WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

ГОНГАДЗЕ Георгий Михайлович 5S рРНК-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ РИБОСОМЫ:

СТРУКТУРА, ФУНКЦИЯ И ЭВОЛЮЦИЯ 03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2010

Работа выполнена в лаборатории структурных исследований аппарата трансляции Института белка РАН ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор химических наук, профессор, академик РАН Богданов Алексей Алексеевич Доктор биологических наук Железная Людмила Алексеевна Доктор физико-математических наук Хечинашвили Николай Николаевич ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Филиал Института биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова РАН.

Защита состоится «___»________2010 года в____часов на заседании диссертационного Совета Д 501.001.76. по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд. 536.

C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «___»__________________2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И. А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синтез белков на рибосоме является одним из ключевых процессов жизнедеятельности любого организма, поэтому выяснение принципов структурной организации рибосомы и молекулярных механизмов трансляции является одной из самых актуальных проблем молекулярной биологии. С одной стороны, рибосома – это уникальный рибонуклеопротеид, консервативность структуры которого определяет универсальность ключевых этапов биосинтеза белка в клетках разных организмов. С другой стороны, сама уникальная и консервативная структура рибосомы в значительной степени зависит от специфических молекулярных контактов между ее компонентами. В связи с этим, в рамках проблемы биосинтеза белка, одной из наиболее приоритетных задач является выяснение роли отдельных рибосомных компонентов и их межмолекулярных контактов в формировании и функционировании рибосомы. Кроме того актуальность проблемы определяется еще тем, что ее решение имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение, так как именно рибосома является мишенью для целого ряда внеклеточных агентов (например, антибиотики и токсины).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение структуры бактериального 5S рРНК-белкового комплекса и специфических взаимодействий в нем, а также выяснение роли 5S рРНК-связывающих белков в сборке функционально-активной бактериальной рибосомы. Для выполнения данной работы были поставлены следующие основные задачи:

Идентификация 5S рРНК-связывающих белков рибосомы Thermus thermophilus и выявление их гомологии с белками из других организмов.

Определение участков связывания рибосомных белков T. thermophilus на молекуле 5S рРНК. Выявление участков белков и РНК, определяющих специфическое взаимодействие в бактериальном 5S рРНК-белковом комплексе.

Определение пространственных структур 5S рРНК-связывающих белков T.

thermophilus и их комплексов с РНК.

Установление степени необходимости каждого из 5S рРНК-связывающих рибосомных белков Escherichia coli для выживания бактериальной клетки и функционирования ее аппарата трансляции.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе была поставлена точка в давнем вопросе о численности бактериальных 5S рРНКсвязывающихся рибосомных белков: их оказалось три, и один из них, белок семейства СТС, является особенностью бактериального аппарата трансляции.

Впервые было продемонстрировано, что представители семейства СТС, такие рибосомные белки как TL5 T. thermophilus и L25 E. coli, а также основной стрессовый белок CTC B. subtilis, являются не только структурными, но и функциональными гомологами. Впервые показано, что местом специфического связывания рибосомного белка L5 на 5S рРНК является С-петля. Определенная в данной работе пространственная структура большей части 5S рРНК-белкового комплекса с высоким разрешением внесла существенный вклад в построение модели рибосомы, и является востребованной до сих пор в исследованиях детальной структурной организации бактериальной рибосомы. В работе также получены данные, которые позволили впервые оценить степень необходимости каждого из 5S рРНК-связывающих белков для сборки функционально-активной рибосомы in vivo и для выживания бактериальной клетки. Впервые показано, что белок семейства СТС, не являясь необходимым для выживания клеток E. coli, чрезвычайно важен для стабилизации структуры центрального протуберанца рибосомной 50S субчастицы.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертационной работы опубликованы в 19 статьях в российских и международных журналах и 29 тезисах, представленных на международных и российских конференциях: “ Frontiers in translation” (Виктория, Канада, 1995), “Thermophiles-96” (Атенс, США, 1996), “Structural aspects of protein synthesis” (Таллберг, Швеция, 1997), “Extremophiles-98” (Йокогама, Япония, 1998), “Thermophiles-98” (Брест, Франция, 1998), “The ribosome.

Structure, function, antibiotics and cellular interactions” (Хельсинор, Дания, 1999), “Protein synthesis” (Пущино, Россия, 2001), “Crystallization of Biological Macromolecules” (Йена, Германия, 2002), “The 8th International Engelgardt conference on molecular biology. RNA-protein interaction” (Буран, Россия, 2006), International conference in honour of Alexander Spirin “Protein biosynthesis, structure and function” (Пущино, Россия, 2007), Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, Россия, 2001-2009), «Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва, Россия, 2009).

Личный вклад автора. Результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук, Российского фонда фундаментальных исследований (гранты: 95-04-11845, 98-04-48314, 01-04-48396, 03-04-48393, 08-04-00459), Шведской академии наук и Федерации европейского биохимического общества.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 3страницах, состоит из введения, трех глав (обзор литературы, результаты и их обсуждение, экспериментальная часть), заключения, выводов, списка цитируемой литературы (575 ссылок) и содержит 73 рисунков и 10 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

К моменту начала нашей работы о 5S рРНК был уже накоплен значительный экспериментальный материал, однако о рибосомных белках, специфически связывающихся с этой РНК, было известно еще очень мало. Так в Археях, Бактериях и Эукариотах было обнаружено разное количество 5S рРНК-связывающихся белков.

Более того даже в двух бактериях, для которых были идентифицированы 5S рРНКсвязывающиеся белки, их число оказалось различным: в Bacillus stearothermophilus – два, L5 и L18, а в Escherichia coli – три, L5, L18 и L25. Поэтому было неясно, сколько белков, специфически связывающихся с рибосомной 5S РНК, характерно для бактериальной рибосомы. Кроме того, несмотря на многолетние исследования, участки связывания бактериальных рибосомных белков L5 и L18 на 5S рРНК были определены только приблизительно. О роли указанных рибосомных белков в формировании и функционировании бактериальной рибосомы было практически ничего не известно. Было только показано, что белки L5 и L18 необходимы для взаимодействия изолированных 5S рРНК и 23S рРНК. Вопрос о пространственной структуре 5S рРНК-белкового комплекса и его компонентов был совершенно не изучен, и потому оставался очень актуальным. Учитывая сложившуюся ситуацию, нами были определены три основных направления в исследованиях: идентификация и изучение 5S рРНК-связывающих свойств рибосомных белков Thermus thermophilus и их гомологов из других бактерий; определение пространственной структуры данных белков и их комплексов с 5S рРНК; выяснение роли 5S рРНК-связывающих белков в формировании функционально-активной бактериальной рибосомы.

1. Рибосомные белки Thermus thermophilus, специфически связывающиеся с 5S рРНК В первых же экспериментах нами были обнаружены два рибосомных белка T.

thermophilus (20 и 23 kDa), образующие стабильный комплекс с изолированной 5S рРНК. По данным двумерного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) этими белками оказались TL4 и TL5 (Рис. 1Б). Белок TL4 – это типичный основной рибосомный белок, а белок TL5 является одним из самых кислых белков 50S рибосомной субчастицы T. thermophilus (Рис. 1А). Белок с такой электрофоретической подвижностью среди рибосомных белков E. coli, B. subtilis и B.

stearothermophilus ранее не обнаруживался. Таким образом, выявленный нами 5S рРНК-связывающий белок TL5 можно было отнести к особенным белкам рибосомы данной бактерии. Рибосомные белки TL4 и TL5 T. thermophilus были выделены и охарактеризованы. Эти белки как независимо, так и вместе образовывали эквимолярный комплекс с 5S рРНК T. thermophilus, E. coli или B. stearothermophilus.

Рис. 1. Двумерный электрофорез в ПААГ рибосомных белков T. thermophilus. А – суммарный белок 50S субчастицы; Б – 5S рРНК-связывающие белки.

Учитывая этот результат, была проверена способность белков TL4 и TLконкурировать с рибосомными белками L5, L18 и L25 из E. coli за связывание 5S рРНК. Оказалось, что белок TL4 конкурирует за связывание 5S рРНК с белком L5, а TL5 – с белками L18 и L25. То, что с 5S рРНК связываются только два рибосомных белка T. thermophilus в середине 90х годов не казалось необычным, так как статистических данных о числе бактериальных 5S рРНК-связывающихся белков на тот момент не было. Однако два появившихся в тот период времени факта подвигли нас на продолжение поисков других 5S рРНК-связывающихся белков этой бактерии.

Во-первых, в нашей лаборатории при секвенировании участка хромосомы T.

thermophilus (часть spc-оперона) был обнаружен ген, кодирующий белок, гомологичный 5S рРНК-связывающему белку L18 E. coli (Vysotskaya et al., 1997). Вовторых, в некоторых наших реконструкционных экспериментах в комплексе с 5S рРНК обнаруживался в следовых количествах третий белок с молекулярной массой около 10 kDa. После оптимизации условий эксперимента нами был идентифицирован третий 5S рРНК-связывающий белок T. thermophilus. В соответствии с номенклатурой двумерного электрофореза им оказался белок TL18 (Рис. 1Б). Таким образом, было показано, что три белка рибосомы T. thermophilus, TL4, TL5 и TL18, образуют прочный специфический комплекс с изолированной 5S рРНК. В связи с полученными данными возникал вполне закономерный вопрос: есть ли среди известных белков других организмов гомологи белков TL4, TL5 и TL18? К середине 90х годов только для нескольких белков большой рибосомной субчастицы T. thermophilus была проведена сравнительная идентификация с белками из других организмов, все белки были идентифицированы значительно позже (Katsani et al., 2000). Поэтому, нами была определена N-концевая аминокислотная последовательность (39 остатков) белка TL4 (Рис. 2). Сравнение этого участка белка TL4 с первичными структурами известных белков выявило явную гомологию с 5S рРНК-связывающими рибосомными белками семейства L5. Как видно на рисунке 2, Рис. 2. Сравнение N-концевых аминокислотных последовательностей белков TL4 и TL5 T.

thermophilus с соответствующими участками рибосомных белков из других организмов.

EcoL5, BstL5 и TfN – рибосомные белки L5 из E. coli, B.

stearothermophilus и неизвестный 5S рРНК связывающий белок из Thermus flavus, соответственно.

N-концевые участки белков TL4 и 5S рРНК-связывающих рибосомных белков L5 E.

coli и B. stearothermophilus консервативны. Становилось очевидным, что белок TL4 T.

thermophilus является представителем семейства рибосомных белков L5. Учитывая полученные результаты и данные об организации генов spc оперона T. thermophilus, полученные в нашей лаборатории, мы клонировали и экспрессировали гены rpl5 и rpl18 T. thermophilus в штамме-продуценте E. coli. Сравнение свойств рекомбинантного белка TthL5 и рибосомного белка TL4 T. thermophilus позволило окончательно убедиться в том, что белок TL4 является продуктом гена rpl5. Кроме того сравнение свойств рибосомного белка TL18 и рекомбинантного белка TthL(продукт гена rpl18 T. thermophilus) показало, что это один и тот же белок. Таким образом, учитывая все имеющиеся данные, мы могли с полной уверенностью заключить, что белки TL4 и TL18 T. thermophilus являются гомологами известных 5S рРНК-связывающихся рибосомных белков L5 и L18 E. coli, соответственно.

Ситуация с выявлением гомологов белка TL5 оказалась гораздо сложнее, чем с двумя указанными белками T. thermophilus. Нами была определена N-концевая аминокислотная последовательность (53 остатка) белка TL5 T.thermophilus (Рис. 2).

Однако этот участок белка TL5 не обнаружил какой-либо достаточно выраженной гомологии с первичными структурами известных рибосомных белков. В то же время, в лаборатории Волькера Эрдманна был выявлен 5S рРНК-связывающий белок из T.

flavus с практически идентичной N-концевой аминокислотной последовательностью (Рис. 2). Таким образом, становилось очевидным, что, по крайней мере, два представителя рода Thermus имеют такой 5S рРНК-связывающий белок. Используя метод ограниченного протеолиза, нами были исследованы некоторые свойства необычного рибосомного белка TL5. Было обнаружено, что при гидролизе от свободного белка отщепляется с N-конца очень нестабильный фрагмент примерно 8-kDa (75-80 остатков). При этом белок, лишенный указанного N-концевого участка, оказывался неспособным связываться с 5S рРНК. В то же время данный N-концевой участок белка TL5 становился недоступным для гидролиза в комплексе с 5S рРНК. Из полученных данных следовало, что N-концевой участок белка TL5 примерно в аминокислотных остатков строго необходим для связывания 5S рРНК.

Так как, несмотря на все полученные данные, ситуация с обнаружением гомологов белка TL5 так и не прояснилась, мы решили секвенировать ген этого белка.

Используя информацию об аминокислотной последовательности некоторых участков белка, был клонирован соответствующий фрагмент ДНК T. thermophilus. Анализ нуклеотидной последовательности этого фрагмента ДНК (1000 bp) выявил наличие в нем открытой рамки считывания (ОРС), которая была фланкирована инициаторным и терминационным кодонами. Данная ОРС кодировала полипептид в 2аминокислотных остатков (Рис. 3). N-концевой район и область 80-90 остатков этого полипептида были идентичны N-концевым участкам белка TL5 и его большого триптического фрагмента, соответственно. Таким образом, мы пришли к заключению, что выявленный нами ген в ДНК T. thermophilus кодирует рибосомный белок TL5.

Поиск гомологов белка TL5 в доступных базах данных (SWISS-PROT, PDB и PIR) не выявил выраженного сходства с известными 5S рРНК-связывающими или другими рибосомными белками. Неожиданным оказалось то, что наибольшее сходство с белком TL5 обнаружил основной стрессовый белок CTC из Bacillus subtilis. Белки TL5 и CTC имеют сходный размер (206 и 204 аминокислотных остатков, соответственно). Сравнение первичных структур этих белков продемонстрировало Рис. 3. Сравнение первичных структур рибосомных белков TL5 T. thermophilus и L25 E.

coli, а также основного стрессового белка CTC B. subtilis.

очевидную, хотя и не очень высокую гомологию между ними (Рис. 3).

Аминокислотные последовательности этих белков оказались гомологичны по всей длине и имели 32.5% идентичных и 53.4% сходных остатков. На момент наших исследований о белке CTC было мало что известно. Было только продемонстрировано, что экспрессия гена ctc индуцируется в клетках B. subtilis в ответ на различные типы стресса (Hecker & Volker, 1990; Volker et al., 1994). О функции белка СТС в бактериальной клетке ничего не было известно.

Еще одной удивительной находкой оказалось то, что аминокислотная последовательность N-концевого участка белка СТС обнаруживала достаточно очевидную гомологию (Рис. 3) с первичной структурой рибосомного белка L25 из E.

coli. Поэтому нами был проведен более тщательный сравнительный анализ первичных структур всех трех белков. Соответствующее выравнивание аминокислотных последовательностей белков TL5, СТС и L25 расставило все точки над «и» (Рис. 3). Во-первых, даже при наилучшем выравнивании первичных структур белков L25 и TL5 наблюдался довольно низкий уровень гомологии (18% идентичности; 40% сходства) между ними. Становилось понятным, почему ранее поиск гомологов не давал результатов. Во-вторых, кластерность расположения идентичных и сходных остатков во всех указанных структурах свидетельствовала о выраженной консервативности отдельных участков этих белков. В-третьих, именно N-концевой участок белка TL5, необходимый для взаимодействия с 5S рРНК, обнаруживал гомологию с белком L25. Таким образом, тщательное сравнение первичных структур рибосомных белков TL5 и L25, а также основного стрессового белка СТС, позволило сделать заключение, что, несмотря на отсутствие ярко выраженной гомологии, эти белки являются родственными. Совокупность полученных данных позволила нам сделать предварительный вывод о том, что именно N-концевой участок белка TL5 образует домен, который может играть роль белка L25 в рибосоме T. thermophilus.

Как было отмечено выше, N-концевой триптический фрагмент (75-80 остатков) белка TL5 необходим для взаимодействия с 5S рРНК. Однако этот изолированный Рис. 4. Взаимодействие белка TL5 и его N-концевого фрагмента (TL5fr91) с 5S рРНК (12% ПААГэлекторофорез, неденатурирующие условия). 1 – 5S рРНК E. coli; 2 – 5S рРНК E. coli + TL5 (1:1); 3 – 5S rRNA T. thermophilus + TL5fr(1:1); 4 – 5S рРНК E. coli + TL5fr91 (1:1); 5 – 5S рРНК + TL5fr91 (1:2); 6 – 5S rRNA + TL5 + TL5fr91 (1:1:1); 7 – 5S rRNA + TL5fr91 + TL5 (1:1:1); 8 – TL5 + TL5fr91 + 5S rRNA (1:1:1); – 5S rRNA + TL5 + TL5fr91 (1:3:1); 10 – tRNA E. coli; 11 – tRNA + TL5fr91 (1:3). Отмечена последовательность добавления компонентов при реконструкции и их молярные соотношения (в скобках).

фрагмент и сходный по размеру N-концевой фрагмент TL5 (остатки 1-80), полученный генно-инженерным методом, были неактивны в связывании 5S рРНК.

После того как стала известна полная аминокислотная последовательность TL5, стало очевидно, что участком белка, гомологичным и соразмерным 5S рРНКсвязывающему рибосомному белку L25 из E. coli, является район с 1 по 91 остаток (Рис. 3). В связи с этим нами был получен соответствующий фрагмент белка, TL5fr91, и проверена его способность связываться с 5S рРНК. На рисунке 4 видно, что TL5frсвязывается с высокой специфичностью с 5S рРНК T. thermophilus и E. coli (дорожки 3, 4), и более того, вытесняет интактный белок TL5 из комплекса (дорожки 6-9).

Можно было считать доказанным, что изолированный TL5fr91 представляет собой функционально активный РНК-связывающий домен белка TL5. Полученные данные также указывали на важность остатков 80-91 белка TL5 для формирования его РНКсвязывающего домена.

2. Формирование 5S рРНК-белкового комплекса Thermus thermophilus Идентификация всех белков 5S рРНК-белкового комплекса T. thermophilus позволила нам провести детальное исследование процесса формирования данного РНК-белкового комплекса. В отличие от гомологов из E. coli, каждый из исследуемых нами рибосомных белков T. thermophilus был способен образовывать эквимолярный прочный комплекс с изолированной 5S рРНК, независимо или совместно.

Консервативность структуры бактериальной 5S рРНК дала нам возможность использовать в работе не только гомологические, но гетерологические РНК-белковые комплексы. Кроме того комплексы 5S рРНК с белками TthL5, TL5 и TthL18 оказались очень стабильны в широком диапазоне условий эксперимента. Все это позволило нам провести исследования, результаты которых внесли существенный вклад в локализацию участков связывания бактериальных рибосомных белков на молекуле 5S рРНК, (сайты связывания для белков L5 и L18 E. coli были окончательно установлены только в 2005 году при кристаллографических исследованиях рибосомы).

Известно, что 5S рРНК из E. coli и других бактерий при ограниченном гидролизе РНКазой А образует крупные стабильные фрагменты (Рис. 5А). Ранее было продемонстрировано, что один из фрагментов 5S рРНК E. coli (Fr5S), состоящий из двух-трех субфрагментов (1-11 и 69-120 (69-87 и 89-120) нуклеотиды), образует комплекс с белком L25 (Doutwaite et al., 1979). Другой фрагмент 5S рРНК E. coli (Fr5S), состоящий из двух субфрагментов (15-36 и 44-65 нуклеотиды), с рибосомными белками не связывался. Используя метод ограниченного гидролиза РНК рибонуклеазой А, нами был установлен участок 5S рРНК, взаимодействующий с рибосомным белком TL5 T. thermophilus. Оказалось, что фрагмент 5S рРНК размером примерно 60 нуклеотидов (рис. 5А, Fr5S), связывающий белок L25 E. coli, образует специфический комплекс и с рибосомным белком TL5 (рис. 5Б, дорожка 4). Далее нами был установлен минимальный фрагмент 5S рРНК, который формировал стабильный комплекс с TL5 и его РНК-связывающим доменом (TL5fr91). В уже отмеченной выше работе Доутвейта с коллегами было показано, что 5S рРНК E. coli, находясь в комплексе с белком L25, гидролизуется РНКазой А с образованием нуклеотидного фрагмента (69-87 и 90-110 нуклеотиды). Мы получили аналогичный по размеру фрагмент 5S рРНК E. coli (Рис. 5Б, дорожка 5), защищаемый белком TLРис. 5. Участок связывания белка TL5 T. thermophilus на 5S рРНК. А - схема вторичной структуры 5S рРНК, на которой отмечены стрелками участки доступные РНКазе А для изолированной РНК. В рамки взяты фрагменты 5S рРНК, образующие комплекс с белком TL5 (данные фрагменты были секвенированы). Б - электрофоретический анализ (12% ПААГэ, неденатурирующие условия) взаимодействия белка TL5 и его РНК-связывающего домена (TL5fr91) с полученными фрагментами 5S рРНК E. coli. 1 - 5S рРНК; 2 - 5S рРНК + TL5; 3 – фрагмент РНК (Fr5S); 4 – Fr5S +TL5; 5 – фрагмент РНК (Fr5S); 6 – Fr5S + TL5; 7 – Fr5S + TL5 fr91.

от гидролиза РНКазой A. Этот фрагмент 5S рРНК состоял из двух цепочек, и по данным секвенирования соответствовал участку 5S рРНК G69-U87 и C91-C110 (Рис. 5А, Fr5S). Данный фрагмент был способен формировать стабильный комплекс с белком TL5 и TL5fr91 (Рис. 5Б, дорожки 6 и 7). Сходный по характеристикам TL5связывающий 40 нуклеотидный фрагмент (Fr5S) 5S рРНК T. thermophilus был также получен. Из полученных данных следовало, что область взаимодействия белка TL(его РНК-связывающего домена) на 5S рРНК ограничивается петлей E, спиралями IV и V (Рис. 5А). Таким образом, участки связывания на молекуле 5S рРНК для белка TL5 и его гомолога, белка L25 E. coli, оказывались практически одинаковыми.

Для картирования на 5S рРНК участков связывания белков TthL5 и TthL18 на первом этапе нами также был использован метод гидролиза РНК рибонуклеазой A.

Картина энзиматического гидролиза или химической модификации нуклеотидов 5S рРНК E. coli и B. stearothermophilus, изолированной или связанной с рибосомными белками, достаточно подробно описана в литературе. Однако к началу наших работ, несмотря на многочисленные данные об участках 5S рРНК, изменяющих свою доступность различным агентам в присутствии бактериальных рибосомных белков Lи L18, конкретные сайты связывания этих белков на РНК не были установлены.

Данные рибосомные белки E. coli диссоциировали от РНК в процессе гидролиза 5S рРНК (Douthwaite et al., 1982; Leontis & Moore, 1986). Можно было предположить, что взаимодействие белков L5 и L18 E. coli с 5S рРНК было недостаточно прочным для защиты собственных сайтов на молекуле РНК.

Два описанных выше стабильных фрагмента 5S рРНК, образующихся при гидролизе РНКазой А, были нами проверены на связывание исследуемых белков. Ни белок TthL18, ни белок TthL5 не были способны образовывать комплекс с этими фрагментами 5S рРНК. Такие результаты нас не очень удивили, так как совпадали с данными полученными для гомологичных белков из E. coli. Однако, в отличие от своего аналога из мезофильного организма, белок L18 T. thermophilus оказался способным защитить 5S рРНК от энзиматического гидролиза. Так, 5S рРНК, гидролизованная в комплексе с белком TthL18, не диссоциировала на фрагменты (Рис. 6А, дорожка 4) и сохраняла способность специфически связывать этот белок (Рис. 6А, дорожка 6). Однако такая РНК была неспособна связывать белок TthL5.

После гидролиза 5S рРНК в присутствии обоих белков, TthL5 и TthL18, РНК не диссоциировала на фрагменты и была способна связывать не только TthL18, но и TthL5 или оба белка одновременно (Рис. 6Б, дорожка 5-8, соответственно). Таким образом, нами было установлено, что белок TthL18 способен сам по себе защищать свой участок связывания на 5S рРНК, в то время как место связывания белка TthL5 с РНК защищалось от гидролиза только в комплексе с обоими белками – TthL18 и TthL5. Сегодня, когда по кристаллографическим данным известно, что в бактериальной рибосоме белки L5 и L18 не образуют между собой прямых контактов, обнаруженный нами совместный эффект двух белков может быть интерпретирован стабилизацией этими белками определенной конформации 5S рРНК. Сравнительный анализ полученных продуктов гидролиза 5S рРНК показал, что состав субфрагментов, Рис. 6. Электрофоретический анализ взаимодействия белков TthL5 и TthL18 с интактной или обработанной РНКазой А 5S рРНК E. coli (А и Б, 10% ПААГэлектрофорез, неденатурирующие условия). А: 1 – 5S рРНК; 2 – комплекс 5S рРНКTthL18; 3 – продукты гидролиза 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:25, w/w); 4 – продукты гидролиза 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:25, w/w) в присутствии белка TthL18 (с последующей фенольной депротеинизацией); 5 – гидролизат 5S рРНК (аналогично 3) + TthL18; 6 – гидролизат 5S рРНК (аналогично 4) + TthL18; Б: 1 - 5S рРНК; 2 – комплекс 5S рРНК-TthL18; 3 – комплекс 5S рРНК-TthL5; 4 – комплекс 5S рРНК-TthL5-TthL18; – продукты гидролиза 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:25, w/w) в присутствии белков TthL5 и TthL18 (с последующей фенольной депротеинизацией); 6 – гидролизат 5S рРНК (аналогично 5) + TthL18; 7 – гидролизат 5S рРНК (аналогично 5) + TthL5; 8 – гидролизат 5S рРНК (аналогично 5) + TthL5 и TthL18. В: 1 – 5S рРНК; 2 – продукты гидролиза 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:25, w/w) в присутствии белка TthL18; 3, 4 – продукты гидролиза 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:500 и 1:25, w/w, соответственно) в присутствии белков TthL5 и TthL18. (12% ПААГ-электрофорез, денатурирующие условия). Справа обозначены размеры фрагментов РНК в нуклеотидных остатках.

Звездочкой отмечено положение 3’-меченого фрагмента 5S рРНК.

полученных при гидролизе РНК в комплексе с белком TthL18 (Рис. 6В, дорожка 2) или с белками TthL18 и TthL5 (Рис. 6В, дорожка 4) отличается от такового для РНК в свободном состоянии. Так, в случае комплекса 5S рРНК/TthL18 накапливается новый субфрагмент длиной 45 нуклеотидов (Рис. 6В, дорожка 2). В случае комплекса 5S рРНК с двумя белками появляется и накапливается субфрагмент длиной нуклеотидов (Рис. 6В, дорожки 3-4). Секвенирование данных субфрагментов показало, что субфрагмент 45 нуклеотидов охватывает участок G44-U87, а субфрагмент 50 нуклеотидов – C36-U87 (схема на Рис. 7А). Таким образом, из полученных данных следовало, что белок TthL18 защищает в 5S рРНК от гидролиза район U65-C68 (спираль II и петля А), а белок TthL5, добавленный к комплексу 5S рРНК/TthL18, защищает район C36-C43 (петля С). Кроме того, во всех экспериментах обнаруживались также два одинаковых субфрагмента, которые являлись участками Рис. 7. Участки связывания белков TthL5 и TthL18 на 5S рРНК. А - схема вторичной структуры 5S рРНК, на которой отмечены участки защищаемые белками TthL5 и TthL18 от гидролиза рибонуклеазой А. В рамку взяты фрагменты 5S рРНК, синтезированные in vitro. Б - электрофоретический анализ (12% ПААГ, неденатурирующие условия) взаимодействия белков TthL5 и TthL18 с синтезированным фрагментом Fr5SS2. 1 – (Fr5SS2); 2 – Fr5SS2 + TthL5;

Электрофоретический анализ (6-25% ПААГ, неденатурирующие условия) взаимодействия белков TthL5 и TthL18 с синтезированным фрагментом Fr5S. 3 – Fr5S +TthL18; 4 – Fr5S +TthL5; 5 – Fr5S +TthL5+TthL18; 6 – Fr5S.

С90-U120 и A15-C35. Эти данные свидетельствуют о том, что белки TthL5 и TthL18 не защищают петлю D и часть петли A от гидролиза (схема на Рис. 7А). Таким образом, нам впервые удалось идентифицировать участки 5S рРНК, которые защищаются рибосомными белками L5 и L18 от гидролиза ферментом. Учитывая то, что белки TthL5 и TthL18 не только эффективно защищают участки C36-C43 и U65-C68, но и взаимодействуют повторно только с РНК, сохранившей указанные участки, можно было заключить – данные области 5S рРНК важны для связывания этих белков.

Полученные результаты пока еще не позволяли точно и надежно идентифицировать сайты связывания белков L5 и L18 T. thermophilus на молекуле 5S рРНК. Поэтому нами были синтезированы три фрагмента 5S рРНК E. coli, входящие в ее домен : два коротких фрагмента, Fr5SS1 (G16-C27/G56-C68) и Fr5SS2 (C28-G56), а также длинный фрагмент, Fr5S (G16-C68), охватывающий весь домен . Эти фрагменты были испытаны в экспериментах по связыванию исследуемых белков. Как видно на рисунке 7Б, Fr5SS2 образует прочный комплекс с белком TthL5 (дорожка 2). То, что 5S рРНК-связывающие белки TL5 и TthL18 и некоторые другие рибосомные белки T.

thermophilus не взаимодействовали с Fr5SS2, указывало на исключительную специфичность комплекса данного фрагмента 5S рРНК и белка TthL5. Таким образом, нам впервые удалось получить минимальный фрагмент 5S рРНК, связывающий рибосомный белок L5, а также идентифицировать основной сайт (петля C) его связывания на молекуле РНК. В то же время оказалось, что фрагмент Fr5SS1, включающий по нашим данным единственный защищаемый белком L18 участок РНК, а по литературным данным содержащий большую часть сайта связывания белка, не связывал белок TthL18. Однако больший фрагмент, Fr5S, представляющий собой полноразмерный домен 5S рРНК, образовывал комплекс не только с белком TthL5, но и с белком TthL18 (Рис 7Б, дорожки 3-5). Таким образом, область взаимодействия белка L18 T. thermophilus с 5S рРНК оказывалась более протяженной, чем участок (U65-C68) защищаемый белком от гидролиза, и охватывала большую часть домена . Учитывая полученные данные можно было предположить, что белок Lимеет два участка связывания на молекуле 5S рРНК.

Сравнение полученных нами данных с сегодняшними кристаллографическими данными о пространственной структуре архейной и бактериальных рибосом позволяют выявить сходство и различия во взаимодействии белков L5 и L18 с 5S рРНК в изолированном комплексе и в составе рибосомы. Определенный нами почти 10 лет назад основной сайт связывания белка L5 на молекуле 5S рРНК сегодня полностью подтвердился результатами структурных исследований. Что же касается участка связывания бактериального рибосомного белка L18 на молекуле 5S рРНК, то только кристаллографические исследования рибосом позволили ответить на этот непростой вопрос.

3. Пространственная структура компонентов бактериального 5S рРНКбелкового комплекса В данной работе был проведен поиск условий кристаллизации для идентифицированных 5S рРНК-связывающих белков T. thermophilus и их комплексов с 5S рРНК или ее фрагментами из разных бактерий. Для этого были использованы 5S рРНК E.coli, T. thermophilus и B. stearothermophilus, а также ряд специфических фрагментов 5S рРНК: Fr5S, Fr5S, Fr5SS2 и Fr5S E.coli, а также Fr5S T.

thermophilus. Кроме белка TL5 для кристаллизации РНК-белковых комплексов использовался его фрагмент, TL5fr91. Для ряда объектов удалось получить кристаллы (белок TthL5, комплексы: TL5-Fr5S E.coli, TL5fr91-Fr5S E.coli, TthL18-5S рРНК T.

thermophilus), однако, большинство этих кристаллов отражали рентгеновские лучи с низким разрешением. Так как кристаллы комплекса TthL18-5S рРНК T. thermophilus отражали рентгеновские лучи только до 8 , для определения структуры белка TthL18 нами был использован метод ЯМР. Наиболее успешными в кристаллизации оказались два объекта. Комплекс TL5-Fr5S E.coli кристаллизовался как гексагональные линзы (Рис. 8А), отражающие рентгеновские лучи с разрешением до Рис. 8. Кристаллы РНК-белковых комплексов. А – комплекс 40 нуклеотидного фрагмента 5S рРНК (Fr5S) E. coli с белком TL5; Б – комплекс 34 нуклеотидного фрагмента 5S рРНК (Fr5SS2) E. coli с белком TthL5.

2.3 . Кристаллы комплекса TthL5-Fr5SS2 E. coli представляли собой многогранные призмы (Рис. 8Б) и отражали рентгеновские лучи до 2.5 . Именно эти кристаллы и были нами использованы для структурных исследований.

Определение пространственной структуры 5S рРНК-связывающих белков и их комплексов с РНК проводили в совместной работе с группами Станислава Владимировича Никонова (Институт белка, РАН) и Торлифа Харда (Королевский Технологический Институт Стокгольма, Швеция).

Модель пространственной структуры белка TL5 T. thermophilus представлена на рисунке 9А. Молекула белка состоит из двух доменов, расположенных друг относительно друга под углом 90, и образует вытянутую L-образную структуру. Cконцевой участок выступает из тела домена белка и очень подвижен:

интерпретируемая электронная плотность распространяется только до E185. Nконцевой домен белка TL5 охватывает 1-91 остаток молекулы. Этот результат полностью подтверждает наши выводы, сделанные из биохимических экспериментов о том, что участок белка TL5 с 1 по91 остаток формирует его самостоятельный домен.

Этот домен белка включает -бочонок, образованный двумя почти перпендикулярно расположенными -листами (Рис. 9А). Один -лист состоит из двух параллельных Рис. 9. А – Ленточная модель пространственной структуры рибосомного белка TL5 T.

thermophilus. Б – сравнение структур белков TL5 (голубой цвет) T.

thermophilus и L25 (красный цвет) E.

coli. Структура L25 (PDB code: 1DFU) взята из работы (Lu & Steitz, 2000).

(, ) и одного антипараллельного 1 ( ) тяжей. Второй -лист состоит из четырех -тяжей (,,, ). 2 3 5 бочонок содержит обширное гидрофобное ядро, остатки которого недоступны растворителю и консервативны во всех известных белках семейства СТС, предполагая, что структура домена должна быть консервативна в них. Структура домена также стабилизирована сетью водородных связей и солевых мостиков. N-концевой домен белка TLтопологически очень похож на белок L25 E. coli (Рис. 9Б), несмотря на то, что сравнение их аминокислотных последовательностей выявляло только ~19% идентичных остатков. Структура -бочонка в двух белках чрезвычайно похожа (при наложении C этого структурного элемента r.m.s.d. не превышает 0.71 ). Однако наблюдаются некоторые вариации в размере других структурных элементов указанных белков (Рис. 9Б). Так, спираль 1 в белке TL5 короче, чем в L25, а спираль 2 в TL5 значительно длиннее и заменяет спирали 2 и 3 в L25.

C-концевой домен белка TL5, охватывающий 92–176 остатки молекулы, сильно вытянут, и имеет сигарообразную (Рис. 9А). Полипептидная цепочка этого домена пять раз сложена вдоль его длины. Семь -тяжей C-концевого домена белка формируют два антипараллельных -листа ( ) и ( ) и один 7, 9, 12 8, 11, двутяжевый параллельный -лист ( ). Обширное гидрофобное ядро протянулось 7, через весь домен. Это гидрофобное ядро вместе с сетью водородных связей стабилизирует структуру домена. Аминокислотные остатки, формирующие это ядро, консервативны во всех известных белках семейства СТС. Общая конформация Cконцевого домена уникальна и не обнаруживалась ранее в других белках.

Относительное положение доменов белка также стабилизировано гидрофобным ядром, которое протянулось через всю молекулу и вовлекает остатки, расположенные на границе двух доменов. Структура TL5 является первой структурой многодоменного белка, представителя семейства белков СТС. Сравнение аминокислотных последовательностей известных белков семейства СТС и анализ кристаллических структур выявляет, что остатки, которые формируют гидрофобное ядро, стабилизирующее структуру обоих доменов белка TL5, строго консервативны среди белков семейства СТС. Таким образом, N- и C-концевой домены всех белков СТС могут свернуться в структуру с топологией как у белка TL5.

Фрагмент 5S рРНК, структура которого определена в комплексе с рибосомным белком TL5 T. thermophilus, включает спираль IV, петлю E, спираль V и часть петли A. За исключением нуклеотидов U87 и G107, A108, A109, C110 на 3'-концах и G69 на 5'конце цепочек РНК, все другие нуклеотиды вовлечены во внутримолекулярные взаимодействия, формирующие структуру двойной спирали (Рис. 10Г). Эти взаимодействия приводят к образованию искаженной двойной спирали РНК, которая значительно отличается по своим параметрам от классической А-формы (Рис. 10А и Г). Расстояние между атомами C1' пар оснований в центральной части петли E и на ее концах изменяется от 14.7 до 9.4 . В результате в районе трех центральных пар оснований петли Е малый желобок расширяется, а большой желобок – сужается.

Данная структура очень похожа на структуру РНК в комплексе с белком L25 E. coli.

Нуклеотидная последовательность Е-петли строго консервативна в бактериальных 5S рРНК и значительно отличается от аналогичного участка 5S рРНК Архей и Эукариот (Szymanski et al., 2002). При этом белки семейства СТС способны формировать стабильные комплексы только с бактериальными 5S рРНК. Из этого можно заключить, что уникальная пространственная структура Е-петли бактериальной. 5S рРНК является необходимым условием для специфического взаимодействия с белками семейства СТС. Как видно из структуры комплекса, только N-концевой домен белка TL5 взаимодействует с фрагментом 5S рРНК (Рис. 10А). Этот результат Рис. 10. Взаимодействие белка TL5 с 5S рРНК. А – модель комплекса TL5/5S рРНК. Б – модель комплекса L25/5S рРНК E. coli (Структура L25/RNA (PDB code: 1DFU) взята из работы (Lu & Steitz, 2000)). В – Область межмолекулярного контакта TL5 с 5S рРНК (указаны консервативные водородные связи). Г – схематичное изображение вторичной структуры фрагмента 5S рРНК и его контактов с белком TL5. Консервативные остатки белка отмечены красным цветом.

находится в полном согласии с другими нашими результатами, описанными в разделах 1 и 2. В формирование межмолекулярных водородных связей вовлечены атомы 10 нуклеотидных и 13 аминокислотных остатков (Рис. 10Г). При образовании комплекса 1680 2 поверхности белка TL5 и 5S рРНК оказывается недоступной растворителю. Прилегающая область, сформированная боковыми группами девяти остатков четырех-тяжевого -листа и четырех остатков спирали, образует прямые и опосредованные через молекулы воды контакты с малым желобком петли E (Рис.

10А, В и Г). Сравнительный анализ структур двух комплексов, TL5-РНК и L25-РНК, показал, что, несмотря на низкую гомологию первичных структур данных белков, их пространственные структуры и способ взаимодействия с РНК очень сходны (Рис. 10А и Б). Аминокислотные остатки одного из -слоев этих белков обеспечивают плотный контакт с сахарофосфатным остовом и основаниями малого желобка 5S рРНК в области Е-петли, а остатки спирали 1 и смежной петли 1-1 взаимодействуют с сахарофосфатным остовом большого желобка РНК. При этом пять аминокислотных остатков (R10, R19, Y29, H85 и D87 /R9, R21, Y31, H88 и D90 в TL5/L25), взаимодействующие напрямую или через растворитель с сахарофосфатным остовом и с основаниями нуклеотидов РНК (Рис. 10В и Г), оказались идентичны в данных белках. При сравнении областей контакта белков TL5 и L25 с РНК было обнаружено, что указанные строго консервативные остатки формируют консервативную сеть межмолекулярных водородных связей (детальному исследованию этого вопроса посвящен раздел 4). Более того, как показал анализ первичных структур белков семейства СТС, указанные аминокислотные остатки строго консервативны в них (см.

раздел 4). Учитывая все эти находки, мы предположили, что все белки семейства могут связываться с 5S рРНК через свой N-концевой домен. Сравнение структур комплексов TL5-РНК и L25-РНК выявило также ряд интересных различий. Так, хотя число РНК-белковых контактов в обоих комплексах примерно одинаково, в L25-РНК комплексе большинство из них расположено в районе спирали 1, которая проникает в большой желобок РНК (Рис. 10Б). В белке TL5 эта спираль оказалась короче и расположена в комплексе вне большого желобка РНК (Рис. 10А).

Модель пространственной структуры рибосомного белка TthL5 представлена на рисунке 11А. Белок содержит 182 аминокислотных остатка и сворачивается в один / домен. Молекула TthL5 содержит четыре -спирали, расположенные с одной стороны сильно скрученного пяти-тяжевого антипараллельного -листа. Этот -лист образует вогнутую поверхность белка, которая увеличивается за счет двух петель ( и - ). Спираль располагается отдельно от глобулярной части молекулы и 1 2 3 связана с ней гидрофобными взаимодействиями и водородными связями. Примерно 50% аминокислотных остатков белка приходится на десять петель, включая N- и C- концевые. Топология укладки полипептидной цепи TthL5 сходна со структурами свободного бактериального белка BstL5 (Nakashima et al., 2001), а также архейного Рис. 11. Ленточная модель пространственной структуры рибосомного белка L5 T.

thermophilus (TthL5) (левая панель) и сравнение данной структуры (голубой цвет) со структурой рибосомного белка L5 (серый цвет) Haloarcula marismortui (HmaL5) (правая панель).

Структура HmaL5 (PDB code:

1JJ2) взята из работы (Ban et al., 2000).

белка HmaL5 в составе рибосомы (Ban et al., 2000) (Рис. 11Б), определенными немного раньше. Различия в структуре указанных белков L5 находятся в N-концевой области и в петлях -, -, -.

1 2 2 3 4 Рис. 12. Схематичное изображение пространственной структуры фрагмента 5S рРНК. Неканонические водородные связи указаны зелеными стрелками, а стэкинг-взаимодействия – серыми пунктирными линиями.

Фрагмент 5S рРНК E. coli, структура которого была нами определена в комплексе с рибосомным белком TthL5, включает петлю C и спираль III (Рис.

12). За исключением двух выпетленных нуклеотидов (A52 и A53), спираль III образует регулярную двуспиральную структуру в А-форме, которая заканчивается триплетом C37·(U48-A34). Другой триплет (C38-G44)·C47является основанием трехгранной «пирамиды», примыкающей к спирали III. В формирование «пирамиды» вовлечены также две неканонические пары, A39·A46 и U40·A45, и три неспаренных нуклеотида (G41, C42 и C43). Таким образом, пирамидальная часть (C38-C47) данного структурного элемента 5S рРНК построена полностью нуклеотидами петли C, за исключением нуклеотидов C35, C36 и C37, два последних из них формируют триплеты (C36·C49-G33 и C37·U48-A34) в верхней части спирали III. Положение оснований в «пирамиде» стабилизировано внутримолекулярными взаимодействиями, число которых уменьшается от основания в вершине структуры. При этом большой желобок A-спирали исчезает на поверхности пирамидальной части структуры, тогда как малый желобок сохраняется и переходит в плоскую экспонированную в растворитель платформу, которая формируется сахарофосфатным остовом G41, C42, C43, A45 и кромкой их оснований.

Известно, что нуклеотидная последовательность петли C 5S рРНК чрезвычайно консервативна у Бактерий, Архей и Эукариот. На сегодняшний день определены структуры 50S рибосомных субчастиц из представителей разных доменов жизни, хотя и с различным разрешением. Однако уже сейчас можно заключить, что, по крайней мере, конформация пирамидальной части петли C фактически оказывается идентичной в бактериальной и архейной 5S рРНК, что может предполагать консервативность межмолекулярных взаимодействий.

Рис. 13. А – Ленточная модель пространственной структуры комплекса белка TthL5 со специфическим фрагментом 5S рРНК. Б - сравнение структур комплексов TthL5/RNA (белок/РНК – голубой/красный цвета) и HmaL5/RNA (белок/РНК – серый/зеленый цвета). Структура HmaL5/RNA (PDB code: 1JJ2) взята из работы (Ban et al., 2000).

Модель пространственной структуры комплекса рибосомного белка TthL5 с фрагментом 5S рРНК представлена на рисунке 13, а их межмолекулярные контакты в таблице 1. Со стороны 5S РНК во взаимодействии с белком TthL5 участвуют практически только нуклеотиды пирамидальной части петли C. Видно, что почти все межмолекулярные водородные связи приходятся на этот уникальный структурный элемент 5S рРНК. Единственным исключением для данного РНК-белкового комплекса является G33, который принадлежит спирали III 5S рРНК (Табл. 1, Рис. 12).

Таблица 1. Сравнение РНК-белковых водородных связей в комплексе TthL5/5S rRNA HmaL5/5S rRNA.

TthL5-5S rRNA HmaL5-5S rRNA* Gln 66 NE2 – O2’ C42 Gln 47 NE2 – O2’ C NE2 – O4’ C43 NE2 – O4’ CLys 67 O – O2’ C42 Met 48 O – O2’ CThr 93 N – O2 C42 Thr 74 N – O2 C OG1 – N3 A26 OG1 – N OG1 – O2 A26 OG1 – OArg 95 NE – O4’ A45 Arg 76 NE – O4’ A NH2 – O4’ NH2 – O4’ NE – O2 C43 NE – O2 C*нумерация соответствует таковой в 50S рибосомной субчастице H. marismortui.

Взаимодействующий с РНК участок белка сформирован атомами главной цепи и боковых остатков тяжей, и петель -, -. Этот район белка сильно 2 3 2 2 3 стабилизирован внутримолекулярными взаимодействиями, в которые вовлечены остатки, строго консервативные в белках семейства L5 (Табл. 1). Граница взаимодействия TthL5/5S рРНК стабилизирована обширной сетью водородных связей. В образовании водородных связей участвуют шесть нуклеотидов 5S рРНК и десять аминокислотных остатков белка. Из них 3 нуклеотида (C43, G44 и A45) и аминокислотных остатка (Q66, T93 и R95) являются строго консервативными. C42, образующий, по крайней мере, четыре межмолекулярные водородные связи (Табл. 1), своим основание участвует еще в стэкинг-взаимодействии с боковой цепью R91.

Можно предположить, что C42 является одним важнейших элементов специфического взаимодействия между 5S рРНК и белком L5. На момент проведения данной работы имелась возможность сравнить только область межмолекулярного контакта в комплексе TthL5/5S рРНК и в соответствующей области рибосомной 50S субчастицы H. marismortui (Рис. 13Б). Из данного рисунка видно, что положение белков семейства L5 относительно петли C 5S рРНК почти идентично для обоих белков. Более того, оказалось, что сетка межмолекулярных водородных связей в этой области тоже консервативна (Табл. 1). Мы предположили, что молекулы РНК и белка узнают их специфические сайты посредством атомов образующих консервативную сетку РНКбелковых водородных связей. В определенных совсем недавно структурах рибосомных 50S субчастиц из разных бактерий, выделенный нами ранее интерфейс специфического взаимодействия рибосомного белка L5 с 5S рРНК, полностью подтвердился. Важность консервативных межмолекулярных водородных связей также была отмечена выше, при описании специфического комплекса TL5-5S рРНК.

Сравнение структуры комплекса TthL5/5S рРНК со структурой соответствующего комплекса H. marismortui выявляет также некоторые различия в области РНКбелковых контактов. Так, петля 5-4 архейного белка L5, которая практически отсутствует в бактериальном белке (Рис. 13Б), вовлечена в дополнительные взаимодействия РНК (Табл. 1), образуя половину всех РНК-белковых водородных связей и взаимодействуя в основном с двуспиральным участком фрагмента 5S рРНК.

При этом межмолекулярный недоступный растворителю район в комплексе HmaL5/5S rRNA больше в два раза, чем в комплексе TthL5/5S рРНК. В отличие от бактериальных белков, у представителей семейства L5 всех таксономических групп Архей присутствует участок, соответствующий длинной петле 5-4 HmaL5 (Рис.

13Б). Учитывая эти данные можно предположить, что такой обширный дополнительный контакт архейного белка с 5S рРНК, является эволюционным приобретением этих организмов, необходимым для стабилизации комплекса.

Модель пространственной структуры рибосомного белка TthL18 представлена на Рис. 14. Ленточная модель пространственной структуры белка L18 T. thermophilus (TthL18).

рисунке 14. Белок содержит 111 аминокислотных остатков и сворачивается в один / домен по схеме. Структура белка L18 в целом хорошо 1 2 3 1 4 упорядочена, за исключением N-концевого участка (21 остаток), который, по-видимому, обладает значительной подвижностью, и поэтому его положение в молекуле не было определено.

Структурированная часть белка (остатки 22-111) содержит две -спирали, -лист, сформированный тремя антипараллельными -тяжами и одним маленьким параллельным -тяжом, и спиральный виток. Две -спирали расположены с одной стороны четырех-тяжевого -листа. Гидрофобное ядро молекулы сформировано остатками -листа и спирали 1.

Кроме невыявляемых из-за высокой подвижности N-концевых остатков белка, наблюдается еще некоторая внутренняя подвижность в петле 3.

На момент определения нами пространственной структуры белка TthLимелась возможность сравнить ее только со структурой архейного гомолога из H.

marismortui (Ban et al., 2000). Белок HmaL18 значительно больше, чем TthL18 (186 и 111 остатков, соответственно), а аминокислотные последовательности их соответствующих участков обнаруживают не очень высокую гомологию (27% идентичных и 43% консервативных остатков). Аналогичный достаточно низкий уровень гомологии наблюдается между другими известными рибосомными белками L18 бактерий и архей. Однако пространственные структуры глобулярного домена белков HmaL18 и TthL18 оказались чрезвычайно похожи (Рис. 15А). При наложении Рис. 15. Сравнение пространственных структур рибосомных белков L18 T. thermophilus (красный цвет) и (А) - L18 H. marismortui (фиолетовый цвет), и (Б) - S11 T. thermophilus (синий цвет). Структура белка L18 H. marismortui (PDB code: 1JJ2) взята из работы (Ban et al., 2000), а S11 T. thermophilus (PDB code: 2J00) взята из работы (Selmer et al., 2006).

48 C атомов элементов вторичной структуры (-спирали и -тяжи) HmaL18 и TthL18, r.m.s.d. отклонение равно 1.16 . Различия в структуре в несвязанной и РНКсвязанной формах белка наблюдались в основном в петлях. Петли 2 и 3 в белке LH. marismortui несколько длиннее, чем в бактериальном белке и конформация этих петель в данных белках отличается (Рис. 15А). Такое изменение петли 2 архейного белка L18, по-видимому, позволяет ему формировать дополнительные контакты с 5S рРНК. N-концевой участок белка, структуру которого нам не удалось определить в TthL18, в белке HmaL18 образует -спираль. Сегодня появилась возможность сравнить структуры рибосомного белка TthL18 со структурами белков семейства из разных бактериальных организмов. В данном случае – это структура свободного белка из B. stearothermophilus, определенная также методом ЯМР (Turner & Moore, 2004) и кристаллические структуры белков в составе рибосомных субчастиц T.

thermophilus, E. coli, D. radiodurans (Schuwirth et al., 2005; Selmer et al., 2006; Harms et al., 2008). Оказалось, что все ранее сделанные нами выводы о сходстве пространственных структур HmaL18 и TthL18, полностью верны и для других представителей семейства бактериальных рибосомных белков L18.

Хотелось бы отметить один интересный факт, обнаруженный нами в данной работе. Кроме сравнения структур белков семейства L18, мы провели поиск в банке данных (Protein Data Bank, PDB) структурных гомологов белка TthL18 среди других рибосомных белков. Оказалось, что наилучшее структурное сходство обнаруживается с белком S11 из T. thermophilus (Рис. 15Б). Имея 129 аминокислотных остатков, Sслегка больше, чем L18. В то время как N-конец S11 на шесть остатков короче, чем Nконец TthL18, его C-конец длиннее и включает дополнительный -тяж. Исключая N- и C-концы, пространственные структуры белков L18 и S11 оказались очень похожи (Рис. 15Б), несмотря на низкую гомологию их первичных структур (около 45% общей гомологии и 20% идентичных остатков. При наложении 45 остатков соответствующих участков структур белков TthS11 и TthL18, r.m.s.d. отклонение было равно 1.4 . Кроме того оказалось, что гидрофобное ядро обоих белков сформировано сходным количеством консервативных аминокислотных остатков.

Поэтому, учитывая все сказанное выше, можно на наш взгляд вполне допустить существование общего предка для рибосомных белков S11 и L18.

4. 5S рРНК-связывающие белки семейства СТС – особенность аппарата трансляции бактерий Как уже было отмечено выше, в 1996 году нами было обнаружено, что основной стрессовый белок СТС B. subtilis и два рибосомных белка, L25 E. coli и TL5 T.

thermophilus, являются гомологами. Эта работа явилась ключевой в появлении такого понятия как «семейство белков СТС». Уже было известно, что два из них – это рибосомные белки, специфически связывающиеся с консервативной для бактерий Епетлей 5S рРНК. Кроме того, в 2001 году при кристаллографических исследованиях рибосомной 50S субчастицы D. radiodurans был выявлен еще один многодоменный представитель семейства белков СТС, контактирующий с петлей E 5S рРНК своим Nконцевым доменом (Harms et al., 2001). Становилось очевидным, что указанные белки семейства обладают одним общим свойством – специфически связываются с 5S рРНК. Однако, как уже было отмечено, белок СТС B. subtilis вырабатывается клеткой только в ответ на различные формы стресса и отсутствует в клетках при нормальных условиях роста. Поэтому, какое отношение к указанным выше рибосомным белкам имел основной стрессовый белок СТС B. subtilis, было совершенно неясно. Учитывая невысокую, но выраженную гомологию указанных белков семейства, мы предположили, что основной стрессовый белок СТС B. subtilis может связываться с 5S рРНК. Мы получили рекомбинантный белок СТС B. subtilis и исследовали его РНК-связывающие свойства. Как видно на рисунке 16, белок BsuCTC образует Рис. 16. Взаимодействие белка СТС B. subtilis с РНК (12% ПААГэлектрофорез, неденатурирующие условия): 1,3,5 – 5S рРНК (E. coli, B. stearothermophilus и T.

thermophilus, соответственно);

2,4,6 – 5S рРНК + CTC (РНК как в образцах 1,3,5); 7 – фрагмент 23S рРНК T. thermophilus (55 нуклеотидов); 8 - фрагмент 23S рРНК + СТС; 9 – суммарная тРНК E. coli; 10 – тРНК + СТС.

прочный и стехиометрический комплекс с 5S рРНК различных видов бактерий (дорожки 2, 4 и 6), но не с фрагментом 23S рРНК T. thermophilus или с тРНК E. coli (дорожки 8 и 10). Кроме того нами было показано, что белок СТС B. subtilis, как и рибосомные белки L25 E. coli или TL5 T. thermophilus, взаимодействует с фрагментом 1 5S рРНК, содержащим петлю Е, спирали I, IV и V. Эти результаты указывали на то, что как и другие уже известные белки семейства основной стрессовый белок BsuCTC специфически связывается с 5S рРНК. Можно было предположить, что именно молекула 5S рРНК является мишенью для белка BsuCTC в клетке во время шока.

За последние десять лет стремительно выросло число расшифрованных бактериальных геномов. Сегодня их известно уже несколько сотен. Оказалось, что геном большинства известных бактерий содержит один ген, кодирующий белок данного семейства. Более того, белки семейства СТС являются особенностью бактерий, поскольку ген ctc не обнаружен в геномах известных Архей и Эукариот (Gasteiger et al., 2003). Все известные на сегодняшний день белки СТС содержат так называемый «5S рРНК-связывающий домен». Единственным исключением являлся Aquifex aeolicus, у которого, как представлено в GenBank NCBI (Deckert et al., 1998), ген ctc кодирует белок, лишенный первых 50 аминокислотных остатков 5S рРНКсвязывающего домена. Нас заинтересовало, способен ли такой укороченный белок (151 аминокислотный остаток) связывать 5S рРНК. Проверка РНК-связывающих свойств данного рекомбинантного белка AaeCTC подтвердила наши сомнения – белок, лишенный половины 5S рРНК-связывающего домена, не связывался с 5S рРНК. Однако, при внимательном анализе соответствующего участка генома данного организма, мы обнаружили ошибку (пропущенный нуклеотид). В результате этой ошибки было неверно определено положение старт кодона. В действительности данный ген кодирует белок с полноразмерным 5S рРНК-связывающим доменом.

Таким образом, белок СТС A. aeolicus не является исключением среди белков семейства, а все известные белки семейства СТС имеют домен соразмерный и гомологичный белку L25 E. coli. Из всех полученных данных следовало одно общее свойство для всех известных белков семейства – они должны быть способны образовывать специфический комплекс с бактериальной 5S рРНК.

Рис. 17. Встречаемость белков семейства СТС в представителях ряда бактериальных таксонов.

Информация для анализа взята из GenBank NCBI только для полностью расшифрованных геномов. Полученные данные для наглядности представлены на фоне гипотетического эволюционного древа. Символы указывают наличие генов, кодирующие многодоменные () и однодоменные () белки, а также отсутствие таких генов в геноме (). Численные значения рядом с символом указывают количество расшифрованных геномов.

Символами , , и / обозначены субдивизионы (классы) типа Proteobacteria.

Данные из расшифрованных бактериальных геномов, позволили нам провести сравнительный анализ основных характеристик белков СТС из разных филогенетических групп. Как видно на рисунке 17, многодоменные белки СТС встречаются у представителей большинства бактериальных таксонов, включая, самые древние (Aquificae, Thermotogae и Deinococcus-Thermus group). По-видимому, первые белки семейства СТС, когда они появились в бактериях, были уже многодоменными.

Только представители типа Cyanobacteria и -субдивизиона Proteobacteria имеют однодоменный белок СТС (например, Nostoc sp. и E. coli). При этом среди известных представителей указанных таксономических групп эта форма белка преобладает. Повидимому, сохранение у данных бактерий только так называемого «5S рРНКсвязывающего домена» оказалось достаточным для выполнения белком его функций.

В геномах же ряда представителей типа Firmicutes ген, кодирующий белок СТС, вообще не обнаружен. У некоторых других представителей класса Bacilli, таких как B. subtilis и Listeria monocytogenes, белок СТС вырабатывался клеткой только в ответ на разные формы стресса. Все это наводит на мысль о возможности так называемой «регрессивной эволюции» белков СТС у представителей отдельных таксонов бактерий. Можно предположить, что изменившиеся условия жизни позволили некоторым бактериям либо полностью, либо частично обходиться без белка СТС.

Анализ первичных структур первых известных белков семейства СТС показал, что несколько аминокислотных остатков в них идентичны и большая часть из них (R10, R19, P25, Y29, G30, H85 и D87 по нумерации белка TL5) сосредоточена в Nконцевом (5S рРНК-связывающем) его домене. Для более объективной оценки степени консервативности отдельных остатков в белках СТС, используя программу ClustalW (Chenna et al., 2003), мы сравнили первичные структуры трехсот белков Таблица 2. Частота встречаемости аминокислотных остатков5S рРНК-узнающего модуля в трехстах белках семейства СТС Аминокислотный остаток в количество наиболее часто количество других остатков белках TL5 (L25) встречающихся остатков R10 (R9) R – 291 Q – 3; K – R19 (R21) R – 295 K – Y29 (Y31) Y – 293 I – 1; F – 6* H85 (H88) H – 298 N – 1; S – D87 (D90) D – 2E – 4**; S – 9***; A – 1*** Эти остатки присутствуют в белках СТС представителей: * - -субдивизион Proteobacteria; ** - класс Bacilli;

*** - тип Cyanobacteria.

семейства, известных на сегодняшний день. Оказалось, что и при такой выборке все семь аминокислотных остатков N-концевого домена «почти инвариантны» в белках СТС подавляющего большинства таксонов. Пять из них являются остатками, которые участвуют в связывании белков L25 и TL5 с 5S рРНК (см. в раздел 3). Все это может свидетельствовать о выраженной консервативности во взаимодействии между белками семейства СТС и 5S рРНК у большинства бактериальных организмов.

Полная картина встречаемости указанных пяти остатков в белках семейства представлена в таблице 2. Видно, что немногочисленные исключения не распределены случайным образом. Большинство из них встречается в белках организмов, принадлежащих вполне конкретным таксономическим группам. Такие исключения оказались характерны для всех известных белков СТС типа Cyanobacteria, отдельных представителей класса Bacilli и -субдивизиона Proteobacteria. Указанные исключения подтверждают ранее высказанную мысль об эволюционной обособленности некоторых групп бактериальных организмов.

Сравнительный анализ TL5-5S рРНК и L25-5S рРНК комплексов позволил нам выявить идентичные структурные элементы РНК и белков, участвующие межмолекулярных в контактах, которые, по-видимому, должны играть ключевую роль в специфическом взаимодействии данных макромолекул. Все аминокислотные Рис. 18. Область контакта белка TL5 с 5S рРНК (отмечена на поверхности белка серым цветом).

Положения консервативных и неконсервативных аминокислотных остатков, образующих с РНК водородные связи, указаны красными и зелеными овалами, соответственно.

остатки белков TL5 и L25, образующие водородные связи с РНК, условно были разделены на две группы - неконсервативные и консервативные. Остатки первой группы располагаются по периферии поверхности белка, контактирующей с РНК (Рис. 18), и образуют доступные растворителю межмолекулярные водородные связи. Остатки второй группы (R9, R21, Y31, H88 и D90 для L25; R10, R19, Y29, H85 и D87 для TL5) расположены в центральной части, контактирующей с РНК поверхности белка, и образуют межмолекулярные водородные связи, недоступные растворителю (Gongadze et al., 2005). Пять строго консервативных остатков, также как и некоторые неконсервативные остатки, которые участвуют во взаимодействии с РНК, были нами заменены, используя сайтнаправленный мутагенез. 5S рРНК-связывающие способности мутантных форм белков TL5 и L25 были проверены несколькими методами. Результаты представлены в таблице 3. При одиночных мутациях неконсервативного остатка (K14, S16 или R20) и даже при двойной замене S16A/R20A, белок связывался с РНК при концентрации, Таблица 3. 5S рРНК-связывающие свойства мутантных форм белков TL5 и L мутация 5S рРНК-связывание a Kd (M) б WT ++ 0.контроль (TL5) K14A ++ 0.замены S16A ++ 0.неконсервативных R20A ++ 0.остатков S16A/R20A ++ 0.R10A + 1.R19A + 1.замены Y29S; Y29F; Y29R - NB в консервативных H85A + 1.остатков H85T + 1.H85N + 1.H85F - NB D87S;D87N - NB D87E +/- 2.WT ++ 0.контроль (L25) Y31A - NB замены консервативных H88F - NB остатков D90A - NB a 5S рРНК-связывающие свойства указанных белков исследовали методом «сдвига полосы в геле» (электрофорез в 12% ПААГ, неденатурирующие условиях).

б Кажущиеся константы диссоциации (Kd) были определены на основании данных сорбции РНК-белковых комплексов на нитроцеллюлозных фильтрах.

в NB, не детектируется связывание РНК при концентрации белка до 5.0 мкМ.

сходной с концентрацией, характерной для белка TL5 дикого типа. Таким образом, замена данных неконсервативных остатков в белке TL5 не влияла на его 5S рРНКсвязывающие свойства. В то же время, замена любого одного из пяти консервативных остатков приводила к дестабилизации или невозможности образования комплекса 5S рРНК с белками TL5 или L25. Замена R10, R19 или H85 в белке TL5 приводила к 10кратному увеличению Kd (Табл. 3). Таким образом, замена только одного из этих консервативных остатков в белке явно дестабилизировала РНК-белковый комплекс.

Более драматический эффект был обнаружен при замене строго консервативного тирозина или аспартата в белках TL5 и L25 (Табл. 3). Исключая мутацию D87E в белке TL5, все остальные замены одного из этих остатков приводили к невозможности образования РНК-белкового комплекса. По данным структурных исследований боковые группы этих двух остатков в обоих комплексах образуют не только водородные связи с РНК, но и внутримолекулярную водородную связь друг с другом. Поэтому, замена указанного тирозина или аспартата должна была не только устранить внутримолекулярную связь между этими остатками и водородную связь замененного остатка с РНК, но и связь второго остатка с РНК. Мутация D87E не исключала возможности формирования комплекса, но сильно его дестабилизировала (Табл. 3). Моделирование показало, что остаток Глютаминовой кислоты может образовывать водородную связь с Y29 и молекулой РНК, но больший размер боковой группы этого остатка по сравнению с Аспартатом будет создавать некоторые стерические препятствия в плотном РНК-белковом контакте. Следовательно, любое изменение боковой группы остатков, расположенных в этих позициях (особенно, сдвиг атомов, образующих водородную связь с рРНК) оказывается критичным для специфического связывания белка семейства СТС с 5S рРНК. Так как пять консервативных остатков и их межмолекулярные водородные связи недоступны растворителю, то разрушение межмолекулярной связи консервативного остатка не может быть компенсировано образованием новой водородной связи. Это объясняет, почему замена любого из указанных консервативных остатков, приводящая формально к исключению одной-двух межмолекулярных водородных связей, приводит к дестабилизации комплекса или к невозможности его образования.

Встречаемость в бактериальных организмах природных замен среди пяти строго консервативных аминокислотных остатков в белках семейства СТС могла бы пролить свет на их роль в связывании белка с РНК. Анализ 300 гомологичных белков семейства СТС выявил только семь случаев замены Y29 и 14 – D87 (Табл. 2). Одна из этих природных замен – D/E. Эта замена была обнаружена у представителей рода Enterococcus. В соответствии с нашими результатами, такая замена значительно снижает способность белка TL5 связываться с 5S рРНК (Табл. 3). Однако у представителей данного бактериального рода, у которых произошла замена Asp/Glu в соответствующей позиции белка СТС, обнаруживаются интересные изменения и нуклеотидной последовательности 5S рРНК. На рисунке 19 показан участок петли Е 5S рРНК Enterococcus faecalis. В сравнение с 5S рРНК E. coli, есть только одна нуклеотидная замена в этой области: в 5S рРНК E. faecalis G75 заменен на U. В комплексе TL5-5S рРНК (L25-5S рРНК), G75 формирует водородную связь с Asp(Asp90). Таким образом, данный случай может быть примером коэволюции структур двух взаимодействующих макромолекул. Другие интересные случаи природных Рис. 19. Природные изменения в контактирующих областях некоторых 5S рРНК и белков СТС. Представлены участки 5S рРНК (спирали IV, V и Епетля) представителей Cyanobacteria и Bacillii, а также соответствующий участок 5S рРНК E. coli. Непрерывной линией обведен участок РНК, контактирующий с белком. Строго консервативные в 5S рРНК нуклеотиды (> 80%) показаны черным цветом, а неконсервативные (< 80%) – серым.

Консервативные нуклеотиды, измененные в данных РНК, отмечены открытыми символами. Изменения консервативного Аспартата в соответствующем белке СТС указано справа от РНК.

замен Asp87 на Ser или Ala были найдены в первичных структурах белков CTC Cyanobacteria. Такие мутации лишали белок TL5 способности связываться с 5S рРНК (Табл. 3). Однако оказалось, что в 5S рРНК цианобактерий тоже произошли изменения (Рис. 19). Нуклеотидная последовательность в районе петли Е цианобактериальной 5S рРНК сильно отличается от таковой для большинства известных структур бактериальных 5S рРНК. Возможно, что и эти одновременные изменения в белке СТС и 5S рРНК являются примером коэволюции.

На основании полученных данных можно сделать несколько основных выводов.

Во-первых, уникальная поверхность Е-петли, образованная искаженной двойной спиралью 5S рРНК, является необходимым условием для специфического взаимодействия с белком семейства СТС. Во-вторых, 5S рРНК-узнающий модуль, формируемый пятью строго консервативными остатками белков TL5 и L25, образующими недоступные растворителю водородные связи с РНК, должен быть характерен для большинства белков семейства СТС. В-третьих, одновременные изменения в области контакта белков СТС и 5S рРНК, произошедшие в этих молекулах в процессе эволюции некоторых групп бактерий, направлены на сохранение ими способности формировать стабильный комплекс.

5. Участие 5S рРНК-связывающих белков в формировании функциональноактивной рибосомы Escherichia coli Несмотря на многолетние исследования рибосомы и ее компонентов, до недавнего времени почти не было информации о роли рибосомных белков в формировании функционально активной бактериальной рибосомы in vivo. Поэтому, описанные в этой главе работы можно считать одними из пионерских в этом направлении.

Изначальная задача работы заключалась в установлении необходимости каждого из 5S рРНК-связывающих белков E. coli в формировании ее активной рибосомы в клетке. Для этого был использован недавно разработанный эффективный и точный метод осуществления нокаута конкретного гена в хромосоме E. coli - «рекомбиниринг».

Гены 5S РНК-связывающих белков E. coli, rplE, rplR или rplY (кодирующие рибосомные белки L5, L18 или L25, соответственно), были разрушены в хромосоме, используя метод «рекомбиниринг» (Court et al., 2002). Эта техника позволяет точно произвести замену хромосомного гена на маркерный ген без неспецифических полярных эффектов на экспрессию генов, фланкирующих замененный ген. Ген указанного 5S рРНК-связывающего белка был инактивирован точной заменой его ОРС на кассету с ОРС хлорамфеникол-ацетилтрансферазы, cat (Рис. 20А). После этого, для выявления рекомбинантов, была проведена селекция клеток на среде с антибиотиком. Оказалось, что в случаях успешной замены rplR<>cat или rplE<>cat, обнаруживается только 10 CmR колоний на 108 выживших клеток (Табл. 4). PCR анализ подтвердил факт замены гена рибосомного белка rplR или rplE на ген cat.

Однако было обнаружено, что хромосома данных рекомбинантных клеток также содержит еще интактный ген Такие частично диплоидные клетки встречаются с частотой ~10-2 для любого одного участка хромосомы (Рис. 20А), и ранее было показано, что жизненно важные гены в таких диплоидных участках хромосомы являются мишенью для замен (Yu et al., 2000; Knowlton et al., 2003). Полученные нами результаты указывали на то, что два 5S рРНК- связывающих рибосомных белка L5 и L18 строго необходимы для выживания клетки E. coli. При нокауте гена (rplY) третьего 5S рРНК-связывающего белка L25 E. coli клетки выживали. При этом мы наблюдали высокую частоту ( 104 колоний/108 выживших клеток) рекомбинации Рис. 20. А – схема замены ОРС хромосомного гена E. coli на маркерный ген (cat), позволяющий осуществлять отбор рекомбинантов на селективной среде.

Последовательности, необходимые для гомологичной рекомбинации, показаны штриховкой. Б – анализ продуктов ПЦРамплификации участков хромосомы, содержащих гены rplE (L5), rplR (L18) и rplY (L25). Электрофорез в агарозном геле. При замене на cat-кассету генов rplE и rplR выживают только рекомбинанты, обладающие диплоидным генотипом ген<>cat/ген+.

(Табл. 4). Рекомбинанты имели генотип только rplY<>cat, а PCR анализ хромосомного участка rplY в них подтвердил rplY<>cat замену в медленнорастущих CmR колониях (Рис. 20Б).

Таким образом, становилось очевидным, что ген rplY и кодируемый им рибосомный белок L25 не являются необходимыми для выживания клеток E. coli.

Известно, что 5'-концевой участок (около 100 нуклеотидов) цистрона rplE образует шпильку, необходимую для регуляции экспрессии генов spc-оперона (Cerretti et al.,1988). Нами была осуществлена замена ОРС rplE или ее 3'-концевой части (начиная с 34го кодона) на cat в присутствии плазмиды, обеспечивающей экспрессию гена rplE (pCR/rplE). При условии in trans экспрессии гена rplE была более высокая частота рекомбинации в обоих случаях (Табл. 4) и рекомбинанты имели гаплоидный генотип rplE<>cat. Таким образом, нами впервые показано, что рибосомный белок L5 строго необходим для выживания клеток E. coli, в то время как отсутствие регуляторного элемент spc оперона не является летальным для клеток.

Необходимо отметить, что в наших экспериментах удаление этого регуляторного элемента, хотя и не было летальным, но приводило к ощутимому замедлению роста клеток (изменения оценивались визуально по размеру колоний рекомбинантов).

Для подтверждения того, что белок L18, подобно белку L5, является необходимым для выживания клеток E. coli мы осуществили нокаут гена rplR в присутствии плазмиды pCR/rplR, которая должна была обеспечивать конститутивную Таблица 4. Эффективность рекомбинации и генотип клеток при нокауте генов 5S рРНК-связывающих белков E. coli.

Ген-мишень Плазмида Эффективность Генотип рекомбинации* rplE (L5) ~10 rplE<>cat/rplE + rplE (L5)** ~10 rplE34<>cat/rplE + rplE (L5) pCR/rplE ~102 rplE<>cat rplE (L5)** pCR/rplE ~102 rplE34<>cat rplR (L18) ~10 rplR<>cat/rplR + rplR (L18) pCR/rplR ~10 rplR<>cat/rplR + rplR (L18) pCR/rplH-rplR- ~102*** rplR<>cat rpsE rplY (L25) ~104 rplY<>cat *Количество рекомбинантов/108 выживших клеток. ** Замещение 3’-концевой части гена rplE (начиная с кодона) на cat для получения в хромосоме гибридного гена rplE33-cat (дающего клеткам RplE фенотип) с сохранением в хромосоме участка, кодирующего шпильку, необходимую для регуляции spc оперона. *** Нокаут осуществлялся с помощью P1-переноса rplR<>cat аллеля из rplR<>cat/rplR+ штамма в штамм W3110.

экспрессию этого гена. В данном случае эффективность рекомбинации также была низкой, и рекомбинанты имели характерный диплоидный генотип rplR<>cat/rplR+ (Табл. 4). Мы повторили эксперимент, но при этом в вектор pCR была клонирована большая часть spc оперона, содержащая три соседних гена, rplF (L6), rplR (L18) и rpsE (S5). Было получено порядка ~102 клонов с гаплоидным генотипом rplR<>cat только в присутствии плазмиды pCR/rplF-rplR-rpsE (Табл. 4). Эти данные полностью подтверждают наш предварительный вывод о том, что белок L18 является жизненно необходимым для E. coli.

Третий 5S рРНК-связывающий рибосомный белок, L25 E. coli или другие белки семейства СТС, найдены только в бактериях, однако, даже не во всех бактериях.

Можно было бы предположить, что белок данного семейства не является строго необходимым компонентом бактериального аппарата трансляции. Однако нами было обнаружено, что при нокауте rplY, клетки хотя и выживают, но растут значительно медленнее, чем клетки родительского штамма W3110 в широком диапазоне температур, от 20 до 42C. При стандартных условиях роста (LB среда, 37C), время удвоения L25-дефицитных клеток было равно примерно 72 минуты, тогда как клеток W3110 штамма – 32 минуты (Табл. 5). В то же время, рост rplY-нокаутированных клеток восстанавливался при экспрессии гена rplY с плазмиды. Этот результат свидетельствует о том, что дефект в росте rplY-нокаутированных клеток связан с отсутствием белка L25, и в большей степени может быть восстановлен экспрессией Таблица 5. Ростовые характеристики L25-штамма E. coli.

Штамм Плазмида Время удвоения, мин W3110 KNB800 W3110 pCR KNB800 pCR 1KNB800 pCR/rplY KNB800 pCR/ctc KNB800 pCR/Nfr-ctc Скорость роста штамма KNB800 (L25) в присутствии плазмид, несущих гены белка L25 E. coli (pCR/rplY) и CTC B. subtilis (pCR/ctc) либо N-концевого фрагмента белка CTC (1-94 остатки) (pCR/Nfr-ctc). Штаммы, трансформированные плазмидами, культивировали в среде LB при 37С в присутствии 50 мкг/мл Kan гена белка L25 in trans. Результаты наших экспериментов показывают, что рибосомный белок L25 хотя и неважен для выживания клетки, но, тем не менее, необходим для нормальной жизнедеятельности E. coli. Интересно отметить, что rplYнокаутированные клетки были способны в значительной степени восстанавливать дефект в росте при экспрессии in trans гена основного стрессового белка СТС B.

subtilis. Как ранее нами было показано, белок CTC B. subtilis специфически связывается с бактериальной 5S рРНК, а N-концевой домен этого белка имеет гомологию с рибосомным белком L25 E. coli. В наших экспериментах синтез либо полноразмерного белка CTC, либо его N-концевого домена в значительной степени восстанавливал рост L25-дефицитных клеток E. coli (Табл. 5). Таким образом, нами впервые показано, что основной стрессовый белок CTC B. subtilis является не только структурным, но и функциональным гомологом рибосомного белка L25 E. coli.

Далее мы проверили влияние отсутствия белка L25 в клетках E. coli на эффективность работы их аппарата трансляции in vivo и in vitro. Используя стандартный -галактозидазный тест, мы сравнили белоксинтезирующие способности клеток L25 (KNB800) и родительского (W3110) штаммов. Оказалось, что rplYнокаутированные клетки накапливают -галактозидазу примерно в 5 раз медленнее, чем клетки родительского штамма (Рис. 21В). Нами были выделены рибосомы из мутантного штамма и проверена их белоксинтезирующая активность in vitro.

Рибосомы из клеток L25-дефицитного и дикого штамма транслировали poly(U) матрицу с одинаковой скоростью, что указывало на то, что отсутствие белка L25 не влияет на способность рибосомы формировать полипептидную цепочку. Мы сравнили способности указанных рибосом транслировать in vitro природные мРНК Рис. 21. Синтез природных полипептидов рибосомами штаммов KNB800 (L25) () и W3110 (wild type) () in vivo и in vitro. А и Б - синтез GFP Aequorea victoria и люциферазы Photinus pyralis в бесклеточной системе трансляции, соответственно. При синтезе GFP, в систему добавлялся [14С]Leu, а синтезируемый продукт дополнительно анализировался электрофорезом в ПААГ с последующей авторадиографией (вставка в секции А). В – способность штаммов KNB800 () и W3110 () синтезировать галактозидазу in vivo. Активность фермента представлена в миллеровских единицах.

для зеленного флюоресцирующего белка (GFP) и люциферазы (Рис. 21А и Б, соответственно). Активность люциферазы начинала появляться через одинаковое время (примерно 3 минуты) в образцах обоих рибосом. Люцифераза проявляет активность только после того, когда она покинула рибосому, поэтому мы заключили, что все этапы трансляции природной матрицы осуществляются со сходной скоростью рибосомами дикого типа и L25 рибосомами. Однако количество синтезированных белков рибосомами L25-штамма оказалось в 1.5-2 раза меньше, чем контрольными рибосомами. Этот результат совпадал с данные о синтезе -галактозидазы в системе in vivo (Рис. 21В), однако, не давал все ответа на вопрос о причине обнаруженных изменений в функциональных свойствах рибосом L25-штамма. Возможной причиной низкого выхода синтезируемого данными рибосомами полипептида могли быть ошибки в трансляции, приводящие к накоплению неактивного белка или укороченных пептидов. Проверка соотношения активного GFP (по флюоресценции) и тотального количества GFP полипептида (по включению [14C]Leu в белок) показала, что большая часть синтезированного полипептида является полноразмерным GFP и общая картина распределения синтезированных пептидов на электрофореграмме (вставка на Рис. 21А) в обоих случаях одинакова. Таким образом, ошибки в трансляции L25 рибосомами, как главную причину низкой эффективности их белоксинтезирующих способностей нами была исключена.

Рис. 22. А - Анализ рибосомной фракции из штаммов KNB800 (L25) и W3110 (WT) E.

coli центрифугированием в градиенте плотности сахарозы 15-30%, при 10 мМ Mg2Cl и 100 мМ KCl. Б - Анализ белкового состава рибосом L25-штамма и штамма дикого типа (двумерный ПААГ-электрофорез). В – Анализ очищенных рибосом из L25штамма и штамма дикого типа центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (условия как на панели А).

Мы исследовали компонентный состав и некоторые другие характеристики рибосом L25-дефицитного штамма. Как видно на рисунке 22А рибосомные фракции L25 и контрольного штаммов, анализированные непосредственно из цитоплазматической фракции клеток, принципиально не отличаются ни по компактности, ни по способности субчастиц ассоциировать. Соотношение и целостность всех трех рибосомных не отличалась для обоих образцов рибосом. За исключением белка L25, все другие индивидуальные рибосомные белки присутствовали в рибосомах мутантного штамма в сравнимых количествах, как и в рибосомах дикого типа (Рис. 22Б). Полученные данные указывали на то, что белок L25 не является строго необходимым для формирования 50S рибосомных субчастиц или 70S рибосом in vivo. Однако, как видно на рисунке 22В, в отличие от контрольных рибосом, рибосомы L25-штамма, выделенные и очищенные по стандартной методике (центрифугирование в присутствии высокой концентрации соли), содержат значительно больше (от 30% до 50% в разных образцах) диссоциированных рибосомных субчастиц. Учитывая то, что использованный способ очистки рибосом не влиял на контрольный образец, можно было заключить, что Рис. 23. Модель пространственной структуры 50S рибосомной субчастицы E. coli (правая панель). Отмечено положение 5S рРНК-белкового комплекса, пептидил-трансферазного (PTC) и ГТФаза-ассоциированного (GAC) центров. Детальная модель центрального протуберанца 50S рибосомной субчастицы (левая панель).

Для построения моделей использована структура рибосомы (PDB code: 2AW4), взятая из работы (Schuwirth et al., 2005).

образец рибосом L25-штамма содержит дефектную фракцию 50S рибосомных субчастиц, неспособную ассоциировать с 30S субчастицами. Ситуация, отраженная на рисунке 22В, принципиально не изменялась при других концентрациях буферных компонентов. Анализ компонентного состава фракции дефектных 50S субчастиц показал, что в ней значительно редуцировано количество белка L16. Становилось очевидным, что наиболее вероятной причиной сниженной эффективности в работе аппарата трансляции L25-штамма является присутствие в рибосомной фракции «дефектных» 50S субчастиц. Мы задались вопросом: что же могло произойти с рибосомными субчастицами данного мутантного штамма? На сегодняшний день известно, что именно у основания центрального протуберанец большой рибосомной субчастицы расположены пептидилтрансферазный и ГТФаза-ассоциированный центры (Рис. 23, правая панель), а сам протуберанец участвует в формировании межсубъединичных мостиков и тРНКсвязывающих сайтов. Центральный протуберанец (Рис. 23) формируется 5S рРНК- белковым комплексом, структурными элементами II и V доменов 23S рРНК и белками L16, L27 и L30. Мы предположили, что отсутствие белка L25 могло повлиять на структуру всего этого сложного структурно-функционального узла рибосомной субчастицы. Поэтому, используя метод химического пробинга РНК, мы решили исследовать, что же произошло в структуре центрального протуберанца 50S субчастиц в отсутствие белка L25. Был проведен сравнительный анализ доступности нуклеотидов 5S рРНК и доменов II и V 23S рРНК для модифицирующих агентов в образцах рибосом L25 и контрольного штаммов. Полученные результаты суммированы на рисунке 24. Оказалось, что изменения в доступности нуклеотидов химическим агентам обнаруживаются уже во фракции 70S рибосом L25-штамма.

Наиболее яркие изменения происходят в E-петле 5S рРНК, а также спиралях H38, H39, H42, петле H41-H42 (домен II) и спирали H89 (домен V) 23S рРНК. Эти же участки 23S рРНК модифицируются и во фракции дефектной 50S субчастицы L25штамма, однако, более интенсивно, чем в 70S рибосомах (Рис. 24). Кроме того в этой субчастице появляются новые участки (спирали H37, H80, H81 и H86), изменившие свою доступность для модифицирующих агентов. Таким образом, из полученных данных можно заключить, что в районе центрального протуберанца 50S субчастицы L25-штамма (особенно во фракции дефектной 50S субчастицы) происходят локальные, но значительные изменения в конформации рибосомной РНК.

Как видно на схеме рисунка 24, именно те участки РНК, которые изменили свою доступность модифицирующим агентам в L25 рибосомной субчастице, участвуют в образовании межмолекулярных водородных связей, формирующих и стабилизирующих пространственную структуру центрального протуберанца. По современным кристаллографическим данным сам белок L25 образует в рибосоме E.

coli контакты только с двумя молекулами, 5S рРНК и белком L16 (Рис. 23 и 24). В то Рис. 24. Изменения в доступности нуклеотидов рибосомной РНК 50S субчастицы для модифицирующих агентов в рибосомах L25-штамма в сравнении рибосомами контрольного штамма. Измененные нуклеотиды в 70S рибосомах L25-штамма отмечены фиолетовым цветом, а во фракции диссоциированных 50S рибосомных субчастиц – розовым. РНК-РНК взаимодействия в рибосоме указаны пунктирными зелеными линиями, РНК-белковые и белок-белковые контакты – стрелками. PTR – пептидил-трансферазное кольцо; GAC – ГТФаза ассоциированный центр. Данные о межмолекулярных контактах в рибосоме были взяты из работы (Schuwirth et al., 2005).

же время, в рибосоме T. thermophilus белок TL5 образует более обширные контакты (взаимодействуют оба домена) с белком L16. Полученные нами данные указывают на то, что отсутствие белка L25 приводит к дестабилизации межмолекулярных связей в значительной части центрального протуберанца большой рибосомной субчастицы и даже к ослаблению удержания рибосомой белка L16. Таким образом, можно заключить, что одной из функций белка семейства СТС, эволюционного приобретения бактериального аппарата трансляции, является стабилизация уникальной пространственной структуры центрального протуберанца 50S рибосомной субчастицы.

Заключение Используя результаты, полученные в настоящей работе, а также данные о расшифрованных бактериальных геномах, делается заключение о том, что подавляющее большинство бактерий содержит третий 5S рРНК-связывающий белок, белок семейства СТС. Все белки этого семейства, без исключения, содержат так называемый «5S рРНК-связывающий» домен. Впервые продемонстрировано, что рибосомный белок L25 E. coli и основной стрессовый белок CTC B. subtilis являются не только структурными, но и функциональными гомологами. Установлено, что пять идентичных аминокислотных остатков в белках TL5 и L25 формируют их 5S рРНКузнающий модуль, а учитывая строгую консервативность этих остатков в белках семейства СТС, предполагается, что такой модуль должен быть характерен для большинства из них. Единичные случаи одновременных природных изменений, произошедших в контактирующих областях белков СТС и 5S рРНК, можно считать примерами коэволюции структур этих двух молекул. Сравнительный анализ структур бактериальных и архейных рибосомных белков семейства L5 и их комплексов с РНК позволяет заключить, что структуры этих белков и их контакты с 5S рРНК эволюционно консервативны. Практически идентичная укладка глобулярной части пространственных структур рибосомных белков семейств L18 и S11 свидетельствует об их родственном происхождении. Определенная в данной работе пространственная структура большей части 5S рРНК-белкового комплекса с высоким разрешением внесла существенный вклад в построение модели рибосомы, и является востребованной до сих пор в исследованиях детальной структурной организации бактериальной рибосомы. Получены данные, которые позволили впервые оценить степень необходимости каждого из 5S рРНК-связывающих белков для формирования функционально-активной рибосомы и для выживания бактериальной клетки.

Установлено, что рибосомные белки L5 и L18 строго необходимы для выживания клеток E. coli, а белок L25, не являясь необходимым для выживания клеток, оказался чрезвычайно важен для стабилизации структуры центрального протуберанца 50S субчастицы бактериальной рибосомы. Большинство полученных в работе данных имеют приоритетный характер и вносят значительный вклад в понимание тонкой структурной организации бактериальной рибосомы.

ВЫВОДЫ 1. Установлено, что 5S рРНК-связывающие рибосомные белки TL4 (TthL5), TL(TthL18) и TL5 (N-концевой домен) Thermus thermophilus являются структурными и функциональными гомологами рибосомных белков L5, L18 и L25 Escherichia coli, соответственно.

2. Основной стрессовый белок CTC из Bacillus subtilis специфически связывается с 5S рРНК и гомологичен 5S рРНК-связывающим рибосомным белкам TL5 T.

thermophilus и L25 E. coli, поэтому указанные белки были объединены в семейство белков СТС. Известные на сегодняшний день представители семейства СТС (несколько сотен белков), найденные только в бактериях, содержат домен, соразмерный и гомологичный белку L25 E. coli, из чего можно заключить, что все они должны обладать 5S рРНК-связывающими свойствами.

3. Консервативная E-петля бактериальных 5S рРНК является специфическим местом связывания белков семейства СТС. Несмотря на довольно низкую гомологию первичных структур, пространственные структуры N-концевого домена белка TL5 и белка L25, и их взаимодействие с РНК очень сходны, а пять идентичных аминокислотных остатков в данных белках формируют их 5S рРНКузнающий модуль. Учитывая строгую консервативность этих остатков в белках семейства СТС, предполагается, что такой модуль должен быть характерен для большинства из них. Единичные обнаруженные случаи одновременных изменений в контактирующих модулях белков семейства СТС и 5S рРНК являются примерами коэволюции структур двух взаимодействующих молекул.

4. Впервые показано, что уникальная по структуре C-петля 5S рРНК является специфическим местом связывания белка TthL5. Рибосомные белки семейства Lв бактериях и археях образуют чрезвычайно сходную пространственную структуру, а при взаимодействии с C-петлей 5S рРНК формируют сеть консервативных межмолекулярных контактов. Все это свидетельствуют об эволюционной консервативности рибосомных белков данного семейства.

5. Глобулярная часть пространственных структур рибосомных белков семейств Lи S11 укладывается практически идентично, что может свидетельствовать об их родственном происхождении.

6. Рибосомные белки L5 и L18 строго необходимы для выживания клеток E. coli.

7. Отсутствие белка L25 не влияет на выживание клеток E. coli, но приводит к значительному снижению количества синтезируемого белка рибосомами L25штамма in vivo и in vitro. В структуре центрального протуберанца 50S рибосомной субчастицы L25-штамма обнаруживаются значительные конформационные изменения, приводящие к ослаблению ее способности ассоциировать с 30S субчастицей. Таким образом, можно заключить, что белок семейства СТС необходим 50S субчастице бактериальной рибосомы для стабилизации структуры ее центрального протуберанца.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи и обзоры в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ 1. Korobeinikova, A.V., Shestakov, S.A., Korepanov, A.P., Garber, M.B., Gongadze G.M.

Protein CTC from Aquifex aeolicus possesses a full-sized 5S rRNA-binding domain // Biochimie. – 2009. – V.91. – P.453-456.

2. Гонгадзе, Г.М., Корепанов, А.П., Коробейникова, А.В., Гарбер, М.Б. Бактериальные 5S рРНКсвязывающие белки семейства СТС // Успехи Биолог. Химии. – 2008. – Т.48. – С.105-132.

3. Коробейникова, А.В., Гонгадзе, Г.М., Корепанов, А.П., Елисеев, Б.Д., Баженова, М.В., Гарбер М.Б. 5S рРНК-узнающий модуль белков семейства СТС и его эволюция // Биохимия. – 2008. – Т.73. – С.193-201.

4. Korepanov, A.P., Gongadze, G.M., Garber, M.B., Court, D.L., Bubunenko, M.G.

Importance of the 5S rRNA-binding ribosomal proteins for cell viability and translation in Escherichia coli // J. Mol. Biol. – 2007. – V.366. – P.1199-1208.

5. Gongadze, G.M., Korepanov, A.P., Stolboushkina, E.A., Zelinskaya, N.V., Korobeinikova, A.V., Ruzanov, M.V., Eliseev, B.D., Nikonov, O.S., Nikonov, S.V. and Garber, M.B., Lim, V.I. The crucial role of conserved intermolecular H-bonds inaccessible to the solvent in formation and stabilization of the TL5-5S rRNA complex // J. Biol. Chem. – 2005. – V.2– P.16151-16156.

6. Корепанов, А.П., Гонгадзе, Г.М., Гарбер, М.Б. Основной стрессовый белок СТС Bacillus subtilis специфически связывается с рибосомной 5S РНК // Биохимия. – 2004.

– Т.69. – С.749-754.

7. Garber, M., Gongadze, G., Meshcheryakov, V., Nikonov, O., Nikulin, A., Perederina, A., Piendl, W., Serganov, A, Tishchenko, S. Crystallization of RNA/protein complexes // Acta Crystallographica Section D. – 2002. – V.58. – P.1664-1669.

8. Woestenenk, E.A., Gongadze, G.M., Shcherbakov, D.V., Rak, A.V., Garber, M.B., Hard, T.

and Berglund, H. The solution structure of ribosomal protein L18 Thermus thermophilus reveals a conserved RNA-binding fold // Biochem. J. – 2002. – V.363. – P.553-561.

9. Perederina, A., Nevskaya, N., Nikonov, O., Nikulin, A., Dumas, P., Yao, M., Tanaka, I., Garber, M., Gongadze, G. and Nikonov, S. Detailed analysis of RNA-protein interactions within the bacterial ribosomal protein L5/5S rRNA complex // RNA. – 2002. – V.8. – P.1548-1557.

10. Гонгадзе, Г.М., Передерина, А.А., Мещеряков, В.А., Федоров, Р.В., Москаленко, С.Е., Рак, А.В., Серганов, А.А., Щербаков, Д.В., Никонов, С.В., Гарбер, М.Б. 5S рРНКбелковый комплекс Thermus thermophilus. Определение специфических участков связывания белков L5 и L18 на 5S рРНК // Мол. биология. – 2001. – Т.35. – С.610-616.

11. Fedorov, R., Meshcheryakov, V., Gongadze, G., Fomenkova, N., Nevskaya, N., Selmer, M., Laurberg, M., Kristensen, O., Al-Karadaghi, S., Liljas, A., Garber, M., Nikonov, S. Structure of ribosomal protein TL5 complexed with RNA provides new insights into the CTC family of stress proteins // Acta Crystallographica Section D. – 2001. – V.57. – P.968-976.

12. Woestenenk, E.A., Allard, P., Gongadze, G.M., Moskalenko, S.E., Shcherbakov, D.V., Rak, A.V., Garber, M.B., Hard, T., Berglund, H. Assignment and secondary structure identification of the ribosomal protein L18 from Thermus thermophilus // J. Biomol. NMR. – 2000. – V.17. – P.273-274.

13. Gongadze, G.M., Meshcheryakov, V.A., Serganov, A.A., Fomenkova, N.F., Mudrik, E.S., Jonsson, B.-H., Liljas, A., Nikonov, S.V. and Garber, M.B. N-terminal domain, residues 191, of ribosomal protein TL5 from Thermus thermophilus binds specifically and strongly to the region of 5S rRNA containing loop E // FEBS Lett. – 1999. – V.451. – P.51-55.

14. Мещеряков, В.А., Грязнова, О.И., Давыдова, Н.Л., Мудрик, Е.С., Передерина, А.А., Василенко, К.С., Гонгадзе, Г.М., Гарбер. М.Б. РНК-связывающие свойства необычного рибосомного белка TL5 из Thermus thermophilus // Биохимия. – 1997. – Т.62. – С.629-634.

15. Gryaznova, O.I., Davydova, N.L., Gongadze, G.M., Jonsson, B.-H., Garber, M.B. & Liljas, A. A ribosomal protein from Thermus thermophilus is homologous to a general shock protein // Biochimie. – 1996. – V.78. – P.915-919.

16. Gongadze, G., Kashparov, I., Lorenz, S., Shroeder, W., Erdmann, V.A., Liljas, A. & Garber, M. 5S rRNA binding ribosomal proteins from Thermus thermophilus: identification and some structural properties // FEBS Lett. – 1996. – V.386. – P.260-262.

17. Gongadze, G.M., Tishchenko, S.V., Sedelnikova, S.E.& Garber, M.B. Ribosomal proteins, TL4 and TL5, from Thermus thermophilus form hybrid complexes with 5S ribosomal RNA from different microorganisms // FEBS Lett. – 1993. – V.330. – P.46-48.

18. Selivanova, O.M., Gongadze, G.M., Gudkov, A.T. and Vasiliev, V.D. Structure of proteindeficient 50S ribosomal subunits. Particles without 5S RNA-protein complex retain the L7/L12 stalk and associate with 30S subunits // FEBS Lett. – 1986. – V.197. – P.79-83.

Статьи в сборниках и избранные тезисы конференций 19. Корепанов А.П., Коробейникова А.В., Баженова М.В., Шестаков С.А., Бубуненко М.Г., Гарбер М.Б., Гонгадзе Г.М. Роль 5S рРНК-связывающих белков L5 и L25 в сборке бактериальной рибосомы in vivo // Сборник тезисов Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, 28 сентября - 2 октября. – 2009. – Москва, Россия. – С.250-251.

20. Баженова М.В., Корепанов А.П., Гарбер М.Б., Гонгадзе Г.М. Белок L25 стабилизирует структуру функционально важного участка бактериальной рибосомы // Сборник тезисов 13-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», 28 сентября - 2 октября. – 2009. – Пущино, Россия. – С.7-8.

21. Баженова М.В., Корепанов А.П., Сарских А.В., Гарбер М.Б., Гонгадзе Г.М. Изучение структурных особенностей рибосом Escherichia coli, лишенных белка L25 // Сборник тезисов 12-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», 10-14 ноября. – 2008. – Пущино, Россия. – С.7.

22. Korobeinikova, A.V., Korepanov, A.P., Gongadze, G.M., Bazhenova, M.V., Sarskikh, A.V., Garber, M.B. Properties of the bacterial CTC family proteins associated with ribosome // Abstracts of the International conference on “Protein biosynthesis, structure and function”, June 9-13. – 2007. – Pushchino, Russia. – P.21.

23. Korepanov, A.P., Gongadze, G.M., Bazhenova, M.V., Garber, M.B., Court, D.L., Bubunenko, M.G. Role of 5S rRNA-binding ribosomal protein L25 of Escherichia coli in cell viability and translation // Abstracts of the International Engelgardt conference on molecular biology, august 19-24. – 2006. – Buran, Russia. – P.68.

24. Корепанов А.П., Гонгадзе Г.М., Столбоушкина, Е.А., Зелинская, Н.В., Рузанов, М.В., Коробейникова, А.В., Елисеев, Б.Д., Никонов, О.С., Никонов, С.В., Гарбер М.Б., Диада консервативных остатков в белке TL5 Thermus thermophilus играет ключевую роль в узнавании этим белком 5S рРНК // Сборник тезисов 8-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», 17-21 мая. – 2004. – Пущино, Россия. – С.17.

25. Garber, M.B., Nikonov, S.V., Gongadze, G.M., Fedorov, R.V., Meshcheryakov, V.A., Nevskaya, N.A., Nikulin, A.D., Perederina, A.A., Tishchenko, S.V., Dumas, P., Ehresmann, B., Ehresmann, C., Lamzin, V., Liljas, A., Piendl, W., Tanaka, I. Structural studies of ribosomal RNA-protein complexes // Abstracts of the International conference in honour of Alexander Spirin “Protein synthesis”, August 27 – September 1. – 2001. – Pushchino, Russia. – P.5.

26. Korepanov, A.P., Gongadze, G.M., Garber, M.B. General stress protein CTC of Bacillus subtilis specifically binds to 5S rRNA // Abstracts of the International conference in honour of Alexander Spirin “Protein synthesis”, August 27 – September 1. – 2001. – Pushchino, Russia. – P.65.

27. Meshcheryakov, V., Fedorov, R., Gongadze, G., Fomenkova, N., Mudrik, E., Serganov, A., Selmer, M., Al-Karadaghi, S., Jonsson, B.-H., Liljas, A., Nikonov, S., Garber, M.

Crystallization and structural studies of ribosomal protein TL5 from Thermus thermophilus in complex with 5S rRNA fragments // Abstracts of the International conference “The ribosome. Structure, function, antibiotics and cellular interactions”, June 13-17. – 1999. – Helsingor, Denmark. – P.64.

28. Garber, M., Davydova, N., Fedorov, R., Gongadze, G., Kalinin, A., Meshcheryakov, V., Moskalenko, S., Mudrik, E., Nevskaya, N., Nikonov, S., Nikulin, A., Perederina, A., Rak, A., Serganov, A., Shcherbakov, D., Tin, O., Tishchenko, S., Vassilieva, J., Kraft, A., Piendl, W., Ehresmann, C., Ehresmann, B., Allard, P., Helgstrand, M., Hard, T. Ribosomal proteins:

Crystallization, crystallographic and solution studies // Proceedings of the first international workshop on “Structure research of the ribosome and its functional complexes”, September 9-11. – 1998. – Geesthacht, Germany. – P.47-51.

29. Gongadze, G.M., Meshcheryakov, V.A., Perederina, A.A., Moskalenko, S.E., Davydova, N.L., Gryaznova, O.I., Rak, A.V., Shcherbakov, D.V., Fomenkova, N.P., Nikonov, S.V., Jonsson, B.-H., Liljas, A., Garber, M.B. 5S rRNA-binding proteins from Thermus thermophilus // Abstracts of the International conference “Thermophiles-98”, September 611. – 1998. – Brest, France. – BM-P48.

30. Gongadze, G.M., Davydova, N.L., Gryaznova, O.I., Meshcheryakov, V.A., Perederina, A.A., Sedelnikova, S.E., Tishchenko, S.V., Liljas, A., Jonsson, B.-H., Garber, M.B. An unusual 5S rRNA binding ribosomal protein TL5 from Thermus thermophilus // Abstracts of the International conference “Thermophiles-96”, September 4-9. – 1996. – Athens, USA. – P.265.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.