрофореграмма плазмидных ДНК штаммов-деструкторов ПАУ: (А) 1 – NAH7 (83 т.п.н.); 2 – рDN13; 3 – рSN11; 4 – рSN21; 5 – рSN101; 6 – рG51; 7 – рSN31.

1.5. Галотолерантные свойства бактерий-деструкторов ПАУ

Бактерии-деструкторы ПАУ, выделенные из района солеразработок, способны как к росту на средах, не содержащих хлорид натрия, так и на средах с повышенным содержанием соли. Большинство штаммов росли на полноценных средах при концентрации NaCl выше 90 г/л. Кроме того, все исследованные бактерии, кроме Paenibacillus sp. SN501 (растет в присутствии 50 г/л NaCl), способны к росту на агаризованной среде с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии, при 60 г/л NaCl. Ряд штаммов росли в присутствии более высоких концентраций соли (см. раздел 4.1.). Полученные результаты позволяют отнести бактерии к умеренно галотолерантным микроорганизмам (Кашнер, 1981).

Следующим этапом изучения являлось установление некоторых механизмов галотолерантности у исследуемых бактерий. Полученные нами трансконъюгантные штаммы (см. раздел 1.4.), содержащие плазмиду из галотолерантного штамма Pseudomonas sp. SN11, были проверены на способность к росту на средах с повышенным содержанием соли (табл. 2).

Таблица 2. Рост рекомбинантных бактерий при повышенном содержании NaCl

Штаммы

Полноценная среда Раймонда,

содержание NaCl (г/л)

Среда Раймонда с нафталином,

содержание NaCl (г/л)

40

60

90

25

40

60

Pseudomonas sp. SN11*

++

++

++

++

++

+

P.putida BS394**

+

-

-

-

-

-

P.putida BS394-(SN11-81)

++

+

-

++

+

-

P.putida BS394-(SN11-82)

++

+

-

++

+

-

Примечание. «++» - рост; «+» - слабый рост; «-» -  нет роста.

* донорный штамм; ** реципиентный штамм.

Было установлено, что реципиентный штамм P. putida BS394 способен к слабому росту на среде, содержащей 40 г/л NaCl, но не растет при 60 г/л NaCl, тогда как у трансконъюгантных штаммов был отмечен хороший рост при содержании 60 г/л соли на полноценной среде и при 40 г/л на среде с нафталином в качестве субстрата. В то же время, природный галотолерантный штамм SN11 более устойчив к повышению концентрации NaCl, чем рекомбинантные бактерии (табл. 2). Таким образом, можно предположить, что в плазмидах исследуемых бактерий-деструкторов присутствуют не только гены, участвующие в деградации ПАУ, но и генетические элементы, детерминирующие способность бактерий к росту при повышенной солености среды.

Кроме того, у галотолерантных штаммов  Arthrobacter sp. SMВ11 и SMB145, выращенных при повышенной солености среды (50-100 г/л NaCl), были обнаружены низкомолекулярные эндо-метаболиты: эктоин, глутамат, бетаин и трегалоза. Известно, что такие соединения относят к осмопротекторам и они обнаружены у многих галофильных и галотолерантных бактерий. Накопление в клетках организмов осмопротекторов является одним из основных механизмов адаптации микроорганизмов к высокой осмолярности среды (Ventosa et al., 1998; Grant, 2004; Lentzen, Schwarz, 2006). Также нами было показано, что штаммы рода Rhodococcus, выращенные в минеральной среде в присутствии 50 и 80 г/л NaCl с глюкозой в качестве субстрата, накапливали эктоин, гидроксиэктоин и глутамат (табл. 3). Такое сочетание осмолитов в клетках родококков обнаружено впервые.

Таблица 3. Содержание осмопротекторов у деструкторов рода Rhodococcus

Штамм

Концентрация NaCl, (г/л)*

Содержание осмопротекторов, % от сухого веса биомассы

Эктоин

Глутамат

Гидроксиэктоин

SMB37

50

0.6

0.4

0.7

SMB37

80

0.3

0.35

SMB38

50

0.6

1.4

1.4

SMB38

80

1.2

0.6

2.0

Примечание. * вес/объем в среде культивирования, «–» – вещество не обнаружено.

1.6. Бактериальные гены, контролирующие начальные этапы деструкции нафталина

Первым этапом аэробной деградации нафталина у бактерий является гидроксилирование субстрата до соответствующего cis-дигидродиола, реакция осуществляется мультикомпонентными ферментными системами – диоксигеназами (Larkin, 1999; Gibson, Parales, 2000). Нафталин диоксигеназы (НДО), кодируемые генами nah (штаммы рода Pseudomonas) и nar (штаммы рода Rhodococcus), существенно различаются между собой структурно, сохраняя при этом основные каталитические свойства (Kulakov, 2000). Разнообразие генов, кодирующих - и субъединицы НДО, в исследуемых штаммах изучали путем амплификации участка генов nah и nar с последующим гидролизом полученных ампликонов эндонуклеазами рестрикции MseI и HaeIII. ПЦР-анализ с использованием праймеров, разработанных Ferrero с соавторами (Ferrero et al., 2002), показал наличие гена nahAc, кодирующего -субъединицу НДО, в исследуемых бактериях рода Pseudomonas. Анализ нуклеотидных последовательностей амплифицированного участка nahAc-гена штаммов SN11, DN13, G51 выявил высокую гомологию (99.6-100%) с таковыми референтных штаммов P. putida NCIB9816, NCIB9816-4 и BS202. На рисунке 6 представлена дендрограмма, отображающая сходство нуклеотидных последовательностей, гомологичных гену nahAc, исследуемых и известных штаммов-деструкторов.

Для исследования генов, кодирующих НДО, грамположительных бактерий, нами были сконструированы праймеры, при создании которых были использованы известные нуклеотидные последовательности nar-генов, кодирующих - и субъединицы НДО, деструкторов нафталина рода Rhodococcus. С ДНК-матриц родококков были получены ампликоны ожидаемой длины (1936 п. н.) (рис. 7).

Рис. 6. Дендрограмма, отображающая сходство нуклеотидных последовательностей,  гомологичных гену nahAc .

  1  2  3 4 5  6 7 8  9  10  11

Рис. 7. Электрофореграмма продуктов амплификации генов narAaAb штаммов-деструкторов рода Rhodococcus: 1 – G10, 2 – P25*, 3 – DB11, 4 – SMB38, 5 – SMB37, 6 – B2-1, 7 – B1-4, 8 – B13, 9 – B14, 10 - отрицательный контроль, 11 – маркер HindIII. *Штамм Rhodococcus ruber P25 подробно описывается в разделе 2.2.

В то же время, применение сконструированных праймеров с препаратами ДНК деструкторов нафталина родов Arthrobacter и Bacillus не дало положительных результатов, что свидетельствует о высокой специфичности сконструированных олигонуклеотидов, а также о различии генетических систем деструкции нафталина у разных таксонов грамположительных бактерий.

Анализ нуклеотидных последовательностей ампликонов штаммов В13, В2-1, DB11, SMB38, выделенных из засоленных почв, показал принадлежность исследуемых фрагментов ДНК к семейству nar-генов, и выявил высокую гомологию (98.5-100%) с таковыми известных штаммов-деструкторов полиароматических соединений рода Rhodococcus. На дендрограммах четко прослеживается закономерность выделения взятых в анализ фрагментов narAa-генов и narAb-генов в два кластера (рис. 8). Степень сходства нуклеотидных последовательностей была выше 98% для narAa- и narAb-генов внутри каждого кластера и не превышала 92% для narAa-генов и 90% для narAb-генов между кластерами. На основании проведенного анализа можно предположить наличие двух ветвей эволюции narАаAb-генов у бактерий рода Rhodococcus. Показано, что nar-гены этих штаммов входят в разные группы одного подкластера (рис. 8) с гомологией нуклеотидных последовательностей внутри группы 100%, а между ними - 99%.

  А

  Б

Рис. 8. Дендрограммы, отображающие сходство нуклеотидных последовательностей, гомологичных генам narAa (А) и narAb (Б).

Полученные данные свидетельствуют о разнообразии генетических систем деструкции нафталина бактерий рода Rhodococcus, выделенных из района разработок Верхнекамского месторождения солей.

  1. Бактерии-деструкторы бифенила/полихлорированных бифенилов

2.1. Характеристика бактерий-деструкторов

Методом накопительного культивирования на бифениле из техногеннозагрязненных почв, грунтов и донных отложений выделено 280 штаммов-деструкторов бифенила, из них детально охарактеризовано 42 штамма. На основании филогенетического анализа и фенотипических характеристик штаммы отнесены к родам: Arthrobacter, Alcaligenes, Cellulomonas, Comamonas, Flavimonas, Flavobacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Rhodococcus, Janibacter, Xanthomonas.

Большинство изолированных бактерий росли в диапазоне температур 8-40С и рН среды 6-9. У ряда бактерий-деструкторов выявлена способность к росту на полноценной и минеральной (с бифенилом в качестве субстрата) средах в присутствии повышенного содержания NaCl. Так, штаммы Alcaligenes sp. Р39, Pseudomonas sp. B2 и Pseudomonas sp. B106, R. ruber Р25 активно росли на бифениле при содержании 60 г/л соли в среде культивирования и в полноценной среде при 100-120 г/л NaCl.

Более половины изученных деструкторов бифенила способны к росту на нафталине, толуоле, бензоле и феноле, пять штаммов могут осуществлять деструкцию фенантрена. Среди исследованных штаммов выявлены бактерии, которые осуществляли деструкцию хлорированных соединений (2ХБК, 4ХБК, 2,4Д). Особо следует отметить штаммы R. ruber Р25, Microbacterium sp. B51, Pseudomonas spр. G1, G12 и B106, которые обладают наиболее широкой субстратной специфичностью по отношению к моно(поли)ароматическим соединениям и их хлорпроизводным.

Все исследованные штаммы осуществляли разложение монохлорированного бифенила: при инкубации клеток бактерий с 4моноХБ (500 μM) наблюдалось накопление 4ХБК (от 75 μM до 230 μM, в зависимости от штамма, за 1 час). Для изучения особенностей разложения орто- и пара-ХБ изолированными бактериями в качестве модельного соединения нами выбран 2,4’диХБ, хлорированный по обоим бифенильным кольцам. Все бактерии проявляли активность по отношению к 2,4’диХБ, однако эффективность и характер окислительных способностей  штаммов различался. На основании анализа продуктов биодеструкции 2,4’диХБ выделены три группы штаммов, обладающие различными путями деградации данного соединения (табл. 4). У большинства штаммов (группы I и II) при деструкции 2,4'диХБ происходило накопление продукта мета-расщепления дихлорбифенила - 3,8-Cl  ГОФДК (λmax=397 нм), что указывает на 2,3диоксигенирование пара-хлорированного кольца 2,4'диХБ (Seeger et al., 1995; Seah et al., 2000). Кроме того, все исследованные штаммы группы II накапливали разные количества 4ХБК, что в свою очередь говорит о более глубокой трансформации 2,4'диХБ по пути предпочтительного 2,3-диоксигенирования ортохлорированного кольца. У штамма Р25 наблюдалось существенное уменьшение количества продуктов разложения 2,4'диХБ (3,8-Cl ГОФДК и ХБК), что указывает на эффективную утилизацию не только 2,4'диХБ, но и 4ХБК.

Таблица 4. Разложение 2,4дихлорбифенила бактериями-деструкторами

Штамм

ГОФДК, ОП (397)

ХБК

3 часа

24 часа

Положе-ние хлора

Концентрация ,%*

3 часа

24 часа

I группа (осуществляют окисление пара-хлорированного кольца)

Alcaligenes sp. P39

0

1.36 ± 0.03

-

0

0

Flavimonas sp. S214

3.1 ± 0.11

3.05 ± 0.04

-

0

0

Flavobacterium sp. P38

0

1.12 ± 0.01

-

0

0

Pseudomonas sp. B106

3.5 ± 0.03

2.44 ± 0.02

-

0

0

Pseudomonas sp. G1

3.7 ± 0.08

3.48 ± 0.03

-

0

0

Pseudomonas sp. G11

3.1 ± 0.09

2.91 ± 0.07

-

0

0

Pseudomonas sp. G13

3.2 ± 0.01

3.78 ± 0.05

-

0

0

Pseudomonas sp. P24

4.2 ± 0.3

4.48 ± 0.03

-

0

0

Pseudomonas sp. S1

0

1.6 ± 0.08

-

0

0

Pseudomonas sp. S2

0

2.3 ± 0.04

-

0

0

Pseudomonas sp. S9

0

0.6 ± 0.04

-

0

0

Pseudomonas sp. S13

0

0.7 ± 0.06

-

0

0

Pseudomonas sp. S15

0

1.1 ± 0.04

-

0

0

Pseudomonas sp. S210

1.1 ± 0.04

1.72 ± 0.07

-

0

0

Pseudomonas sp. S212

3.0 ± 0.06

2.94 ± 0.02

-

0

0

Rhodococcus sp. P1

0

0.5 ± 0.04

-

0

0

Rhodococcus sp. P19

0

0.1 ± 0.03

2

0

3.0

Janibacter sp. P9

3.6 ± 0.02

2.7 ± 0.01

-

0

0

Xanthomonas sp P8

1.7 ± 0.04

4.1 ± 0.08

-

0

0

II группа (осуществляют окисление орто- и пара-хлорированных колец)

Arthrobacter sp. P29

2.1 ± 0.07

1.79 ± 0.02

4

28.4

46.7

Arthrobacter sp. B107

1.8 ± 0.03

2.01 ± 0.03

4

30.3

43.1

Cellulomonas sp. P27

0.8 ± 0.04

0.84 ± 0.03

4

67.0

97.0

Cellulomonas sp. P28

0.6 ± 0.07

0.64 ± 0.03

4

70.0

66.0

Flavobacterium sp. G14

3.3 ± 0.09

3.40 ± 0.04

4

0

7.0

Microbacterium sp. P26

1.1 ± 0.05

3.24±0.01

4

38.7

68.7

Pseudomonas sp. B2

4.0 ± 0.06

3.96 ± 0.02

4

5.4

10.0

Pseudomonas sp. B7

2.7 ± 0.03

1.60 ± 0.01

4

9.3

14.0

Pseudomonas sp. B8

1.6 ± 0.06

1.69 ± 0.02

4

48.0

64.0

Pseudomonas sp. P22

0.7 ± 0.05

0.87 ± 0.05

4

72.0

74.0

Pseudomonas sp. P23

0.3 ± 0.08

0.36 ± 0.01

4

70.6

84.0

Rhodococcus sp. G10

2.9 ± 0.01

2.69 ± 0.05

4

10.0

13.0

Rhodococcus sp. P2kr

3.1 ± 0.05

3.8 ± 0.04

4

2.0

12.0

Rhodococcus sp. P12

0

0

4

0

6.0

2

3.6

3.0

Rhodococcus sp. P13

0.2 ± 0.09

0.4 ± 0.04

4

1.4

2.2

2

3.0

4.0

Rhodococcus sp. P20

0.2 ± 0.07

0.5 ± 0.04

4

0

2.0

2

3.0

4.6

Rhodococcus sp. P25**

1.2 ± 0.02

0.52 ± 0.07

4

67.0

29.0

Rhodococcus sp. SN31

0.8 ± 0.04

1.22 ± 0.04

4

3.7

9.0

III группа (осуществляют окисление орто-хлорированного кольца)

Comamonas sp. S211

0

0

4

16.4

18.6

Microbacterium sp. B51

0

0

4

88.0

92.7

Pseudomonas sp. G12

0

0

4

84.0

85.5

Rhodococcus sp. DB11

0

0

4

9.5

33.0

Примечание: * - % от теоретически возможного, ** - к 5 часам инкубации штамма Р25 с 2,4’диХБ было отмечено: ГОФДК – ОП397=1.1, 4ХБК – 73.8%.

Штаммы III группы - Rhodococcus sp. DB11 и Comamonas sp. S211 в присутствии 2,4'диХБ аккумулировали около 33 и 18.6% 4ХБК, соответственно, а штаммы Pseudomonas sp. G12 и Microbacterium sp. B51 - около 90% этого продукта, накопления продуктов мета-расщепления 2,4'диХБ не было зафиксировано (табл. 4). Таким образом, можно предположить, что эти штаммы атакуют только орто-хлорированное кольцо молекулы 2,4'диХБ.

2.2. Биодеградативные особенности штаммов R. ruber Р25 и Microbacterium sp. В51

Штамм R. ruber Р25 (=ИЭГМ 896)  является активным деструктором орто-, пара-замещенных хлорированных бифенилов. При деструкции 2моноХБ в среде наблюдалось накопление 8-Cl ГОФДК (max=395 нм) и 2ХБК, а при деструкции 4моноХБ – 10-Cl ГОФДК (max=434 нм) и 4ХБК. В процессе деградации 4моноХБ к 24 часам было отмечено снижение содержания 4ХБК в среде с 66% до 41%. При культивировании штамма Р25 с 2,2’диХБ не была обнаружена ГОФДК, но в среде аккумулировались свободные ионы хлора и 2ХБК (около 14% от теоретически возможного, за 24 часа). При разложении 4,4’диХБ было отмечено накопление в среде 3,10-диCl ГОФДК (max=434 нм) и увеличение концентрации 4ХБК в течение первых 24 часов до 68% с последующим снижением в 5.5 раза. Установлено, что при деструкции 2,4’диХБ штамм R. ruber Р25 предпочтительнее окислял орто-хлорированное кольцо молекулы хлорбифенила (табл. 4), при деструкции 2,4,2’триХБ – ди(орто-пара)-хлорированное кольцо, а при разложении 2,4,4’триХБ – моно(пара)-хлорированное кольцо. Изучена способность штамма R. ruber Р25 использовать в качестве единственного источника углерода и энергии 2-, 4моноХБ и 2,4’диХБ (рис. 9). Кроме того, штамм эффективно утилизировал образующиеся в процессе разложения 2ХБК и 4ХБК (рис. 10).

Рис. 9. Динамика роста R. ruber Р25 на бифениле (1) и его хлорированных производных: 2 - 2моноХБ, 3 - 4-моноХБ, 4 - 2,4'диХБ.

Рис. 10. Рост R. ruber Р25 на бензойной кислоте (1) и ее хлорпроизводных: КОЕ при росте на 2ХБК (2), 4ХБК (3),  2,4ХБК (4); Cl при росте на 2ХБК (5), 4ХБК (6), 2,4ХБК (7); концентрация ХБК при росте на 2ХБК (8) и 4ХБК (9).

R. ruber Р25 содержит три плазмиды, размером ~110 т.п.н. (рР25-1), ~90 т.п.н. (рР25-2) и ~80 т.п.н. (рР253) (рис. 11А). Для доказательства плазмидной локализации генов, ответственных за разложение бифенила, нафталина и ХБК,  проведены эксперименты по элиминации плазмид. При скрининге клонов, утративших способность к росту на одном или нескольких субстратах, обнаружено отсутствие одной или нескольких плазмид (рис. 11Б). Клоны с фенотипом бифнаф2ХБК4ХБК характеризовались отсутствием плазмид, у клонов с фенотипом бифнаф+2ХБК4ХБК было зафиксировано наличие плазмиды рР25-3 (~80 т.п.н.), а у клонов, утративших способность к росту только на ХБК, отсутствовала плазмида рР25-1 (~110 т.п.н.). Таким образом, нами сделано предположение о плазмидной локализации генетических детерминант, контролирующих деградацию бифенила, нафталина и ХБК у штамма R. ruber Р25.

 

  1 2  3  4  1  2  3 4 5

  А  Б

  Рис. 11А. Электрофореграмма плазмидных ДНК: 1 – рР25-(1-3); 2  HindIII; 3  pBS1501 (110 т.п.н.); 4  NAH7 (83 т.п.н.).

Рис. 11Б. Скрининг клонов R. ruber Р25 с различным фенотипом на наличие плазмидной ДНК: 1  биф+наф+ХБК (рР25-2, рР25-3); 2  бифнаф+ХБК (рР25-3); 3 –бифнафХБК (элиминант); 4 – -HindIII; 5  NAH7 (83 т.п.н.).

Результаты изучения деструкции моно(ди)хлорбифенилов штаммом Microbacterium sp. В51 приведены в таблицах 4 и 5.

Таблица 5. Деструкция хлорбифенилов штаммом Microbacterium sp. В51

ПХБ

Концен-трация ПХБ (мг/л)

Время инкубации (час)

Концен-трация

Cl- (мг/л)

Хлорбензойная кислота

ГОФДК

Поло-жение хлора

Концентрация

max (нм)

ОП

мг/л

%*

2ХБ

94.25

0

н.о.

2

-

-

395

-

5

56.60±0.02

72.3

-

24

11.82±0.01

15.1

<0.1

4ХБ

94.25

0

н.о.

4

-

-

434

-

5

31.11±0.08

39.7

<0.1

24

28.31±0.05

36.0

<0.1

2,2’ХБ

22.3

0

-

2

-

-

-

-

5

3.8±0.05

14.13±0.03

90.3

-

24

6.3±0.08

1.65±0.02

10.6

-

4,4’ХБ

22.3

0

-

4

-

-

432

0

5

-

  3.59±0.01

23.0

0.36±0.05

24

-

12.69±0.06

81.1

0.95±0.02

Примечание: «н.о.» – не определяли, « - » - не зафиксировано, * - % от теоретически возможного.

Штамм Microbacterium sp. В51 осуществлял практически 100% деструкцию диХБ (2,2’-, 2,4’- и 4,4’диХБ). Аккумуляция в среде 2ХБК и 4ХБК при деструкции 2,2’- и 2,4’диХБ, соответственно, свидетельствовала о предпочтительной атаке штаммом орто-хлорированного кольца этих соединений (табл. 4, 5). Microbacterium sp. В51 утилизировал 2ХБК, продукт разложения 2моноХБ и 2,2’диХБ, и трансформировал 4,4’диХБ через стадию образования 3,10диCl ГОФДК до 4ХБК (табл. 5). Полученные данные позволяют предположить, что штамм В51 способен окислять орто- и пара-хлорированные кольца молекул ПХБ. Таким образом, Microbacterium sp. В51 по своим деградативным свойствам близок к известному штамму-деструктору ПХБ Burkholderia sp. LB400 (Seeger et al., 1995, 1999; Seah et al., 2000), но, в отличие от штамма LB400, способен деградировать 4,4’диХБ и осуществлять полную утилизацию 2моноХБ и 2,2’диХБ.

Было также установлено, что штамм В51 способен активно разлагать 2моноХБ в условиях модельной почвенной системы. Анализ динамики изменения концентрации 2моноХБ показал, что основное снижение количества субстрата (до 98%) происходило в течение первых 24 часов инкубирования. Увеличение количества жизнеспособных клеток штамма в течение эксперимента на три порядка по сравнению с контролем свидетельствовало об использовании 2моноХБ в качестве ростового субстрата.

       2.3. Разнообразие генов, кодирующих -субъединицы ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ, исследуемых бактерий-деструкторов

Проведен скрининг 24 штаммов-деструкторов бифенила, на наличие в их геноме нуклеотидных последовательностей, кодирующих -субъединицы ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ (Gibson, Parales, 2000). Амплифицируемые участки ДНК соответствуют правой части генов субъединиц терминальных оксигеназ, включающей каталитический центр (Zielinski et al., 2002). С ДНК четырнадцати штаммов был получен ПЦР-продукт ожидаемого размера, около 500 п.н. В то же время с ДНК ряда деструкторов бифенила/ПХБ, в том числе активных штаммов R. ruber Р25 и Microbacterium sp. В51, отсутствовала специфичная амплификация. Несмотря на сформировавшуюся в процессе эволюции специализацию ферментов по отношению к конкретным субстратам, наблюдается перекрывание спектров окисляемых соединений даже для диоксигеназ, относящихся к разным подсемействам (Barriault, Sylvestre, 1999; Raschke et al., 2001). С другой стороны, известны бактерии родов Sphingomonas, Bacillus, Rhodococcus, осуществляющие деструкцию бифенила с помощью бифенил 2,3-диоксигеназ, существенно отличающихся от ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ и сходных с фенантрен и нафталин диоксигеназами бактерий-деструкторов ПАУ (Romine et al., 1999; Mukerjee-Dhar et al., 2005; Taguchi et al., 2007; Yang et al., 2007). Полученные данные свидетельствуют об отличии ключевых ферментов деструкции бифенила исследованных нами активных бактерий от ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ.

По результатам гидролиза ампликонов эндонуклеазами рестрикции HhaI и HaeIII бактерии рода Pseudomonas были выделены в отдельную группу, бактерии порядка Actinomycetales можно подразделить на три группы (рис. 12). К первой группе относятся Rhodococcus sp. P1, P12, P13, P20, утилизирующие бифенил/ХБ, нафталин, бензол, толуол. Штамм Rhodococcus sp. G10 (вторая группа) осуществляет трансформацию бифенила/ХБ и растет на бензоле и толуоле. В третью группу вошли штаммы Arthrobacter sp. Р24а, Cellulomonas sp. Р28, Janibacter sp. P27a и P9, способные к слабому росту на бифениле.

  (А)

(Б) 

Рис. 12. Электрофореграммы рестрикционных фрагментов, полученных при обработке ампликонов эндонуклеазами HhaI (A) и HaeIII (Б):
Rhodococcus sp. (штаммы: 3 – P1, 4 – P12, 5 – P13, 6 – P20, 7 – G10),  Janibacter sp. (штаммы: 8 – P9, 9 – P27a), 12 – Arthrobacter sp. P24a, 13 – Cellulomonas sp. P28, Pseudomonas sp. (штаммы: 14 – S9, 15 – S13, 16 – S210, 17 – S211, 18 – S212);
2, 19 – Rhodococcus sp. P20 (ампликон, не обработанный эндонуклеазой); 1, 10, 20 – маркер молекулярных масс 100–1000 п.н. («Силекс», Россия); 11 – маркер молекулярных масс pUC19 ДНК/ MspI («Силекс», Россия).

Анализируемые участки генов бактерий рода Rhodococcus существенно отличались от гомологичных генов бактерий рода Pseudomonas (рис. 13). Участки ДНК штаммов Rhodococcus sp. P1, P12 и P13 были на 98-99% сходны с  генами, кодирующими -субъединицы бифенил 2,3-диоксигеназ, известного деструктора ПХБ Rhodococcus sp. RHA1 и разлагающего бифенил R. opacus BIE-20. Амплифицированный фрагмент ДНК Rhodococcus sp. G10 на 98% сходен с геном -субъединицы гидроксилирующей диоксигеназы деструктора толуола Arthrobacter sp. 3YC3. У бактерий родов Janibacter и Arthrobacter обнаружены уникальные нуклеотидные последовательности, отличающиеся от генов, кодирующих большие субъединицы известных гидроксилирующих диоксигеназ как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий (рис. 13).

Полученные данные свидетельствуют о разнообразии генетических систем, контролирующих ключевые процессы деструкции ароматических углеводородов, бактерий-деструкторов бифенила из техногеннозагрязненных почв Прикамья.

Рис. 13. Дендрограмма, отображающая сходство нуклеотидных последовательностей, гомологичных исследуемым участкам генов -cубъединиц подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ.

3. Природные и генетически-модифицированные бактерии-деструкторы хлорбензойных кислот

Более 20 бактерий-деструкторов хлорбензойных кислот (2-, 3-, 4- и 2,4ХБК) были выделены из почв и грунтов, загрязненных отходами производства галогенсодержащих соединений (г. Пермь). Подробно нами были исследованы шесть штаммов-деструкторов 4ХБК, которые на основании филогенетических и фенотипических особенностей были идентифицированы как Arthrobacter sp. H4, H5, Micrococcus sp. G120, G126, Pseudomonas sp. G107, H2.

3.1. Генетические системы, контролирующие дехлорирование 4ХБК, бактерий рода Arthrobacter

Данные ДНК-типирования двух исследованных артробактерий, штаммов H4 и H5, показали их идентичность. Наибольший уровень сходства (99%) ген 16S pРНК штамма Н4 имеет с типовым штаммом A. globiformis M23411T. Штаммы Arthrobacter sp. H4 и Н5 эффективно растут на 4ХБК, используя данное соединение в качестве единственного источника углерода и энергии, способны к росту на высоких концентрациях хлорбензоата - до 3 г/л. Параметры роста артробактерий сопоставимы с таковыми хорошо изученного штамма-деструктора 4ХБК A. globiformis КЗТ1 (Зайцев, Карасевич, 1981). Анализ метаболитов при культивировании штаммов H4 и Н5 на 4ХБК показал наличие в среде  инкубирования интермедиатов – 4ГОБК, ПКК и ионов хлора. На основании полученных результатов и анализа литературных данных было сделано предположение, что штаммы H4, Н5, как и штамм КЗТ1, осуществляет дегалогенирование 4ХБК до расщепления ароматического кольца (Зайцев, Карасевич, 1981). Описан механизм первичной атаки на молекулу 4ХБК - гидролитическое дегалогенирование (Elsner et al., 1991). Эту реакцию катализирует трехкомпонентная 4ХБК-дегалогеназа, включающая  4-хлорбензоат-KoA-лигазу (FcbA),  4-хлорбензоил-KoA-дегалогеназу (FcbB) и 4-гидроксибензоат:КоА-тиоэстеразу (FcbC).

Ранее нами было показано, что у штамма A. globiformis КЗТ1 реакция  дегалогенирования 4ХБК контролируется генами, расположенными в плазмиде размером ~110 т.п.н. Гены, ответственные за дальнейший метаболизм пара-гидроксибензойной кислоты, находятся в хромосоме (Zaitzev et al., 1991). У Arthrobacter sp. H4 и Н5, выделенных из техногенных почв (г. Пермь), плазмидные ДНК не были обнаружены. Можно предположить, что генетические детерминанты, контролирующие весь путь разложения 4ХБК, у этих штаммов располагаются в хромосоме. 

Клонирование и изучение fcb-генов A. globiformis КЗТ1. В клетках  E. coli JM109 на мультикопийном векторе pUC19 была сконструирована клонотека Sau3A-фрагментов тотальной ДНК (обогащенной плазмидной ДНК) штамма A. globiformis КЗТ1. При анализе Арr-клонов E.coli JM109 обнаружен рекомбинантный штамм, содержащий плазмиду pCA311, которая придавала клеткам E. coli способность к дехлорированию 4ХБК. Анализ с использованием метода ТСХ показал, что 4ГОБК является единственным продуктом конверсии 4ХБК клетками E. coli. Таким образом, в составе pCA311 были клонированы fcbгены, кодирующие 4-хлорбензоат-4-гидроксилазу (дегалогеназу). На основе рестрикционного анализа плазмиды pCA311 и ее делеционных производных, а также анализа полипептидов, синтезированных в мини-клетках E. coli на матрицах полученных рекомбинантных плазмид была построена физическая карта клонированного фрагмента ДНК (7612 т.п.н.), определена последовательность расположения генов, кодирующих полипептиды с Mr=57, 31 и 17 кДа. Показано, что все 3 гена fcbA1(А), fcbA2(В), fcbA3(С) требуются для сохранения 4ХБК+ фенотипа. В дальнейшем, данные о наличии трех структурных генов, определяющих дегалогеназную активность, были подтверждены и дополнены, когда была определена и проанализирована  нуклеотидная последовательность ДНК, клонированная в составе плазмиды pCA311 (номер в GenBank AF304300). Основываясь на результатах анализа нуклеотидных последовательностей и литературных данных (Babbitt et al.,1992; Schmitz et al.,1992), было сделано заключение, что проклонированные нами гены fcb объединены в структурный оперон с тремя открытыми трансляционными рамками, кодирующими полипептиды в следующем  порядке: 4ХБК-КоА-лигаза, 4ХБК-КоА-дегалогеназа  и 4ХБК-КоА-тиоэстераза.

3.2. fcb-Гены бактерий-деструкторов 4ХБК из техногеннозагрязненных почв (г. Пермь)

На основе нуклеотидных последовательностей fcb-генов штаммов A. globiformis КЗТ1 (GenBank AF304300) и Arthrobacter sp. SU (GenBank M93187) были разработаны праймеры, при использовании которых возможна амплификация участков ДНК, содержащих гены fcbA и fcbB (Rodrigues et al., 2001). Методом ПЦР нами были исследованы выделенные бактерии-деструкторы 4ХБК на наличие в геноме fcb-генов. С ДНК штаммов Arthrobacter sp. H4, H5, Micrococcus sp. G120 были получены ПЦР-продукты ожидаемого размера – 589 п.н. (fcbA) и 598 п.н. (fcbB) (рис. 14А). Полученные результаты позволяют сделать предположение о наличии у этих штаммов генов, контролирующих дегалогенирование 4ХБК. fcb-Гены были также обнаружены у штамма R. ruber Р25 (рис. 14Б), деструктора ХБ/4ХБК (см. раздел  2.2.).

  500 п.н

   

1  2 3  4  5

  А  Б

Рис. 14. Электрофореграммы продуктов амплификации fcb-генов штаммов-деструкторов 4ХБК: (А) Arthrobacter sp. H4 (2 – fcbA, 6 – fcbB), Micrococcus sp. G126 (3 – fcbA, 7 – fcbB), Micrococcus sp. G120 (4 – fcbA, 8 – fcbB), Arthrobacter sp. Н5 (5 – fcbA, 9 – fcbB), 1, 10 – маркер молекулярных масс IX («Sigma», Германия), 11 – отрицательный контроль; (Б) A. globiformis КЗТ1 (1 fcbA, 4 – fcbB), R. ruber Р25 (2   fcbA, 5 – fcbB), 3  маркер молекулярных масс 1000 п.н. («Силекс», Россия).

Анализ нуклеотидных последовательностей генов fcbA и fcbB штамма Arthrobacter sp. H4 показал 100% сходство с гомологичными последовательностями большинства бактерий рода Arthrobacter. Уровень сходства участка гена fcbA штамма R. ruber P25 с генами, кодирующими 4хлоробензоатКоА-лигазу, бактерий A. globiformis КЗТ1, A. ramosus FG1, Arthrobacter sp. SU, Arthrobacter sp. TM1 составил 9899%; с гомологичным геном Arthrobacter sp.  FHP1 – 95%. Обнаружено 98-99% сходство участка гена fcbB штамма R. ruber P25 с гомологичными нуклеотидными последовательностями бактерий рода Arthrobacter. В литературе не описано фактов присутствия fcb-генов у природных бактерий рода Rhodococcus. Следует отметить, что штамм R. ruber P25, способный полностью разлагать 4ХБ/4ХБК, и деструкторы 4ХБК рода Arthrobacter (штаммы H4, H5),  выделены из одних и тех же почв, загрязненных отходами производства галогенированных соединений (г. Пермь). Известно, что гены, контролирующие деструкцию 4ХБК, могут входить в состав плазмид и транспозонов  (Zaitsev et al., 1991; Peel, Wyndham, 1999), кроме того, fcb-гены бактерий рода Arthrobacter успешно экспрессируются в клетках бактерий рода Rhodococcus (Rodrigues et al., 2006). Таким образом, не исключена возможность горизонтального переноса кластера генов fcb между бактериями почвенной экосистемы, находящейся под высоким селективным давлением галогенсодержащих поллютантов.

3.3. ohb-Гены, контролирующие окислительное дегалогенирование орто-замещенных хлорбензоатов, Pseudomonas aeruginosa 142

Другим механизмом первичной атаки хлорбензойных кислот является окислительное дегалогенирование, описанное для ряда бактерий-деструкторов 2ХБК, 2,4диХБК и 2,5диХБК рода Pseudomonas, в том числе P. aeruginosa 142 (рис. 15). В нашей работе были клонированы и охарактеризованы ohb-гены, контролирующие отщепление галогена из орто-положения до расщепления ароматического кольца, штамма деструктора 2ХБК и 2,4диХБК P. aeruginosa 142 (Романов и др., 1993). На основе вектора широкого круга хозяев pSP329 в клетках E. coli DH5F’ была создана клонотека генов тотальной ДНК P. aeruginosa 142, среди 3700 клонов которой обнаружены 2 клона, осуществляющие превращение 2ХБК в катехол и 2,4диХБК – в 4-хлоркатехол. На основании полученных результатов был сделан вывод, что в рекомбинантных плазмидах pOD33 и pOD22, содержащихся в этих клонах, присутствуют ohb-гены орто-галобензоат 1,2диоксигеназы (ОГБД) (рис. 15).

Рис. 15.   Молекулярный механизм окислительного орто-дегалогенирования хлорбензоатов, описанный для P. aeruginosa 142 (Romanov and Hausinger, 1994).

Плазмида pOD33, содержащая вставку ДНК около 6 т.п.н. и стабильно поддерживающаяся в клетках E. coli, была использована для дальнейших исследований. Путем субклонирования плазмиды pOD33 с применением экзонуклеазы Bal31 была получена плазмида pE43 с размером вставки ДНК 3.7 т.п.н., проявляющая наибольший уровень экспрессии ohb-генов в клетках E. coli, которая была трансформирована в клетки P. putida mt-2 (штамм PB2440) (Bagdasarian et al., 1981). Рекомбинантный штамм P. putida PB2440(pE43) приобрел новые свойства: рос на 2ХБК как единственном источнике углерода и энергии при концентрации субстрата до 2 мМ. В опытах с отмытыми клетками была показана способность штамма окислять дихлорированные субстраты - 2,4диХБК, 2,5диХБК и 2,6диХБК.

Определена нуклеотидная последовательность вставки ДНК плазмиды pOD33 размером 6052 п.н. (GenBank AF121970). Обнаружены 6 открытых рамок считывания, в том числе генов ohbB, ohbA, кодирующих большую и малую субъединицы терминальной диоксигеназы, соответственно (рис. 16).  Кроме того, обнаружен регуляторный ген ohbR, транслируемый им белок относится к регуляторным белкам IclR-типа (Donald et al., 1996). Интересен факт, что орто-галобензоат 1,2-диоксигеназная активность проявлялась в отсутствие генов, кодирующих ферредоксин и редуктазу, предполагается, что терминальная оксигеназа ОГБД использует электрон-транспортную систему, синтезируемую различными бактериями-хозяевами. Терминальная оксигеназа, кодируемая генами ohbB и ohbA, образует отдельный филогенетический кластер, который включает ароматические оксигеназы нетипичной структурно-функциональной организации и отличающиеся от других членов семейства ароматических диоксигеназ (Gibson, Parales, 2000).

В составе клонированной вставки была обнаружена открытая рамка считывания ORF5 (ohbC); функция транслируемого полипептида массой 48969 Да неизвестна (рис. 17). ohb–Гены фланкированы IS1396-подобными инсерционными последовательностями, в состав транспозона входили гены tnpA и top, кодирующие транспозазу А и топоизомеразу I/III, соответственно. Кроме того, было обнаружено, что весь «ohb-регион» ограничен инвертированными повторами размером 14 п.н. в позициях (56 – 69) и (5984 – 5997) (GenBank AF121970).

Рис. 16. Физическая карта и организация ohb-локусов в составе рекомбинантных плазмид  pOD22 и pOD33. Плазмиды pK33A16, pK33H7 и pK33A20 были cконструированы на основе вектора BlueScript; для других вариантов использовали вектор pSP329. Фенотипы указаны справа от названия плазмид. Локализация и ориентация ORF1 (top), ORF2 (ohbR), ORF3 (ohbA), ORF4 (ohbB), ORF5 (ohbC), ORF6 (tnpA) показана в нижней части рисунка, там же указаны молекулярные массы соответствующих полипептидов.

Рис. 17. Авторадиограмма [35S]метионин-меченных полипептидов, синтезируемых в миниклетках E. coli 925, содержащих рекомбинантные плазмиды. Дорожки: 1, pSP329; 2, pOD33; 3, p33K21; 4, pOD22; 5, pE43; 6, pE33-1. Стандарты молекулярных масс (SDS-7; «Sigma»): бычий сывороточный альбумин (66.2 kDa), овальбумин  (45 kDa), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (36 kDa), карбоангидраза (29 kDa), трипсиноген (24 kDa), ингибитор трипсина (20.1 kDa), and -лактальбумин (14.2 kDa).

3.4. Конструирование метаболических путей деструкции хлорароматических соединений в клетках бактерий

3.4.1. Клонирование и экспрессия fcb-генов в составе рекомбинантной плазмиды в клетках P. putida

На основе вектора с широким кругом бактерий-хозяев pRK415 (Keen,1988) нами была сконструирована рекомбинантная плазмида pPC3, содержащая fcb-гены. Из клеток рекомбинантного штамма E. coli JM109(pPC3) плазмида была мобилизована в клетки штамма  P. putida KЗ6R (Rifr), способного к полному окислению пара-гидроксибензойной кислоты (ПГБК), но не 4ХБК (Карасевич, Зайцев, 1984). Эксперименты по выращиванию в Cl--cвободной среде в  присутствии возрастающих концентраций 4ХБК показали, что за 48 часов роста рекомбинантный штамм P. putida KЗ6R(pPC3) полностью дехлорирует 3.5 г/л субстрата в сравнении с 1.5 г/л в случае родительского штамма KЗT1. Таким образом, внесение fcb-генов в штамм, утилизирующий ПГБК, привело к образованию гибридного пути деградации 4ХБК путем вертикального наращивания предсуществовавшего пути.

Путем пересевов рекомбинантного штамма P. putida КЗ6R(pPC3) на среды с постепенно повышающимися концентрациями 4ХБК (от 1 до 10 г/л) были получены варианты, характеризующиеся суперэкспрессией fcb-генов. Наиболее эффективное фенотипическое выражение функции дехлорирования наблюдалось у штамма KЗ6R(pPC3-10), адаптированного к росту на 10 г/л 4ХБК, который полностью минерализовал до 6 г/л 4ХБК при росте в минеральной среде. Все штаммы, адаптированные к высоким концентрациям 4ХБК, характеризовались более высокой степенью стабильности поддержания плазмиды в клетках по сравнению с исходным штаммом КЗ6R(pPC3). Рестрикционный анализ плазмид из всех адаптированных вариантов штамма КЗ6R(pPC3) выявил во всех случаях наличие делеции размером 3 т.п.н. в векторной части плазмиды pPC3. Основываясь на этом факте, можно предположить, что повышение стабильности плазмид в клетках адаптированных штаммов связано со структурными изменениями исходной рекомбинантной плазмиды pPC3.

3.4.2. Конструирование рекомбинантного штамма, содержащего fcbгены в хромосоме  P. putida

Реальный путь достижения генетической  стабильности - интеграция желаемого гена в хромосому реципиента. С этой целью нами были проведены эксперименты по конструированию штамма, содержащего fcb-гены в хромосоме  P. putida KЗ6R. На основе вектора pDK8, содержащего модифицированный транспозон Tn5-K2GA(Tcr), была сконструирована плазмида pCDK4, содержащая fcb-гены, которая была мобилизована в клетки P. putida KЗ6R. При селекции трансконьюгантов на среде, содержащей тетрациклин и 4ХБК в качестве единственного источника углерода и энергии, был получен рекомбинантный штамм KЗ6R::Tn5-K2GA[Tcr fcbA1,A2,A3], характеризовавшийся высокой стабильностью признака 4ХБК+. Сравнительный анализ эффективности деградации 4ХБК полученного штамма и плазмидных вариантов штамма КЗ-6R показал, что за 20 суток штамм полностью утилизирует до 4 г/л 4ХБК. Эта величина сравнима с таковой для штамма KЗ6R(pPC3), но много ниже для адаптированных вариантов последнего.

Таким образом, введение генов дехлорирования в хромосому, с одной стороны, приводило к стабилизации проявления функции. С другой стороны, плазмидные варианты штамма P. putida КЗ6R обладали более высокой эффективностью дехлорирования 4ХБК, так как в хромосоме fcb-гены находились в единственной копии.

3.4.3. Штаммы-деструкторы ПХБ, сконструированные при использовании  fcb- и ohb-генов

Описано большое количество бактерий-деструкторов, осуществляющих разложение различных конгенеров ПХБ, и наиболее изученными из них являются штаммы Burkholderia xenovorans LB400 и Rhodococcus sp. RHA1 (Chain et al., 2006; McLeod et al., 2006). Однако подавляющее большинство деструкторов ПХБ, в том числе и вышеперечисленные, в процессе разложения этих токсикантов аккумулируют хлорбензоаты. Для создания рекомбинантного пути полной утилизации орто- и пара-ХБ были использованы ohb и fcb гены (рис. 18), контролирующие орто- и пара-дегалогенирование хлорбензоатов (см. разделы 3.1. и 3.3.).

Рис. 18. Рекомбинантные пути деградации 2ХБК (вверху) и 4ХБК (внизу), конструированные путем наращивания предсуществовавших путей окисления (хлор)бифенилов, орто-гидроксибензоата, катехола и пентадиена с использованием дегалогеназных генов ohbAB и fcbABC. Показано анаэробное дехлорирование Арохлора, в результате которого аккумулируются, в основном, орто- и пара-замещенные ХБ (слева) и метаболизм 2ХБ и 4ХБ через орто-ХБ-ГОФДК и пара-ХБ-ГОФДК, соответственно, которые трансформируются в ХБК и пентадиен (цит. по Hrywna et al., 1999).

Первоначально были проведены эксперименты по созданию модифицированных путей полной утилизации моноХБ путем добавления генов дегалогенирования ohb и fcb в составе рекомбинантных плазмид в штамм-деструктор хлорбифенилов Comamonas testosteroni VP44 (Мальцева et al., 1999). Рекомбинантные штаммы C. testosteroni VP44, содержащие ohb и fcb гены приобретали способность расти на 2ХБК, 2моноХБ  и 4ХБК, 4моноХБ, соответственно, при концентрации 10 мМ каждого из субстратов (Hrywna et al., 1999). Аналогичные эксперименты были проведены с использованием штамма Rhodococcus sp. RHA1 в качестве реципиента генов fcb (плазмиды pRHD34): сконструированный штамм приобретал способность к росту на 4ХБК и 4моноХБ (Rodrigues et al., 2001).

Рекомбинантные штаммы B. xenovorans LB400 (pRO41, ohb) и Rhodococcus sp. RHA1 (pRHD34, fcb) были исследованы в модельных почвенных экспериментах при деструкции коммерческой смеси ПХБ «Aroclor 1242». После 30 дней инкубирования количество ПХБ-конгенеров сократилось на 57%, при этом рекомбинантные бактерии стабильно сохранялись в загрязненной ПХБ почве в течение всего эксперимента (Rodrigues et al., 2006).

Таким образом, использование клонированных генов раннего дегалогенирования при создании бактерий с новыми метаболическими характеристиками, существенными при разложении хлорароматических ксенобиотиков, имеет фундаментальное и практическое значение.

4. Природные и модельные ассоциации бактерий, перспективные для использования в биотехнологиях очистки окружающей среды

    1. Нафталинметаболизирующие ассоциации бактерий, выделенные из техногеннозасоленных почв

Из почв района солеразработок методом накопительного культивирования получены две ассоциации бактерий, способные расти на нафталине в присутствии повышенной солености среды: ассоциация SMB1 – до 80 г/л NaCl, ассоциация SMB3 – до 90  г/л NaCl.

4.1.1. Характеристика нафталинметаболизирующих ассоциаций

Ассоциация бактерий SMВ1. При росте ассоциации SMВ1 на агаризованной минеральной среде в парах нафталина наблюдалось формирование биопленки на агаре при содержании хлорида натрия до 140 г/л (табл. 6). В то же время, рост ассоциации в жидкой минеральной среде на нафталине как единственном источнике углерода и энергии был зафиксирован при содержании соли не более 80 г/л. Наибольшие показатели роста сообщества были установлены в отсутствие NaCl в среде культивирования (ОП540=0.66 о.е.), в присутствии 50, 70 и 80 г/л NaCl оптическая плотность культуры уменьшалась и достигала 0.25, 0.19 и 0.11 о.е., соответственно.

Таблица 6. Рост ассоциации SMB1 и индивидуальных штаммов на агаризованной среде в присутствии разных концентраций NaCl (г/л)

Штамм

Рост на минеральной среде с нафталином

Рост на полноценной среде

0

30

70

100

140

0

30

60

120

180

240

290

Arthrobacter sp.  SMB11

+

+

+

-

-

+

+

+

±

-

-

-

Arthrobacter sp.  SMB145

+

+

+

-

-

+

+

+

+

-

-

-

Brevibacterium permense  SMB14

-

-

-

-

-

+

+

+

+

-

-

-

Chromohalobacter sp. SMB17

-

-

-

-

-

-

+

+

+

+

±

±

Ассоциация SMB1*

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

±

±

Примечание. «+» -  рост (колонии размером 1-3 мм); «±» – слабый рост (колонии  размером менее 1 мм); «-» - отсутствие роста бактерий.

*Рост фиксировался по образованию биопленки на агаризованной среде. При росте на полноценной среде в присутствии 240 г/л и 290 г/л NaCl присутствовали только колонии штамма Chromohalobacter sp. SMB17.

Галотолерантные штаммы Arthrobacter sp. SMВ11 и Arthrobacter sp. SMВ145 филогенетически близки (99.7% сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК) к A. сrystallopoietes (см. раздел 1.1). Штаммы росли на нафталине, салицилате и ацетате (интермедиаты деструкции нафталина), а также бензойной и пара-гидроксибензойной кислотах. 

Грамположительный штамм SMB14 (=ВКМ Ас-2280Т =LMG 22207) на основании результатов изучения генотипических, хемотаксономических и морфо-физиологических характеристик был валидно описан как новый вид Brevibacterium permense. Штамм рос на бензойной, пара-гидроксибензойной кислотах и ацетате как единственном источнике углерода и энергии, а также на полноценной среде Раймонда без NaCl в среде культивирования и при концентрации соли до 120 г/л (табл. 6).

Штамм SMB17 - умеренно галофильная бактерия семейства Halomonadaceae, растет на средах при 30–290 г/л NaCl и не растет в отсутствии соли (табл. 6). Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК (около 1470 п.н.) показал, что штамм входит в филогенетический кластер, включающий представителей рода Chromohalobacter,  и наиболее близок (более 99% сходства 16S рРНК генов) к C. canadensis ATCC 43984Т, C. beijerinckii ATCC 19372Т и C. japonicus CECT 7219T. Штамм растет на бензойной, пара-гидроксибензойной кислотах и ацетате.

Ассоциация бактерий SMB3. Изучение влияния солености среды на рост консорциума SMB3 в минеральной среде Раймонда с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии показало, что максимальные значения оптической плотности культуры наблюдаются при 30 г/л NaCl и в отсутствие соли. Увеличение концентрации хлорида натрия в среде культивирования до 90 г/л приводило к снижению показателей ростовых характеристик. При более высоких концентрациях соли увеличения оптической плотности не зафиксировано (рис. 19). Из исследуемой ассоциации выделено семь штаммов бактерий (табл. 7), отличающиеся между собой и от выделенных ранее из района солеразработок бактерий по фенотипическим и генотипическим характеристикам (REP-, BOX-ПЦР и ARDRA).

Рис. 19. Рост ассоциации SMB3 в минеральной среде Раймонда с нафталином при разных концентрациях NaCl (г/л). 1 – без соли, 2 – 30, 3 – 60, 4 – 75, 5  90.

В состав ассоциации входят Rhodococcus sp. SMB37 и Rhodococcus sp. SMB38 - деструкторы нафталина (см. раздел 1.2.), а также штаммы, не деградирующие данное соединение (бактерии-спутники) (табл. 7), характеристики которых приводятся ниже.

Штамм Halomonas sp. SMB31, согласно филогенетическому анализу (16S рРНК), наиболее близок к Halomonas taeanensis (уровень сходства 99.8%) и характеризуется фенотипическими признаками, свойственными роду.

Таблица 7. Рост бактерий из ассоциации SMB3 на полноценной и минеральной (с нафталином) средах в присутствии разных концентраций NaCl (г/л)

Штамм

полноценная среда *

минеральная среда

с нафталином**

0

30

80

100

170

300

0

75

90

Halomonas sp. SMB31

+++

+++

+++

++

+

Arthrobacter sp. SMB32

+++

+++

+++

+

Microbacterium sp. SMB33

+++

+++

+++

++

Thalassospira permensis SMB34

+++

+++

+++

Salinicola socius SMB35

+

+++

+++

+++

++

+

Rhodococcus sp. SMB37

+++

+++

+++

+

+++

+

Rhodococcus sp. SMB38

+++

+++

+++

+

+++

+++

+

Примечание. * – рост на полноценной агаризованной среде Раймонда, ** – рост в жидкой минеральной среде Раймонда с нафталином, «–» – нет роста, «+» – «+++» – активность роста.

Штамм SMB35 образует периферическую ветвь в филогенетическом кластере, включающем роды Halomonas, Cobetia и Chromohalobacter. Уровни сходства 16S рРНК гена штамма SMB35 и видов рода Halomonas - в пределах 90.6% - 95.1%. Наиболее высокие величины сходства (95.0-95.1%) обнаружены с тремя видами рода Halomonas – H. pacifica, H. taeanensis и H. ventosae. Штамм SMB35 отличается также от видов Halomonas sensu stricto и близкородственных видов Halomonas, а также от представителей других родов семейства Наlomonadaceae по фенотипическим характеристикам (подвижность и характер расположения жгутиков, диапазон концентраций NaCl, при которых возможен рост, способность гидролизовать крахмал, желатину, твин 80, мочевину). На основании вышеперечисленных характеристик, а также отличий по содержанию Г+Ц-пар в ДНК, штамм SMB35 (=ВКМ В2397Т =DSM 19940Т) валидно описан в качестве нового рода и вида Salinicola socius в семействе Halomonadaceae.

Штамм SMB34 (сем. Rhodospirillaceae) является аэробом, хемоорганотрофом, клетки - изогнутые палочки, подвижные (один полярный жгутик). Оксидазо- и каталазоположительные. Штамм растет как в отсутствии NaCl, так и при высокой солености среды культивирования (до 80 г/л соли). Филогенетический анализ (16S рРНК)  показал, что штамм группируется с представителями рода Thalassospira и имеет наиболее высокий уровень сходства гена 16S рРНК (99.5%) с T. xiamenensis M-5T. Уровень сходства с типовым штаммом типового вида рода Thalassospira (T. lucentensis QMT2T) - 96.6%. Состав жирных кислот SMB34 и референтных штаммов оказался близким, преобладали C18:17, C16:0 , C18:0, C16:17c, C17:0 cyclo. Однако у штамма SMB34 дополнительно выявлены iso-C15:0 и anteiso-C15:0, не обнаруженные у близкородственных видов. Уровень ДНК-ДНК сходства между штаммом SMB34 и типовыми штаммами (T. xiamenensis M-5T , T. tepidiphila 1-1BT и T. profundimaris WPO211T) не превышает 50%. Основываясь на перечисленных выше данных,  штамм SMB34 (=ВКМ B2527T =NBRC 106175T) отнесен к новому виду «Thalassospira permensis».

Штаммы SMB32 и SMB33 на основании филогенетического анализа и ряда фенотипических признаков на данном этапе исследований определены как Arthrobacter sp. (группа «A. nicotianae») и Microbacterium sp., соответственно. Штаммы являются компонентами нафталинметаболизирующего консорциума SMB3, способны использовать в качестве единственного источника углерода и энергии интермедиаты деструкции нафталина – салицилат и гентизат.

Галотолерантные штаммы Rhodococcus sp. SMB37, Rhodococcus sp. SMB38, Arthrobacter sp. SMB32 и Microbacterium sp. SMB33 способны к росту на полноценной среде Раймонда без и в присутствии NaCl до 100 г/л , а «Thalassospira permensis» SMB34 растет при концентрации соли до 80 г/л  в среде культивирования (табл. 7). Умереннно галофильные, согласно классификации Кашнера (Кашнер, 1981; Ventosa et al., 1998),  штаммы SMB31 и SMB35 (сем. Halomonadaceae)  растут на полноценной среде Раймонда при 30 - 300 г/л  NaCl; оптимальный рост – при 30-100 г/л  NaCl в среде культивирования.

Штаммы Halomonas sp. SMB31 и Salinicola socius SMB35 при росте в минеральной среде Раймонда с глюкозой в качестве субстрата в условиях высокой осмолярности среды (50, 100 г/л NaCl) внутриклеточно накапливали эктоин и глутамат. В клетках S. socius при росте в присутствии 100 г/л NaCl был дополнительно обнаружен гидроксиэктоин. Полученные результаты о качественном составе осмопротекторов представителей семейства Halomonadaceae согласуются с литературными данными (Calderon et al., 2004; Vargas et al., 2006).

4.1.2. Протокооперация в нафталинметаболизирующем консорциуме бактерий SMB3

Поскольку бактерии-спутники консорциума SMB3 способны расти на интермедиатах катаболизма нафталина (салицилате, гентизате, ацетате), было проведено исследование влияния промежуточных метаболитов деструкции нафталина на структуру консорциума, используя метод ДГГЭ и подсчет КОЕ. Установлено, что культивирование консорциума на ацетате, салицилате и гентизате приводит к элиминации ряда бактерий, в то время как при инкубировании с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии состав стабильно сохраняется. Наблюдаемое уменьшение биоразнообразия консорциума SMB3 при смене источника углерода и энергии (нафталина на промежуточные продукты его метаболизма) можно объяснить сокращением звеньев трофической цепи, что ведет к конкуренции между бактериальными популяциями, трансформирующими одинаковый субстрат. Полученные результаты доказывают, что в ассоциации присутствуют сформированные трофические связи, в которых каждый член сообщества занимает определенную экологическую нишу.

Изучены кинетические параметры роста модельных смешанных культур на нафталине в условиях высокой солености среды. В экспериментах были использованы родококки - деструкторы нафталина SMB37 и SMB38, умеренно галофильный штамм Halomonas sp. SMB31 в следующих вариантах: штаммы SMB37 и SMB31 (I); штаммы SMB38 и SMB31 (II); штаммы SMB37, SMB38 и SMB31 (III). Контроль качественного состава смешанных культур бактерий осуществляли методом ДГГЭ. Результаты электрофореза подтверждают данные, полученные на основе макроморфологических свойств бактерий (подсчет КОЕ).

Показано, что умеренно галофильная бактерия Halomonas sp. SMB31 сохраняется в составе смешанных культур при культивировании на нафталине и, более того, способна к эффективному росту (рис. 20 А,Б). При совместном культивировании штаммов-деструкторов с умеренно галофильной культурой Halomonas sp. SMB31 значительно сокращается lag-период и увеличивается удельная скорость роста Rhodococcus sp. SMB38, а также увеличивается количество клеток Rhodococcus sp.  SMB37 (рис. 20 В).

I вариант  II вариант 

III вариант

Рис. 20. Рост модельных ассоциаций и индивидуальных штаммов-деструкторов в среде Раймонда на нафталине в присутствии 70 г/л NaCl. Не заштрихованные маркеры – индивидуальные бактерии, заштрихованные маркеры – штаммы в составе ассоциаций.

  Результаты модельных экспериментов, демонстрирующие наличие взаимовыгодных отношений между деструкторами и бактериями-спутниками в искусственно созданных ассоциациях, могут быть спроецированы как на отношения организмов в полученных нами путем селекции консорциумах (SMB1, SMB3), так и на отношения в микробиоценозах природных и техногенных экосистем. По всей вероятности, описанные выше взаимодействия между бактериями в условиях высокой осмолярности среды связаны с обменом осмопротекторными соединениями между членами микробных сообществ (консорциумов). Способность синтезировать осмолиты была нами выявлена у умеренно галофильных бактерий сем. Наlomonadaceae (см. раздел 4.1.1.) и галотолерантных бактерий из ассоциаций SMB1, SMB3 (см. раздел 1.5.).

4.2. Двухкомпонентная бактериальная ассоциация, осуществляющая полную деструкцию 2,4-дихлорбифенила

Штамм-деструктор хлорбифенилов Microbacterium sp. B51 не осуществляет полную утилизацию 2,4’диХБ, а разлагает его до 4ХБК (см. раздел 2.1, табл. 4). Для дополнения полного пути разложения 2,4’диХБ, утилизации хлорбензоата (рис. 21), был использован штамм-деструктор 4ХБК Arthrobacter sp. Н5 (см. раздел 3). При совместном культивировании штаммов Microbacterium sp. В51 и Arthrobacter sp. Н5 полная деструкция 2,4’диХБ и 4ХБК осуществляется за 58 часов. О минерализации 2,4’диХБ данной двухкомпонентной культурой свидетельствует и накопление в культуральной жидкости свободных ионов хлора: к 82 часам их количество составило 100% от теоретически возможного.

Рис. 21. Деструкция 2,4-дихлорбифенила двухкомпонентной бактериальной ассоциацией: 1 – рост Microbacterium sp. B51; 2 – рост Arthrobacter sp. H5; 3 - Cl-; 4 - 4ХБК; 5 - Cl-  (без внесения Arthrobacter sp. H5); 6 - 4ХБК (без внесения Arthrobacter sp. H5). Стрелкой указан момент внесения штамма Н5.

Деструкция 2,4’диХБ сопровождалась интенсивным ростом бактерий, о чем свидетельствует увеличение КОЕ штамма В51 в два раза, а штамма Н5 – в три раза. На основании полученных результатов можно сказать, что созданная нами двухкомпонентная ассоциация осуществляет деструкцию 2,4’диХБ эффективнее, чем описанные ранее смешанные культуры (Fava et al., 1994, 1996; Potrawfke et al., 1998). Одним из важных моментов, влияющих на активность деградации токсикантов, являются особенности взаимодействия бактерий в ассоциации (Davey, O’Toole, 2000; Christensen et al., 2002). Анализ параметров роста штаммов В51 и Н5 при совместном культивировании на 2,4’диХБ выявил отсутствие антагонистического действия штаммов друг на друга.

Таким образом, на примере изучения экспериментально созданной ассоциации штаммов Microbacterium sp. В51 и Arthrobacter sp. Н5 показана возможность создания комбинаций бактерий-деструкторов, которые могли бы служить основой при создании биопрепаратов, использующихся для ремедиации объектов окружающей среды от устойчивых токсичных поллютантов – полихлорированных бифенилов.

Заключение

Применение микроорганизмов для очистки окружающей среды от токсичных, устойчивых к разложению поллютантов в настоящее время приобретает все большие масштабы. Бактерии рассматриваются как перспективные объекты для создания новых экотехнологий и являются предметом всесторонних исследований. Эффективность методов биоремедиации определяется как способностью используемых организмов к полной деградации целевых токсикантов или их разложения до менее токсичных интермедиатов (утилизируемых основной массой участников микробиоценозов), так и активностью создаваемых биопрепаратов (технологий) в широком диапазоне  физико-химических условий. В результате скрининга более 500 штаммов-деструкторов полициклических  ароматических углеводородов и полихлорированных бифенилов, были выявлены и детально охарактеризованы бактерии различных эволюционных групп, способные разлагать токсиканты в широком диапазоне температур (от +4 до 40С), солености (до 80-90 г/л NaCl) и рН среды (от 5 до 9). В их числе протеобактерии (Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium), актинобактерии (Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas, Microbacterium, Rhodococcus, Dietzia, Janibacter, Kocuria, Streptomyces), спорообразующие  бактерии семейства Bacillaceae (Bacillus, Paenibacillus).

При исследовании галотолерантных нафталинметаболизирующих бактериальных консорциумов, выделенных из техногеннозасоленных почв, было продемонстрировано наличие протокооперативных отношений между их компонентами (бактериями-деструкторами ПАУ и бактериями-спутниками). Показано положительное влияние умеренно галофильных бактерий семейства Halomonadaceae (постоянных членов данных консорциумов), синтезирующих осмопротекторные соединения, на процесс разложения ПАУ в условиях повышения солености среды. Полученные результаты, несомненно, внесут существенный вклад в стратегии усовершенствования методов биоремедиации засоленных экосистем.

В результате изучения бактерий-деструкторов бифенила/ПХБ были впервые обнаружены грамположительные бактерии, осуществляющие полное разложение моно(ди)хлорбифенилов: Microbacterium sp. В51 - орто-моно(ди)ХБ; Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896) – (орто)пара-моноХБ и 2,4’диХБ, характеризующиеся  уникальными особенностями утилизации индивидуальных хлорбифенилов и их смесей - как в минеральных средах, так и в модельных почвенных системах. Штаммы могут применяться для восстановления почв, водоемов и деструкции промышленных смесей, содержащих  хлорбифенилы (Патент РФ №2262531). Было также показано, что полное разложение 2,4’-дихлорбифенила эффективно осуществляется двухкомпонентным модельным консорциумом, включающим Microbacterium sp. В51 (осуществляет деструкцию 2,4’-дихлорбифенила до 4хлорбензойной кислоты) и Arthrobacter sp. H5 (деструктор 4-хлорбензоата). Использование ассоциаций микроорганизмов, содержащих дополняющие друг друга метаболические пути разложения какого-либо субстрата, является одной из стратегий детоксикации сложных органических поллютантов и лежит в основе создании  современных биопрепаратов.

Клонирование fcb- и ohb-генов,  контролирующих пара-дегалогенирование 4ХБК и орто-дегалогенирование 2-/2,4ХБК, соответственно, и конструирование рекомбинантных путей полной деградации хлорбензоатов в клетках P. putida определило новые подходы к созданию штаммов микроорганизмов, способных к эффективной деструкции и/или детоксикации различных ксенобиотиков-поллютантов. На основе этих генов был создан ряд генетически модифицированных штаммов, осуществляющих эффективную утилизацию орто/пара-хлорбифенилов и коммерческих смесей ПХБ.

У активных бактерий-деструкторов ПАУ и бифенила/ПХБ родов Arthrobacter, Janibacter, Rhodococcus и Pseudomonas  были изучены ключевые гены начального этапа разложения этих соединений. Нуклеотидные последовательности этих функциональных генов (har, bph) включены в международные базы данных GenBank/EMBL/DDBJ. Показано, что у актинобактерий har, bph гены характеризуются большим полиморфизмом по сравнению с аналогичными функциональными генами протеобактерий рода Pseudomonas. Накопление информации о структуре генов/оперонов, определяющих ключевые моменты метаболизма токсичных соединений, имеет важное значение для развития системной биологии с целью применения ее достижений в биодеградации (Trigo et al., 2009). Подходы системной биологии, учитывающие в максимальной степени результаты экологических исследований и информацию в сфере геномики, метагеномики, протеомики и метаболомики, являются наиболее перспективными как для понимания молекулярных механизмов биодеградации трудноразлагаемых поллютантов в условиях микробиоценозов, так и для создания биопрепаратов (биотехнологий), активных в определенных биологических и физико-химических условиях, оптимизации протекания биодеградативных процессов.

Проведенные исследования выявили значительный пласт не исследованного ранее микробного разнообразия. На основании филогенетической обособленности и фенотипических отличий от ближайших таксонов, обнаружены организмы нового рода и новых видов бактерий, в их числе, характеризующиеся биодеградативными свойствами. Ряд из них (Salinicola socius,  Brevibacterium permense, Brevibacterium antiquum и Brevibacterium аurantiacum) валидно описаны в соответствии с международными правилами, описания других  («Rhodococcus naphthalenivorans» sp. nov., «Thalassospira permensis» sp. nov.) представлены в настоящее работе. Важным результатом таксономического направления исследований явилось упорядочение таксономической структуры рода Brevibacterium и доказательство наличия среди оранжево-пигментированных организмов нескольких видов внутри этого рода. Обоснование создания нового рода Salinicola для штамма SMB35 из нафталинметаболизирующего консорциума явилось важным этапом в развитии системы классификации филогенетически гетерогенного рода Halomonas и семейства Halomonadaceae в целом. В настоящее время в род Salinicola реклассифицированы некоторые ранее описанные виды родов Halomonas и Chromohalobacter (de la Haba et al., 2009).

ВЫВОДЫ

  1. Получены новые сведения о микробном разнообразии биоценозов района разработок Верхнекамского месторождения солей (г. Березники, Пермский край). Впервые выделены и изучены галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ (нафталина и фенантрена) родов Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas. Показано, что большинство исследуемых бактерий родов Pseudomonas и Arthrobacter содержат D-плазмиды, контролирующие начальные этапы разложения полиароматических соединений.
  2. Впервые изучены консорциумы бактерий, выделенные из почв/грунтов района солеразработок, способные к росту на нафталине в аэробных условиях при повышенной солености среды (до 8 - 9% NaCl). В состав консорциумов входят галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ порядка Actinomycetales, а также галотолерантные и умеренно галофильные актинобактерии и протеобактерии, не способные к росту на нафталине в чистой культуре, но синтезирующие осмопртекторные соединения. Полученные данные свидетельствуют о протокооперативных взаимоотношениях членов нафталинметаболизирующих консорциумов.
  3. На основании филогенетической обособленности (16S рРНК ген) и фенотипических отличий бактерий, входящих в  нафталинметаболизирующие консорциумы, описаны новый род Salinicola и вид Salinicola socius (семейство Halomonadaceae), а также виды «Thalassospira permensis» sp. nov. (семейство Rhodospirilaceae), Brevibacterium permense (семейство Brevibacteriaceae) «Rhodococcus naphthalenivorans» sp. nov. (семейство Nocardiaceae).
  4. Впервые описаны грамположительные бактерии, осуществляющие полное разложение моно(ди)хлорбифенилов: Microbacterium sp. В51 - орто-моно(ди)ХБ; Rhodococcus ruber Р25(=ИЭГМ 896) – (орто)пара-моноХБ и 2,4’диХБ. Обнаружены и исследованы другие бактерии-деструкторы бифенила и хлорбифенилов, характеризующиеся разной степенью деструктивной активности по отношению к ди- и три-(орто- и пара)-хлорбифенилам.
  5. Показано, что у актинобактерий (роды Arthrobacter, Janibacter, Rhodococcus) ключевые гены начального этапа разложения нафталина и бифенила характеризуются большим полиморфизмом по сравнению с аналогичными функциональными генами протеобактерий рода Pseudomonas.
  6. Клонированы и охарактеризованы fcb-гены A. globiformis  KЗT1 и ohb-гены  Pseudomonas aeruginosa 142, контролирующие реакции раннего дегалогенирования пара- и орто-хлорбензоатов, соответственно. Впервые в геноме бактерий рода Rhodococcus обнаружены гены, кодирующие компоненты 4-хлорбензоат-дегалогеназы. Выявлен значительный  (98-99%) уровень сходства исследуемых участков ДНК штамма R. ruber P25 с гомологичными (fcb) генами бактерий рода Arthrobacter.
  7. Впервые при клонировании fcb-генов в клетки P. putida (ПГБК+) сконструирован рекомбинантный путь утилизации пара-хлорбензоата. Получены рекомбинантные штаммы P. putida КЗ-6R(pPC3) и KЗ6R::Tn5K2GA[TcrfcbA1,A2,A3], способные расти на 4ХБК как единственном источнике углерода и энергии, характеризующиеся суперэкспрессией и высокой стабильностью fcb-генов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Экспериментальные статьи в журналах

  1. Егорова Д.О., Плотникова Е.Г. Грамположительные бактерии-деструкторы хлорированных бифенилов, перспективные для использования при биоремедиации загрязненных почв //  Биотехнология. - 2009. - №3. - С. 72-79.
  2. Шумкова Е.С., Соляникова И.П., Плотникова Е.Г., Головлева Л.А. Разложение пара-толуата бактерией Rhodococcus ruber P25 // Микробиология. - 2009. - Т. 78. - №3. - С. 427-429.
  3. Yastrebova O.V., Plotnikova E.G., Anan’ina L.N., Demakov V.A. Aerobic spore forming bacteria from the region of salt mining // Russian Journal of Ecology. – 2009. - V. 40. - №7. - P. 516–521.
  4. Егорова Д.О., Шумкова Е.Г., Плотникова Е.Г. Разложение моно- и полиароматических соединений новым грамположительным бактериальным штаммом // Вестник Пермского Университета. Серия биология. - 2009. - Вып. 10(36). - С. 84-89.
  5. Ястребова О.В. Ананьина Л.Н., Пастухова Е.С., Плотникова Е.Г. Разнообразие бактерий, выделенных из района солеразработок месторождения калийных солей Верхнекамья // Вестник Пермского Университета. Серия биология. - 2009. - Вып. 10(36). -С. 124-129.
  6. Ястребова О.В., Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г. Бактерии рода Bacillus, выделенные из почв района солеразработок // Вестник Пермского Университета. Серия биология. - 2008. - Вып. 7. - С. 58-62.
  7. Шумковa Е.С., Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г. Скрининг и изучение ключевых генов катаболизма бифенила у бактерий // Вестник Пермского университета. Серия биология. - 2008. - Вып. 7. - С. 53-57.
  8. Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г., Гавриш Е.Ю., Демаков В. А., Евтушенко Л.И. Salinicola socius  gen. nov., sp. nov. - умеренно галофильная бактерия из ассоциации микроорганизмов, утилизирующей нафталин // Микробиология. - 2007. - Т. 76. - № 3. - С. 369-376.
  9. Ястребова О.В., Плотникова Е.Г. Галотолерантные бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов рода Arthrobacter // Вестник Пермского Университета. Серия биология. - 2007. - Вып.5(10). - С. 100-106.
  10. Шумкова Е.С., Лобова И.В., Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г. Изучение генов, контролирующих реакцию дегалогенирования, бактерий-деструкторов 4-хлорбензоата // Вестник Пермского Университета. Серия биология. - 2007. - Вып.5(10). - С. 117-122.
  11. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О., Ананьина Л.Н., Ястребова О.В., Демаков В.А. Характеристика микроорганизмов, выделенных из техногенных почв Прикамья // Экология.  - 2006. - № 4. - С. 261-268.
  12. Ананьина Л.Н., Алтынцева О.В., Плотникова Е.Г. Изучение сообщества микроорганизмов, выделенного из района солеразработок // Вестник Пермского университета. Серия биология. - 2005. - Вып. 6. - С. 109-114.
  13. Рыбкина Д.О., Гусев В.А., Плотникова Е.Г. Почвенные микроорганизмы-деструкторы, разлагающие широкий спектр соединений техногенного происхождения // Вестник Пермского университета. Серия биология. - 2005. - Вып. 6. - С. 115-122.
  14. Гавриш Е.Ю, Краузова В.И., Потехина Н.В., Карасев С.Г., Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Коростелева Л.А., Евтушенко Л.И. Три новых вида бревибактерий - Brevibacterium antiquum sp. nov., Brevibacterium aurantiacum sp. nov. и Brevibacterium permense sp. nov. // Микробиология. - 2004. - В. 73. - №2. - С. 218-225.
  15. Рыбкина Д.О., Плотникова Е.Г., Дорофеева Л.В., Мироненко Ю.Л., Демаков В.А. Новый аэробный грамположительный микроорганизм с уникальными свойствами деструкции орто- и пара-хлорированных бифенилов // Микробиология. - 2003.  - Вып. 72. - №6. - С. 759-765.
  16. Рыбкина Д.О., Плотникова Е.Г., Демаков В.А. Деструкция хлорбензоатов почвенными бактериями // Объединенный научный журнал . - 2003. - №1. - С. 7382.
  17. Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Кошелева И.А., Пунтус И.Ф., Филонов А.Е., Гавриш Е.Ю., Демаков В.А., Боронин А.М. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок // Микробиология.  - 2001.  - № 1. - С. 61-69.
  18. Tsoi T.V., Plotnikova E.G., Cole J.R., Guerin W.F., Bagdasarian M., Tiedje J.M. Cloning, expression and nucleotide sequence of the Pseudomonas aeruginosa strain 142 ohb genes for oxygenolytic ortho-dehalogenation of halobenzoates // Appl. Environ. Microbiol. -1999. - V.65. - №5. - P. 2151-2162.
  19. Tsoi T.V., Plotnikova E.G., Cole J.R., Stoddard J., Tiedje J.M. Engineering coupled reductive ortho- + hydrolytic para-dechlorination gene system for degradation of ortho-, and para-substituted and PCBs // In: "Center for Microbial Ecology. Research findings. Fall 1996”. Michigan State University, East Lansing, USA. – 1996. - P. 174-177.
  20. Tsoi T.V., Plotnikova E.G., Cole J.R., Bagdasarian M., Tiedje J.M. Cloning and expression genes responsible for oxynolytic ortho-dehalogenation of halobenzoates // In: "Center for Microbial Ecology, Reserch findings. An NSF Science and Technology Center, Michigan State University". East Lansing, USA. - 1993. - P. 263-270.
  21. Tsoi T.V., Plotnikova E.G., Bezborodnikov S.G., Zaitsev G.M., Kosheleva I.A., Boronin A.M., Cole J.R., Tiedje J.M. Arthrobacter  globiformis KZT-1 fcb genes specifying hydrolytic para-dehalogenation of 4-chlorobenzoate // In:"Center for Microbial Ecology. Research findings. Fall 1992". Michigan State University, East Lansing, USA. – 1992. - P. 111-113.
  22. Zaitsev M.G., Tsoi T.V., Grishenkov V.G., Plotnikova E.G., Boronin A.M. Genetic control of degradation of chlorinated benzoic acids in Arthrobacter  globiformis, Corynebacterium sepedonicum and Ps.cepacia strains // FEMS Microbiol. Lett. – 1991. - V. 81. - P. 171-176.
  23. Tsoi T.V., Zaitsev G.M., Plotnikova E.G., Kosheleva I.A., Boronin A.M. Cloning and expression of the Arthrobacter globiformis KZT-1 fcb  gene encoding dehalogenase (4chlorobenzoate-hydroxylase) in E.coli  // FEMS Microbiol. Lett. – 1991. - V. 81. - P.165-170.
  24. Плотникова Е.Г., Цой Т.В., Грищенков В.Г., Зайцев Г.М., Нагаева М.В., Боронин А.М. Клонирование генов дегалогеназы штамма Arthrobacter globiformis KZT-1 и конструирование гибридного пути разложения 4-хлорбензойной кислоты в клетках Pseudomonas putida // Генетика. - 1991. - Т. 27. - C. 589-597.

Обзор

  1. Solyanikova I.P., Travkin V.M., Plotnikova E.G., Rybkina D.O., Golovleva L.A. Variability of Enzyme System of Nocardioform Bacteria as a Basis of their Metabolic Activity // Journal of Environmental Science and Health, Part B. - 2008. - V.43. - № 3. – P. 241-252.

Патенты

  1. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О., Демаков В.А. Штамм бактерий Rhodococcus ruber – деструктор полихлорированных бифенилов // Патент РФ №2262531. Опубликован 20.10.2005 г. Бюл. №29.
  2. Назаров А.В., Плотникова Е.Г., Ананьина Л.Н., Демаков В.А. Средство для очистки загрязненных почв от нефти и полициклических ароматических углеводородов в условиях повышенной минерализации среды // Заявка № 2008127332/13(033519). Положительное решение о выдаче патента.

Учебное пособие

  1. Плотникова Е.Г. Методы ДНК-типирования микроорганизмов // В кн. Молекулярная генетика. Под ред. Боронниковой С.В. Перм. ун-т, Пермь. - 2007. - С. 92101.

Статьи в научных сборниках

  1. Плотникова Е.Г, Алтынцева О.В., Егорова Д.О., Демаков В.А. Деструкция полиароматических углеводородов и хлорированных бифенилов почвенными микроорганизмами // В кн.: МНТЦ. Доклады международного семинара: Научно-технический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного комплекса. - Пермь. - 2001. - С. 325­329.
  2. Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Рыбкина Д.О. Поиск и характеристика активных бактерий-деструкторов полихлорированных бифенилов // В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал: Сборник аннотационных отчетов. – Пермь. - 2003. - С. 219223.
  3. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О., Демаков В.А. Изучение аэробных бактерий-деструкторов полихлорированных бифенилов // Материалы международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». -Минск. - 2004. - C. 237-238.
  4. Рыбкина Д.О., Плотникова Е.Г.  Восстановление техногенных территорий, загрязненных полихлорированными бифенилами, с использованием микроорганизмов-деструкторов // Материалы международной научно-практической конференция «Проблемы и перспективы реабилитации техногенных экосистем». - Астрахань. - 2004. - C. 64-68.
  5. Плотникова Е.Г., Ананьина Л.Н., Алтынцева О.В. Природные микробные ассоциации – как основа для биоремедиации загрязненных почв // Материалы международной научно-практической конференции «Проблемы и перспективы реабилитации техногенных экосистем». - Астрахань. - 2004. - C. 43-46.
  6. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О. Разложение полихлорированных бифенилов микроорганизмами // Материалы всероссийской конференции «Экологические проблемы промышленных регионов». - Екатеринбург. - 2004. - C. 354-356.
  7. Рыбкина Д.О., Плотникова Е.Г. Исследование способности штаммов-деструкторов бифенила к разложению хлорароматических ксенобиотиков // Материалы международной конференции «Татищевские чтения: Актуальные проблемы науки и практики-2004». -Тальятти. - 2004. - C. 226-230.
  8. Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Рыбкина Д.О. Поиск и характеристика активных бактерий-деструкторов полихлорированных бифенилов // В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал: Сборник аннотационных отчетов. - Пермь. - 2004. - C. 200-203.
  9. Алтынцева О.В., Рыбкина Д.О., Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г. Грамположительные бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв с высокой техногенной нагрузкой. В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал: Научно-практические итоги региональных конкурсов РФФИ-Урал в Пермском крае 2004-2006 годов. Пермь, Екатеринбург. - 2007. - C. 179-181.
  10. Плотникова Е.Г., Ястребова О.В., Егорова Д.О., Ананьина Л.Н., Шумкова Е.С. Структура и функционирование микробных сообществ района солеразработок (Пермский край). В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал: “Результаты научных исследований, полученные за 2007 год». Сборник статей. - Пермь, Екатеринбург. - 2008. - С. 124-127.
  11. Плотникова Е.Г., Ананьина Л.Н., Егорова Д.О., Шумкова Е.С., Ястребова О.В. Аэробные бактерии-деструкторы полиароматических соединений, выделенные из техногеннозагрязненных почв // Материалы международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». - Минск. - 2008. - С. 17-19.
  12. Плотникова Е.Г., Ястребова О.В., Егорова Д.О., Ананьина Л.Н., Шумкова Е.С., Головлева Л.А., Соляникова И.П., Бабошин М.А. Новые биотехнологии реабилитации техногенных территорий Пермского края. В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал: “Результаты научных исследований, полученные за 2007 год». Сборник статей. - Пермь, Екатеринбург. - 2008. - С. 128-131.

Избранные тезисы докладов и стендовых сообщений

  1. Tsoi T.V., Plotnikova E.G., Zaitsev G.M., Kosheleva I.A., Grishenkov V.G., Boronin A.M. Construction of the recombinant Pseudomonas putida strains capable of effective degradation of 4-chlorobenzoate and dechlorination of 4-chlorophenol, 4-chloroanilin and their constituent alkylated derivatives // Third international symposium on Pseudomanas. Biology and biotechnology. – Miramare Grignano, Trieste, Italy. - 1991. - P. 171.
  2. Tsoi T.V., Plotnikova E.G., Bezborodnikov S.G., Zaitsev G.M., Boronin A.M., Cole J.R., Tiedje J.M. Arthrobacter globiformis strain KZT-1 genes responsible for hydrolytic dehalogenation of 4-chlorobenzoate // ASM conference:"Anaerobic dehalogenation and its environmental implications". - Athens, USA. - 1992. - P. 10.
  3. Tsoi T.V., Bezborodnikov S.G., Plotnikova E.G., Cole J.R. The halobenzoate dehalogenation fcb operon of Arthrobacter globiformis strain KZT-1: Organization, expression, regulation and evolution. // 93th general meeting of the ASM. - Atlanta, USA. - 1993. - P. 394.
  4. Tsoi T.V., Plotnikova E.G., Cole J.R., Bagdasarian M., Tiedje J.M. Cloning of Pseudomonas aeruginosa 142 tcb genes responsible for ortho-dehalogenation of halobenzoates // 94th ASM general meeting. - Las Vegas, USA. - 1994. - P. 459.
  5. Tsoi T.V., Cole J.R., Plotnikova E.G., Hrywna Y., Tiedje J.M. Cloning of Corynebacterium sepedonicum KZ4 rod gene responsible for reductive ortho-degalogenation of halobenzoates and construction of coupled reductive ortho- and hydrolytic para-dechlorination system for degradation of PCBs // 96th ASM general meeting. - New Orleans, USA. - 1996. - P. 419.
  6. Plotnikova E.G., Maltseva O.V., Tsoi T.V., Demakov V.A., Tiedje J.M. Isolation and characterization of new PCB-degrading bacteria // International conference on environmental pollution. - Moscow, Russia. – 1998. - P. 351.
  7. Алтынцева О.В., Плотникова Е.Г., Демаков В.А. Микробная деструкция полиароматических углеводородов в условиях повышенного засоления среды // 4й Международный семинар-презентация инновационных научно-технических проектов "Биотехнологии-2000". - Пущино. - 2000. - C. 73.
  8. Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Измалкова Т.Ю., Кошелева И.А., Филонов А.Е. Деструкция полициклических ароматических углеводородов галотолерантными бактериями рода Arthrobacter // V Международный семинар-презентация инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2001». - Пущино. - 2001. -С. 138.
  9. Kosheleva I.A., Plotnikova E.G., Altyntseva O.V., Puntus I.F., Filonov A.E., Boronin A.M. Halotolerant microorganisms, degrading polycyclic aromatic hydrocarbons // Organic soil contaminants 2001: SETAC, Europe conference. - Copenhagen, Denmark. - 2001. - P. 122.
  10. Алтынцева О.В., Плотникова Е.Г., Кошелева И.А., Евтушенко Л.И., Демаков В.А. Сообщества микроорганизмов и индивидуальные штаммы бактерий, деградирующие полициклические ароматические углеводороды в условиях повышенного содержания хлорида натрия // V Международная конференция "Проблемы загрязнения окружающей среды". - Волгоград-Пермь. - 2001. - С. 53.
  11. Gavrish E., Krausova V., Plotnikova E., Potekhina N., Evtushenko L. Three new species among Brevibacterium linens-like strains // Xth international congress of bacteriology and applied microbiology. - France, Paris. - 2002. – С. 297.
  12. Kosheleva I.A., Akatova E.V., Altyntseva O.V., Plotnikova E.G., Filonov A.E. and Boronin A.M. Microbial community capable of degrading naphthalene under high salt concentration // Iat FEMS congress of European microbiologists. - Ljubljana, Slovenia. – 2003. - P. 396.
  13. Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Рыбкина Д.О. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов и хлорированных бифенилов, выделенные из донных отложений, загрязненных отходами химических производств // Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ: Матер. Междунар. Байкальского микробиологического симпозиума. - Иркутск. - 2003. - С. 125-126.
  14. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О. Бактерии-деструкторы полихлорированных бифенилов, перспективные для биоремедиации загрязненных почв // Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. - 2005. - C. 37-38.
  15. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О. Изучение грамположительных бактерий-деструкторов полихлорированных бифенилов // II Международная конференция «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал».  - Пермь-Казань.  - 2005. - С. 80.
  16. Ананьина Л.Н., Ястребова О.В., Плотникова Е.Г. Галофильные бактерии сем. Halomononaceae – продуценты внеклеточных гидролитических ферментов // Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. -2007. – Ч. 2. - C. 39.
  17. Плотникова Е.Г., Ананьина Л.Н., Ястребова О.В., Рыбкина Д.О. Разнообразие и функционирование микроорганизмов из техногенных почв солеразработок Верхнекамья // Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. - 2007. - Ч. 2. - C. 135.
  18. Шумкова Е.С., Плотникова Е. Г., Соляникова И. П., Егорова Д. О., Головлева Л. А. Разложение пара-замещенных ароматических соединений штаммом Rhodococcus ruber P25 // Международная научная конференция «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». - Минск. - 2008. - С. 10-11.
  19. Назаров А.В., Ананьина Л.Н., Ястребова О.В., Плотникова Е.Г. Оценка влияния бактериального консорциума, окисляющего нафталин, на деструкцию углеводородов в нефтезагрязненной дерново-подзолистой почве в условиях засоления // Международная научная конференция «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». - Минск. - 2008. - С. 200-201.
  20. Шумкова Е.С., Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г., Демаков В.А. Полиморфизм генов, кодирующих -субъединицу бифенил 2,3диоксигеназы, бактерий-деструкторов бифенила и полихлорированных бифенилов // III международная конференция «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал». - Пермь. - 2008. - С. 110-111.
  21. Плотникова Е.Г., Ястребова О.В., Ананьина Л.Н. Изучение генов, кодирующих большую субъединицу нафталин 1,2-диоксигеназы, бактерий-деструкторов нафталина // Пятый съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. - Москва. - 2009. - C. 40.
  22. Егорова Д.О., Плотникова Е.Г., Демаков В.А. Биоремедиация почв, загрязненных полихлорированными бифенилами, грамположительными бактериями // Актуальные проблемы микробиологии и биотехнологии: Материалы Международной научной конференции. - Кишинев. - 2009. – С. 24-25.

Список принятых сокращений: ПАУ – полициклические ароматические углеводороды; ПХБ – полихлорированные бифенилы; моноХБ - монохлорбифенил; диХБ - дихлорбифенил; триХБ - трихлорбифенил; ХБК - хлорбензойная кислота; 2,4Д – 2,4дихлорфеноксиуксусная кислота; ГОФДК – 2гидрокси-6-оксо-6-фенилгекса-2,4-диеновая кислота; ПГБК – пара-гидроксибензойная кислота; ПКК – протокатеховая кислота; ТСХ - тонкослойная хроматография; ВЭЖХ-высокоэффективная жидкостная хроматография; ГЖХ – газожидкостная хроматография; ОП – оптическая плотность; о.е. – оптические единицы; КОЕ – колониеобразующие единицы; ДГГЭ – денатурирующий градиентный гель электрофорез; НДО – нафталин диоксигеназа; ОГБД - орто-галобензоат 1,2-диоксигеназа; ЯМР – ядерный магнитный резонанс; ПЦР – полимеразная цепная реакция; ARDRA (amplified 16S rDNA restriction analysis) - рестрикционный анализ амплифицированных рибосомальных ДНК.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.