WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Тарасова Елена Владимировна

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ  МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ  L-ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ ИЗ ПАТОЛОГОАНАТОМИЧЕСКОГО  МАТЕРИАЛА И ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунологией

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Белгород – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном

образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Белгородская государственная сельскохозяйственная академия

имени В.Я.Горина»

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук

  Коваленко Анатолий Михайлович

Официальные оппоненты: Евглевский Алексей Алексеевич, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лаборатории «Ветеринарная медицина» ГНУ «Курский НИИ агропромышленного производства»  Россельхозакадемии;

       Стебловская Светлана Юрьевна, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры эпизоотологии, радиобиологии и фармакологии, ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени  профессора И.И.Иванова».

Ведущая организация -  ФГОУ ВПО  Санкт–Петербургская государственная

академия ветеринарной медицины.

Защита диссертации состоится « » 2012 г. в  часов

на заседании диссертационного совета Д 220.004.02 при ФГБОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Я. Горина» по адресу: 308503, Белгородская область, Белгородский район, пос. Майский, ул. Вавилова, д. 1. Тел/факс 8(4722)39-22-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия имени В.Я.Горина», а с авторефератом в сети интернет на официальном сайте Министерства образования и науки РФ vak.ed.gov.ru и  на сайте академии  www.bsaa.edu.ru

Автореферат разослан «___» ____________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Резниченко Людмила Васильевна

  1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Увеличение производства и повышение качества продуктов животноводства в значительной степени зависит от благополучия стад по инфекционным болезням, в том числе и по туберкулезу крупного рогатого скота.

В неблагополучных стадах борьба с туберкулезом ведется длительное время с использованием аллергической диагностической пробы, которая не всегда отображают истинную картину развития туберкулезного процесса (Ю.Ю. Данко, 2006; Л.М. Ходун с соавт., 1991, А.С. Донченко, с соавт., 1990, 1991,  В.И. Кузин, 1977, 1992, Э.Д. Лакман, 1982; А.Х. Найманов, 2001; Н.П. Овдиенко, 2001; В.И. Ротов, В.П. Урбан, 2004; В.А. Кузьмин, 2012).

Кожный туберкулиновый тест не информативен при проведении аллергических исследований на животных, находящихся в латентной форме развития туберкулезного процесса и сенсибилизированных атипичными микобактериями. Возникает проблема выделения микобактерий из биоматериала (без видимых патологоанатомическим изменениям присущих теберкулезу) при проведении лабораторной диагностики. Выделение микобактерий из биоматериала, в силу их физиологического строения клеточной стенки (генетических и фенотипических особенностей) всегда представляет трудную задачу при проведении бактериологических  исследований (Л.В. Галатова, 1990, 1993; Б.Ф. Керимжанова, 1991; В.Г., А.З. Равилов, 1999; О.А. Иртуганова, 2006).

Исследования ряда авторов (В.С. Федосеев, 1985;  Донченко А.С. с соавт.; 1986, 2001, 2004; И.Р. Дорожкова, 1994, 1993; Б.Ф. Керимжанова, 1991;  Г.М. Николаева, 1995; K. Duncan, 1997 и др; В.Г. Ощепков, 2001, 2009; Л.А. Таллер, 2003; В.И. Голышевская, 2004; А.А. Евглевский, 2011 и др.) дают основания предположить, что одной из причин длительного неблагополучия хозяйств по туберкулезу крупного рогатого скота, а также рецидивы в оздоровленных хозяйствах, является  персистенция в организме животных  L-форм микобактерий туберкулеза.

Существующие методы предпосевной обработки биоматериала заключаются в длительном воздействии кислот, что приводит к уничтожению не только сопутствующей микрофлоры, но и кислотоустойчивых микобактерий. При этом, возникают трудности связанные с сохранностью клеточной стенки микобактерий, а в дальнейшем с существованием самой микобактерии во время предпосевной обработки биоматериала (В.И. Голышевская и соавт., 1997;  И.Г. Шемякин и соавт., 2000; В.Н. Донченко, 2007;  А.А. Безбородова, 2008;  T.M. Shinnik, 1996).

В этой связи вопросы усовершенствования предпосевной обработки патологоанатомического материала, лабораторной диагностики, направленные на повышение эффективности существующих методов выделения микобактерий и разработки новых способов, является актуальной задачей, что и предопределило цель нашего диссертационного исследования.

Цель исследования. Целью исследования явилось усовершенствование метода выделения L–форм микобактерий из патологоанатомического материала и объектов внешней среды.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

- разработать новый способ предпосевной обработки патологоанатомического материала, обеспечивающего повышение эффективности выделения деструктивных по клеточной стенке L-форм микобактерий;

- изучить возможность образования L–форм из бактериальных форм микобактерий в объектах внешней среды и продуктах питания, а также in vitro под действием лекарственных препаратов;

- изучить биологические особенности выделенных L–форм микобактерий, их сенсибилизирующие и вирулентные свойства.

Научная новизна. Разработан новый способ предпосевной обработки для выделения L-форм микобактерий из патологоанатомического материала и объектов внешней среды заключающийся в обработке патологоанатомического материала 2–3%-ным раствором серной кислоты и дополнительной фильтрации, который  позволяет повысить на 30% высеваемость микобактерий туберкулеза из биоматериала от животных и из объектов внешней среды (положительное решение на патент РФ №2011150969/15 (076563) «Способ предпосевной обработки патологоанатомического материала для выделения L-форм микобактерий» от 14.12.2011г. и  патент UA №39178 «Способ выделения L-форм микобактерий из патологического материала» от 10.02.2009г.). Изучена возможность образования L–форм микобактерий в объектах внешней среды и продуктах питания, а также in vitro под действием лекарственных препаратов. Изучены сенсибилизирующие и вирулентные свойства выделенных L–форм микобактерий.

Практическая значимость работы. Повышение выделяемости L-форм микобактерий из биоматериала от животных, из объектов внешней среды с использованием усовершенствованного метода предпосевной обработки патологоанатомического материала позволит увеличить высеваемость на питательных средах как в бактериальной так и в L-форме микобактерий, что позволит выделить всех инфицированных животных, оперативно организовать противотуберкулезные мероприятия и ускорить проведения оздоровительных мероприятий.

Результаты исследований использованы при составлении методических рекомендаций «Микобактерии деструктивные по клеточной стенке: диагностика, культивирование, идентификация» утвержденных ученным советом факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия» им. В.Я. Горина (протокол №1 от 13 сентября 2011 г.), «Выделение L–форм микобактерий» (методические рекомендации) утверждены научно - методическим советом Государственного комитета ветеринарной медицины Украины (протокол №1от 23 декабря 2009 г.).

Материалы исследований использованы при подаче заявки на патент РФ «Способ предпосевной обработки патологоанатомического материала для выделения L-форм микобактерий» (положительное решение от 14.12.2011 г.  №2011150969/15 (076563)) и формировании патента UA №39178 «Способ  выделения L-форм микобактерий из патологического материала» от 10.02.2009г.

Материалы исследования использованы в учебном процессе по дисциплине эпизоотология и инфекционные болезни животных для студентов 4 и 5 курса факультета ветеринарной медицины, ФГБОУ ВПО «Белгородская ГСХА  им В.Я. Горина».

Апробация. Основные положения диссертационной работы были доложены на:

- на международной научно-практической конференции (АР Крым, Феодосия, 14-18 сентября 2009 г.);

- на международной научно-практической и учебно-методической конференции (Харьков, 2009, 2010 г.);

- на заседаниях кафедры инфекционной и инвазионной патологии и отчетных сессиях Ученого совета Белгородской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Я. Горина (2011-2012 гг.);

- научно практической конференции, посвященной дню науки в Белгородской ГСХА им. В.Я. Горина (г. Белгород, 8 февраля 2012 г.).

Публикация результатов исследований. Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 8 научных статьях, в том числе  2 в изданиях перечня ВАК Российской Федерации.

Получены  положительное решение на выдачу патента Российской Федерации и патент Украины.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, практических предложений. Библиографический список использованной литературы включает  153 отечественных и 61 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами, 11 рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Краткий анализ эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в Российской Федерации.
  2. Усовершенствованный способ предпосевной обработки патологоанатомического материала для выделения L–форм микобактерий.
  3. Экспериментальные данные по выделению L–форм из бактериальных форм микобактерий в объектах внешней среды и продуктах питания, а также in vitro под действием лекарственных препаратов;
  4. Результаты изучения вирулентных и сенсибилизирующих свойств выделенных  L–форм микобактерий.
  1. Материалы и методы исследований

Диссертационная работа выполнялась в период с 2007 по 2011гг. Исследования проводились на кафедре инфекционной и инвазионной патологии Белгородской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Я. Горина, отделе изучения туберкулеза, ННЦ «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины».

Для выполнения поставленных задач были использованы эпизоотологические, клинические, патологоанатомические, микробиологические, биохимические методы исследования.

Обработку патологического материала проводили по методике А.П. Аликаевой (1940), туберкулезные поражения внутренних органов определяли по методикам П.М. Кокуричева (1953) и А.И. Тогуновой с соавт. (1961).

Бактериологические исследования по выделению микобактерий, последующей их идентификации,  проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий» (Т.Б. Ильина, 1975; 1980), согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных», утвержденному Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации от 18 ноября 2002 г.

При изучении L-трансформации микобактерий в объектах внешней среды был поставлен опыт, для которого отбирали пробы почвы, песка, комбикорма, водопроводной и речной воды. Отобранные пробы были подвергнуты стерилизации, а молоко и сметана исследовали в нативном виде. Приготовленные таким образом тест–объекты контаминировали M. bovis, M. аvium,  M. scrofulaceum, M. fortuitum из расчета 1,0 см взвеси (1мг/см) на 100,0 см почвы, песка, комбикорма, воды, сметаны и молока. Контаминированые тест–объекты хранили при температуре 4°С и 25°С. Исследования проводили через каждые 30 дней на протяжении 12 месяцев.

У выделенных культур L–форм микобактерий изучали сенсибилизирующие и вирулентные свойства на клинически здоровых морских свинках, которые до начала опыта не реагировали на ППД – туберкулин для млекопитающих. Микобактерии, выделенные на среде Е.А. Школьниковой (1948г.) в L–форме, стабильные (№№ 4-6, 9, 15-17) и нестабильные (№№ 1-3, 7, 8, 10-14), отбирали пастеровской пипеткой, отмывали физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин. Полученной взвесью заражали морских свинок подкожно в дозе 1,0 см. Зараженных лабораторных животных исследовали через 30 дней на протяжении 3 месяцев аллергическим методом. Через 90 дней  (от начала опыта) всех инфицированных животных после эвтаназии, исследовали патологоанатомическим методом, а отобранный патологоанатомический материал — бактериологическим методом.

Данные экспериментальных исследований обработаны методами математической статистики по методике, описанной Г.Ф. Лакиным (1990), рассчитывая средние значения (M±m), достоверность разницы опытных и контрольных показателей (Р) с помощью программы Microsoft Excel.

  1. Результаты  исследований
    1. Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в Российской Федерации.

Анализируя эпизоотическую ситуацию по туберкулезу крупного рогатого скота в Российской Федерации в период с 1999 по 2010 годы, необходимо отметить тенденцию к снижению числа вновь выявленных реагирующих на туберкулин животных, неблагополучных пунктов, что коррелировало со снижением общего поголовья крупного рогатого скота (рис. 1).

Рис. 1. - Анализ эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в Российской Федерации  в период с 1999 по 2010 годы

Так если по состоянию на 1999 г. в Российской Федерации было выявлено 1124 неблагополучных пунктов, то в 2001 г. этот показатель снизился до 377 что на 548,3 пункта меньше чем 1999 г. В течении этого периода было оздоровлено  756 и выявлено новых 433 неблагополучных пунктов. Период с 1999 по 2001 гг. характеризовался проведением широкомасштабных мероприятий по борьбе с туберкулезом крупного рогатого скота, чему способствовали и снижение количества неблагополучных пунктов.

В дальнейшем, по мере проведения оздоровительных мероприятий, количество неблагополучных пунктов стало постепенно уменьшаться, так в 2002 г. насчитывалось 231, а в 2005г. этот показатель снизился до 106 неблагополучных пунктов,  что на 45,9% меньше чем 2002 г.

Отмечено  некоторое увеличение количества неблагополучных пунктов в 2006г. до 304, что на 198 больше в сравнении с 2004 г. С 2008 г. количество неблагополучных пунктов стабильно ежегодно снижалось и по состоянию на конец 2008 г. составляло 93. Было оздоровлено 47 неблагополучных пунктов, что  в 4 раза меньше в сравнении с 2006 г. В течение 2009г. было оздоровлено 18 и выявлено 8 новых хозяйств, неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота.

По состоянию на 1999 г. было выявлено реагирующих на туберкулин  15585 тыс. голов крупного рогатого скота, а в 2000 г. этот показатель снизился до 12720 тыс. голов, что на 43% меньше в сравнении с 1999 г.  В 2001 г. было выявлено реагирующих на туберкулин  10863 тыс. голов, что меньше на  58%,  по сравнении 2003 г. и составило 12024 головы. Повышение выявляемости реагирующих животных было связано с повышением заболеваемости и появлением новых неблагополучных пунктов, в которых данная инфекция протекала, по всей видимости, в латентной форме. В 2008 г. заболело туберкулезом 5 014 голов крупного рогатого скота, а в 2009 г. – 2 085, то есть заболело на 2 929 голов меньше. К 2010 г. количество заболевших туберкулезом животных уменьшилось более, чем в 2 раза по сравнению с 2008 г.

В хозяйствах с невыясненной эпизоотической ситуацией по туберкулезу, где сенсибилизируют L-формы микобактерий, существуют трудности с постановкой диагноза. Вышеизложенная эпизоотическая ситуация и несовершенство методов предпосевной обработки по выделению возбудителей инфекции подтолкнули нас к разработке метода предпосевной обработки по выделению L-форм микобактерий.

    1. Разработка метода предпосевной обработки патологоанатомического материала для выделения L-форм микобактерий

Культуральными исследованиями 106 проб патологоанатомического материала, полученного из хазяйств с невыясненной  эпизоотической ситуацией установлено, что метод А.П. Аликаевой (1940) не позволяет выявить из проб биоматериала, (без туберкулезных изменений в лимфатических узлах)  типичные бактериальные формы в 85,8% случаев.

В результате бактериологических исследований выделено 96 культур микобактерий, из них – в бактериальной форме (R–форме) 19 (19,8%), в смешанной R + L–формах – 25 (20,1%) и в L–форме 52 (54,2%) культуры микобактерий.

Предложенный нами усовершенствованный метод предпосевной обработки патологоанатомического материала для выделения деструктивных по клеточной стенке микобактерий, который основывается на измельчении патологоанатомического материала в ступке ножницами, выдерживании в  2%-ном растворе серной кислоты в течении 15 мин, отмывании физиологическим раствором, растирании с кварцевым песком и фильтровании взвеси через целлюлозные мембраны с диаметром пор 0,2 – 0,45 мкм. Полученный фильтрат высевали на среду Школьниковой пастеровской пипеткой в толщу среды. Посевы культивировали в термостате при температуре 37С в течении 30 – 60 суток.

Проводили отбор парных проб патологоанатомического материала от  106 голов крупного рогатого скота, реагирующего на ППД–туберкулин, и использовали для предпосевной обработки с помощью традиционной методики по А.П. Аликаевой (1940) и усовершенствованной нами методики предпосевной обработки.

Результаты сравнительного изучения эффективности усовершенствованной нами методики предпосевной обработки для выделения L-вариантов микобактерий с методикой по А.П. Аликаевой отображены в табл. 1.

При использовании традиционного способа обработки патологоанатомического материала по методу А.П. Аликаевой с применением 3%-ного раствора серной кислоты культуры микобактерий в L-форме выделены из 25 (23,6%) проб,  а после применения (5 - 8%-ного) раствора серной кислоты — из 15 (14,6%) проб.

Таблица 1 – Результаты сравнительного изучения предпосевной обработки патологоанатомического материала

Метод обработки

Количество проб

Концентрация серной кислоты, %

Начало роста (сутки)

Выделено культур в L-форме

Загрязненность посевов, %

А.П.Аликаевой

106

3

25±1,5

25 (23,65%)

1,0

5

34±2,0

15 (14,6%)

0,6

8

34±2,0

15 (14,6%)

0,6

Усовершенст-вованный  метод

106

3

14±1,5

52 (49,1%)

0,5

5

15±1,0

38 (35,8%)

0,6

8

27±2,0

9 (8,5%)

0,6

Зарегистрирован первичный рост на среде Школьниковой после применения 3 %-ного раствора серной кислоты на 25±1,5, а  при использовании  (5–8%-ного) раствора серной кислоты на 34±2,0 сутки после посева.

При использовании модифицированного метода с применение 3%-ного раствора серной кислоты культуры микобактерий  M. bovis в L-форме выделены от 52 (49,1%) пробы на 14±1,5 сутки, 5%-ного раствора серной кислоты от 38 (35,8%), а с применением 8%-ного раствора серной кислоты выделено от  9 (8,5%) проб. Первичный рост  культур в L-форме микобактерий отмечали на 15±1,0 - 27±2,0 сутки.

Предложенная методика предпосевной обработки позволила избежать роста посторонней микрофлоры в 0,5% случаях, тогда как при использовании метода А.П. Аликаевой (1940) рост посторонней микрофлоры отмечался в 1% случаев (табл. 1).

Изучены реверсивные свойства выделенных L-форм микобактерий. При проведении исследований по изоляции L-форм микобактерий из патологоанатомического материала нами было выделено 154 культуры M. bovis в L-форме, которые подвергали 13 - кратному пассажированию на среде Школьниковой.

Было установлено что, на втором – четвертом последовательном пассажах реверсировало в исходную бактериальную форму 94 (61,1%) и на восьмом – девятом 32 (20,7%) культуры M. bovis раннее находившихся в L-форме. При этом 21 (13,6%) культура M. bovis находящаяся в L-форме сохраняла стабильность и реверсировала только на 13 пассаже в бактериальную R-форму. Утратили свои ростовые свойства на среде Школьниковой во втором – третьем пассаже раннее не идентифицированные 7 (4,5%) культур микобактерий в L-форме. L-варианты, у которых реверсия в бактериальную форму на питательных средах наблюдалась на втором - третьем пассаже, расценивали как нестабильные, а те культуры, которые реверсировали в бактериальную форму после четвертого пассажа относили к условно стабильным.

Для детекции микобактерий находящихся в L-формах, на среде Школьниковой использовали фазово–контрастное микроскопирование (20х40) изъятых из глубоких слоев среды облаковидных образований.

При проведении фазово-контрастной микроскопии нами были обнаружены микроструктурные элементы в виде сферических тел разного размера и оптической плотности в виде аморфной массы представленные сферобластами и другими морфологическими формами.

Таким образом, предложенный нами способ предпосевной обработки патологоанатомического материала позволил дополнительно выявить 27 культур микобактерий, находящихся в L-форме, и снизить загрязненность питательных сред в 2 раза по сравнению с традиционной методикой по А.П. Аликаевой.

    1. Исследование по выделению L-форм микобактерий из проб молока и сметаны и изучение влияния антибиотиков на культуры  микобактерии in vitro

В результате проведених исследований были установлены изменения  клеточной структуры бактериальных форм микобактерий M. bovis в деструктивные L-формы микобактерий в 60% проб через 60 дней, в 30% проб сметаны после начала опыта. Тогда как из проб сметаны хранившихся при температуре +4°С L-трансформацию культур M. bovis не выявлено. L-трансформацию культур  М. avium отмечали в 90% проб через 30 дней, а в  100% проб сметаны через 60 дней от начала опыта (при температурных режимах +4°С и +25°С).

После контаминации проб сметаны M. scrofulaceum через 30 и 60 дней (хранение в бытовом холодильнике +4°С) отмечали рост L-форм микобактерий  у 90% случаях, а через 3 месяца от начала эксперимента в 50% случаев.

В пробах молока (при +4°С, +25°С ) контаминированого культурой M. bovis, были выделены деструктивные по клеточной стенке L-формы через 60 и 90 дней от начала опыта во всех исследованных пробах. Тогда как L-формы М. avium из проб молока были выделены только через 90 дней с начала опыта (при +4°С) в 70% проб. Из проб молока, контаминированого M. scrofulaceum, были выделены L-формы микобактерий  на среде Школьниковой через 2 месяца после контаминации (при +4°С, +25°С ).

Первичный рост на среде Школьниковой M. bovis, М. avium и  M. scrofulaceum в L-форме отмечали на 10 - 14 сутки после посева.

При аналогичных исследованиях с культурами M. fortuitum  L-трансформации из бактериальных в деструктивные формы не наблюдали.

При изучении L-индуцирующего влияния лекарственных препаратов на возбудителей туберкулеза установлено, что при действии пенициллина на культуру M. bovis изменчивость проявляется в 55%, а в культуре M. avium в  75% случаев, а при воздействие стрептомицина изменчивость проявлялась в 42%, M. avium в 52%. Были выявлены стабильные Lформы выше упомянутых микобактерий, на среде Школьниковой.

    1. Выделение L-форм микобактерий из проб почвы, кормов и воды

Проведенными исследованиями установлено, что в пробах почвы и песка, которые хранились при температуре +4°С, M. bovis в L-форме были выделены через 30, 60, 90 дней, тогда как из почвы и песка, которые хранили при комнатной температуре +25°С, культуры в L-форме выделяли только через 30, 60 дней, после начала опыта в 100% случаев. L-формы вида M. bovis из комбикорма были выделены через 30, 60 и 90 дней после начала опыта (температурах хранения +4С, +25С) в 90% случаях, а с водопроводной и речной воды L-формы выделены только через 90 дней с момента контаминации проб, которые хранили при комнатной температуре (+25°С).

После контаминации проб почвы бактериальной формой M. аvium, L-формы выделяли через 90 дней (+4°С, +25°С), из песка через 60 дней (только при температуре хранения +25°С). Из  проб комбикорма M. avium в L-форме на среде Школьниковой выделяли через  60 и 90 дней после контаминации (+4°С, +25°С), а через 30 дней (+25°С) в 60% случаев. Из проб водопроводной воды L-формы выделяли через 60, речной воды 90 дней после контаминации (+25°С) в (70-80%) случаев.

M. fortuitum в L-форме из проб почвы, песка, комбикорма (+4°С) выделяли на среде Школьниковой через 60, 90 дней,  а при температуре (+25°С) — только через 60 дней с момента контаминации. Из проб водопроводной и речной воды (+4°С) M. fortuitum в L-форме выделяли через 90 дней, а при температуре  +25°С — через 60 дней с момента контаминации в (60-80%) случаях.

M. scrofulaceum в  L-форме были выделены на среде Школьниковой из проб почвы, песка и комбикорма (+4°С, +25°С) через 30, 60, 90 дней с момента контаминации в 70% случаев. Из водопроводной воды L-формы выделены через 60 и 90 дней, а из проб речной воды (+4°С, +25°С) - через 30 и 60 дней с момента контаминации в 60% случаев.

Первичный рост L-форм M. bovis, M. avium на среде Школьниковой выявлен на 16±1,5 день в 60% посевов, а M. fortuitum и M. scrofulaceum на 7,3±2,0 день с момента посева в 80% посевов.

При исследовании посевов (на среде Школьниковой) произведенных из объектов внешней среды, были изолированы M. bovis, M. аvium, M. fortuitum и  M. scrofulaceum в L-форме из проб почвы 33,3%, песка 35,4%, комбикорма в 39,6%, водопроводной воды 16,7% и речной воды 14,5% случаев. При проведении сравнительной характеристики количественных показателей выделения микобактерий в L-форме необходимо отметить, что M. scrofulaceum в L-форме давала рост 38,1% посевов, M. fortuitum — в 15,5% посевов,  M. bovis — в 28,7%, M. avium  — в 17,8% посевов. 

В зависимости от типа тест-объекта и культуры микобактерий, а также режима хранения, следует, что L-формы вида M. bovis выделялись из почвы, песка (41,7%), комбикорма (50%), водопроводной и речной воды (8,3%) при обоих режимах хранения.

Что касается атипичных микобактерий, которыми были контаминированы объекты внешней среды, то их трансформация в L-форму была наиболее выражена в культуре M. scrofulaceum. L-формы M. scrofulaceum выделены из 50% проб песка и почвы, из 41,7% проб комбикорма и из  33,3%  проб водопроводной и речной воды. L-формы M. fortuitum выделены из  25% проб песка, почвы, комбикорма, из 16,7% проб водопроводной и речной воды.

    1. Изучение сенсибилизирующих и патогенних свойств L-форм микобактерий

В результате проведенных исследований установлено, что при аллергическом исследовании морских свинок, зараженных стабильными M. bovis №4 и №7 в L-форме, через 30 суток после инфицирования, реакция на туберкулин (ППД) для млекопитающих была выявлена только у 20% животных, а через 60, 90 суток — у 30% морских свинок (инфицированных L-формами M. bovis №№1-3, 7, 8, 10).

У морских свинок, зараженных культурами стабильных L-форм M. bovis №4 и №5, положительная реакция на туберкулин (ППД) для млекопитающих наблюдалась на 60 день после заражения у 15% животных, а на 90 день  у 35% морских свинок.

Зараженные референтным штаммом Vallee (морские свинки)  контрольной группы, реагировали во все сроки исследования. При этом реакция на туберкулин (ППД) для млекопитающих характеризовалась ярко выраженными воспалительными отеками.

Патогенные свойства выделенных культур в L-форме микобактерий изучали на тех же морских свинках, на которых изучали и сенсибилизирующие свойства.

Было установлено, что характерные для туберкулеза изменения в лимфатических узлах и единичные  туберкулы в печени были выявлены  у 30% морских свинок, зараженных нестабильными L-формами M. bovis №№1-3, 7.  В этой группе животных пало 50% особей на 75 день опыта.

У морских свинок, которые были заражены стабильными L-формами M. bovis (№№ 4-6, 9, 15-17) при вскрытии у 60% особей патологоанатомических изменений не выявлено, а у 40% были выявлены увеличения паховых лимфатических узлов в 2–3 раза.

Проведенные исследования позволяют заключить, что L-формы микобактерий возбудителя туберкулеза M. bovis способны персистировать в организме и при определенных условиях реверсировать в исходный бактериальный вид с присущей им вирулентности.

Результаты наших исследований показывают, что нестабильные L-формы микобактерий, выделенные из патологоанатомического  материала от крупного рогатого скота, обладали слабыми вирулентными свойствами. У 60% морских свинок L-формы микобактерий вызывали единичные поражения в печени и селезенке, а у животных  (40%), зараженных стабильными L-формами, отмечали увеличение пахового лимфатического узла в 2 - 3 раза. Однако патологоанатомические изменения были выражены в опытной слабее, нежели у контрольной группы  животных, зараженных референтным штаммом  Vallee.

  1. ВЫВОДЫ

1. Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в Российской Федерации за период с 1999 по 2011 год характеризуется стабильной стационарностью неблагополучия с постепенным снижением численности неблагополучных пунктов, что коррелирует с показателями  уменьшения численности поголовья животных.

2. При проведении мониторинговых культуральных, исследовании 106 проб патологоанатомического материала от реагировавшего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота в хозяйствах с невыясненной эпизоотической ситуацией было выделено 19 (19,8%) культур в бактериальной, 52 (54,2%) в L-форме  и  25 (20,1%) культур в смешанной  L+R-формах микобактерий.

3. Нами усовершенствована методика предпосевной обработки патологоанатомического материала, отличающаяся от существующих, применением 2 – 3%-ного раствора серной кислоты и дополнительного использования фильтрации через целлюлозные мембраны диаметром пор 0,2 - 0,45мкм, позволяющая увеличить в два раза выделяемость деструктивных по клеточной стенке L-форм микобактерий (положительное решение на патент РФ  «Способ предпосевной обработки патологоанатомического материала для выделения L-форм микобактерий» от 14.12.2011 г. №2011150969/15 (076563) и патент UA №39178 «Способ выделения L-форм микобактерий из патологического материала» от 10.02.2009г.)

4. Установлено L-трансформирующее влияние пенициллина и стрептомицина на бактериальные формы возбудителя туберкулеза, проявляющиеся изменчивостью M. bovis в 55%, M. avium в 75% случаев (при воздействии пенициллина), в 42% (M. bovis), в 52% (M. аvium) случаев, при воздействии стрептомицина.

5. Впервые в условиях камерального эксперимента установлена трансформация бактериальных форм микобактерий туберкулеза в L-форму при длительном хранении контаминированых продуктов питания и субстратов  внешней среды (в течении 1 года), выражающаяся  изоляцией культур L-форм микобактерий: из сметаны в 20,8%, молока в 14,5%, почвы в 33,3%, песка в 35,4%, комбикорма в 39,6%, водопроводной в 16,7% и речной воды в 14,5% случаях.

6. Нами установлена способность вызывать развитие туберкулезного процесса у лабораторных животных экспериментально зараженных как стабильными, так и нестабильными L-формами M. bovis, соответственно в 60% и 40% случаях, что свидетельствует об их высоких вирулентных и сенсибилизирующих свойствах.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИДЛОЖЕНИЯ

  1. В лабораторной диагностике рекомендуется проводить исследования по выделению L-форм микобактерий, согласно разработанных нами методических рекомендаций «Деструктивные по клеточной стенке микобактерии: диагностика, профилактика, идентификация», утвержденных ученным советом факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия» им. В.Я. Горина (протокол №1 от 13 сентября 2011 г.), «Выделение L–форм микобактерий» (методические рекомендации) утверждены научно - методическим советом Государственного комитета ветеринарной медицины Украины (протокол №1 от 23 декабря 2009 г.).
  2. Рекомендован усовершенствованный способ обработки патологоанатомического материала для выделения L-форм микобактерий (положительное решение на патент «Способ предпосевной обработки патологоанатомического материала для выделения L-форм микобактерий» от 14.12.2011г. №2011150969/15 (076563) РФ и патент UA №39178 «Способ выделения L-форм микобактерий из патологического материала» от 10.02.2009г.), позволяющий повысить выделяемость L-форм микобактерий из биоматериала от животных и из объектов внешней среды, а также выявлять всех инфицированных животных как в бактериальной так и в L-форме микобактерий, при организации противотуберкулезных мероприятий для эффективности  оздоровления хозяйств от туберкулезной инфекции.
  3. Материалы диссертации используются в учебном процессе по дисциплине эпизоотология и инфекционные болезни животных для студентов 4 и 5 курса, факультета ветеринарной медицины,  ФГБОУ ВПО «Белгородская ГСХА им В.Я. Горина».

6. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Коваленко А.М., Тарасова Е.В. Выделение измененных форм микобактерий / Вестник КГСХА – Курск, 2012 - № 1 – С. 113 – 115.
  2. Кузьмин В.А., Тарасова Е.В.,  Коваленко А.М.  Биологические свойства L-форм микобактерий, выделенных из объектов внешней среды / Ветеринарная практика – Санкт – Петербург,  2012г - №1 (56) – С. 13 – 16.
  3. Положительное решение на выдачу патента РФ № 2011150969/15 (076563) «Способ предпосевной обработки для выделения L-форм микобактерий» от 14.12.2011 г.
  4. Патент UA № 39178 «Способ выделения L-форм микобактерий из патологического материала», от 10.02.2009 г., Бюл. № 3, 2009 г.
  5. Тарасова Е.В. Выделение L-форм микобактерий из патологического материала / Е.В. Тарасова // Вестник Сумского национального аграрного университета. Серия «Ветеринарная медицина». – Сумы, 2009. – Вып. 6 (25). – С. 122-125.
  6. Позмогова С.А. Способ предпосевной обработки патологического материала / С.А. Позмогова, В.В. Белушко, Е.В. Тарасова // Научный вестник Луганского национального аграрного университета. – Луганск, 2009. - № 4 – С. - 52-54.
  7. Завгородний А.И. Выделение L-форм микобактерий от кур / А.И. Завгородний, С.А. Позмогова, Е.В. Тарасова // Вет. Медицина: Межвед. темат. сб. – Х.,  2009,  – Вып. 92. – С. 195–197.
  8. Выделение L-форм микобактерий из объектов внешней среды  /  Е.В. Тарасова // Проблемы зооинженерии и ветеринарной медицины: сб. науч. трудов ХГЗВА. – Х., 2009. – Вып. 19, ч. 2, том 1: Ветеринарная наука. – С. 167-171.
  9. Тарасова Е.В. Сенсибилизирующие и патогенные свойства L-форм микобактерий выделенных из биоматериала от КРС и кур / Е.В. Тарасова // Вет. Медицина: Межвед. темат. сб. – Х., 2010,  – Вып. 93. – С. 381–387.
  10. Тарасова Е.В. Коваленко А.М. Изучение сенсибилизирующих и патогенных свойств L-форм микобактерий / Е.В. Тарасова, Коваленко А.М. // Бюллетень научных работ – Белгород, 2012.- Вып. 29 – С. – 76-80.


Подписано к печати 10.04.2012г.

Печ.л.1.0 Тираж 100 экз. Заказ № 13

308503,  п. Майский, Белгородской области

Типография БелГСХА им. В.Я. Горина




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.