WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

БОБОЕВ ГИЁСИДДИН ЮНУСОВИЧ

Тест-система [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук

Душанбе - 2012

Работа выполнена в Научно-производственном предприятии «Биологические препараты» Таджикской Академии сельскохозяйственных наук и на базе РГП Научно- исследовательского института проблем биологической безопасности Республики Казахстан

  Научный руководитель:  доктор ветеринарных наук,

Амирбеков Муллоджон

Амирбекович

Научный консультант:         доктор ветеринарных наук,

профессор, академик

              Сансызбай Абылай Рысбайулы

Официальные оппоненты:         доктор биологических  наук,

                       профессор

  Тишкова Фарида

                       Хаматгалиевна

доктор ветеринарных наук,

      профессор

  Диев Вячеслав Иванович

Ведущая организация Национальный центр ветеринарной

  диагностики

  Служба государственного надзора

  Министерства  сельского хозяйства

  Республики Таджикистан 

Защита состоится  11 мая  2012 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета ДМ 050.001.01 при Институте ветеринарии Таджикской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 734005, Республика Таджикистан, г.Душанбе, ул. А. Каххарова, 43, тел. (992-372) 27-39-95.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ветеринарии ТАСХН.

Автореферат разослан 10 апреля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук З.Д. Ашурова 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Чума мелких жвачных животных – чрезвычайно инфекционное заболевание домашних и диких жвачных животных. Впервые оно было зарегистрировано в Западной Африке (Кот-д’Ивуаре) в 1942 году.

В последние годы болезнь была зарегистрирована на Ближнем Востоке и Аравийском Полуострове, в таких странах, как Исламская Республика Иран, Ирак, Израиль, Иордания, Кувейт, Ливан, Оман, Саудовская Аравия, Объединенные Арабские Эмираты и Йемен, а также есть серологические подтверждения в Сирийской арабской Республике и Турции. Известны вспышки чумы МЖЖ в Индии, Непале, Бангладеш, Пакистане и Афганистане. Распространение ЧМЖЖ на территориях в странах бывшего Советского Союза среди животных изучено недостаточно.

Для диагностики и идентификации вируса ЧМЖЖ на сегодняшний день в мире разработаны и применяются различные серологические и иммунологические методы. Все они имеют различную диагностическую ценность – одни требуют значительных затрат по времени, другие имеют низкую чувствительность и специфичность (133, 134, 135, 136). Поэтому усовершенствование и разработка более чувствительных и специфичных, а также экспрессных методов диагностики остается актуальной проблемой.

Метод ПЦР имеет ряд преимуществ – прямое определение ДНК возбудителя, высокая специфичность, высокая чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, сравнительно небольшие затраты времени на проведение анализа. В зарубежных странах метод ПЦР успешно применяют для диагностики ЧМЖЖ. (56,57, 133, 134). Разработка эффективных, быстрых и надежных методов диагностики ЧМЖЖ является весьма актуальной проблемой для Таджикистана.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлась разработка тест-системы (набора) для диагностики ЧМЖЖ, c использованием компьютерно-моделированных и синтезированных специфических праймеров.

Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:

1. Отработать оптимальные методы очистки и концентрирования вируса ЧМЖЖ из вируссодержащих материалов с целью получения вирусной РНК;

2. Отработать оптимальные методы выделения РНК из очищенного вируса ЧМЖЖ;

3. Сконструировать, отобрать и синтезировать оптимальные специфические праймеры для амплификации участка геномной кДНК вируса ЧМЖЖ;

4. Отработать оптимальные условия проведения ПЦР (временный и температурный режим реакции, концентрация основных компонентов в реакционной смеси) при выявлении кДНК вируса ЧМЖЖ;

5. Изучить специфичность и чувствительность ПЦР системы при выявлении кДНК вируса ЧМЖЖ.

Научная новизна работы. Впервые сконструированы и синтезированы оригинальные праймеры для амплификации фрагмента гена РНК-полимеразы вируса ЧМЖЖ, имеющие нуклеотидный состав:

- PCR_PPRV_f3;

- PCR_PPRV_r3.

Данные праймеры ограничивали участок кДНК вируса ЧМЖЖ размером 274 п.о.

Установлено, что использование подобранных праймеров, позволяет сократить общее время проведения анализа. Показано, что для отжига данных специфических праймеров и наработки ПЦР-продукта размером 274 п.о. достаточно по 60 с.

Разработан и апробирован вариант ПЦР тест-системы для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ.

Практическая значимость работы. Разработана ПЦР тест-система для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ, которая является высокочувствительной, простой в исполнении, позволяет поставить диагноз в короткие сроки, включая ранние стадии инфекции.

По результатам исследований разработана и составлена нормативно-техническая документация, включающая:

- Тест-система [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции, СТ 405-1919-04 ГП-050–2012 (28 февраля 2012г.);

- Временная инструкция по изготовлению и контролю тест-системы [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (28 февраля 2012г.);

- Временное наставление по применению тест-системы [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (28 февраля 2012г.);

-  Тавсияхо оид ба гузаронидани тадбирхои зиддиэпизооти ва пешгирикунанда хангоми тоуни чорвои хурди шохдор (Рекомендации по проведению противоэпизоотических мероприятий при чуме мелких жвачных животных (15 марта 2011г.))..

Таким образом, полученные в диссертационной работе результаты позволяют упростить диагностику ЧМЖЖ и повысить её эффективность, что может сократить экономические потери в животноводстве от данного заболевания.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на: заседаниях Ученого Совета Научно-производственное предприятие «Биологические препараты» (Среднеазиатского ящурного института) Таджикская Академия сельскохозяйственных наук - 2003-2011гг. Основные положения диссертационной работы изложены и обсуждены на научно – теоретических конференциях в гг. Бишкеке Республики Кыргызстан, в  Казани и  Москве Российской Федерации.

Основные положения, выносимые на защиту:

- сконструированные, отобранные и синтезированные специфические праймеры могут быть использованы для амплификации участка геномной кДНК вируса ЧМЖЖ размером 274 п.о.;

- предлагаемый температурно-временной режим, обеспечивающий отжиг праймеров и синтез ПЦР-продукта, позволяет уменьшить время постановки диагноза на ЧМЖЖ;

- создан ПЦР тест-системы для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ, позволяющий упростить и сократить время постановки диагноза, значительно повысить эффективность обнаружения вируса, в том числе на ранних сроках инфекции.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные получены автором самостоятельно. Теоретическое обоснование, проведение экспериментов, анализ и обработка полученных данных проведена при личном участии автора и сотрудников РГП Научно- исследовательского института проблем биологической безопасности Республики Казахстан. Результаты работы опубликованы и апробированы в производственных условиях.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность за неоценимую помощь, оказанную при выполнении данной работы, критическую оценку и ценные советы при оформлении диссертации сотрудникам РГП Научно- исследовательского института проблем биологической безопасности Республики Казахстан, Ж.К. Кошеметову, С. Нурабаеву, НПП «Биологические препараты» ТАСХН Т.К. Висковой, М.И. Косумбекову.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, из них три статьи в изданиях, по перечню ВАК Российской Федерации, в которых изложены основные положения и выводы по изучаемым вопросам.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 странице компьютерного текста (Word) и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. Список используемой литературы включает 138 источников, из которых 114 иностранных. Диссертация иллюстрирована 29 рисунками, 9 таблицами. Приложение на 3 страницах.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работы были проведены на базах НПП «Биологические препараты» ТАСХН и РГП Научно- исследовательского института проблем биологической безопасности Республики Казахстан, производственные опыты проводились на базе республиканской и областных ветеринарных лабораторий и в овцеводческих и козоводческих хозяйствах Республики Таджикистан.

В экспериментах по изучению вируса ЧМЖЖ принимали участие сотрудники лаборатории «Диагностики инфекционных заболеваний» РГП НИИ проблем биологической безопасности МОН Республики Казахстан, которым автор выражает искреннюю признательность за оказанную помощь и сотрудничество.

Материалы для исследования. Вирусы и вируссодержащие материалы. В качестве объекта исследований в работе использовали вакцинные и эпизоотические штаммы следующих возбудителей:

1. Вирус чумы КРС, штамм "К3770".

2. Вирус чумы мелких жвачных, штамм «G – 45».

3. Вирус чумы плотоядных, штамм "ЛД", вакцинный.

4. Вирус болезни Ньюкасла «Ла-Сота».

5. Вирус ЧМЖЖ, штамм "Темурмалик", эпизоотический. Выделен на  территории Республики Таджикистан от больных овец в 2005 г.;

- 20 % суспензия органов (гортань, трахея, легкие, селезенка) от павших животных разных регионов Республики Таджикистан.

Методы исследований. Пробы патологического материала растирали в ступке на стерильном физиологическом растворе и готовили 20%-ную суспензию. Полученные суспензии замораживали при минус 40С и оттаивали при комнатной температуре трехкратно. Суспензию центрифугировали при 3000-4000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочные жидкости использовали для лабораторных исследований. Кровь исследовали в цельном виде после однократного замораживания при температуре минус 40С и оттаивания при комнатной температуре.

Статистическая обработка данных. Все исследования проводили с учетом повторностей, обеспечивающих получение достоверных результатов. Полученные результаты исследования обрабатывали математически. Подсчет среднего арифметического значения (М) и средней квадратической ошибки (m) проводили с помощью компьютерной программы "Microsoft Exel" ("Microsoft", США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Очистка и концентрирование вируса ЧМЖЖ. Прежде чем приступить к разработке метода ПЦР для диагностики вируса ЧМЖЖ необходимо было выполнить предварительные этапы, которые включали наработку вируссодержащего материала, его очистку и концентрирование. Подготовительные этапы очень важны, поскольку для разработки ПЦР необходимо наличие нативных и высокоочищенных полноразмерных препаратов геномной РНК вируса во избежание получения недостоверных результатов. При этом одним из основных этапов при получении нативной РНК генома вируса является получение высокоочищенного вируса с отсутствием каких-либо примесей. Однако универсального способа очистки, пригодного для всех вирусов, не существует, что связанно с индивидуальной морфологией и физико-химическими свойствами вирусов. Выбор методики получения вируса определяется также целью дальнейшего исследования.

Подбор оптимальных условий культивирования вируса ЧМЖЖ. При изучении оптимальных параметров культивирования вируса ЧМЖЖ проводили исследования по накоплению вируса в культуре клеток ПЯ в зависимости от величины инфицирующей дозы и состава поддерживающей среды.

Накопление вируса в культуре клеток ПЯ изучали при дозах инфицирования 0,01 и 0,001 ТЦД50/кл в динамике.

Полученные результаты опытов показывают, что при величине инфицирующей дозы 0,01 ТЦД50/кл репродукция вируса в культуре происходит в более ранние сроки (9-10 сут), а активность вируссодержащих суспензий достигает 6,0 lg ТЦД50/см3.





При изучении зависимости накопления вируса ЧМЖЖ от поддерживающей среды и концентрации сыворотки в питательной среде было установлено, что присутствие сыворотки КРС в поддерживающих средах играет определенную роль.

При использовании поддерживающих сред без сыворотки вирус накапливался в сравнительно невысоких титрах (3,25-3,75 lg ТЦД50/см3). Вируссодержащие материалы с более высокой цитопатической активностью удавалось получать при использовании сред, содержащих 2% и 5% сыворотки.

В дальнейшем для культивирования вируса в ростовую среду вносили 2% прогретой при 56оС в течение 30 минут сыворотки КРС рН 7,5-7,6.

Получение очищенных и концентрированных препаратов вируса ЧМЖЖ из вируссодержащих материалов. С целью получения нативного препарата вируса ЧМЖЖ проводился подбор оптимальной методики очистки вируса. С учетом анализа литературных данных очистку вируса ЧМЖЖ проводили двумя методами в зависимости от контаминации микоплазмами вируссодержащего материала: хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и осаждением полиэтиленгликолем (м.м. 6000).

Метод очистки и концентрирования вируса с помощью полиэтиленгликоля (м.м. 6000) и последующее центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, первоначально в ступенчатом, затем в линейном имел преимущество перед другими схемами очистки по скорости и простоте выполнения, а также позволил получать высокоочищенные препараты вируса. Отработанная схема пригодна только для вируссодержащих материалов, свободных от микоплазменной контаминации.

При необходимости удаления из вируссодержащей жидкости микоплазменной контаминации применяли схему очистки с использованием ионообменной хроматографии на волокнистой ДЕАЕ-целлюлозе. Общая схема очистки вируса ЧМЖЖ включала следующие этапы. На первом этапе вирус подвергали хроматографии на колонках с волокнистой ДЭАЭ–целлюлозой. Колонку нагружали вирусом из расчета 200-300 см3 вируссодержащего материала на 1 г ионообменика. После адсорбции колонку промывали 0,2 М раствором хлористого натрия на 0,05 М ФБР, рН 7,0 – 7,2 до тех пор, пока поглощение УФ–лучей при 280 нм оттекающей жидкости не становилось равным нулю. Вирус элюировали 0,5 М – 1,0 М растворами хлористого натрия на 0,05 М ФБР, рН 7,0 – 7,2. Элюаты концентрировали высокоскоростным центрифугированием через 30% сахарозную «подушку». Дальнейшую очистку проводили центрифугированием в ступенчатом градиенте (20-45-60%) сахарозы.

Таким образом, центрифугирование в градиенте плотности сахарозы являлось одновременно и контролем предшествующих стадий очистки вируса, и ее непременным заключительным этапом.

Электронно-микроскопические исследования подтвердили чистоту и целостность вирусных частиц.

Применение метода для очистки и концентрирования вируса ЧМЖЖ с использованием преципитации полиэтиленгликолем (М.М. 6000) позволяет успешно решать задачу по наработке препаративных количеств очищенного и концентрированного вируса.

Результаты экспериментов показали, что при использовании в качестве элюентов  0,2 М;  0,3 М;  0,4 М;  0,5 М;  0,6 М;  0,7 М;  0,8 М; 0,9 М;  1,0 М; 1,2 М;  1,5 М NaCl выход вируса наблюдается в области 0,7 - 1,0 М NaCl. Повышение концентрации хлористого натрия в элюирующем растворе до 1,5 М не привело к увеличению выхода вируса.

В результате подобранных условий очистки удалось получить лишенные примесей препараты вируса, в которых сохранялась целостность выделяемых вирусных частиц, о чем свидетельствовал электронно-микроскопический контроль препаратов и спектрофотометрический метод анализа. Полученные результаты совпадают с данными других авторов по очистке представителя семейства парамиксовирусов.

При проведении экспериментов получены аналогичные данные по степени очистки вируса ЧМЖЖ, выход вируса составил 60%. Показатели очистки и концентрирования вируса ЧМЖЖ представлены в табл. 1.

Таблица 1

Показатели очистки вируса ЧМЖЖ

Стадии очистки

Объем, см3

Концентрация

белка, мг/см3

(М±m, n=5)

Процент очистки вируса (%)

(М±m, n=5)

Исходный материал

500

78,00±2,99

-

Осветление ВСС

492

72,19±2,22

9,94±1,0

Очистка и концент-рирования через ДЭАЭ-целлюлозы

5

5,26±0,44

99,87±11

При использовании данного метода удалось очистить вирус от основной массы балластных белков и при этом не нарушить структуру вирионов.

Выбранный нами метод имел преимущества перед другими схемами очистки по скорости и простоте выполнения.

Подбор оптимальных методов выделения РНК вируса. Для выделения РНК вируса ЧМЖЖ использовали методики, применяемые для РНК содержащих вирусов.

При отработке оптимальных условий выделения нативных РНК в опытах использовали очищенные препараты исследуемого вируса. Выделение РНК проводили модифицированными методами с использованием протеиназы К и гуанидинизотиоцианата (ГИТЦ) с последующей фенольной депротеинизацией.

В нашем опыте для выделения РНК вируса ЧМЖЖ более приемлемым оказался метод с использованием ДСН и протеиназы К.

Проверку целостности РНК проводили электрофорезом в агарозном геле. Электрофорез проводили в 0,8% агарозном геле, при напряжении 5 В/см в течение 2 ч, визуализацию полосы РНК осуществляли с помощью бромистого этидия. Электрофоретический анализ РНК вируса ЧМЖЖ представлен на рис.1.

1 2

Рисунок 1 Электрофоретический профиль РНК вируса чумы МЖЖ

1 – РНК, выделенная 1 методом, 2 – РНК, выделенная 2 методом.

Спектрофотометрические характеристики переосажденных препаратов РНК имели отношение Е260/Е280=2. Выход очищенной РНК составил 15-25%. Электрофоретический анализ полученных препаратов РНК показал наличие одной гомогенной полосы.

Таким образом, результаты качественного и количественного анализа показали, что  наилучшим является метод с использованием ДСН и протеиназы К. Оптимальная схема выделения РНК вируса ЧМЖЖ при использовании данного метода представлена ниже:

- Очищенный и концентрированный препарат вируса чумы МЖЖ инкубировали с протеиназой К (к/к 0,2мкг/см3 и 1-1,5 % ДСН) при 370С в течение 20-30ч;

- Депротеинизация фенол/хлороформом 2 раза, 1 раз хлороформом. Разделение фаз при центрифугировании  2500 g , 20 мин;

- Осаждение РНК спиртом, в присутствии ацетата натрия.

Выход геномной РНК при данном методе составлял 60-80%. В экспериментах количество полученной РНК варьировало в зависимости от титра инфекционности  вируссодержащего материала.

Разработка метода ПЦР для идентификации вируса ЧМЖЖ. Эффективность метода ПЦР и его специфичность зависит от многих параметров, включающих буферный состав реакционной смеси, температурно-временной режим и специфичность подобранных праймеров. Однако, наиболее критическим этапом при разработке метода ПЦР, оказывающим в особенности на его специфичность, является правильный подбор праймеров, его локализация на исследуемой ДНК или РНК.

Подбор праймеров. Конструирование праймеров с соблюдением необходимых параметров проводится с помощью различных компьютерных программ, основными из которых являются Pirmer 3, Oligo 6, OligoSoftware и другие. В результате проведенных работ было сгенерировано различное количество пар праймеров на проанализированные участки вируса ЧМЖЖ.

При разработке метода ПЦР для идентификации вируса ЧМЖЖ на начальном этапе исследований был проведен анализ всех имеющихся нуклеотидных последовательностей генома ЧМЖЖ в международном банке генов. Определены консервативные участки, присущие только для представителей данного рода и на данные участки были сконструированы специфические праймеры, позволяющие нарабатывать ПЦР-продукты. В данном случае также проводили предварительный отбор пула праймеров по основным критериям, предъявляемым для ПЦР праймеров. В первую очередь длина олигонуклеотида не должна была превышать 22 нуклеотида, имела допустимое процентное соотношение GC-оснований – 40-70%, температуру плавления и прогнозируемый размер ПЦР продукта, находящийся в пределах 150-400 п.н. на предварительном этапе работы нами были подобраны 16 пар  праймеров.

Из всего пула конструированных праймеров на первом этапе для дальнейших исследований отобраны пять пар праймеров для разработки ПЦР. Параметры праймеров представлены в табл. 2.

Таблица 2

Краткие характеристики праймеров для постановки ПЦР при идентификации

вируса ЧМЖЖ

Название праймера

Последовательность (5'-3')

поз.на геноме

Tm, 0С

Ta,0С

GC,%

ПЦР продукт

1

PCR_PPRV_f1

GGA CAC CCA ACC ACC GAA  ACA ()

4974

75.8

61.4

57.1

200

PCR_PPRV_r1

TTC CCT GCC GTT TGG TC ()

5157

69.2

58.8

2

PCR_PPRV_f2

ATC CAG AGT CGG CTG AAT ACC()

7533

68,9

53,3

52,4

343

PCR_PPRV_r3

GCC CAA GAG TCA ATG ATT GC()

7856

69,1

50,0

3

TGC CGT CTA CCG ATG TT

8425

64,5

54,6

52,9

230

AAG ATC CAT GCC AGA TAG GTG

8634

67,4

47,6

4

CGT TGC CAT GTT CCC ATA GAA

8802

71,0

54,3

47,6

325

CGG TCA GCC CTC TCG TAT

9109

67,3

61,1

5

PCR_PPRV_f3

CAA AGA AAG GGC AGT GTT ATC ()

12643

64,9

55,3

42,9

274

PCR_PPRV_r3

ACA CGA AGA GCC GAA GTC ()

12899

64,9

55,6

Сконструированные праймеры затем синтезировали на синтезаторе олигонуклеотидов Expedite 8909, согласно инструкции прилагаемой к прибору. Очистку праймеров проводили методом спиртового переосаждения, конечную концентрацию праймера доводили до 20 пг.

Проведенные эксперименты по выбору пары праймеров показали, что оптимальными оказались праймеры PCR_PPRV_f3 и PCR_PPRV_r3, позволяющие нарабатывать ПЦР продукт размером 274 п.н. гена полимеразы, представленные на рисунке 2.

Рисунок 2. Локализация специфических праймеров PCRPPRVf3 и PCRPPRVr3 на геноме вируса ЧМЖЖ

Подбор и отработка температурно-временного режима. Подбор и отработка температурно-временного режима амплификации является очень важным и сложным моментом при разработке метода ПЦР.

Температурный профиль амплифицируемого цикла соответствует трем последовательным стадиям ПЦР (денатурации матрицы при нагревании, отжигу праймеров с одноцепочечной матрицей и синтезу второй цепи с помощью термостабильной ДНК-полимеразы). Для каждой стадии подбирается своя определенная температура и время. В общем случае температура этапа денатурации обычно выбирается между 90-95оС, отжига между 40-60оС, а достройки между 70-75оС.

На первом этапе исследований проводили синтез кДНК на РНК вируса ЧМЖЖ. Для наработки кДНК использовали специфический праймер, обратную транскриптазу и свободные нуклеотиды.

Синтез кДНК проводили в реакционной смеси, состоящей из:

Вода                       –  до 50 мкл

5х буфер для ОТ       – 10 мкл

MgCl2               – 2,0 мкл

дНТФ (10 мМ) – 1,0 мкл

праймер                 – 5,0 мкл

обратная транскриптаза MuLVRT – 0,6 мкл

РНК вируса        ЧМЖЖ  – 4 мкл

Для синтеза кДНК пробирку помещали в термостат с температурой 37оС и инкубировали в течение 50 минут. По истечении времени пробы синтезированной кДНК использовали непосредственно в реакции ПЦР или помещали в холодильник на минус 20оС до использования.

Амплификацию специфического ПЦР продукта проводили в реакционной смеси, состоящей из:

10х ПЦР буфер                 - 2,0 мкл

дНТФ                                - 0,5 мкл

праймер PCR_PPRV_f3        - 1,0 мкл

праймер PCR_PPRV_r3        - 1,0 мкл

Taq ДНК полимераза         - 0,5 мкл

кДНК        вируса ЧМЖЖ        - 1 мкл

вода до - 20 мкл

Двуспиральная кДНК-матрица денатурируется при температуре, зависящей от содержания в ней GC оснований. Чем выше их содержание, тем выше требуется температура для полного расхождения цепей в молекуле кДНК. Также, более длинные матрицы кДНК требуют большей температуры для полной денатурации. Если температура денатурации будет слишком низкой, или время слишком коротким, будут денатурировать только регионы богатые АТ-основаниями. Однако слишком продолжительное время денатурации или слишком высокая температура приводят к нежелательной потере ферментативной активности полимеразы.

В наших экспериментах при подборе температурного режима для денатурации использовали стандартные условия – 95оС, так как содержание  G+C пар генома ЧМЖЖ не превосходит 45 %. Выбор такого режима гарантирует денатурацию матричной кДНК на первом шаге. С целью полного расхождения цепей кДНК проводили преденатурацию при температуре 95оС в течение 2 минут.

Критичным для специфичности амплификации является, в основном, только выбор температуры отжига праймеров, при которой они взаимодействуют с комплементарными участками кДНК-матрицы. Несмотря на то, что праймеры присутствуют с самого начала, они не образуют связей при 90-95оС. При температуре в пределах 50-60оС праймеры способны гибридизоваться с комплементарными последовательностями на матричных нитях.  Очень важно правильно подобрать температуру отжига праймеров. Считается, что температура отжига зависит от длины праймера и содержания в нем GC-пар. На сегодняшний день существует много компьютерных программ, которые определяют температуру посадки праймеров. Однако для каждой пары праймеров существует своя температура отжига и лучше всего оптимальную температуру подбирать эмпирически. В наших экспериментах оптимальную температуру отжига определяли на термоциклире TC-512, Techne, используя градиент температур (55±25)оС. Полученные пробы анализировали в 2 % агарозном геле, приготовленном на ТВЕ буфере. Полученные результаты представлены на рис. 3.

  М 1 2 3  4 5  6 7  8 9 10 11  12

13  14  15

Рисунок 3. Электрофореграмма амплифицированной кДНК вируса ЧМЖЖ при различных температурах отжига праймеров

Примечание: М – маркер "50 bpDNALadder." Фирмы BioLabs, 1-отрицательный контроль, 2-45,4оС, 3-46,6оС, 4-47,6оС, 5-49,3оС, 6-51,2оС, 7-52,5оС, 8-54,2оС, 9-55,0оС, 10-58,2оС, 11-59,3оС, 12-61,6оС,13- 63,3оС, 14-65,3оС, 15-67,5оС.

Из рисунка 3 видно, что при температуре 45,4оС не происходит посадки праймеров. С увеличением температуры отжига начинает повышаться специфичность и выход ПЦР-продукта. При температурах от 52,5  до 59,3оС ПЦР-продукт нарабатывается в достаточных количествах, отсутствуют шлейфы. При температуре 61,6оС количество продукта начинает резко снижаться, по-видимому, она начинает превышать критическую температуру для данной пары праймеров. В дальнейших наших экспериментах при проведении ПЦР для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ использовали 55оС.

При проведении ПЦР важное значение имеет фермент – полимераза, которая работает с комплексом элонгации (праймер и матрица ДНК). На данный момент известно, что существует три класса полимераз. Фермент выбирается в зависимости от размера специфического продукта. В наших исследованиях длина ПЦР-продукта составляет порядка 274 п.о. Рекомендуемой полимеразой при синтезе до 1000 п.о. является Taq-полимераза. Фермент оптимально работает при 72оС. Выбор такой температуры обеспечивает максимальную активность Taq-полимеразы на третьем шаге цикла амплификации.

Как известно, время синтеза определяется скоростью работы Taq-полимеразы и длиной амплифицируемого фрагмента. Как правило, при расчётах принимают во внимание, что для синтеза продукта размером 1000 п.о. необходима одна минута достраивать вновь синтезированные комплементарные цепи кДНК. Введение же в конце дополнительного времени синтеза (10 мин) при 72оС обеспечивает завершение синтеза всего неполного имеющегося амплификата. В проводимых исследованиях было изучено влияние продолжительности синтеза на наработку специфического продукта. Сокращение времени необходимого для синтеза, позволяет сократить время постановки диагноза. Поэтому, при отработке параметров метода ПЦР большое значение было уделено определению оптимального времени синтеза для амплификации продукта размером 274 п.о. Первоначально синтез проводили в течение 1 минуты, далее уменьшали время на каждые 10 секунд. Результаты исследований представлены на рис. 4.

Рисунок 4. Электрофореграмма амплифицированной кДНК вируса ЧМЖЖ

при различной продолжительности синтеза.

Примечание: М – маркер ДНК  "50 bpDNALadder." BioLabs ", 1 – отрицательный контроль, 2 – 5 с синтез, 3 – 10 с, 4 – 15 с, 5 - 20 с, 6 – 30 с, 7 – 40 с, 8 – 50 с, 9 – 60 с, 10 -70с.

Из рисунка 4 видно, что при использовании в качестве времени синтеза 5 и 10 секунд отсутствуют какие-либо ПЦР-продукты. В течение 15 секунд нарабатывается ПЦР-продукт, но c очень низкой специфичностью. Достаточное количество ПЦР-продукта размером 274 п.о. нарабатывается в пробах, для которых используют время синтеза от 20 до 60 секунд. Таким образом, за 30 секунд полимераза полностью достраивает вновь синтезированные комплементарные цепи кДНК. В наших дальнейших экспериментах для синтеза ПЦР-продукта использовали 30 секунд.

На основании выбранных в процессе экспериментов оптимальных параметров времени и температур для всех стадий амплификации, был составлен следующий режим для проведения ПЦР:

95оС – 2 минуты  - денатурация кДНК

94оС – 30 сек

55оС – 30 сек  40 циклов

72оС – 60 сек

72оС – 10 минут

После того как были определены временные и температурные условия амплификации, проводили оптимизацию содержания компонентов в реакционной смеси и отработку ПЦР.

Подбор оптимальных условий проведения ПЦР. Специфичность и чувствительность ПЦР находятся в большой зависимости от таких параметров, входящих в состав буфера, как концентрация MgCl2 и KCl, рН буфера. Изменения в буфере для ПЦР вызывают качественное или количественное изменение выхода амплификата.

MgCl2 необходим для поддержания активности Taq-полимеразы. Концентрация MgCl2 также влияет на отжиг праймеров и денатурацию образца. Однако избыток может вызывать неспецифичность продукта. KСl и Трис-HCl обеспечивают необходимую ионную силу и рН смеси. Хлорид калия является активатором ПЦР и его добавляют для улучшения отжига праймеров. Предельной концентрацией KСl является 50 мМ, так как последующее увеличение может привести к ингибированию полимеразы.

Варьирование концентраций MgCl2 , KСl и рН буфера может приводить к уменьшению выхода неспецифического продукта и увеличению выхода амплификата. Обычно оптимальные концентрации перечисленных выше соединений подбираются эмпирическим путем в процессе оптимизации условий реакции. Однако существующие на сегодняшний день наборы для оптимизации ПЦР значительно упрощают эту задачу.

Для подбора оптимальных условий проведения ПЦР был использован набор для оптимизации ПЦР – "PCROptimizationKitII" фирмы "Sigma".

В ходе работы были апробированы 10 буферных систем, которые различались концентрацией хлористого магния и калия, а также величиной рН. Состав буферных систем приведен в табл. 3.

Таблица 3

Состав буферных систем, используемые при оптимизации ПЦР

№ буфера

Состав ПЦР буфера, х10

1

100 мМ Трис HCl, pH 8,3, 15 мМMgCl2, 250 мМKCl

2

100 мМ Трис HCl, pH 8,3, 15 мМMgCl2, 750 мМKCl

3

100 мМ Трис HCl, pH 8,3, 35 мМMgCl2, 250 мМKCl

4

100 мМ Трис HCl, pH 8,3, 35 мМMgCl2, 750 мМKCl

5

100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 15 мМMgCl2, 250 мМKCl

6

100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 15 мМMgCl2, 750 мМKCl

7

100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 35 мМMgCl2, 250 мМKCl

8

100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 35 мМMgCl2, 750 мМKCl

9

100 мМ Трис HCl, pH 9,2, 15 мМMgCl2, 250 мМKCl

10

100 мМ Трис HCl, pH 9,2, 15 мМMgCl2, 750 мМKCl

Амплификацию специфического ПЦР продукта проводят в реакционной смеси состоящей из:

10х ПЦР буфер                 - 2,0 мкл

дНТФ                                - 0,5 мкл

праймер PCR_PPRV_f3        - 1,0 мкл

праймер PCR_PPRV_r3        - 1,0 мкл

Taq ДНК полимераза         - 0,5 мкл

кДНК        вируса ЧМЖЖ        - 1 мкл        

вода до 20 мкл

Амплификацию специфического участка проводили на термоциклере "GeneAmpPCR 9700", фирмы "AppliedBiosystems" при следующих режимах:

95 0С – 2 минуты - денатурация кДНК

94 0С – 30 сек

55 0С – 30 сек  40 циклов

72 0С – 60 сек

72 0С – 10 минут

По завершению наработки кДНК, полученные пробы детектировали электрофорезом в 2% агарозном геле, приготовленном на ТБЕ буфере в присутствии бромистого этидия. Полученные результаты представлены на рис. 5.

Рисунок 5. Электрофореграмма амплифицированной кДНК вируса ЧМЖЖ в различных буферных системах и режимах.

Примечание: М – маркер ДНК "AmplisizeMolecularRuler 50-2000 bp", 1-10 – буферные системы.

Из полученных результатов видно, что при использовании буферных систем № 6, 7 и 10 не происходит амплификации фрагмента. При использовании остальных буферных систем (№ 1, 2, 3, 4, 5, 8 и 9) нарабатывается ПЦР-продукт размером 274 п.о., представленный на рисунке  яркими и четкими полосами. Существенных различий при использовании буферных систем (№1, 2, 3, 4, 5, 8 и 9)  не наблюдается. По-видимому, в буферных системах (№ 6, 7 и 10) сочетание более высокой рН и использование данных концентраций MgCl2 и KCl приводит к ингибированию реакции.

При проведении ПЦР как было упомянуто основная роль, отведена ферменту Taq-полимеразе. Концентрация фермента в реакции подбирается в зависимости от индивидуальной мишени (кДНК) или праймеров. Если концентрация фермента слишком высокая, то могут образовываться неспецифические продукты, а если слишком низкая, то образуется недостаточное количество амплификата. При подборе оптимальной концентрации брали активности фермента в реакционной смеси от 0,5 ед до 3,0 ед/50 мкл, и проверяли результаты амплификации гель-электрофорезом в 2 % агарозе, которые представлены на рис. 6.

  М 1 2 3 4  5  6

Рисунок 6. Оптимизация концентрации Taq ДНК-полимеразы  в реакционной смеси при обнаружении кДНК вируса ЧМЖЖ (штамм "Темурмалик") методом ПЦР.

Примечание: 1 – 0,5 ед; 2 – 1,0 ед; 3 – 1,5 ед; 4 – 2,0 ед; 5 – 2,5 ед; 6 – 3,0 ед; M –маркер  "DirectLoadTMWideRangeMarker, 10.000 п.о. - 50 п.о."

Как видно из рисунка 6 концентрация Taq ДНК-полимеразы влияет на выход конечного продукта; заметно, что с повышением концентрации фермента в реакционной смеси происходит увеличение интенсивности полос, а, следовательно, и концентрации ДНК. Однако при активности фермента всего 0,5 ед. нарабатывается ПЦР-продукт, который достаточно легко визуализировать в 2 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия под УФ-светом. Нужно отметить, что в разрабатываемой тест-системе полимераза является  самым дорогим компонентом. Поэтому в наших экспериментах мы выбрали экономичный расход фермента – 0,5 ед.

Ионы Mg2+ являются необходимым кофактором для ДНК-полимеразы в ПЦР. Многие компоненты реакционной смеси связывают эти ионы, в том числе ДНК-матрица, праймеры, ампликоны и дНТФ. Как известно, избыток концентрации ионов магния может приводить к появлению неспецифичности продукта реакции. Поэтому, чтобы определить и создать оптимальный избыток несвязанного иона проводили оптимизацию для выбранных концентраций ДНК-матрицы, праймера, дНТФ и ДНК-полимеразы путем изменения концентрации ионов в интервале 1-5 мМ. В наших экспериментах мы изучили  влияние концентрации хлорида магния, начиная с 1 мМ постепенно повышая концентрацию до предельного значения 2,5 мМ. Результаты представлены на рис. 7.

М 1  2  3 4 5 6

Рисунок 7. Оптимизация концентрации MgCl2 в реакционной смеси при обнаружении кДНК вируса ЧМЖЖ (штамм "Темурмалик") методом ПЦР.

Примечание: 1 – 1 мМ; 2 – 1, 5 мМ; 3 – 1,75 мМ; 4 – 2 мМ; 5 – 2,5 мМ; 6 – отрицательный контроль. M- маркер ДНК "AmplisizeMolecularRuler 50-2000 bp"

Как видно из рисунка 7, изменение концентрации соли в пределах 1-2,5 мМ существенно не влияло на процесс амплификации. Выход специфического ПЦР-продукта был приблизительно одинаков. Нужно заметить, что и при максимальной концентрации MgCl2 (2,5 мМ) нарабатывалось достаточно большое количество специфического продукта. На основании полученных экспериментальных данных в дальнейших экспериментах при проведении ПЦР, для приготовления реакционных смесей использовали концентрацию соли 1,5 мМ.

Определение специфичности и чувствительности ПЦР при идентификации ЧМЖЖ. На первом этапе исследований проводили синтез кДНК на РНК вируса ЧМЖЖ. Для наработки кДНК использовали специфический праймер, обратную транскриптазу и свободные нуклеотиды.

Синтез кДНК проводили в реакционной смеси состоящей из:

Вода                        – до 50 мкл

5х буфер для ОТ        – 10 мкл

MgCl2        – 2,0 мкл

дНТФ (10 мМ)         – 1,0 мкл

праймер                – 5,0 мкл

обратная транскриптаза MuLVRT – 0,6 мкл

РНК вируса        ЧМЖЖ– 4 мкл

Для синтеза кДНК пробирку помещали в термостат с температурой 37оС и инкубировали в течение 50 минут. По истечении времени пробы синтезированной кДНК использовали непосредственно в реакции ПЦР или помещали в холодильник на минус 20оС до использования.

Амплификацию специфического ПЦР продукта проводили в реакционной смеси, состоящей из:

10х ПЦР буфер                - 2,0 мкл

дНТФ                                - 0,5 мкл

праймер PCR_PPRV_f3        - 1,0 мкл

праймер PCR_PPRV_r3        - 1,0 мкл

Taq ДНК полимераза         - 0,5 мкл

кДНК        вируса ЧМЖЖ        - 1 мкл        

вода до  -20 мкл

Амплификацию ПЦР-продуктов проводили в следующих температурно-временных режимах:

95оС – 2 минуты - денатурация кДНК

94оС – 30 сек

55оС – 30 сек  40 циклов

72оС – 60 сек

72оС – 10 минут

Дальнейшие исследования проводили по определению специфичности отработанного метода ПЦР при идентификации вируса ЧМЖЖ. В качестве исследуемых проб использовали РНК вирусов ЧМЖЖ, ЧКРС, ЧП и БН. Полученные результаты исследований представлены на рис. 8.

  1 2 3 4 M

Рисунок 8. Определение специфичности ПЦР при идентификации вируса ЧМЖЖ.

Примечание: М – маркер ДНК, 1 – кДНК ЧМЖЖ штамм "Темурмалик",  2 – кДНК вируса чумы плотоядных, 3 – кДНК вируса ЧКРС  штамм "К37-70", 4 – кДНК вируса болезни Ньюкасла штамм "Ла-Сота"

Как видно из представленных данных при использовании пар праймеровPCR_PPRV_f1 и PCR_PPRV_r1 и подобранных условий постановки ПЦР образовался ПЦР-продукт размером 274 п.н. только в пробе с вирусом ЧМЖЖ, в остальных пробах кДНК обнаружено не было.

Дальнейшие исследования проводили по определению чувствительности разработанного метода ПЦР при идентификации вируса ЧМЖЖ. Чувствительность метода определяли десятикратными разведениями кДНК. Полученные результаты представлены на рис. 9.

1 2  3  4 5  6 7  8 9  М

Рисунок 9. Определение чувствительности ПЦР при идентификации вируса ЧМЖЖ

Примечание: 1 – 100 нг; 2 – 10 нг; 3 – 1 нг; 4 – 0,1 нг; 5 – 10 пг; 6 – 1 пг; 7 – 0,1 пг; 8 – 10 фг; 9 – 1 фг. М – маркер ДНК “BioLabs 50 bpDNALadder, "50 – 1350 bp".

Как видно из данных рисунка 9 чувствительность разработанного метода ПЦР при выявлении кДНК вируса ЧМЖЖ составляет 0,1 пг.

Таким образом, в результате исследований по определению параметров постановки ОТ-ПЦР для идентификации вируса ЧКРС оптимальными оказались использование специфических праймеров PCR_PPRV_f1 и PCR_PPRV_r1, позволяющие нарабатывать ПЦР продукт размером 274 п.н., характерный только для вирусов ЧМЖЖ.

Была также показана высокая специфичность разработанного метода, при котором только в положительных пробах нарабатывались специфические ПЦР продукты размером 274 п.н. Полученные результаты представлены на рис. 10.

  М 1  2 3 4  5 6 7  8 9

Рисунок 10. Электрофоретический профиль разделения ПЦР продуктов при апробации тест-системы по выявлению кДНК вируса ЧМЖЖ  из патологических материалов методом ПЦР.

Примечание - М – маркер ДНК "AmplisizeMolecularRuler 50-2000 bp", 1 – кДНК вируса чумы МЖЖ, штамм "Темурмалик" (положительный контроль) , 2-8 - 20 % суспензия органов от павших животных от ЧМЖЖ из Хатлонской области, 9 – отрицательный контроль.

Из рисунка 10 видно, что на дорожках 2 - 8 образуются полосы, лежащие на одном уровне с положительным контролем. Данный факт позволяет заключить, что во всех исследуемых пробах методом ПЦР с последующей детекцией электрофорезом выявлена кДНК вируса ЧМЖЖ.

Таким образом, результаты испытаний показывают, что разработанная ПЦР тест-система позволяет выявлять кДНК вируса ЧМЖЖ из патологических материалов.

Тест-система для диагностики ЧМЖЖ на основе ПЦР. Тест-система для диагностики ЧМЖЖ, состоит из двух комплектов. Комплект А предназначен для выделения РНК из вируссодержащего материала, который включает раствор 1, раствор 2 и раствор 3 и РНК-элюент. Комплект Б предназначен для проведения реакции обратной транскрипции и постановки ПЦР, состоящий из: обратной транскриптазы, смеси праймера и нуклеотидов для синтеза кДНК, буфера для обратной транскрипции, ПЦР-буфера, смеси специфических праймеров и нуклеотидов для ПЦР, ДНК полимеразы, положительного контроля и воды.

В результате подбора компонентного состава набора, состоящего из двух комплектов, для выделения РНК и постановки ПЦР при обнаружении РНК вируса ЧМЖЖ был определен оптимальный его состав, представленный в таблицах 4 и 5.

Таблица 4

Комплект для выделения РНК вируса ЧМЖЖ

Наименование компонентов в наборе

Объем компонента (мл)

Тип упаковки

Кол-во пробирок (шт.)

Раствор 1

5,0

пластиковый флакон объемом 10 мл

1

Раствор 2

25,0

пластиковый  флакон объемом 50 мл

1

Раствор 3

25,0

пластиковый  флакон объемом 50 мл

1

РНК-элюент

0,5

пластиковая пробирка объемом 1,5 мл

10

Таблица 5

Комплект для обратной транскрипции и постановки ПЦР при ЧМЖЖ

Наименование компонентов в наборе

Объем компонента (мкл)

Тип упаковки

Кол-во пробирок (шт.)

Буфер для обратной транскрипции

1000,0

пластиковая пробирка объемом 1,5 мл

1

Обратная транскриптаза

50,0

пластиковая пробирка объемом 1,5 мл

1

Смесь праймера и дНТФ для кДНК

250,0

пластиковая пробирка объемом 1,5 мл

1

ДНК полимераза

50,0

пластиковая пробирка объемом 1,5 мл

1

ПЦР-буфер

500,0

пластиковая пробирка объемом 1,5 мл

1

Смесь праймеров и дНТФ для ПЦР

300,0

пластиковая пробирка объемом 1,5 мл

1

Положительный контроль  кДНК вируса ЧМЖЖ

100,0

пластиковая пробирка объемом 1,5 мл

1

Вода

1000,0

пластиковая пробирка объемом 1,5 мл

2

Испытание тест-системы при выявлении кДНК вируса ЧМЖЖ на основе ПЦР проводили в лабораторных условиях на базе НПП «Биологические препараты» ТАСХН.

Применение данной тест-системы подразумевает проведение трех этапов: выделение РНК, обратная транскрипция для синтеза кДНК и постановка ПЦР, при которой амплифицируется специфический фрагмент к-ДНК вируса ЧМЖЖ, размером 274 п.н. ПЦР продукт детектируется с помощью электрофореза в агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Компоненты для проведения электрофореза ПЦР продуктов в агарозном геле в данную тест-систему не входят и приобретаются отдельно.

Таким образом, использование тест-системы для диагностики ЧМЖЖ позволяет проводить анализ исследуемых проб на наличие или отсутствие вируса ЧМЖЖ. Реакция считается положительной, если в исследуемой пробе наблюдается ПЦР продукт размером 274 п.н. Отсутствие полос ДНК или наличие полосы ДНК другого размера говорит об отрицательном результате. Тест-система предназначена для проведения 50 ПЦР-анализов.

Выводы

1. Подобраны оптимальные условия очистки и концентрирования вируса ЧМЖЖ штамма «Темурмалик», позволяющие получать вирус, пригодный для выделения РНК. Очистка и концентрирование через ДЭАЭ-целлюлозы позволил сконцентрировать вирус ЧМЖЖ в 100 раз с концентрацией вирусных  белков (5,26±0,44) мг/см3.

2. Подобраны оптимальные условия выделения нативных препаратов геномной РНК из очищенного и концентрированного вируса ЧМЖЖ штамма «Темурмалик», позволяющие получать высокоочищенную и нефрагментированную нуклеиновую кислоту. Обработка вируса протеиназой К в присутствии додецилсульфата натрия и инкубирование при 56оС в течение часа с последующей экстракцией фенол/хлороформом позволяет получать образцы вирусной РНК с выходом 15-25%.

3. Впервые сконструированы и синтезированы специфические праймеры на ген тимидинкиназы для амплификации участка геномной кДНК вируса ЧМЖЖ, имеющие нуклеотидный состав:

- PCR_PPRV_f1;

- PCR_PPRV_r1.

4. Установлено, что для отжига сконструированных праймеров и синтеза ПЦР-продукта требуется 30; 30 и 60 секунд для каждой стадии. Определен оптимальный состав реакционный смеси при проведении ПЦР по обнаружению кДНК вируса ЧМЖЖ.

5. Предлагаемая ПЦР тест-система позволяет выявлять кДНК вируса ЧМЖЖ в пробах органов взятых от больных и павших животных, при отсутствии у них клинической картины.

Практические предложения

Разработана и оформлена научно-техническая документация:

- Тест-система [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции, СТ 405-1919-04 ГП-050–2012 (28 февраля 2012г.);

- Временная инструкция по изготовлению и контролю тест-системы [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (28 февраля 2012г.);

- Временное наставление по применению тест-системы [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (28 февраля 2012г.) ;

-  Тавсияхо оид ба гузаронидани тадбирхои зиддиэпизооти ва пешгирикунанда хангоми тоуни чорвои хурди шохдор (Рекомендации по проведению противоэпизоотических мероприятий при чуме мелких жвачных животных (15 марта 2011г.)).

Лабораторный вариант ПЦР тест-системы для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ рекомендуется к использованию в ветеринарных лабораториях и животноводческих хозяйствах Республики Таджикистан. Данная тест-система адаптирована к вирусам, циркулирующим на территории Таджикистана.

Результаты данных исследований можно использовать при серийном  выпуске тест-систем для диагностики ЧМЖЖ на основе ПЦР.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Аноятбеков М. Серомониторинг чумы мелких жвачных животных Таджикистана /Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю. и др. // ж. Ветеринария: изд-во. «Эчод».- Душанбе.- 2005.- № 3.- С. 30.
  2. Джумаев Ш.Н. Эпизоотическая ситуация по трансграничным болезням животных в Таджикистане /Бобоев Г.Ю., Косумбеков М.И. и др. // ж. Ветеринария: изд-во. «Эчод».- Душанбе.- 2005. № 4.- С. 15-18.
  3. Бобоев Г.Ю. Серологический мониторинг чумы мелких жвачных животных /, Джумаев Ш.Н. и др. // Актуальные проблемы, перспективы развития сельского хозяйства: Сб.н.тр.. Том III. - Душанбе: изд-во. «Дониш» - 2006.- С. 195-197.
  4. Амирбеков М. О чуме овец и коз в Таджикистане / Мурватуллоев С.А, Аноятбеков М., Бобоев Г., Джумаев Ш. и др. // Вестник Кыргызского научно-исследовательского института животноводства, ветеринарии и пастбищ имени А. Дуйшева.- Бишкек.-2007.- С.171-174.
  5. Аноятбеков М.А. Приготовление и контроль иммунопероксидазных конъюгатов для иммуноферментного анализа при чуме мелких жвачных животных /Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю. и др. // Доклады Таджикской академии сельскохозяйственных наук.- Душанбе.-2007. № 3.- С. 48-53.
  6. Аноятбеков М.А. Изучение культуральных свойств вируса чумы мелких жвачных животных, выделенного в Республике Таджикистан /Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю. и др. // Материалы международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел», посвященной 110-летнему юбилею Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко.-М.: ВИЭВ.-2008.- С. 41-45.
  7. Бобоев Г.Ю. Распространение и особенности проявления чумы мелких жвачных животных в Таджикистане /Джумаев Ш.Н., Вискова Т.К. и др.//Материалы международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел», посвященной 110-летнему юбилею Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко.-М.: ВИЭВ.-2008.- С. 55-60.
  8. Кошеметов Ж.К. Изучение антигенных свойств вируса чумы мелких жвачных животных в лабораторных тест-системах /Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю. и др. // ж. Ветеринария: изд-во. «Эчод».- Душанбе.- 2008.- № 4.- С. 26-31.
  9. Кошеметов Ж.К. Изучение культурального свойства штамма «Кентау-7» вируса чумы мелких жвачных животных /Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю. и др. // ж. Ветеринария: изд-во. «Эчод».- Душанбе.- 2009.-№ 2.- С. 31-35.
  10. Бобоев Г.Ю., Эпизоотическая  ситуация по чуме мелкого рогатого скота в Республике Таджикистан /Джумаев Ш.Н., Аноятбеков М.А. и др. Ветеринарная медицина домашних животных: сборник науч. статей.- Выпуск 7.-Казань:- КВА.-2010.- С. 83-85.
  11. Джумаев Ш.Н. Оптимальные условия проведения иммуноферментного анализа для выявления антител против чумы мелких жвачных животных /Бобоев Г.Ю., Аноятбеков М.А. и др. // Ветеринарная медицина - 2011.- № 1- С. 72-74.
  12. Строчков В.М. Разработка полимеразной цепной реакции для диагностики чумы мелких жвачных животных / Кошеметов Ж.К., Бобоев Г.Ю., и др.// Теоретический и научно-практический журнал «Кишоварз» (Земледелец) ТАУ им. Ш.Шотемур №1(53) 2012г.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.