WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

НГУЕН ЧЫОНГ ЗАНГ

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ НА БАЗЕ МИКРОБНОЙ БИОКОНВЕРСИИ КОМПЛЕКСНОГО

РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

Специальность 05.18.15 –

Технология и товароведение пищевых продуктов и функционального и специализированного назначения и общественного питания

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Москва 2012

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор

Борисенко Евгений Георгиевич

Официальные оппоненты:

Ермолаева Галина Алексеевна

доктор технических наук, профессор,

ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств», заведующая кафедрой «Процессы ферментации и промышленного биокатализа»,

Серба Елена Михайловна, кандидат технических наук, доцент, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИ ПБТ РАСХН), старший научный сотрудник

Ведущая организация: ФГУ Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А.Тимирязева

Защита состоится: «__» декабря  2012 г. в  ч. в ауд. 302 на заседании Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.148.08 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «МГУПП».

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, ФГБОУ ВПО «МГУПП».

Автореферат разослан «___»________2012 г.

Ученый секретарь

Совета Д 212.148.08

к.х.н., доц. В.С. Штерман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Около половины 7 миллиардного населения Земли испытывает недостаток в тех или иных пищевых веществах. Это в первую очередь относится к развивающимся странам, в которых люди получают в 2 раза меньше растительного белка и в 5 раз меньше белков животного происхождения, чем в высокоразвитых странах.

Нехватка в рационе питания полноценных белков, витаминов, пищевых волокон, макро- и микронутриентов, полезных микробов вызывает рост социально опасных заболеваний, в том числе желудочно-кишечных. Часто причиной этих заболеваний является нарушение микробиоценозов желудочно-кишечного тракта. Возбудителями заболеваний нередко становятся условно-патогенные бактерии, приобретающие плазмиды токсигенности, колонизационной резистентности и антибиотикоустойчивости. Современное человечество перед этой угрозой становится все менее защищенным, о чем свидетельствуют вспышки микробных токсикоинфекций даже в относительно благополучной Европе в 2011 и 2012 году.

Вышеприведенные проблемы могут эффективно решаться путем включения в рацион питания продуктов с пробиотическими свойствами, получаемых с использованием микробной биоконверсии. При этом особенный интерес вызывает возможность использования в качестве производственных культур для биоконверсии растительного сырья микроорганизмов из натуральной микрофлоры человека.

Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы стала разработка технологии новых продуктов, обладающих пробиотическими свойствами, путем биоконверсии растительного сырья с помощью микроорганизмов, выделенных из грудного молока и их товароведная оценка.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

– оценить женское грудное молоко (ЖГМ) из разных регионов планеты как возможный источник микроорганизмов-продуцентов биомассы на растительном сырье;

– определить способность к накоплению биомассы на растительном сырье дрожжевых изолятов из грудного молока представительниц разных регионов и отобрать наиболее продуктивные;

– исследовать взаимное влияние микроорганизмов в дрожже-бактериальных ассоциациях;

– подобрать сахаристые растительные субстраты разных регионов, перспективные для микробной биоконверсии с помощью отселекционированных культур;

– из сахаристых и целлюлозосодержащих субстратов сконструировать питательные среды для твердофазного культивирования микроорганизмов;

– подобрать оптимальные режимы культивирования микроорганизмов на отобранном растительном сырье;

– изучить динамику роста дрожжей и бактерий на разных комплексных растительных субстратах в ходе твердофазного и твердофазно-глубинного культивирования;

– исследовать показатели качества и биологической ценности функциональных продуктов, полученных путем дрожже-бактериальной биоконверсии растительного сырья.

Научная новизна работы:

впервые женское грудное молоко оценено как возможный источник микроорганизмов-продуцентов биомассы на твердом растительном сырье;

– установлена способность дрожжевых изолятов из грудного молока представительниц разных регионов активно накапливать биомассу на твердом растительном сырье;

– определено, что наиболее активные продуценты биомассы из изолятов отнесены к роду Pichia;

– установлены благоприятные возможности симбиоза дрожжей и лактобактерий в микробных сообществах из грудного молока;

– для микробной биоконверсии с помощью отселекционированных микробных ассоциаций подобраны перспективные тропические и российские сахаристые субстраты;

– выявлен выраженный стимулирующий эффект целлюлозосодержащих компонентов сред при культивировании микробных ассоциаций на сахаристых субстратах;

– установлена равноценность хранимых высушенных и свежих комплексных субстратов по накоплению на них дрожжевой биомассы;

– выявлена динамика взаимодействия дрожжей и бактерий на различных стадиях аэробно-анаэробного культивирования отселекционированных ассоциаций на растительных субстратах – интенсивное накопление дрожжевой биомассы на аэробном этапе, разрушение дрожжей и интенсивное накопление лактобактерий на анаэробном этапе;

– показано, что на стадии анаэробной ферментации формируются специфические органолептические и функциональные свойства новых напитков, которые по своим товароведным качествам могут быть отнесены к нутрипарафармацевтикам.

Практическая значимость результатов работы: Отселекционированы высокопродуктивные и быстрорастущие на различных видах твердого растительного сырья штаммы дрожжей рода Pichia.

Созданы дрожже-бактериальные ассоциации из дрожжей рода Pichia и лактобактерий для биоконверсии растительного сырья.

Определен ряд первичных и вторичных сахаристых субстратов, перспективных для микробной биоконверсии (сахарный тростник, свеклосахарная пульпа и жом, арбузная пульпа и выжимки, зеленая биомасса кукурузы, виноградные выжимки).

Для изготовления питательных сред, используемых в твердофазном культивировании микроорганизмов, предложен ряд перспективных целлюлозосодержащих субстратов (зерновые отруби, рисовая мучка, травяная, сенная мука) и определены их соотношения с сахаристыми материалами в средах.

Впервые для сохранения скоропортящегося сахаристого сырья для микробной биоконверсии предложено высушивать его вместе с целлюлозосодержащими добавками.

Разработаны основные параметры культивирования дрожже-бактериальных ассоциаций на твердых растительных субстратах.

Для комплексной биоконверсии сахаристого и целлюлозосодержащего сырья предложен метод аэробно-анаэробной ферментации с получением напитков для человека и кормовых добавок для животных, содержащих симбиотические ассоциации дрожжей и бактерий.

Разработаны лабораторные регламенты производства функциональных напитков из сахарного тростника с рисовой мучкой и из арбуза с пшеничными отрубями, полученных путем микробной биоконверсии. Оптовая цена таких напитков составляет около 25 руб за 1 л.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на российских и международных конференциях и симпозиумах: EurasiaBio 2nd International Congress-Partnering & Exhibition on Biotеchnology and Bioenergy (Moscow, 2010), III межведомственной научно-практической конференции с международным участием “Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров”, (Москва, 2010); IX Международная научной конференции “Живые системы и биологическая безопасность населения” (Москва, 2011); Международная конференция “Биология-наука XXI века” (Москва, 2012); Конференция, посвященная 125-летию с дня рождения профессора П.М. Силина “Связь времен и поколений, из прошлого в настоящее” (Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 240 источников (в том числе 58 на иностранных языках). Работа изложена на 181 страницах, содержит 60 рисунков, 36 таблиц и 11 приложений.

  1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы расмотрены общие представления о роли растительной биомассы как основы пищевой цепи, животных  продуктов как источника наиболее ценных компонентов пищи и микробной биомассы как принципиального обогатителя растительной пищи. Расмотрена также микрофлора молока высших животных и человека и ее роль в формировании микробиоценозов желудочно-кишечного тракта. Представлены также современные представления о продуцентах микробной биомассы и методах получения продуктов с пробиотическими свойствами, их промышленного производства на различных источниках сырья.

  1. ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исследования проводились на кафедрах “Биотехнология”, “Технология сахаристых, субтропических и пищевкусовых продуктов”, “Технология общественного питания” МГУПП; в лаборатории «Молекулярные основы патогенности» ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России; а также в лабораториях Иститута животноводства Вьетнама, в отделе “Технология ферментации” Государственного технологического и научного института Вьетнама.

2.1 Материалы и методы исследований

Объектом исследования были различные штаммы дрожжей и бактерий, выделенные из ЖГМ представительниц России и Вьетнама, микробиоценозов молочнокислых продуктов, производственных заквасок и пробиотических продуктов.

Образцы ЖГМ  высевали на твердофазную питательную среду (пшеничные отруби), в которую добавляли 50 мкг/г гентамицина. После инкубации в аэробных условиях при температуре 28-32С выделяли доминирующие культуры и оценивали их продуктивность. Критерием оценки служила концентрация дрожжевых клеток в 1г субстрата, накопленных в процессе твердофазной ферментации (ТФФ). Подсчет клеток осуществляли микроскопически в камере Горяева. Размеры клеток определяли с помощью окуляр-микрометра.

В качестве основы питательных сред использовалось первичное и вторичное сырье: сахарный тростник, отходы его переработки, сахарная свекла, свекловичный жом, кукуруза, арбуз, плодово-ягодные выжимки, сенная и травяная мука, соевый шрот, зерновые отруби, мучки.

Усредненные данные по химическому составу источников сырья, использованных в работе, представлены в табл. 1.

Таблица 1 - Химический состав сырья

п/п

Сырье

Содержание, %

Влаж-ность

Сырой протеин

Жир

Клет-чатка

Безазотистые экстрактив-ные вещества

Зола

1

Арбуз

92,0

0,6

0,1

0,4

6,0

0,4

2

Виноградная выжимка

70,0

4,8

3,6

7,5

12,9

1,2

3

Зеленая масса кукурузы

70,0

2,6

0,6

8,1

16,4

2,3

4

Пшеничные отруби

16,3

13,4

3,3

8,6

54,2

4,2

5

Рисовая мучка

15,0

7,1

2,8

24,4

38,3

12,4

6

Сахарная свекла

83,0

1,3

0,2

4,0

10,5

1,0

7

Сахарный тростник

78,0

0,3

0,1

8,0

11,0

2,6

8

Свекловичный жом

88,8

5,8

0,3

3,3

5,7

0,7

9

Сено луговое

16,3

9,3

2,6

25,6

39,7

6,5

Для поддержания культур лактобактерий и дрожжей, их учета и определения антагонистической активности применяли питательные среды производства ФГУП ГНЦПМ, г. Оболенск.

Глубинную ферментацию (ГФ) вели в качалочных колбах на круговых лабораторных качалках при 180-220 об./мин. при температуре 30±2°С. ТФФ в лабораторных условиях проводили в чашках Петри и в качалочных колбах при высоте слоя 1-5 см и влажности субстрата 50-55%. Чашки Петри или колбы помещали в термостат на 48ч при температуре воздуха 30±2°С и влажности 90-95%.

Определение содержания молочнокислых микроорганизмов проводили в соответствии с ГОСТ 10444.11–89, дрожжей - в соответствии с ГОСТ 10444.12-88.

Титруемую кислотность определяли в соответствии с ГОСТ 3624-92, ГОСТ 27493-87, активную кислотность - потенциометрическим методом на рН-метре НАNNA рН 211. Содержание белка проводили в соответствии с ГОСТ 23327-98, ГОСТ 10846-91, «сырого протеина»  - по методу Несслера.

Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли по программе Excel 2007 Microsoft Office, вычисляя среднее значение и стандартное отклонение для каждой величины, а также доверительный интервал при уровне значимости 95%. 

Органолептические свойства напитков оценивали по результатам дегустаций с оценкой по 5-балльной шкале в соответствии с ГОСТ 6687.5-86.

2.2 Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1 Оценка рынка пробиотических продуктов

На современном рынке достаточно широко представлены кисломолочные пробиотические продукты (кефир, биокефир, ряженка, таны, айраны и т.п.) с содержанием полезных бактерий 107-108 КОЕ/г. Но молоко является крайне дефицитным продуктом особенно в развивающихся странах. Рынка микробных функциональных продуктов на базе растительного сырья практически не существует. Попытка заполнить именно эту нишу сделана в настоящей работе.

2.2.2 Селекция молочных дрожжей суперпродуцентов биомассы на комплексном растительном сырье

В предшествующих исследованиях (Горин, 2011; Каночкина, 2012) было достаточно четко установлено, что российские дрожжевые изоляты из ЖГМ нередко обладают способностью интенсивно накапливать биомассу на таком твердом субстрате, как увлажненные пшеничные отруби. В рамках диссертационной работы было исследовано 60 вьетнамских образцов ЖГМ и из них выделено 46 чистых культур дрожжей, растущих при твердофазном культивировании на пшеничных отрубях. Следовательно, дрожжи-продуценты  биомассы на твердых субстратах можно выделять в разных регионах планеты. 44 вьетнамских и 4 высокопродуктивных российских штамма были испытаны на способность расти на измельченном сахарном тростнике. По результатам этого эксперимента только 1 российский и 1 вьетнамский штамм обладали повышенной продуктивностью на чистом тростнике (3,0-3,5.109 кл/г).

Более детальную селекцию дрожжей-суперпродуцентов биомассы на тростнике провели, используя весь комплект дрожжей российской и вьетнамской селекции. При этом в качестве питательной среды использовали смесь измельченного тростника с сенной мукой в соотношении 3:2 (табл.2).

Таблица 2 Продуктивность дрожжей на сахарном тростнике и сенной муке

Штамм дрожжей

Продуктивность дрожжей, 109 кл/г

Штамм дрожжей

Продуктивность дрожжей, 109 кл/г

24 ч

48 ч

72 ч

24 ч

48 ч

72 ч

1

8*

3,2

4,6

4,2

33

V7a

0,6

1,2

0,8

2

P.anomala 9а*

4,6

8,0

8,0

34

V7b

5,5

6,2

6,2

3

9b*

4,4

5,4

5,0

35

V7c

4,6

5,1

5,5

4

11*

0,3

0,2

0,2

36

V7d

1,2

2,1

1,6

5

12*

0,3

0,8

0,7

37

V7e

1,2

1,2

1,5

6

13*

0,4

0,2

0,2

38

V8

1,6

2,5

2,5

7

14*

4,8

2,6

2,4

39

V9a

1,0

0,8

0,8

8

17*

0,2

0,9

1,0

40

V9b

4,8

7,8

8,6

9

19*

6,4

6,6

7,5

41

V9c

1,3

1,4

1,0

10

25*

0,8

1,6

1,4

42

V9d

1,7

3,8

3,5

11

P.guilliermondii А1*

3,7

3,1

3,1

43

V9e

5,0

5,4

5,4

12

А2*

0,8

0,5

0,4

44

V9f

1,0

2,1

2,0

13

P.guilliermondii I1*

4,8

6,2

5,5

45

V9g

0,7

0,6

0,6

14

L1*

0,4

0,4

0,4

46

V9h

1,6

1,3

1,1

15

P.guilliermondii N1*

3,7

4,8

6,2

47

V9i

3,0

3,6

2,8

16

P.anomala P1*

4,7

6,5

6,2

48

V10a

1,7

1,4

1,3

17

Т1*

1,6

2,4

1,8

49

V10b

1,0

2,0

1,8

18

V1

4,0

4,4

3,8

50

V10c

0,1

0,4

0,3

19

V2а

3,1

4,0

3,0

51

V10d

4,8

6,6

6,2

20

V2b

0,9

0,9

0,9

52

V11a

0,7

1,3

1,0

21

V3

2,6

3,0

4,4

53

V11b

1,0

1,5

1,1

22

V4a

2,9

3,2

4,2

54

V11c

2,9

4,8

4,6

23

V4b

0,3

0,4

0,8

55

V12a

1,1

2,3

2,1

24

P.guilliermondii V5-1

5,6

7,8

8,4

56

V12b

0,8

2,0

1,4

25

V5-2

2,5

3,4

3,2

57

V12c

0,7

1,2

1,5

26

V5-3

0,2

0,3

0,2

58

V13a

1,1

1,6

1,5

27

H26

1,2

3,0

4,1

59

V13b

1,1

1,7

1,1

28

V6a

1,1

1,2

1,0

60

V13c

1,2

1,9

1,6

29

V6b

3,9

3,6

3,5

61

V13d

2,0

1,3

1,3

30

V6c

2,4

2,7

2,5

62

R1

5,5

8,0

7,8

31

V6d

1,3

1,1

1,1

63

R2

2,5

5,0

5,0

32

V6e

1,5

2,2

1,7

64

* - дрожжи российской селекции (Горин, 2011)

В этой серии экспериментов более четко выявились возможности селекционировать продуценты как среди российских, так и вьетнамских изолятов.

Наиболее продуктивные российские и вьетнамские штаммы были сравнены и на других сырьевых композициях. Российский штамм Pichia anomala 9a показал некоторые преимущества в росте на разных субстратах. В связи с этим именно он был выбран для дальнейших работ, хотя возможность использовать  вьетнамские штаммы также вполне реальна.

В молоке млекопитающих, в том числе и в ЖГМ, дрожжи присутствуют в ассоциации с молочнокислыми бактериями. На рис.1 достаточно четко видно, что далеко не каждая культура лактобактерий может успешно ассоциироваться с дрожжами. Некоторые из них могут стимулировать рост дрожжей P.anomala 9a (например штаммы В4 и В6), другие же достаточно заметно этот рост ингибируют. Хотя производственный штамм Laсtobacillus acidophilus La5 таким активирующим действием не обладает, для дальнейших исследований совместного культивирования дрожжей и бактерий мы выбрали именно его, т.к. он обладает стандартными технологическими характеристиками и не требует специального изучения в ходе получения ферментированных продуктов.

В3, В4, В5, ...В14 – лактобактерии, выделеные из ЖГМ,

La5 – произ-водственный штамм Lactobacillus acidophilus La5,

H* - Lactobacillus acidophilus317/402 (Наринэ),

Б**-Bifidobacterium bifidum,

-Pichia anomala 9a

Рисунок 1 Влияние молочнокислых бактерий на рост дрожжей Pichia anomala 9a на сахарном тростнике и рисовой мучке

Если оценивать эффективность биоконверсии по накоплению дрожжевых клеток на единицу массы сахаристого субстрата при глубинной и твердофазной биоконверсии, то накопление дрожжей например на комплексном субстрате арбуз-сенная мука в 4-5 раз выше, чем на жидкой среде из арбузной пульпы.

Значительное нарастание эффективности использования сахаристого субстрата микроорганизмами при твердофазном культивировании объясняется наличием экзоглюканазной и ксиланазной активностей у дрожжей Pichia anomala 9a (рис.2 и 3). Следовательно, целлюлозосодержащий компонент питательных сред является не просто пористым носителям, но сам может быть субстратом биоконверсии, и именно это делает ТФФ преимущественным способом для накопления дрожжевой биомассы в настоящей работе.

Рисунок 2 Экзоглюканазная актив-ность дрожжей Pichia anomala 9а в ТФФ на сенной муке

Рисунок 3 Ксиланазная активность дрожжей Pichia anomala 9а в ТФФ на сенной муке

2.2.3 Конструирование питательных сред для твердофазной ферментации дрожжей на базе комплексного растительного сырья

В работе исследована возможность смешивать все использованные легкоферментируемые сахаристые субстраты со всеми трудноферментируемыми целлюлозосодержащими. Основные принципы конструирования сред приведены на примере некоторых комплексных субстратов. На рис.4 представлено влияние содержания сахарозы в отрубевой питательной среде, а на рис. 5 в среде из сенной муки на рост дрожжей Pichia anomala 9a. Из этих рисунков видно, что максимум в накоплении дрожжей наблюдается при добавлении 7% сахарозы в питательные среды на основе пшеничных отрубей и при 10% сахарозы в среды на основе сенной муки. При увеличении концентраций сахарозы в средах происходит ингибирование роста дрожжей. Такое ингибирование дрожжей и неэффективное использование сахарозы для процесса биоконверсии совершенно не приемлемо.

Рисунок 4 Влияние содержания сахарозы на рост дрожжей Pichia anomala 9a на пшеничных отрубях

Рисунок 5 Влияние содержания сахарозы на рост дрожжей  Pichia anomala 9a на сенной муке

Более рациональным будет процесс биоконверсии первичного сахаристого сырья (вместе с целлюлозосодержащим компонентом), например сахарного тростника, с сенной мукой (рис.6) или с рисовой мучкой (рис.7).

Рисунок 6 Продуктивность дрожжей Pichia anomala 9a на сахарном тростнике и сенной муке

Рисунок 7 Продуктивность дрожжей Pichia anomala 9a на сахарном тростнике и рисовой мучке

Если принять во внимание, что содержание сахарозы в сахарном тростнике колеблется на уровне 12-13%, то ее концентрация в комплексной твердофазной среде будет около 10%, т.е. соответствует оптимальному значению концентрации сахарозы в среде, что было выявлено ранее. Роль разных целлюлозосодержащих компонентов в комплексных субстратах для стимулирования роста дрожжей неравноценна, но практически все они могут быть использованы в процессе твердофазного культивирования. Хорошим субстратом является сено, которое можно заготавливать, хранить традициоными методами и превращать в муку в процессе приготовления комплексных субстратов для микробной биоконверсии.

Рисунок 8 Продуктивность дрожжей Pichia anomala 9a на свекловичном жоме и сенной муке

Рисунок 9 Продуктивность дрожжей Pichia anomala 9a на свекловичном жоме и рисовой мучке

В условиях Вьетнама с абсолютным доминированием риса в рационе населения рисовая мучка как вторичный продукт переработки риса будет самым интересным стимулятором роста дрожжей.

Если говорить о производстве сахарозы в России, то основным ее источником является сахарная свекла, а отходом является свекловичный жом.

Возможности использования жома в микробной биоконверсии представлены на рисунках 8 и 9. Данные этих рисунков свидетельствуют о рациональности комплексной переработки жома с целлюлозосодержащими компонентами, о возможности использования разных целлюлозосодержащих стимуляторов роста дрожжей и подчеркивают высокую ценность рисовой мучки в такой биоконверсии.

При конструировании комплексных твердофазных питательных сред из легко- и трудноферментируемых субстратов для производства функциональных продуктов питания могут быть использованы различные региональные сахаристые продукты. В южных областях России такими продуктами являются бахчевые (прежде всего арбузы).

Рисунок 10 Продуктивность дрожжей P. anomala 9a на арбузной пульпе и рисовой мучке

Рисунок 11 Продуктивность дрожжей Pichia anomala 9a на арбузной выжимке и сенной муке

На рис. 10 представлены результаты ферментации арбузной пульпы с рисовой мучкой. Аналогичные исследования проводились и с другими целлюлозо-содержащими добавками. Все полученные данные подтверждают рациональность смешивания сахаристого субстрата с целлюлозосодержащими компонентами с целью накопления максимального количества микробной биомассы. Подобная же закономерность отмечается при биоконверсии и арбузной выжимки (рис.11).На таком виде сырья достаточно высокая продуктивность дрожжей наблюдается при заметно более низком содержании целлюлозосодержащего компонента.

Кукуруза широко распространена по самым различным регионам планеты и является растительным сырьем, которое по содержанию сахара приближается к предлагаемым композициям (8-10%).

Поэтому зеленая масса кукурузы использовалась в качестве основы питательных сред для твердофазного культивирования дрожже-бактериальной ассоциации P. anomala 9a и L. аcidophilus La5. На рис. 12, 13 видно, что измельченная зеленая масса кукурузы является хорошим питательным субстратом для накопления дрожжевой биомассы, но особенно активно этот процесс идет при добавлении традиционных обогатителей – отрубей и рисовой мучки. В разных регионах планеты такой целлюлозосодержащий обогатитель может варьировать.

Рисунок 12 Продуктивность дрожжей Pichia anomala 9a на зеленой биомассе кукурузы и пшеничных отрубях

Рисунок 13 Продуктивность дрожжей Pichia anomala 9a на зеленой биомассе кукурузы и рисовой мучке

Многие сахаристые субстраты как вторичные, так и первичные являются скоропортящимися продуктами, и в естественных условиях могут подвергаться интенсивному микробному обсеменению. Поэтому для комплексных сахаристо-целлюлозных субстратов было применено консервирование высушиванием. На рис. 14 и 15 представлена интенсивность роста дрожжей на высушенных при 80оС комплексах биомассы арбуза и целлюлозосодержащих субстратов (сенной муки и отрубей) до остаточной влажности 10% после 30 сут хранения этих комплексов при комнатной температуре. Результаты этих исследований свидетельствуют о реальности такого приема сохранения твердых питательных субстратов и о наиболее рациональных соотношениях исходных субстратов, используемых для изготовления таких сухих композиций. Наиболее эффективным для роста дрожжей является соотношение 7:3 при смешивании арбузной пульпы как с сенной мукой, так и пшеничными отрубями. Подобный же способ получения смешанных субстратов и их последующего высушивания можно рекомендовать для заготовки и других сахаристых продуктов как первичных, так и вторичных, например для того же свекловичного жома в период массовой переработки корнеплодов сахарной свеклы на сахарных заводах и формирования больших количеств жома.

Рисунок 14 Влияние влажности комплексного субстрата (арбуз и сенная мука) до сушки на рост дрожжей P. anomala 9a на высушенном субстрате

Рисунок 15 Влияние влажности комплексного субстрата (арбуз и пшеничные отруби) до сушки на рост дрожжей P. anomala 9a на высушенном субстрате

2.2.4 Определение условий культивирования Pichia anomala 9a на комплексных растительных субстратах

Продуктивность дрожжей Pichia anomala 9a в зависимости от величины посевной дозы была исследована при культивировании на измельченном сахарном тростнике с рисовой мучкой (7:3) (рис.16). Из этого рисунка видно, что наращивание посевной дозы рационально до 30х107кл/г, а дальше начинается снижение выхода дрожжей, т.е. очевидно в таком случае биосинтетический тип метаболизма начинает сменяться на биоокислительный, для которого характерно некоторое снижение максимума количества дрожжей в культурах при более быстром достижении этого максимума.

Влияние времени стерилизации в автоклаве при температуре 120оС субстрата арбузная выжимка-сенная мука (7:3) на продуктивность дрожжей P. anomala 9a представлено на рис. 17. Из этого рисунка достаточно четко видна ингибирующая роль длительной термической обработки на рост микроорганизмов. Поэтому были исследованы и более щадящие режимы обработки. На примере высушенного субстрата арбуз-пшеничные отруби (7:3) показано, что 30 минутная термическая обработка субстрата при более низких температурах, например 80-100оС, может приводить к более интенсивному росту дрожжей, чем стерилизация в автоклаве при 120оС (рис.18).

Рисунок 16 Влияние посевной дозы на рост дрожжей P.anomala 9a на сахарном тростнике и рисовой мучке (7:3)

Рисунок 17 Влияние времени стерилизации в автоклаве при 120оС на продуктивность дрожжей P.anomala 9a на субстрате арбузная выжимка-сенная мука (7:3)

Рисунок 18 Влияние температуры обработки субстрата (влажность 15%) на рост дрожжей P.anomala 9a на предварительно высушенном субстрате арбуз - пшеничные отруби (7:3)

Рисунок 19 Влияние длительности культивирования на продуктивность дрожжей P.anomala 9a на сахарном тростнике и сенной муке (3:2)

Любой живой организм имеет какие-то оптимальные температурные параметры для максимальной активности его ферментов и всех присущих для него обменных процессов. Исходя из источника выделения используемых в настоящей работе дрожжей – продуцентов биомассы, выделенных из ЖГМ можно было бы надеяться на их определенную термотолерантность. Однако при исследовании роста дрожжей на субстрате арбуз-сенная мука (7:3) при разных температурах таким оптимумом являются 30оС, хотя температурный диапазон достаточно интенсивного роста лежит в более широких пределах (25-35оС).

Что касается продолжительности культивирования, то на различных комплексных средах кривая роста дрожжей выходит на максимум уже к 48 ч, а далее продуктивность начинает снижаться (рис.19). На некоторых более трудноферментируемых субстратах рост  дрожжей продолжается и до 72 ч.

2.2.5 Динамика роста дрожжей и бактерий на комплексном растительном сырье в процессе биоконверсии

Рисунок 20 Динамика роста P.anomala 9a дрожжей на тростниксодержащих субстратах в аэробной ферментации

Рисунок 21 Динамика роста бактерий на тростниксодержащих субстратах в аэробной ферментации

В процессе аэробного культивирования на увлажненных твердых растительных субстратах наблюдается рост как аэробных дрожжей рода Pichia, так и таких факультативных анаэробов как молочнокислые бактерии. На рис.20 представлен рост дрожжей, засеянных совместно с молочнокислыми бактериями, на тростниксодержащих субстратах с разными целлюлосодержащими добавками. Из этого рисунка видно, что продуктивность дрожжей на этих комплексных субстратах несколько варьирует в зависимости от внесенной пористой добавки, но все же она достаточно высокая, составляет от 5 до 8,0х109 кл/г. Содержание бактериальных клеток в комплексных культурах после аэробной ферментации в несколько раз меньше чем дрожжей (рис.21). Следовательно при аэробной ферментации накапливается прежде всего дрожжевая биомасса.

Перевод процесса из аэробного в анаэробное культивирование может быть осуществлен разбавлением полученной в результате первого этапа твердофазной культуры водным раствором сахарозы (7%). Микробная составляющая при этом разбавляется пропорционально количеству добавляемой жидкости, однако на новом количественном уровне динамику роста дрожжей и бактерий проследить достаточно легко.

Рисунок 22 Динамика роста дрожжей P. anomala 9a на тростниковых субстратах при анаэробной ферментации

Рисунок 23 Динамика роста бактерий на тростниковых субстратах при анаэробной ферментации

На рис.22 представлена динамика роста дрожжей на тростниковых субстратах с разными целлюлозосодержащими добавками на первом этапе аэробной ферментации и после разбавления раствором сахарозы в анаэробных условиях на втором этапе. Обычно на втором этапе количество дрожжей резко падает. Что же касается молочнокислых бактерий, то их содержание в жидких комплексных культурах напротив резко возрастает (рис.23), достигая концентраций, обычно не наблюдаемых в молочнокислых продуктах.

На основании всех проведенных исследований было предположено, что накапливающаяся на первом этапе дрожжевая биомасса является специфическим стимулирующим нутриентом для бактерий.

Рисунок 24 Динамика активной кислотности в процессе анаэробной глубинной ферментации дрожже-бактериальных культур на тростниковых субстратах

Рисунок 25 Динамика титруемой кислотности в процессе анаэробной глубинной ферментации дрожже-бактериальных культур на тростниковых субстратах

В дрожже-бактериальных культурах на разных комплексных субстратах изучалась динамика активной кислотности (рис.24) и показано, что рН жидких культур в процессе анаэробной ферментации падает до 3,5-3,8. Титруемая же кислотность на сахаристых субстратах нарастает более или менее интенсивно в зависимости от характера сахаристого субстрата (рис.25).

2.2.6 Товароведная оценка разработанной категории продуктов

Принципиальная схема производства продуктов питания (напитков), путем биоконверсии комплексного растительного сырья представлена на рис.26.

Рисунок 26 Принципиальная схема получения продуктов питания из растительного сырья путем микробной биоконверсии

В результате реализации технологической схемы могут быть получены пищевые продукты, например напиток «Биоквас», представляющий собой мутную дрожже-бактериальную суспензию с хорошими органолептическими свойствами (табл.3 и рис.27).

Таблица 3 Характеристика напитков «Биоквас», полученных путем микробной биоконверсии комплексного растительного сырья

Наименование показателя

Напиток из тростника

Напиток из арбуза

Органолептические свойства

Мутная жидкость от светло-коричневого до коричневого цвета, запах свойственный тростнику, кисло-сладкий вкус

Мутная жидкость от светло-красного до красного цвета, запах свойственный арбузному, кисло-сладкий вкус

Массовая доля СВ, % не менее

10,0

10,0

Содержание сахара, г в 100см3

4,5

3,5

Содержание белка,% на СВ не менее

5,0

5,0

Активная кислотность, рН не менее

3,5

3,8

Титруемая кислотность, оТ не более

115

115

Микроорганизм, КОЕ не менее

Лактобактерии 109, дрожжи 107

Лактобактерии 109, дрожжи 107

Рисунок 27 Органолептическая оценка напитков «Биоквас», полученных путем биоконверсии различного растительного сырья

В то же время у таких продуктов довольно интенсивно выражена антитоксическая активность (табл.4), что позволяет отнести их к разряду уже известных парафармацевтиков. Кроме того разработанные продукты биоконверсии имеют повышенную по сравнению с исходным сырьем нутрициологическую ценность, например по содержанию аминокислот, в том числе незаменимых (табл.5 и 6), что позволяет причислить их к перспективным нутрицевтикам. Объединение двух этих свойств в одной категории продуктов  позволяет отнести их в разряд нутрипарафармацевтиков.

Таблица 4 Показатели роста и функциональных свойств токсино-образующих S. aureus FRI 722 при совместном выращивании с полученными комплексными культурами

Штамм

lg  КОЕ/ см3(г)

Концентрация токсина

б/р

1:10

1:50

1:100

1:200

1

Контроль  S. aureus FRI 722

10,8

+

+

+

-

-

2

Контроль S. boulardii  живые

9,5

+

+

+

+

-

3

Контроль S. boulardii  инакт*.

10,0

+

+

+

+

+

4

P. anomala 9а + La 5 живые

10,0

-

-

-

-

-

5

P. anomala 9а  + La5 инакт*.

12,3

+

+

+

+

-

инакт* инактивированный (прогретый при 100°С 15 минут)

Таблица 5 Содержание аминокислот в арбузном соке и в проферментированном напитке (% от СВ)

Показатели

Арбузный сок

Биоквас**

Относительное изменение,%

1

Сухие вещества,%

6,91

10,25

+48,30

2

Аспарагиновая к-та

0,40

0,47

+17,50

3

Глутаминовая к-та

0,62

0,78

+25,80

4

Серин

0,15

0,22

+46,67

5

Гистидин*

0,07

0,13

+85,71

6

Глицин

0,12

0,19

+58,30

7

Треонин *

-

-

-

8

Аланин

0,18

0,23

+27,78

9

Аргинин*

0,61

0,69

+13,11

10

Тирозин

0,13

0,20

+53,85

11

Цистеин

-

-

-

12

Валин *

0,18

0,72

+300

13

Метионин *

0,06

0,15

+150

14

Фенилаланин*

0,04

0,09

+125

15

Изолейцин *

0,20

0,28

+40

16

Лейцин *

0,18

0,23

+27,78

17

Лизин *

0,63

0,69

+9,52

18

Пролин

0,27

0,34

+25,93

19

Общее количество аминокислот

3,84

5,41

+40,89

* - незаменимые аминокислоты

** - приготовление на основе арбузной выжимки, отрубей, арбузного сока с использованием P. anomala 9a и L. аcidophilus La5.

Таблица 6 Динамика нарастания количества аминокислот в процессе ферментации зеленой массы кукурузы

Название аминокислот

Содержание аминокислот, %

Относи-тельное изменение,% (К3/К1)

К1

К2

К3

1

Аспарагиновая к-та

0,758

0,834

0,872

+15,04

2

Глутаминовая к-та

0,760

0,976

0,993

+30,66

3

Серин

0,375

0,402

0,473

+26,13

4

Гистидин*

0,047

0,195

0,101

+114,90

5

Глицин

0,207

0,332

0,233

+12,56

6

Треонин*

0,348

0,399

0,451

+29,60

7

Аланин

0,463

0,531

0,560

+20,95

8

Аргинин*

0,317

0,433

0,395

+24,61

9

Тирозин

0,358

0,340

0,434

+21,23

10

Валин *

0,342

0,376

0,433

+26,61

11

Метионин *

0,109

0,111

0,137

+25,69

12

Фенилаланин*

0,313

0,384

0,472

+50,80

13

Изолейцин*

0,377

0,330

0,405

+7,43

14

Лейцин *

0,660

0,660

0,839

+27,12

15

Лизин *

0,279

0,325

0,286

+2,51

16

Пролин

1,391

1,455

1,829

+31,49

17

Общее количество аминокислот

7,104

8,083

8,913

+25,46

К1: Измельченная высушенная зеленая масса кукурузы.

К2: Проферментированная измельченная высушенная зеленая масса кукурузы с помощью дрожже-бактериальных ассоциаций Pichia anomala 9a и Lactobacillus acidophilus La5 после аэробной ферментации (первая фаза ферментации).

К3: Проферментированная измельченная высушенная зеленая масса кукурузы после аэробной и анаэробной ферментации с помощью дрожже-бактериальных ассоциаций Pichia anomala 9a и Lactobacillus acidophilus La5 (вторая фаза ферментации).

ВЫВОДЫ

  1. Установлена возможность производства продуктов питания путем дрожже-бактериальной биоконверсии различных видов растительного  сырья.
  2. Дрожжи рода Pichia – продуценты микробной биомассы, хорошо ассоциирующиеся с лактобактериями, выделены из женского грудного молока представительниц России и Вьетнама.
  3. Выбраны оптимальные для биоконверсии сахаристые растительные субстраты РФ и Вьетнама как первичные, так и вторичные.
  4. Установлена большая перспективность для накопления дрожжей твердофазного культивирования на  растительных субстратах.
  5. Отмечено, что оптимальными для накопления микробной биомассы являются комплексные питательные среды из сахаристых и целлюлозосодержащих субстратов.
  6. Показана  возможность сохранения скоропортящегося сахаристого сырья для биоконверсии путем высушивания в комплексе с измельченными целлюлозосодержащими субстратами.
  7. Подобраны рациональные условия культивирования дрожже-бактериальных ассоциаций на твердофазных комплексных растительных субстратах: температура 28-32оС, влажность 40-60% (в зависимости от сырья), посевная доза дрожжей 20-40х107 кл/г, продолжительность культивирования 42-48 ч, содержание сахарозы в субстрате не более 10%.
  8. Предложена технология твердофазно-глубинной микробной ферментации комплексных растительных субстратов, исследована динамика роста дрожжей и бактерий в ходе этого процесса.
  9. Получены функциональные напитки на основе ассоциации дрожжей и лактобактерий, определен их химический состав, органолептические свойства и биологическая ценность.

ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Нгуен Чыонг Занг. Функциональные свойства дрожжей и бактерий, входящих в состав микробных корректоров пищевого и кормового назначения./ Е.Г. Борисенко, К.В. Горин, М.С. Каночкина, Чан Ван Ти, Е.А Борисенко, Ф.С. Флуер, А.Ю. Максимушкин. // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2012. - №3. - C. 46-49.

2. Нгуен Чыонг Занг. Исследование оптимальных условий культивирования перспективных штаммов дрожжей – источников биологически активных веществ на основе растительного сырья и отходов его переработки. / Е.Г. Борисенко, К.В. Горин, М.С. Каночкина, Чан Ван Ти, Е.А Борисенко, Л.А. Гулимова. // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2012. - №1. – С. 18-20.

3. Нгуен Чыонг Занг. Функциональные нутриенты на базе продуктов свеклосахарного и тростникового производств. / Е.Г. Борисенко, В.И. Тужилкин. // Сахар. - 2012. - №9. - С. 34-36.

Статьи и материалы конференций

4. Nguyen Truong Giang. The yeast-bacterial edible products based on the primary and secondary agroindustrial raw materials. / Borisenko E.G., Gorin K.V., Kanochkina M.S. // EurasiaBio 2nd International Congress-Partnering & Exhibition on Biotechnology and Bioenergy, Moscow, 2010. – Р. 236-237.

5. Нгуен Ч.З. Нутриенты – биокорректоры на базе нетрадиционного сырья. / Горин  К.В., Каночкина М.С., Борисенко Е.Г. // Сборник докладов III межведомственной научно-практической конференции “Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров”/ Отв. ред. Ю.И. Сидоренко. – М.: Издательский комплекс МГУПП, 2010. – С. 81-85.

6. Нгуен Чыонг Занг. Повышение питательной и биологической ценности растительных нутриентов с помощью микроорганизмов. / К. В. Горин,  М.С. Каночкина, Л.А. Гулимова, Чан Ван Ти, Е.Г. Борисенко. // Живые системы и биологичесая безопасность населения: материалы IX международной конференции студентов и молодых ученых – М. : МГУПП, 2011- С. 380-382.

Summary

The problem of protein deficiency could be resolved by producing microbial nutrients.  The yeast-bacterial associations which were isolated from human breast milk could be used to create varieties in nutrient production. The accumulation of yeast biomass that concludes complex of sugar and cellulose grew in a culture medium during solid aerobic fermentation. The process of bacteria biomass accumulating, their substances of metabolites and the taking shape of functional foods occurred in anaerobic submerged fermentation.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В АВТОРЕФЕРАТЕ

ЖГМ женское грудное молоко; БАД биологически активная добавка; ГФ – глубинная ферментация; ТФФ – твердофазная ферментация; СВ – сухие вещества; КОЕ – колонии образующих единиц.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность своему научному руководителю д.т.н., профессору Борисенко Е.Г., заведующей кафедрой “Биотехнология” МГУПП д.т.н., профессору Ивановой Л.А., к.т.н., профессору Войно Л.И., заведующему кафедрой “Технология общественного питания” МГУПП д.т.н., профессору Дубцову Г.Г., заведующему кафедрой “Технология сахаристых, субтропических и пищевкусовых продуктов” МГУПП д.т.н., профессору Тужилкину В.И., д.т.н. профессору Сапронову А.Р., к.т.н. Клемешову Д.А., а также всем сотрудникам кафедры «Биотехнология» МГУПП.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.