WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

ТАДЖИКСКИЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Ш. ШОТЕМУРА

На правах рукописи

САТТОРОВ НОСИРЧОН РАСУЛОВИЧ

ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОБИОТИКОВ

НА ОСНОВЕ BACILLUS SUBTILIS

И ИХ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ

ПРИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЭНТЕРИТАХ ТЕЛЯТ

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Диссертация

на соискание ученой степени

доктора ветеринарных наук

Научный консультант:

доктор ветеринарных наук,

академик И. Саттори

Душанбе – 2012

Работа выполнена в лаборатории микробиотехнологии Таджикского аграрного университета им. Ш. Шотемура и на кафедре ветеринарной санитарной экспертизы, микробиологии и зоогигиены Сумского национального аграрного университета (Республика Украина).

Научный консультант:

доктор ветеринарных наук, академик

И. Саттори

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук Салимов Т.М.;

член-корреспондент Россельхозакадемии, доктор биологических наук, профессор

Девришов Д.А.;

доктор медицинских наук, профессор

Ходжаева Н.М.

Ведущая организация: НПО «Биологические препараты».

Защита диссертации состоится 29 декабря 2012 г. в 10 ч на заседании диссертационного совета ДМ 050.001.01 при Институте ветеринарии Таджикской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 734005, г. Душанбе, ул. Каххорова, 43, тел. (992-372) 27-39-95.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ветеринарии Таджикской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 734005, г. Душанбе, ул. Каххорова, или на официальных сайтах ВИ ТАСХН www.tajnivi.tj и ВАКа России www.vak2.ed.gov.ru

Автореферат разослан 28 сентября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор ветеринарных наук,

профессор

Ярбаев Н.Я.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Инфекционные энтериты молодняка сельскохозяйственных животных, вызываемые бактериальными и вирусными агентами, наносят животноводческим хозяйствам Республики Таджикистан (РТ) значительный экономический ущерб, выражающийся в снижении привеса, падеже, затратах на диагностику, профилактику и терапию. Отход телят от диареи может достигать 30% и более от количества родившихся животных (Жумаев Н.С., 1986; Сатторов И.Т., 1991; Салахутдинов К.Г., 1993; Волков Г.К. 1997). В связи с развитием резистентности у возбудителей лечение и профилактика инфекционных болезней животных антибиотиками, сульфаниламидами, нитрофурановыми и химиотерапевтическими препаратами не всегда эффективна (Подкопаев В.М. и др., 1967; Егоров Н.С., 1986; Пивовар Л.М., 1990; Куриленко А.Н., 1996; Сидоркин В.А. и др., 2003).

В борьбе с возбудителями болезней животных первостепенная роль отводится неспецифическим и специфическим факторам резистентности организма. Накопление антибиотикорезистентных бактерий в организме животных и окружающей среде снижает эффективность профилактических и лечебных мероприятий и приводит к тяжелым экологическим последствиям (Субботин В.В. и др., 2001).

Для профилактики и терапии желудочно-кишечных болезней и повышения продуктивности молодняка сельскохозяйственных животных широко применяют пробиотики, изготавливаемые на основе различных симбиотических микроорганизмов, среди которых наиболее перспективными признаны молочнокислые, пропионовокислые, бифидобактерии, Bacillus subtilis и др., проявляющие избирательную антагонистическую активность в отношении патогенной кишечной флоры, эффективно и быстро восстанавливающие микробиоценоз кишечника (Антипов В.А., 1991; Панин А.Н. и др., 1993, 1999; Паршин П.А. и др., 1997; Малик Н.И. и др., 2000, 2001; Сатторов И.Т. и др., 2001 – 2006).

Использование пробиотиков в ветеринарии затрагивает довольно широкий круг проблем: от коррекции кишечного биоценоза до воздействия на иммунную, гормональную и ферментативную системы организма животных, что обусловливает необходимость внедрения пробиотиков в систему выращивания животных для профилактики инфекционных и неинфекционных желудочно-кишечных заболеваний молодняка, поддержания колонизационной продукции, безопасной в ветеринарно-санитарном отношении (Панин А.Н., 1998, 1999; Малик Н.И. и др., 2001).

Технологии производства пробиотиков при поверхностном культивировании микроорганизмов сопряжены со значительными материальными затратами и являются высоко трудоемкими из-за большого числа операций с применением ручного труда. Существенно повысить производственные возможности предприятий микробиологической промышленности по выпуску готовой продукции и их рентабельность позволяет глубинное выращивание микроорганизмов. Однако большинство применяемых для глубинного культивирования B. subtilis питательных сред из растительных и химических веществ неэффективны из-за невозможности получить достаточное количество микробных клеток в мг бактериальной суспензии (Грязнева Т.Н., 2005).

Для длительного сохранения физико-химических и лечебно-профилактических свойств пробиотики выпускают, в основном, в лиофилизированном виде в герметичных ампулах и флаконах, что обусловливает технологические и иные ограничения, приводящие к нерациональному использованию ампул (флаконов), относительно высокий процент их выбраковки при производстве и контроле качества, специфические условия применения, отличающиеся рядом особенностей, регидратацию препарата, высокие затраты на фасовку, транспортную тару и др. (Власов Н.Г. и др., 2001).

Поэтому серийный выпуск пробиотиков в сухих лекарственных формах, позволяющих точно дозировать препарат, упакованных в емкости, вмещающие большое количество доз, исключает большинство вышеперечисленных недостатков, свойственных производству пробиотиков, упакованных в ампулы или флаконы (Саттори И., 2009).

В лаборатории микробиотехнологии Таджикского аграрного университета им. Ш. Шотемура (ТАУ) проводятся фундаментальные исследования биологии аэробных спорообразующих бактерий рода Bacillus, многие представители которого синтезируют широкий ряд биологически активных веществ (БАВ), характеризуются отсутствием патогенных свойств и безвредностью для теплокровных. Накопленные научные сведения позволяют вести целенаправленную разработку эффективных средств для лечения и профилактики болезней человека, животных и растений. При этом возможно использование как выделяемых чистых веществ (антимикробных и др.), так и биологически высокоактивных живых микробных культур для конструирования пробиотиков.

Целью исследования явились разработка технологии производства пробиотиков на основе Bacillus subtilis и исследование их лечебно-профилактической эффективности при инфекционных энтеритах телят.

Для достижения указанной цели решены следующие задачи:

1. Изучить эпизоотическую ситуацию по инфекционным энтеритам телят в хозяйствах Северного, Центрального и Южного Таджикистана и северо-восточного региона Украины.

2. Отобрать и изучить морфологические, культуральные, биохимические, физиолого-биологические свойства, патогенность и антагонистическую активность штаммов B. subtilis для производства на их основе пробиотиков.

3. Модифицировать картофельный питательный бульон для глубинного культивирования B. subtilis в производственных условиях.

4. Разработать состав и технологию производства действующих веществ на основе B. subtilis для изготовления пробиотиков.

5. Модифицировать контактно-сорбционный метод сушки бактериальной суспензии в производственных условиях.

6. Исследовать антагонистические и токсикологические свойства действующих веществ на основе B. subtilis для изготовления пробиотиков.

7. Стандартизировать эти вещества и определить их стабильность.

8. Разработать состав и технологии производства пробиотиков на основе B. subtilis в форме гранул, таблеток (Субтилбен) и суспензии (Лаксубтил).

9. Изучить антагонистическую активность и токсикологические свойства препарата Лаксубтил, провести доклинические исследования этого пробиотика.

10. Провести экспериментальное изучение и производственные испытания эффективности пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии, определить их оптимальные терапевтическую и профилактическую дозы, разработать схему применения этих препаратов при инфекционных энтеритах молодняка КРС.

11. Разработать нормативную документацию на препараты Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии, внедрить эти пробиотики в ветеринарную практику.

Научная новизна. Впервые в результате эпизоотологического мониторинга в животноводческих хозяйствах Северного, Центрального и Южного Таджикистана и северо-восточного региона Украины определены условия для циркуляции, пассажирования и повышения вирулентности условно-патогенных микроорганизмов – отсутствие родильных отделений и профилакториев для содержания новорожденных телят, нарушение параметров доения коров и ветеринарно-санитарных правил содержания и выращивания телят.

Установлено, что инфекционные энтериты телят вызываются бактериальной флорой, которая циркулирует в хозяйствах и выделяется от коров больных эндометритами и маститами. Чаще всего этиологическим фактором этих заболеваний являлись E. coli, S. dublin, Pr. vulgaris.

Для производства пробиотиков на основе B. subtilis отобраны наиболее перспективные непатогенные штаммы BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26, проявляющие антагонистические свойства в отношении тест-культур в низких концентрациях (3,9 – 31,2 млн м.к./мл) и характеризующиеся типичными для B. subtilis физиолого-биологическими свойствами, которые обусловливают более широкий диапазон действия при сочетанном применении этих штаммов.

Модифицированы картофельная питательная среда, cостоящая из пептона, картофельного крахмала, глюкозы, хлорида натрия и бентонита, для глубинного культивирования B. subtilis и контактно-сорбционный метод обезвоживания биомассы, содержащей бактериальную суспензию B. subtilis и бентанито-пектиновую смесь.

Разработаны состав и технологии производства действующих веществ пробиотиков на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 и пробиотических препаратов Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии. Изучены антагонистическая активность, токсикологические свойства (безвредность, острая и хроническая тосксичность, раздражающие и аллергенные свойства), проведены доклинические исследования этих препаратов. Предложены методы контроля пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил, изучена их стабильность.

В эксперименте отработана рациональная схема применения пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии при терапии и профилактике инфекционных энтеритов молодняка КРС. При производственных испытаниях сконструированных препаратов установлена их лечебно-профилактическая и экономическая эффективность, которая значительно превосходит таковую у препаратов-аналогов.

Научная новизна проведенных исследований подтверждена патентами:

1) Патент TJ 386 Республика Таджикистан. Способ профилактики у телят рота-, коронавирусного энтерита и колибактериоза у телят, протекающих в ассоциации / Cатторов И.Т., Коромыслов Н.С., Махмудов К.Б., Сатторов Н.Р.;

2) Патент TJ 395 Республика Таджикистан. Препарат «Шодмон» для лечения инфекционного энтерита телят / Cатторов И.Т., Турдиев Ш.А., Махмудов К.Б., Сатторов Н.Р.;

3) Патент TJ 403 Республика Таджикистан. Дибаферол, обладающий противомикробной активностью / Сатторов И.Т., Сатторов Н.Р., Юсупов З.Н., Рачабов У.;

4) Патент TJ 404 Республика Таджикистан. Дибакупрол, обладающий противомикробной активностью / Сатторов И.Т., Сатторов Н.Р., Юсупов З.Н., Рачабов У.;

5) Патент TJ 405 Республика Таджикистан. Препарат Витагин для лечения эндометрита коров / Сатторов И.Т., Сатторов Н.Р., Давлатмуродов Т.М.;

6) Патент TJ 627 Республика Таджикистан. Препарат ДС-1100 для лечения желудочно-кишечных болезней телят / Сатторов И.Т., Махмудов К.Б., Сатторов Н.Р., Саидов А.

Практическая ценность. В результате проведенных исследований ветеринарной практике предложены эффективные пробиотические препараты Субтилбен и Лаксубтил, обладающие этиотропным и патогенетическим действием и предназначенные для терапии и профилактики инфекционных энтеритов телят.

Разработанные лекарственные средства в формах гранул, таблеток и суспензии, успешно прошедшие широкие производственные испытания и внедренные в ветеринарную практику, обеспечивают высокий лечебно-профилактический эффект в короткие сроки.

На основании результатов проведенных исследований разработана нормативная документация:

- Инструкция по изготовлению и контролю ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и пастереллеза сельскохозяйственных животных (утв. ГУВ МСХ РТ, 1999 г.);

- Технические условия на ассоциированную вакцину против сальмонеллеза и пастереллеза сельскохозяйственных животных (утв. ГУВ МСХ РТ, 1999 г.);

- Наставление по применению ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и пастереллеза сельскохозяйственных животных (утв. ГУВ МСХ РТ, 1999 г.);

- Инструкцию по изготовлению и контролю иммунобиотика Субтилбен для профилактики и лечения желудочно-кишечных и респираторных болезней животных и пчел (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.);

- Технические условия на иммунобиотик Субтилбен (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.);

- Наставление по применению иммунобиотика Субтилбен для профилактики и лечения желудочно-кишечных и респираторных болезней животных и пчел (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.);

- Инструкция по изготовлению и контролю препарата «Шодмон» (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.);

- Технические условия на препарат «Шодмон» (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.);

- Наставление по применению препарата «Шодмон» для профилактики и лечения бактериозов животных и птиц (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.);

- Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации колибактериоза новорожденных животных (утв. СГВН МСХ РТ, 2009 г.);

- Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации ротавирусной инфекции телят (утв. СГВН МСХ РТ, 2009 г.);

- Инструкция о мероприятиях по борьбе с сальмонеллезом новорожденных животных (утв. СГВН МСХ РТ, 2009 г.);

- Решение 26-го заседания Межправительственного совета по сотрудничеству в области ветеринарии СНГ от 24.11.2004 г. (Душанбе) о практическом использования препарата Субтилбен в ветеринарной практике СНГ;

- Научно-обоснованная система получения здорового молдняка и профилактики желудочно-кишечных болезней новорожденных телят: Рекомендации (утв. СГВН МСХ РТ, 11.09.2012 г.);

- Рекомендация по профилактике и лечению пневмоэнтеритов телят (утв. СГВН МСХ РТ, 11.09.2012 г.).

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Результаты эпизоотологического мониторинга по инфекционным энтеритам телят в хозяйствах Северного, Центрального и Южного Таджикистана и северо-восточного региона Украины.

2. Результаты отбора и изучения морфологических, культуральных, биохимических, физиолого-биологических свойств, патогенности и антагонистической активности штаммов B. subtilis для производства на их основе пробиотиков.

3. Состав модифицированного картофельного питательного бульона для глубинного культивирования B. subtilis в производственных условиях.

4. Состав и технология производства действующих веществ на основе B. subtilis для изготовления пробиотиков.

5. Модифицированный контактно-сорбционный метод сушки бактериальной суспензии в производственных условиях.

6. Результаты исследования антагонистических и токсикологических свойств действующих веществ на основе B. subtilis для изготовления пробиотиков.

7. Методы стандартизации и контроля этих веществ, результаты определения их стабильности.

8. Состав и технология производства пробиотиков на основе B. subtilis в форме гранул, таблеток (Субтилбен) и суспензии (Лаксубтил).

9. Результаты изучения антагонистической активности и токсикологических свойств, доклинических исследований препарата Лаксубтил.

10. Результаты экспериментального изучения и производственных испытаний эффективности пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии, их оптимальные терапевтическая и профилактическая дозы, схема применения этих препаратов при инфекционных энтеритах телят.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на заседаниях ученого совета ТАУ (Душанбе, 2006 – 2011 гг.); республиканских конференциях и семинарах-совещаниях (Душанбе, 2006 – 2011 гг.); Международной научно-практической конференции «Биобезопасность и зоонозные инфекции» (Алматы, 2009 г.), Международной научно-практической конференции «Research and Clinical Application of Traditional Medicinein Xinjiangand Neighbouring Countries» (Урумчи, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Ветеринарные проблемы в Центральной Азии – Продовольственная безопасность: Использование современных методов диагностики и профилактики инфекционных болезней животных» (Душанбе, 2011 г.).

Публикации. По результатам исследований опубликована 23 научная работа, получены 6 патентов РТ .

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.

Диссертация изложена на 361 странице, иллюстрирована 32 таблицами и 15 рисунками. Список литературы содержит 450 источников. В приложение включены материалы, подтверждающие внедрение результатов исследования в практику.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в 2006 – 2011 гг. в лаборатории микробиотехнологии ТАУ в соответствии с республиканской научно-технической программой «Разработка и внедрение эффективных и биологических средств в профилактике и терапии бактериозов и микоплазмоза животных» на 2005 – 2010 гг., зарегистрированной в Национальном патентно-информационном центре РТ (№ госрегистрации 0105 ТД 236) и на кафедре ветеринарной санитарной экспертизы, микробиологии и зоогигиены Сумского национального аграрного университета (СНАУ) Республики Украина.

Бактериальные заболевания диагностировали на основании анализа эпизоотических данных с учетом клинических признаков болезни, патологоанатомических изменений и результатов бактериологического исследования патологического материала от больных, павших и вынужденно убитых больных телят.

При бактериологической диагностике микроскопировали мазки крови и мазки-отпечатки внутренних органов, на элективные питательные среды высевали выделеные из патологического материала культуры, для определения патогенности которых заражали лабораторных животных, затем культуры идентифицировали и типизировали серологическим методом.

В работе использовали штаммы B. subtilis (BS TJ 06, BS TJ 07, BS TJ 08, BS TJ 09, BS TJ 10, BS TJ 11, BS TJ 12, BS TJ Д 24, BS TJ Д 26) из коллекции ТАУ, при сравнительной характеристике которых изучали морфологические, тинкториальные, культуральные, ферментативные свойства, патогенность (биопроба), антагонистическую активность (методом серийных разведенийи с посевом на плотные питательные среды в отношении тест-культур и изолятов E. coli, S. dublin, Pr. vulgaris), совместимость (при совместном культивировании на жидких и плотных питательных средах, после которого изучали морфологические, тинкториальные, культуральные, ферментативные свойства, патогенность и антагонистическую активность).

Антагонистические свойства действующих веществ и пробиотиков изучали методом двукратных серийных разведений в жидкой (МПБ) и плотной (МПА) средах на музейных штаммах (6) и изолятах E. coli (4), S. dublin (3), Pr. vulgaris (2), выделенных от больных инфекционными энтеритами телят в животноводческих хозяйствах РТ. МБсК определяли по задержке роста в мазках тест-культур, окрашенных по Граму, МБцК – через 24 – 72 ч инкубации.

Безвредность действующих веществ и пробиотиков определяли с использованием сухой культуры инфузории Colpoda steinii, на которую согласно требованиям ГОСТа Р 52337-2005 воздействовали исследовавшимися препаратами, оценивая результаты биотеста по гибели стилохоний.

Для культивирования инфузорий и разбавления действующих веществ и пробиотиков использовали раствор Лозина-Лозинского, состоящий из NaCl (0,01%), KCl (0,001%), CaCl2 двуводного (0,001%), MgCl2 шeстиводного (0,001%), NaHCO3 (0,002%). В часть раствора, применявшуюся для культивирования инфузорий, вносили свежие высушенные хлебопекарные дрожжи (12 мг на 100 мл), которые предварительно тестировали на токсичность.

Использовали суточную культуру стилохоний, находившихся в фазе экспоненциального (активного) роста, для чего за сутки до опыта цисты и споры культуры пересаживали в новую питательную среду со свежим кормом и помещали в термостат при температуре 22 – 24оС.

Для приготовления рабочего раствора испытывавшихся образцов действующих веществ и пробиотиков брали навеску массой 1000±10 мг, вносили ее в колбу вместимостью 25 мл, заливали 10 мл раствора Лозина-Лозинского и на 20 мин колбу помещали в аппарат для встряхивания жидкостей. Затем раствор в течение 5 мин центрифугировали с частотой вращения 1000 об/мин и использовали надосадочную жидкость.

Каждую пробу исследовали в пяти повторностях. Пересадку и подсчет стилохоний проводили под микроскопом при увеличении 2×8 или 2×14. Сначала автоматической пипеткой отбирали по 20 мкл среды со стилохониями и помещали в каждую лунку двух рядов блока микроаквариумов (5 лунок в ряде). Через 2 мин учитывали в каждой лунке количество живых стилохоний. Затем в пять (опытных) лунок первого ряда добавляли по 20 мкл рабочего раствора испытывавшегося препарата, а в 5 лунок второго ряда (контроль) – такое же количество дистиллированной воды. Спустя 3 ч в лунках опытного и контрольного рядов снова проводили подсчет количества активных стилохоний и сопоставляли результаты. Выживаемость стилохоний каждого ряда (N, %) вычисляли по формуле:

N = N2 : N1 × 100, где

N1 – среднеарифметическое (из пяти) значение количества активных стилохоний в начале опыта, экз.;

N2 – среднеарифметическое (из пяти) значение количества активных стилохоний в конце опыта, экз. (ТУ 9388-001-885-95).

Токсикологические показатели (острая и хроническая токсичность, раздражающие и аллергенные свойства) пробиотиков изучены согласно «Методическим указаниям по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве» (М., 1988).

Стабильность действующих веществ и пробиотиков для определения срока их годности изучали методами «ускоренного старения» при повышенных температурах (37 и 50оС) и естественного хранения. Образцы экспериментальных серий препаратов помещали в термостат на сроки, соответствующие 0,5; 1; 2 и 3 годам естественного хранения. Оценку качества препаратов проводили по основным показателям: внешний вид и цвет; наличие механических примесей, плесени; концентрация водородных ионов (рН) 10% водной суспензии; массовая доля влаги; однородность; количество клеток B. subtilis; количество жизнеспособных клеток B. subtilis; контаминация бактериальной и грибной микрофлорой; контаминация микоплазмами; антагонистические свойства в отношении E. coli; токсичность.

Ветеринарно-санитарную экспертизу мяса осуществляли согласно ГОСТу 202353 до введения пробиотиков и через 5 (2 раза в сутки) и 10 (1 раз в сутки) дней после перорального введения препарата кроликам в ориентировочно-терапевтической дозе. Биохимические исследования мяса кроликов включали определение величины рН, коэффициента кислотность-окисляемость, показателей качественных реакций с 5%-ным раствором сернокислой меди и бензидиновой пробы на пероксидазу. При бактериологическом исследовании мяса опытных животных определяли общую бактериальную обсемененность поверхностных и глубоких слоев скелетной мускулатуры, прежде всего, исключая обсемененность мяса стрептококками, стафилококками, сальмонеллами, кишечной палочкой, B. subtilis и др.

Коэффициент терапевтической эффективности пробиотиков (E) вычисляли по формуле:

где a – количество выживших телят в опыте;

b – количество телят в опытной группе;

A – количество телят, выживших в контроле;

B – количество телят в контроле.

Экономическую эффективность научных разработок рассчитывали согласно «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий» (утв. ГУВ МСХ СССР, 1982), а также в соответствии с «Методикой определения экономической эффективности использования в сельском хозяйстве результатов научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ, новой техники, изобретений и рационализаторских предложений» (утв. МСХ СССР, 1983).

Методики отдельных экспериментов изложены в соответствующих разделах диссертации.

Цифровой материал диссертации обработан статистически по критерию Стьюдента для проверки достоверности различий. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при p≤0,05 (Лакин Г. Ф., 1990).

За основу выводов и практических предложений взяты результаты контролируемых опытов в лабораторных и производственных условиях.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Инфекционные энтериты телят

3.1.1. Эпизоотическая ситуация

в Северном, Центральном и Южном Таджикистане

На молочно-товарных фермах (МТФ) Таджикистана E. coli, S. dublin, Pr. vulgaris являются возбудителями инфекционных энтеритов молодняка КРС, вероятность возникновения и тяжесть течения которых определяют внешние факторы, влияющие на естественную резистентность и иммунологическую реактивность организма.

В результате исследования 700 проб патологического материала (фекалии, кровь, паренхиматозные органы) от новорожденных телят из 12 животноводческих хозяйств районов республиканского подчинения (РРП), Хатлонской и Согдийской областей РТ наибольшее количество больных инфекционными энтеритами телят (42,0%) выявлено в хозяйствах РРП, наименьшее (25,0%) – Хатлонской области (табл. 1).

Таблица 1

Результаты бактериологического исследования
патологического материала от новорожденных телят (2006 2011 гг.)

РРП

Область

Согдийская

Хатлонская

Кол-во

хозяйств

всего

7

2

3

12

неблагополучных

7

2

2

11

проб

всего

420

126

154

700

положительных

176 (42,0)

42 (33,0)

39 (25,0)

257 (40,3)

Примечание. В скобках указано процентное значение.

В 97 (76,3%) пробах выделены моновозбудители, 30 (23,7%) – ассоциации патогенов. В 59,8% (76) случаев возбудителем инфекционного энтерита была E. coli, в 10,2 (13) – Pr. vulgaris, 6,3% (8) – S. dublin, 14,2% (18) – ассоциации E. coli и Pr. vulgaris, 5,5% (7) – ассоциации E. coli и S. dublin, 4,0% (5) – ассоциации E. coli, S. dublin и Pr. vulgaris.

3.1.2. Эпизоотическая ситуация

в хозяйствах северо-восточного региона Украины

Результаты бактериологических исследований Сумской, Харьковской и Черниговской государственных областных и районных лабораторий ветеринарной медицины за 2007 – 2011 гг. свдетельствуют, что в хозяйствах северо-восточного региона Украины, специализирующихся на выращивании КРС, чаще всего циркулируют сальмонеллы сероваров S. dublin, S. typhimurium, S. enteritidis; ешерихии – О1, О8, О4, О78, О86, О101 и О111; стафилококки – St. aureus, St. saprophyticus, St. epidermidis; стрептококки – Str. agalactiae, Str. dysgalactiae, Str. pyogenes, Str. uberus, Str. pneumoniae. Реже из патоматериала изолировали синегнойную палочку, протей и пастереллу.

Результаты эпизоотологических исследований показывают, что в исследуемых хозяйствах существуют условия для циркуляции, пассажирования и повышения вирулентности условно-патогенных микроорганизмов – отсутствие родильных отделений и профилакториев для содержания новорожденных телят, нарушение параметров доения коров и ветеринарно-санитарных правил содержания и выращивания телят.

Все хозяйства были благополучными по туберкулёзу, лейкозу, криптоспоридиозу, инфекционному ринотрахеиту, парагриппу и другим инфекционным заболеваниям, но в них регистрировали эндометриты (15,9 – 29,2%), маститы (12,5 – 13,0%) у коров, а также желудочно-кишечные (18,3 – 50,2%) и респираторные болезни (6,7 – 11,5%) новорожденных телят.

При бактериологических исследованиях в 32,2% случаев изолировали E. coli, 15,6 – Ps. aeroginosa, 10,1 – Pr. vulgaris, 9,9 – St. aureus, 5,9 – S. enteritidis, 5,7 – Str. uberus, 20,6% – приходилось на долю остальных видов микроорганизмов.

При серотипизации ешерихий и сальмонелл установлено, что в регионе циркулируют серовары эшерихий – О8 (16,9%), О4 (11,1%), О1 (10,4%), О78 (10,1%), О86 (9,8%), О101 (8,5%), О111 (7,3%), не типировались – 24,9% и сальмонелл – S. enteritidis (55,7%), S. dublin (23,5%), S. typhimurium (20,8%).

При исследовании слизи матки у коров больных эндометритом чаще изолировали E. coli (24,1%), Pr. vulgaris (15,1%), Ps. aeroginosa (14,6%), St. aureus (13,6%), на долю остальных микроорганизмов приходилось 45,6%. При изучении микробного пейзажа вымени коров, больных маститом, установлено, что заболевание вызывали ассоциации микроорганизмов – St. aureus, E. coli, Ps. aeroginosa, реже – Pr. vulgaris, Str. agalactiae, Str. dysgalactiae, Str. pyogenes, Str. uberus, Str. pneumoniae.

При бактериологическом исследовании больных и павших телят изолирована условно-патогенная микрофлора – 12 видов (E. coli – 23,1% случаев, Ps. aeroginosa – 17,6, S. enteritidis – 13,7, S. dublin – 10,5, S. typhimurium – 8,8, Pr. vulgaris – 6,1, St. aureus – 5,6, Str. pyogenes – 5,6, Str. pneumoniae – 4,6, Str. epidermidis – 2,6, P. multicida – 1,8% случаев).

Таким образом, инфекционные энтериты молодняка КРС вызываются бактериальной флорой, которая циркулирует в хозяйствах и выделяется от коров, больных эндометритами и маститами. Чаще всего этиологическим фактором этих заболеваний были эшерихии, сальмонеллы, протей и синегнойная палочка, что обусловливает актуальность разработки новых антибактериальных лекарственных средств и рациональных способов их применения.

3.2. Действующие вещества в форме порошка

для производства пробиотиков на основе штаммов B. subtilis

3.2.1. Подбор штаммов B. subtilis

3.2.1.1. Морфологические, культуральные и биохимические свойства

В результате изучения морфологических и культуральных свойств штаммов B. subtilis (BS TJ 06, BS TJ 07, BS TJ 08, BS TJ 09, BS TJ 10, BS TJ 11, BS TJ 12, BS TJ Д 24, BS TJ Д 26) из коллекции ТАУ установлено, что культуры представляют собой грамположительные спорообразующие палочки с закругленными концами. Размер клеток – 3 – 6 0,9 – 1 мкм; в мазках 18-часовой культуры клетки расположены одиночно, попарно, реже – в цепочку. Споры овальной формы в клетке расположены центрально, размер спор – 0,6 – 1,2 мкм.

На твердых питательных средах при температуре (37±0,5)оС через 24 ч наблюдали рост бацилл в виде кремово-белых складчатых сухих колоний с кратерообразным центром, вязкой консистенции, края колоний изрезанные.

Испытанные культуры восстанавливали нитраты до нитритов, образовывали каталазу, кислоты из D-глюкозы, L-арабинозы, D-ксилозы и D-маннита, окисляли глюкозу с образованием ацетоина (ацетилметилкарбинола), расплавляли крахмал, желатин и казеин.

Изученные штаммы бацилл на основании морфологических, культуральных и биохимических свойств идентифицированы как В. subtilis.

3.2.1.2. Патогенность и антагонистические свойства

При пероральном кроликам (с помощью шприца с тупой иглой), телятам и парентеральном (внутрибрюшинная инъекция) белым мышам введении смывов суточной агаровой культуры штаммов BS TJ 06, BS TJ 07, BS TJ 08, BS TJ 09, BS TJ 10, BS TJ 11, BS TJ 12, BS TJ Д 24, BS TJ Д 26 в концентрациях соответственно 9 млрд и 100 млн м.к./кг массы тела в объемах 0,6 (кролики), 10,5 (телята) и 0,3 мл (белые мыши) признаки заболевания и другие физиологические отклонения у опытных животных в сравнении с контрольными не отмечали, что свидетельствует об отсутствии патогенности у испытанных штаммов.

Результаты бактериологического исследования показали (табл. 2), что МБсК штаммов BS TJ 08, BS TJ 09, BS TJ 10, BS TJ Д 24, BS TJ Д 26 в отношении E. coli, S. dublin, Pr. vulgaris составляет 3,9 – 31,2 млн м.к./мл, соответствующая концентрация штаммов BS TJ 11, BS TJ 12 – 15,6 – 124,8 млн м.к./мл. Штаммы BS TJ 06, BS TJ 07 подавляют рост тест-культур в высоких концентрациях (500 млн м.к./мл).

Таблица 2

Противомикробная активность штаммов B. subtilis, млн м.к./мл

Штамм

Тест-культура

МБсК

МБцК

1

2

3

4

BS TJ 06

E. coli

500

S. dublin

500

Pr. vulgaris

500

BS TJ 07

E. coli

500

S. dublin

500

Pr. vulgaris

500

BS TJ 08
E. coli

15,6

31,2

S. dublin

7,8

15,6

Pr. vulgaris

15,6

31,2

BS TJ 09

E. coli

7,8

15,6

S. dublin

7,8

15,6

Pr. vulgaris

15,6

31,2

BS TJ 10

E. coli

7,8

15,6

S. dublin

7,8

7,8

Pr. vulgaris

15,6

31,2

Окончание табл. 2

1

2

3

4

BS TJ 11

E. coli

31,2

62,4

S. dublin

15,6

31,2

Pr. vulgaris

31,2

62,4

BS TJ 12

E. coli

62,4

124,8

S. dublin

31,2

62,4

Pr. vulgaris

62,4

124,8

BS TJ Д 24

E. coli

3,9

7,8

S. dublin

3,9

7,8

Pr. vulgaris

15,6

31,2

BS TJ Д 26

E. coli

7,8

15,6

S. dublin

7,8

15,6

Pr. vulgaris

7,8

15,6

Примечание. «–» – отсутствие антибактериальной активности.

Из изученных для изготовления на их основе действующих веществ для производства пробиотиков отобраны наиболее перспективные штаммы BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26, проявляющие антимикробные свойства в отношении тест-культур микроорганизмов в низких концентрациях (3,9 – 31,2 млн м.к./мл).

Установлено, что штаммы BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 характеризуются типичными для B. subtilis физиолого-биологическими свойствами, которые могут обусловить более широкий диапазон их действия при сочетанном применении.

Изученные штаммы характеризуются отсутствием гемолитической активности, у них не обнаружены ферменты, которые могут обуславливать патогенные свойства (лецитиназа, гиалуронидаза), обладают важными технологическими свойствами – растут в присутствии 7%-ной NаС1, не нуждаются в аминокислотах и витаминах, не проявляют взаимного антагонизма при совместном культивировании.

Таким образом, морфологические, культуральные, ферментативные свойства, отсутствие патогенности, высокая антагонистическая активность и физиолого-биологические свойства штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 обусловили их использование при изготовлении пробиотиков.

3.2.2. Модифицированный картофельный питательный бульон

для культивирования штаммов B. subtilis

Для выращивания B. subtilis рекомендуют картофельные среды (Ноздрин Г.А., 2000), но получаемая концентрация бацилл в бактериальной суспензии не превышает 10 млн/мл и недостаточна для изготовления пробиотиков.

Вначале были проведены эксперименты по глубинному культивированию В. subtilis на:

1) элективной питательной среде (среда для выращивания В. subtilis), содержащей фосфатнокислый калий – 0,1%, азотнокислый натрий – 1%, глюкозу – 1%, хлорид натрия – 0,01%, сернокислый магний – 0,1%, сернокислое железо – 0,1% и дистиллированную воду – до 100%;

2) картофельной питательной среде, содержащей пептон – 0,25%, картофельный крахмал – 0,25%, глюкозу – 0,125%, хлорид натрия – 0,01% и дистиллированную воду – до 100%.

В колбах Эрленмейера (объемом 1,5 л), наполненых не более 1 л, среды стерилизовали при 0,8 атм. в течение 15 – 20 мин, гидроокисью калия рН доводили до 7,0 – 7,2. На каждую питательную среду подсеивали штаммы BS TJ 09, BS TJ 24, BS TJ 26 (10 млн м.к./см3) из расчета 1 см3 на 1 л, которые культивировали в условиях интенсивной аэрации при температуре (37±0,5)оС в течение 24 ч. Затем бактериальную суспензию проверяли на стерильность и методом серийных разведений определяли в ней количество микробных клеток B. subtilis (в средах с обильным ростом и помутнением с осадком). Из последнего разведения культуру подсеивали на картофельный агар на чашках Петри и подсчитывали количество выросших колоний (в средах с обильным ростом и помутнением с осадком).

При культивировании на элективной питательной среде рост бактерий был слабым, наблюдали ее незначительное помутнение, а на картофельной питательной среде отмечали обильный рост, ее помутнение и выпадение осадка, что определило направление дальнейших исследований с целью модификации этой среды для получения качественной бактериальной суспензий с высоким содержанием споровых форм бактерий.

Нами установлены абсолютно необходимые вещества (химические – пептон, глюкоза, хлорид натрия; растительные – картофельный крахмал; комплекс макро- и микроэлементов – бентонит) и их оптимальное содержание для культивирования изученных бацилл.

Определено, что эффективной питательной средой для выращивания B. subtilis является состоящая из 0,25% пептона, 0,25% картофельного крахмала, 0,125% глюкозы, 0,01% хлорида натрия и 10% бентонита.

Таким образом, морфологические, культуральные, ферментативные свойства, антагонистическая активность отобранных для производства пробиотиков штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 при культивировании на модифицированной нами среде в сравнении с исходными штаммами не изменялись, что определило использование этой среды при производстве пробиотиков.

3.2.3. Сушка бактериальной суспензии

модифицированным контактно-сорбционным методом

Нами модифицирован контактно-сорбционный метод обезвоживания биомассы, содержащей бактериальную суспензию штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 и бентанито-пектиновую смесь (бентонит месторождения «Каратаг» – РТ, Шахринавский район). Минеральные и растительные адсорбенты стимулировали рост микроорганизмов, которые продолжали культивировать 24 ч при температуре (37±0,5)оС. Затем производственную серию биомассы сушили при (50±0,5)оС в течение 48 ч.

3.2.4. Состав и технология производства

действующих веществ пробиотиков на основе штаммов B. subtilis

Таблица 3

Состав действующих веществ пробиотиков на основе штаммов B. subtilis


Компонент

Кол-во, %

Концентрация м.к., млрд/г

Порошок на основе штамма

BS TJ 09

бактериальная масса

3

30

минеральные вещества (комплекс макро- и микроэлементов)

60

растительные вещества

37

BS TJ Д 24

бактериальная масса

3

30

минеральные вещества (комплекс макро- и микроэлементов)

60

растительные вещества

37

BS TJ Д 26

бактериальная масса

3

30

минеральные вещества (комплекс макро- и микроэлементов)

60

растительные вещества

37

Основные технологические стадии производства действующих веществ на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 пробиотиков в форме порошка:

1. Получение первичных культур производственных штаммов

С полужидкого агара культуры производственных штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 засевают в пробирку с модифицированным картофельным питательным бульоном и выращивают в течение 24 ч при температуре (37±0,5)оС.

2. Получение матричных культур производственных штаммов

Первичные культуры проверяют на чистоту, засевают в колбы Эрленмейера (объемом 1,5 л), наполненные модифицированным картофельным питательным бульоном не более 2/3 объема, и инкубируют при температуре (37±0,5)оС в течение 24 ч.

3. Изготовление бактериальной суспензии методом глубинного культивирования (I стадия)

Чистые культуры производственных штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 24-часового роста в количестве 10% объема (1 л) засеваемого модифицированного картофельного питательного бульона (рН 7,4 – 7,6) инокулируют в 10-литровые бутыли и выращивают при температуре (37±0,5)оС в течение 48 ч.

4. Приготовление бентонито-пектиновой смеси

Пектин перемешивают с бентонитом в соотношении 37:60 до получения однородной смеси.

5. Приготовление гомогената бентонито-пектиновой смеси и бактериальной суспензии производственного штамма B. subtilis

Бентонито-пектиновую смесь добавляют в бактериальную суспензию производственного штамма B. subtilis (BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26) и перемешивают.

6. II стадия культивирования бактериальной суспензии

В течение 24 ч при температуре (37±0,5)оС минеральные и растительные адсорбенты стимулируют рост микроорганизмов.

7. Сушка производственной серии биомассы

Контактно-сорбционным методом обезвоживания биомассу в течение 48 ч сушат при температуре (50±0,5)оС.

8. Измельчение высушенной производственной серии биомассы

Производственную серию биомассы после сушки измельчают в шаровых мельницах, порошок просеивают через сито.

9. Упаковка и хранение

10. Контроль серии

3.2.5. Антагонистическая активность

Установлена высокая бактериостатическая и бактерицидная активность порошков на основе штаммов B. subtilis в отношении исследованных тест-культур. МБсК порошка на основе штамма BS TJ 09 для E. coli составляла 0,3, S. dublin и Pr. vulgaris – 0,6 мг/мл; BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 в отношении всех изученных тест-культур – соответственно 0,6 и 0,3 мг/мл (табл. 4). В количестве 0,6 мг/мл порошок на основе штамма BS TJ 09 вызывал гибель (МБцК) E. coli, S. dublin и 1,2 мг/мл – Pr. vulgaris; МБцК штаммов BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 для всех культур составила соответственно 1,2 и 0,6 мг/мл.

Таблица 4

Антагонистические свойства

действующего вещества на основе штаммов B. subtilis, мг/мл


E. coli

S. dublin

Pr. vulgaris

Порошок

на основе штамма

BS TJ 09

МБсК

0,3

0,6

0,6

МБцК

0,6

1,2

1,2

BS TJ Д 24

МБсК

0,6

0,6

0,6

МБцК

1,2

1,2

1,2

BS TJ Д 26

МБсК

0,3

0,3

0,3

МБцК

0,6

0,6

0,6

В отношении односуточной бульонной культуры E. coli (концентрация – 1 млрд м.к./мл) методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде изучили динамику антагонистической активности порошков на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26, которую оценивали через 1, 3, 6, 12, 18, 24, 36 и 48 ч.

Изменение морфологии E. coli начинается спустя 6 ч после контакта с порошками на основе штаммов B. subtilis: клетки тест-культуры увеличивались в размере и принимали различную форму. Количество клеток E. coli через 12 – 18 ч начинало уменьшаться, лизис тест-культур заканчивался через 48 ч после контакта с порошками.

В контрольных пробирках (бентонито-пектиновая смесь) изменение морфологии тест-культуры не наблюдали, что свидетельствует о связи бактерицидной активности изученных порошков с выделением B. subtilis биологически активных веществ.

О равной активности в отношении различных серотипов E. coli свидетельствуют бактерицидные свойства (в концентрациях 0,3 – 1,2 мг/мл) порошков на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 в отношении наиболее часто выделявшихся от больных колибактериозом телят серотипов E. coli О8, О101, а также О9, О15, О55, О78, О115, О117.

Таким образом, выделение B. subtilis биологически активных веществ обусловливает высокую антагонистическую активность порошков на основе штаммов B. subtilis в отношении музейных штаммов и изолятов E. coli, S. dublin и Pr. vulgaris.

3.2.6. Токсикологические свойства

3.2.6.1. Безвредность

Безвредность порошков на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 изучали на белых мышах (массой 18 – 20 г; 3 группы, n=10), кроликах породы шиншилла (массой 2,5 – 2,7 кг; 3 группы, n=5) и новорожденных телятах черно-пестрой породы (массой 31 – 33 кг; 3 группы, n=5), которым препарат в дозе 0,5 г/кг массы тела вводили с водой перорально в объемах соответственно 0,5; 10 и 30 мл 2 раза в сут в течение 7 дней.

В течение 14 сут наблюдения не было ни одного случая падежа животных, что свидетельствует о безвредности изученных порошков на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26.

Проверку продуктов микробиологического синтеза осуществляли методом с использованием сухой культуры инфузории Colpoda steinii, на которую согласно требованиям ГОСТа Р 52337-2005 воздействовали исследовавшимися порошками на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26, оценивая результаты биотеста по гибели стилохоний.

Установлено, что через 3 ч воздействия исследовавшимися препаратами активность стилохоний опытного ряда составила 89%, а в контроле – 90%.

В соответствии с требованиями ГОСТа Р 52337-2005 изученные порошки на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 относятся к нетоксичным препаратам микробиологического синтеза, под действием которых за установленное время остаются активными свыше 80% стилохоний.

3.2.6.2. Острая токсичность

Острую токсичность изучали в опытах на белых мышах (массой 18 – 20 г, n=10) и новорожденных телятах черно-пестрой породы (массой 31 – 33 кг, n=5), из которых по принципу парных аналогов сформировали по 6 групп для каждого порошка на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26.

Белым мышам порошки в виде 10%-ной суспензии на физиологическом растворе вводили однократно перорально в объеме 0,5 мл в дозах 1,0 (1-я группа), 1,5 (2-я), 2,0 (3-я), 2,5 (4-я), 3,0 г/кг массы тела (5-я); телятам – в объеме 30 мл в тех же дозах. Контрольным животным в соответствующих объемах вводили физиологический раствор.

За лабораторными животными и телятами наблюдали в течение 14 дней, учитывая общее состояние, внешний вид, поведенческие реакции, прием пищи и воды, ритм и частоту сердцебиения, количество дыхательных движений.

Гибели опытных животных не наблюдали, клиническое состояние опытных и контрольных животных не отличалось.

Следовательно, порошки на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 относятся к нетоксичным веществам.

3.2.6.3. Хроническая токсичность

В опытах по скармливанию порошков на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 в течение 20 сут трем группам (n=10) белых мышей (массой 18 – 20 г) и трем группам (n=10) кроликов породы шиншилла (массой 2,5 – 2,7 кг) в дозах 0,6; 1,5 и 3,0 г/кг массы тела изучали хроническую токсичность. Животные контрольных групп (n=10) порошки на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 не получали. За лабораторными животными наблюдали в течение 30 дней.

Установлено, что при длительном введении порошков на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 в дозах 0,6; 1,5 и 3,0 г/кг массы тела поведение, аппетит, прием воды, состояние слизистых оболочек и шерстного покрова опытных животных не отличается от контрольных.

Применение порошков на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 в дозах 0,6; 1,5 и 3,0 г/кг массы тела не влияет на динамику массы тела, которую определяли на 5, 10, 15 и 20 сут: у опытных и контрольных животных величины статистически не отличались. Порошки на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 не вызывали повышения температуры тела и не влияли на характер локомоторной активности, стереотипное поведение и выносливость животных.

3.2.6.4. Раздражающее действие на кожу и слизистые оболочки

Влияние порошков на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 на кожу изучали методом однократной аппликации 10% суспензии на кожу мышей (массой 18 – 20 г, n=6).

Повторное местное раздражающее действие порошков исследовали на белых мышах (самках, массой 18 – 20 г, n=6) и кроликах (самках, массой 2,5 – 2,7 кг, n=6), которым ежедневно на выстриженный участок кожи в межлопаточной области наносили соответственно по 1 и 2 капли 10% суспензии порошков на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 в течение соответственно 14 и 21 дня. Животным контрольных групп (n=6) по той же методике наносили подсолнечное масло. Наблюдение за белыми мышами вели в течение 30, кроликами – 60 дней.

При изучении раздражающих свойств порошков на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 методом аппликации на кожу установлено, что кожа кроликов на месте нанесения порошков оставалась гладкой, эластичной, неутолщенной, безболезненной и без признаков гиперемии.

На кроликах (самках, массой 2,5 – 2,7 кг), которых разделили на две группы (n=6) изучали действие порошков на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 на слизистую оболочку глаза, которое при однократном и повторном введении выражено слабо.

3.2.7. Стандартизация порошка на основе штаммов B. subtilis

Качество препарата характеризуется следующими физико-химическими и биологическими показателями:

1. Внешний вид и цвет – порошок серовато-белого цвета.

2. Наличие механических примесей, плесени – нет.

3. Концентрация водородных ионов (рН) 10% водной суспензии – 6,5 – 7,0.

4. Массовая доля влаги – не более 10%.

5. Стерильность – посторонняя микрофлора отсутствует.

6. Количество клеток B. subtilis – 30 млрд/г.

7. Количество жизнеспособных клеток B. subtilis – 75 – 80%.

8. Контаминация бактериальной и грибной микрофлорой – отсутствует.

9. Контаминация микоплазмами – отсутствует.

10. Антагонистические свойства (МБцК в отношении E. coli) – 0,3 – 1,2 мг/мл.

11. Токсичность в дозе 3,0 г/кг массы тела – нетоксичен.

3.2.8. Стабильность

Изучение стабильности порошков на основе штаммов B. subtilis методом «ускоренного старения» при повышенных температурах (37 и 50оС; образцы экспериментальных серий помещали в термостат на сроки, соответствующие 0,5; 1; 2 и 3 годам естественного хранения) показало, что по физико-химическим и биологическим показателям качества препарат оставался стабильным в течение срока, соответствовавшего 2 годам естественного хранения. При естественном хранении физико-химические и биологические свойства порошков на основе штаммов B. subtilis оставались стабильными в течение 2 лет. На основании полученных данных установлен срок хранения препарата – 2 года. Препарат хранят по списку Б, в сухом, хорошо проветриваемом, защищенном от света и атмосферных осадков месте, при температуре не выше 30оС.

3.3. Технология производства

пробиотиков на основе штаммов B. subtilis

3.3.1. Пробиотик Субтилбен в форме гранул и таблеток

3.3.1.1. Состав

Пробиотический препарат Субтилбен на основе штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24, BS TJ Д 26 в форме гранул и таблеток изготавливают из компонентов, представленных в таблице 5.

Таблица 5

Состав пробиотика Субтилбен в форме гранул и таблеток, %

Компонент

Гранулы

Таблетки

Порошок, содержащий бактериальную массу

BS TJ 09 (30 млрд м.к./г)

30,0

29,0

Порошок, содержащий бактериальную массу

BS TJ Д 24 (30 млрд м.к./г)

30,0

29,0

Порошок, содержащий бактериальную массу

BS TJ Д 26 (30 млрд м.к./г)

30,0

29,0

Крахмал

5,0

5,0

Сахарный сироп

3,0

3,0

Кальция стеарат

2,0

5,0

3.3.1.2. Технологическая схема

Основные технологические стадии изготовления Субтилбена в форме гранул:

1. Взвешивание компонентов.

2. Смешивание.

3. Увлажнение.

4. Гранулирование.

5. Упаковка и хранение.

6. Контроль серии.

Основные технологические стадии изготовления Субтилбена в форме таблеток:

1. Взвешивание компонентов.

2. Смешивание.

3. Увлажнение.

4. Гранулирование.

5. Обработка скользящим веществом.

6. Высушивание.

7. Обработка гранул смазывающим веществом.

8. Таблетирование.

9. Сортировка таблеток.

10. Упаковка и хранение.

11. Контроль серии.

3.3.2. Пробиотик Лаксубтил в форме суспензии

3.3.2.1. Состав

Действующим веществом пробиотика Лаксубтил на основе штаммов BS TJ 09 и BS TJ Д 26 в форме суспензии являются субстанции в форме порошков, содержащих бактериальную массу, минеральные и растительные вещества, в количестве, указанном в таблице 6.

Таблица 6

Состав пробиотика Лаксубтил в форме суспензии, %

Компонент

Кол-во

Порошок, содержащий бактериальную массу

BS TJ Д 24 (30 млрд м.к./г)

0,0005

Порошок, содержащий бактериальную массу

BS TJ Д 24 (30 млрд м.к./г)

0,0005

Сахароза

5,0

Коровье молоко

94,999

3.3.2.2. Технологическая схема

Основные технологические стадии изготовления Лаксубтила в форме суспензии:

1. Взвешивание компонентов.

2. Пастеризация и охлаждение молока до 40оС.

3. Смешивание компонентов до образования суспензии.

4. Инкубация бактериальной суспензии при температуре 25 – 30оС в течение 24 ч.

5. Упаковка и хранение.

6. Контроль серии.

3.3.3. Антагонистические свойства Лаксубтила

В отношении исследованных тест-культур установлены высокая бактериостатическая и бактерицидная активность пробиотика Лаксубтил в форме суспензии, МБсК которого в отношении E. coli, S. dublin составляла 75 и Pr. vulgaris – 150 мкл/мл; МБцК – соответственно 150 и 300 мкл/мл (табл. 7).

Таблица 7

Антагонистические свойства

пробиотика Лаксубтил в форме порошка, мкл/мл

E. coli

S. dublin

Pr. vulgaris

МБсК

75

75

150

МБцК

150

150

300

Таким образом, установлена высокая антагонистическую активность Лаксубтила в форме суспензии, обусловленная выделением B. subtilis биологически активных веществ, в отношении музейных штаммов и изолятов E. coli, S. dublin и Pr. vulgaris.

3.3.4. Токсикологические свойства Лаксубтила

3.3.4.1. Безвредность

Безвредность Лаксубтила определяли с использованием сухой культуры инфузории Colpoda steinii, на которую согласно требованиям ГОСТа Р 52337-2005 воздействовали исследовавшимся препаратом, оценивая результаты биотеста по гибели стилохоний.

Установлено, что через 3 ч воздействия Лаксубтилом активность стилохоний опытного ряда составила 89%, а в контроле – 90%.

В соответствии с требованиями ГОСТа Р 52337-2005 пробиотик Лаксубтил относится к нетоксичным препаратам микробиологического синтеза, под действием которых за установленное время остаются активными свыше 80% стилохоний.

3.3.4.2. Острая токсичность

Опыты проводили на 40 белых мышах двухмесячного возраста (массой 18 – 21 г). Перед началом исследований лабораторных животных содержали в обычных условиях и наблюдали в течение 14 дней. Последний раз корм давали накануне опыта вечером, прием воды не ограничивали. Из белых мышей по принципу парных аналогов сформировали 5 групп (n=8): 4 опытные и 1 контрольная.

Исходя из результатов предыдущего опыта о нетоксичности препарата Лаксубтил на культуре инфузории Colpoda steinii, в этой серии наблюдений мышам опытных групп пробиотик вводили перорально однократно в дозах 0,1 мл (1-я группа), 0,2 мл (2-я группа), 0,3 мл (3-я группа) и 0,5 мл (4-я группа), что в пересчете на 1 кг массы тела составляло соответственно 5 мл; 10 мл; 15 мл и 25 мл. Контрольным животным (5-я группа) в таком же объеме вводили физиологический раствор.

Через 6 ч после введения препарата белым мышам всех групп давали корм и переводили их на обычный режим кормления. За лабораторными животными наблюдали в течение 15 сут, учитывая общее состояние, внешний вид, поведенческие реакции, прием пищи и воды, ритм и частоту сердцебиения, количество дыхательных движений.

При определении острой токсичности пробиотика за клиническим состоянием белых мышей наблюдали в течение первых шести часов, потом через каждые 3 ч в течение первых суток опыта, учитывая начало и динамику развития клинических проявлений отравления, время гибели опытных животных или симптомы улучшения их физиологического состояния. В последующие 14 дней опыта ежесуточно три раза отмечали клиническое состояние лабораторных животных. За все время наблюдения не было ни одного случая гибели белых мышей кроме кратковременного снижения двигательной активности в первые 3 – 4 ч наблюдений. В дальнейшем клиническое состояние опытных и контрольных лабораторных животных не отличалось.

Таким образом, опыты на белых мышах свидетельствуют о том, что пробиотик Лаксубтил при энтеральном введении в максимальной дозе (25000 мг/кг) не вызывает гибели экспериментальных животных. Следовательно, препарат в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76 относится к VI классу токсичности, то есть к нетоксичным веществам.

3.3.4.3. Хроническая токсичность

Хроническую токсичность Лаксубтила изучали в опытах по скармливанию препарата 1 раз в день в течение 30 сут трем группам (n=10) кроликов породы шиншилла (n=60, масса – 2,5 – 2,7 кг) в 1-, 2- и 3-кратной ориентировочно-терапевтической дозе (5 мл/кг массы тела). Животные контрольной группы (n=10) препарат не получали. За лабораторными животными наблюдали во время всего опыта, по окончании которого их усыпляли и проводили патологоанатомическое вскрытие.

Раздражающее действие пробиотика Лаксубтил на кожу кроликов изучали на 6 кроликах, которым ежедневно делали аппликации на выстриженных участках кожи нативного препарата в дозе 0,1 см3 в течение 26 сут, учитывая реакцию кожи (гиперемия, болезненность, утолщение кожной складки, расчесы) и клиническое состояние организма лабораторных животных.

Раздражающее действие Лаксубтила на слизистую оболочку глаза определяли на двух группах (n=6) самок кроликов, первым (опытная группа) из которых в конъюнктивальный мешок однократно закапывали 10%-ную суспензию Лаксубтила в объеме 0,1 см3, вторым (контроль) – инстилировали воду в том же объеме. Влияние препарата оценивали по проявлению гиперемии, инъекции сосудов склеры, слезотечению.

Аллергенные свойства Лаксубтила определяли на 12 кроликах, из которых сформировали 2 группы (n=6). Опытным животным на выстриженные участки кожи наносили ежедневно в течение 14 дней по 0,1 см3 10%-ной суспензии препарата, контрольным – физраствора. После 14-дневного перерыва однократной аппликацией в том же объеме наносили разрешающую дозу соответственно Лаксубтила и физраствор, учитывая реакцию кожи и общее состояние животных.

При изучении хронической токсичности препарата установлено, что его длительное введение в дозах 5, 10 и 15 мл/кг массы тела не влияет на поведение, аппетит, прием воды, состояние слизистых оболочек и шерстного покрова опытных и контрольных лабораторных животных. При применении Лаксубтила в этих дозах не наблюдали повышения температуры тела, характер локомоторной активности, стереотипное поведение и выносливость кроликов не изменялись.

Лабораторные животные в течение всего опыта оставались живы, охотно принимали корм, были подвижными и не имели отклонений как в клиническом состоянии, так и во внутренних паренхиматозных органах. При исследовании сердца, печени и селезенки у опытных животных нарушений в размере и структуре органов не отмечали. Они были однородного цвета, без кровоизлияний и дистрофических изменений.

Таким образом, пробиотик Лаксубтил не обладает хронической токсичностью при оральном введении лабораторным животным. При изучении раздражающего свойства препарата методами аппликации на кожу и инсталляции на слизистую оболочку глаз установлено, что кожа кроликов на месте нанесения препарата оставалась гладкой, эластичной, неутолщенной, безболезненной и без признаков гиперемии, не наблюдали гиперемии слизистой (оболочки) глаз, инъекции сосудов склеры, слезотечения. Отрицательная реакция кожи и организма кроликов на нанесение разрешающей дозы Лаксубтила свидетельствует об отсутствии сенсибилизации организма.

3.3.5. Доклиническое исследование

Переносимость препарата Лаксубтил исследовали общепринятыми методами на МТФ им. Л. Муродова Гиссарского района. По принципу аналогов сформированы 4 группы (n=11; опытные – 1 – 3-я, контрольная – 4-я) новорожденных телят черно-пестрой породы массой 31 – 33 кг. В опытных группах Лаксубтил применяли из расчета 5, 10, 15 мл/кг массы тела (условно-терапевтическая, двух- и трехкратная дозы от условно-терапевтической) в течение 20 сут.

За телятами наблюдали во время опыта и в течение 14 дней после него, учитывая общее состояние, внешний вид, поведенческие реакции, прием пищи и воды, ритм и частоту сердцебиения, количество дыхательных движений.

Перед проведением опыта, а также в 1-ый, на 3-ий, 5-ый, 10-ый, 15-ый и 20-ый день применения Лаксубтила проводили биохимические исследования крови.

В течение всего экспериментального периода ни одна из применяемых доз Лаксубтила не оказала отрицательного действия на организм телят, которые были активны и не отставали в развитии и приросте живой массы от контрольных животных.

Ни в опытных, ни в контрольной группах гибели животных не наблюдали. Среднесуточный прирост телят в опытных группах превышал контрольные показатели на 2,5 (1-я группа) и 3,6% (2- и 3-я группы), что свидетельствует о безвредности Лаксубтила, применение которого не оказывает отрицательного влияния на организм телят.

Использование Лаксубтила в указанных дозах не вызывало повышения температуры тела и не влияло на характер локомоторной активности, стереотипное поведение и выносливость животных.

Проведенные нами исследования показали, что пробиотик Лаксубтил позитивно влияет на количество лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина и уровень гематокрита.

Гематологические показатели крови телят как опытной, так и контрольной групп находились в пределах нормы. Повышение количества гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов, уровня гематокрита в крови телят опытных групп в пределах верхних границ физиологической нормы свидетельствует, что препарат стимулирует эритропоэз и лейкопоэз, не изменяя стабильности кроветворения и постоянства в составе и общем количестве периферической крови.

Пробиотик Лаксубтил не оказывает существенного влияния на биохимические показатели крови телят. При воздействии препарата на организм животных все изучавшиеся показатели не претерпевали существенных изменений и существенно не отличались от контрольных, что свидетельствует об отсутствии у Лаксубтила токсического действия на организм животных.

3.3.6. Стандартизация и контроль качества

пробиотиков на основе штаммов B. subtilis

3.3.6.1. Субтилбен в форме гранул и таблеток

Качество Субтилбена характеризуется следующими физико-химическими и биологическими показателями:

1. Внешний вид и цвет – гранулы (таблетки) серовато-белого цвета.

2. Размер гранул – 0,2 – 0,3 мм.

3. Диаметр таблеток – 16,0±0,5 мм.

4. Масса таблеток – 1,8±0,1 г.

5. Время распадаемости таблеток – 30 мин.

6. Концентрация водородных ионов (рН) 10% водной суспензии – 5,0 – 6,0.

7. Массовая доля влаги – 3,0 – 6,0.

8. Стерильность – посторонняя микрофлора отсутствует.

9. Количество микробных клеток B. subtilis – 27 (гранулы), 24 (таблетки) млрд/г.

10. Количество жизнеспособных клеток B. subtilis – 75 – 80%.

11. Контаминация бактериальной и грибной микрофлорой – отсутствует.

12. Контаминация микоплазмами – отсутствует.

13. Антагонистические свойства (МБцК в отношении E. coli) – 0,3 – 1,2 мг/мл.

14. Токсичность в дозе 3,0 г/кг массы тела – нетоксичен.

3.3.6.2. Лаксубтил в форме суспензии

Качество препарата характеризуется следующими физико-химическими и биологическими показателями:

1. Внешний вид и цвет – суспензия желтовато-белого цвета.

2. Наличие механических примесей, плесени – нет.

3. Концентрация водородных ионов (рН) – 4,5 – 5,0.

4. Стерильность – посторонняя микрофлора отсутствует.

6. Количество микробных клеток B. subtilis – 500 млн/мл.

7. Количество жизнеспособных клеток B. subtilis – 85 – 90%.

8. Контаминация бактериальной и грибной микрофлорой – отсутствует.

9. Контаминация микоплазмами – отсутствует.

10. Антагонистические свойства (МБцК в отношении E. coli) – 150 мкл/мл.

11. Токсичность в дозе 25 мл/кг – нетоксичен.

3.3.7. Стабильность

3.3.7.1. Субтилбен в форме гранул и таблеток

Физико-химические и биологические свойства препарата при естественном хранении оставались стабильными в течение 2 лет. При определении количественных показателей достоверных расхождений в полученных результатах не отмечали (p0,05).

На основании проведенных исследований установлен срок хранения Субтилбена по списку Б, в сухом, хорошо проветриваемом, защищенном от света и атмосферных осадков месте, при температуре не выше 30оС – 2 года.

3.3.7.2. Лаксубтил в форме суспензии

Стабильность Лаксубтила изучили при естественном хранении (+18 – +20оС) и в условиях холодильника (+2 – +4оС) в течение 1, 5, 10 и 15 дней.

При естественном хранении физико-химические и биологические свойства Лаксубтила оставались стабильными в течение 2 сут, а при хранении в условиях холодильника – 10 дней.

На основании полученных данных установлен срок хранения препарата – 10 дней. Лаксубтил хранят по списку Б, в сухом, хорошо проветриваемом, защищенном от света и атмосферных осадков месте, при температуре не выше 4оС.

3.3.8. Влияние пробиотиков на основе штаммов B. subtilis на качество мяса

Ветеринарно-санитарная экспертиза и бактериологические исследования свидетельствуют о доброкачественности мяса, полученного после убоя кроликов, обработанных Субтилбеном и Лаксубтилом.

Мясо кроликов после 5-кратной дачи препаратов один раз в сутки не отличалось по качеству от мяса контрольных (интактных) животных, на разрезе мышечная ткань красноватого цвета, поверхность разреза влажная, эластичная, плотная; бульон прозрачный без посторонних запахов.

При бактериологическом исследовании проб мяса и внутренних органов не обнаружено их обсемененности микроорганизмами из групп токсикоинфекций. Мазки-отпечатки из проб мяса контрольных и опытных животных окрашивались плохо.

В препаратах из поверхностных слоев обнаруживались отдельные колонии (по 1 – 3 в поле зрения микроскопа) кокковой микрофлоры. Микрофлора не выделялась в препаратах из глубоких слоев мышц.

3.4. Применение пробиотиков на основе B. subtilis

при лечении и профилактике инфекционных энтеритов телят

3.4.1. Терапевтическая эффективность

3.4.1.1. Экспериментральное определение лечебной эффективности

пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил

Терапевтическую эффективность пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии экспериментально изучили (в сравнении с биоспорином, который применяли в соответствии с наставлением по применению) на телятах в возрасте 1 – 6 сут с клиникой инфекционной диареи, у которых до применения препаратов отмечали угнетение общего состояния, анорексию, учащение пульса и увеличение интенсивности дыхания. На внешние раздражители животные реагировали слабо, были малоподвижными, больше лежали. В первые сутки заболевания наблюдали выделение жидких каловых масс с примесью хлопьев казеина, на 2 – 3 сут – профузный понос с примесью крови и пузырьков газа. При бактериологическом исследовании выделены моно- и ассоциированные патогенные возбудители – E. coli, S. dublin и Pr. vulgaris.

За животными вели клиническое наблюдение, учитывая длительность болезни, выздоровление, сохранность поголовья, прирост массы тела.

Для определения оптимальных лечебных доз пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии 4 группам (n=20) телят (для каждой лекарственной формы препаратов) с клиникой диареи внутрь с молоком вводили Субтилбен в дозах 0,2; 0,3; 0,4 и 0,5 г/кг массы тела и Лаксубтил – 3,0; 5,0; 10,0 и 15,0 мл/кг массы тела 2 раза в сут до выздоровления.

Экспериментально установлено, что лечебная эффективность пробиотика Субтилбен в форме гранул (табл. 8) и таблеток (табл. 9) в дозе 0,2 г/кг массы тела составляет соответственно 85,0 и 90,0%. Наиболее эффективным (100,0%) препарат был в дозах 0,3; 0,4 и 0,5 г/кг массы тела. Препарат сравнения Биоспорин был эффективен в 75,0 и 90,0% случаев.

Функции органов пищеварения при применении Субтилбена в форме гранул у телят 1-ой опытной группы нормализовались на 5,0 сут, 2 – 4-ой – на 4,0 сут, контрольной – 6,2 дня. Субтилбен в форме таблеток нормализовал работу ЖКТ телят 1-ой группы через 5,5 дня, 2-ой – 4,2 дня, 3-ей и 4-ой – 4 сут. В контрольной группе соответствующий показатель составил 6,2 дня.

Более высокий лечебный эффект отмечен в группе телят, получавших Лаксубтил, применение которого способствовало улучшению общего состояния животных, повышению аппетита, нормализации температуры тела.

Терапевтическая эффективность Лаксубтила в дозе 3,0 мл/кг массы тела – 95,0%, а в дозах 5,0; 10,0 и 15,0 мл/кг массы тела – 100%. В контроле (Биоспорин) соответствующий показатель – 85%. Продолжительность лечения Лаксубтилом в дозе 3,0 г/кг массы тела составила 6,0, в дозах 5,0; 10,0 и 15,0 мл/кг массы тела – 4,0, в контрольной группе (биоспорин) – 6,2 дня (табл. 10).

Таблица 8

Результаты изучения в эксперименте терапевтической эффективности

Субтилбена в форме гранул (хозяйство им. Л. Муродова, 2008 г.)

Показатель

Группа

Контроль (Биоспорин)

1

2

3

4

Доза, г/кг массы тела

0,2

0,3

0,4

0,5

Кол-во больных телят, гол.

20

20

20

20

20

Выздоровело, гол.

17

20

20

20

15

Пало, гол.

3

5

Кол-во телят с повторными заболеваниями, гол.

2

3

Продолжительность терапии, сут

5,0

4,0

4,0

4,0

6,2

Среднесуточный прирост, г

130

142

146

150

120

Терапевтическая эффективность, %

85

100

100

100

75

Таблица 9

Результаты экспериментального изучения лечебной эффективности

Субтилбена в форме таблеток (хозяйство им. Л. Муродова, 2009 г.)

Показатель

Группа

Контроль (Биоспорин)

1

2

3

4

Доза, г/кг массы тела

0,2

0,3

0,4

0,5

Кол-во больных телят, гол.

20

20

20

20

20

Выздоровело, гол.

18

20

20

20

18

Пало, гол.

2

2

Кол-во телят с повторными заболеваниями, гол.

1

3

Продолжительность терапии, сут

5,5

4,2

4,0

4,0

6,2

Среднесуточный прирост, г

125

130

130

135

120

Терапевтическая эффективность, %

90

100

100

100

90

Таблица 10

Результаты изучения в эксперименте терапевтической эффективности

Лаксубтила в форме суспензии (МТФ им. К. Маркса, 2010 г.)

Показатель

Группа

Контроль (Биоспорин)

1

2

3

4

Доза, мл/кг массы тела

3,0

5,0

10,0

15,0

Кол-во больных телят, гол.

20

20

20

20

20

Выздоровело, гол.

19

20

20

20

17

Пало, гол.

1

3

Кол-во телят с повторными заболеваниями, гол.

2

3

Продолжительность терапии, сут

5,0

4,0

4,0

4,0

6,2

Среднесуточный прирост, г

135

150

150

160

125

Терапевтическая эффективность, %

95

100

100

100

85

Прирост живой массы животных в опытных группах при применении Субтилбена в форме гранул и таблеток и Лаксубтила в форме суспензии был соответственно на 8,3 – 25,0%; 4,0 – 8,3 и 8,0 – 28,0% выше, чем в контрольной (соответственно по 120 и 125 г).

Таким образом, результаты эксперимертального изучения терапевтической эффективности свидетельствуют о целесообразности применения пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток в дозе 0,3 г/кг массы тела и Лаксубтил в форме суспензии в дозе 5,0 мл/кг массы тела в производственных условиях для лечения инфекционных энтеритов телят.

3.4.1.2. Производственные испытания Субтилбена и Лаксубтила

Производственную проверку пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии провели в 11 хозяйствах РТ на соответственно 542, 527 и 240 больных диареей телятах, которым препараты выпаивали с молозивом (молоком) в дозах 0,3 г/кг массы тела (Субтилбен в форме гранул и таблеток) и 5,0 мл/кг массы тела (Лаксубтил в форме суспензии) 2 раза в сут до выздоровления.

За подопытными животными вели клиническое наблюдение: учитывали длительность болезни, выздоровление, сохранность поголовья, прирост массы тела.

Применение пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил способствовало улучшению общего состояния животных, повышению аппетита, нормализации температуры тела. Более высокий терапевтический эффект отмечен в группах телят, получавших разработанные нами пробиотики (Субтилбен в форме гранул – 90,0 – 94,8%, Субтилбен в форме таблеток – 91,3 – 93,0%, Лаксубтил в форме суспензии – 90,9 – 92,9). Биоспорин был эффективен в 80,0 – 83,3% случаев.

Таким образом, результаты производсвенных испытаний свидетельствуют о высокой лечебной эффективности пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил при инфекционных энтеритах телят. Пероральное применение этих препаратов в комплексе с ветеринарно-санитарными мероприятиями обеспечивает сохранность 90,0 – 94,8% больных животных.

3.4.2. Профилактическая эффективность

3.4.2.1. Определение профилактической эффективности

пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил в эксперименте

В экспериментальных условиях профилактическую эффективность пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии исследована в сравнении с препаратом-аналогом (Биоспорин) на 2 молочно-товарных фермах, стационарно неблагополучных по инфекционным энтеритам телят.

Субтилбен в дозах 0,2 (1-я группа, n=20), 0,3 (2-я группа, n=20), 0,4 (3-я группа, n=20), 0,5 г/кг массы тела (4-я группа, n=20) и Лаксубтил 3,0 (1-я группа, n=20), 5,0 (2-я группа, n=20), 10,0 (3-я группа, n=20) и 15,0 г/кг массы тела (4-я группа, n=20) в течение 10 дней 1 раз в сут телятам выпаивали с молозивом (молоком); Биоспорин (5-я группа, n=20) использовали в соответствии с наставлением по применению.

В течение месяца за животными вели клиническое наблюдение, учитывая общее состояние, заболеваемость и сохранность.

Результаты клинических наблюдений свидетельствуют о высокой профилактической эффективности Субтилбена в форме гранул (табл. 11) и таблеток (табл. 12) и Лаксубтила в форме суспензии (табл. 13), выразившейся в предотвращении инфекционных энтеритов телят в оптимальных терапевтических дозах (0,3 г/кг и 5,0 мл/кг массы тела), сохранности и хорошем общем состоянии соответственно 100, 95 и 100% телят, увеличении пророста массы тела. Биоспорин предотвращал заболеваемость телят инфекционными энтеритами в 70 – 80% случаев.

Таблица 11

Результаты изучения в эксперименте

профилактической эффективности Субтилбена в форме гранул

(хозяйство им. Л. Муродова, 2008 г.)

Показатель

Группа

Контроль (Биоспорин)

1

2

3

4

Доза, г/кг массы тела

0,2

0,3

0,4

0,5

Кол-во больных телят, гол.

20

20

20

20

20

Заболело, гол.

3

5

Пало, гол.

3

5

Стоимость 1 дозы препарата, сомони

0,26

0,39

0,52

0,65

0,80

Затраты на профилактику, сомони

52

78

104

130

160

Терапевтическая эффективность, %

85

100

100

100

75

Таблица 12

Результаты экспериментального изучения

профилактической эффективности Субтилбена в форме таблеток

(хозяйство им. Л. Муродова, 2009 г.)

Показатель

Группа

Контроль (Биоспорин)

1

2

3

4

Доза, г/кг массы тела

0,2

0,3

0,4

0,5

Кол-во больных телят, гол.

20

20

20

20

20

Заболело, гол.

3

1

1

1

4

Пало, гол.

1

2

Стоимость 1 дозы препарата, сомони

0,28

0,42

0,56

0,70

0,80

Затраты на профилактику, сомони

56

84

112

140

160

Терапевтическая эффективность, %

85

95

95

95

80

Таблица 13

Результаты изучения в эксперименте

профилактической эффективности Лаксубтила в форме суспензии

(МТФ им. К. Маркса, 2010 г.)

Показатель

Группа

Контроль (биоспорин)

1

2

3

4

Доза, г/кг массы тела

0,2

0,3

0,4

0,5

Кол-во больных телят, гол.

20

20

20

20

20

Заболело, гол.

2

6

Пало, гол.

1

3

Стоимость 1 дозы препарата, сомони

0,16

0,24

0,32

0,40

0,80

Затраты на профилактику, сомони

32

48

64

80

160

Терапевтическая эффективность, %

90

100

100

100

70

Таким образом, профилактическая эффективность пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии превышает соответствующий показатель у препарата-аналога (Биоспорин), использующегося в хозяйствах Таджикистана, на 20 – 30%.

3.4.2.2. Производственная проверка профилактической эффективности

пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил

При производственном испытании Субтилбена в форме гранул и таблеток и Лаксубтила в форме суспензии на 175 телятах в 5 хозяйствах РРП и Согдийской области в 2009 – 2011 гг. профилактическая эффективность препаратов соответственно составила 95,0; 91,4 и 97,0% (табл 14 – 16). Профилактические мероприятия, проводившиеся по схемам, принятым в хозяйствах с применением пробиотика Биоспорин, предотвращали инфекционные энтериты телят (161 гол.) в 77,1 – 88,4%.

Таблица 14

Профилактическая эффективность Субтилбена в форме гранул

в производственных условиях

Кооператив «Навруз» (Шахринавский р-н, 2010 г.)

Показатель

Группа

опытная

контроль

(Биоспорин)

Количество телят, гол.

40

40

Заболело, гол.

2 (5,0)

5 (12,5)

Пало, гол.

0

2 (5,0)

Стоимость 1 дозы препарата, сомони

0,39

0,80

Затраты на профилактику, сомони

156,0

320,0

Профилактическая эффективность, %

95,0

87,5

Примечание. В скобках указано процентное значение.

Таблица 15

Производственные испытания профилактической эффективности Субтилбена в форме таблеток

Учебно-производственное хозяйство ТАУ

(Гиссарский р-н, 2009 г.)

Показатель

Группа

опытная

контроль

(Биоспорин)

Количество телят, гол.

35

35

Заболело, гол.

3 (8,6)

8 (22,9)

Пало, гол.

0

3 (8,6)

Стоимость 1 дозы препарата, сомони

0,42

0,80

Затраты на профилактику, сомони

147,0

280,0

Профилактическая эффективность, %

91,4

77,1

Примечание. В скобках указано процентное значение.

Таблица 16

Профилактическая эффективность

Лаксубтила в форме суспензии в производственных условиях

МТФ им. Л. Муродова (Гиссарский р-н, 2010 г.), МТФ «Рохи Ленин» (Согдийская обл., Исфаринский р-н, 2010), Племзавод им. Дж. Расулова (Согдийская обл., Бободжон-Гафуровский р-н, 2011 г.)

Показатель

Группа

опытная

контроль

(Биоспорин)

Количество телят, гол.

100

86

Заболело, гол.

3 (3,0)

10 (11,6)

Пало, гол.

0

1 (1,2)

Стоимость 1 дозы препарата, сомони

0,24

0,80

Затраты на профилактику, сомони

240,0

688,0

Профилактическая эффективность, %

97,0

88,4

Примечание. В скобках указано процентное значение.

Таким образом, профилактическая эффективность пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии в производственных условиях выше соответствующих показателей применяемого в хозяйствах Таджикистана пробиотического препарата Биоспорин, что обусловливает введение разработанных нами пробиотиков в комплекс ветеринарно-санитарных мероприятий.

3.4.3. Экономическая эффективность пробиотиков Субтилбен

и Лаксубтил при инфекционных энтеритах телят

При оценке эффективности лечебно-профилактических мероприятий учитывали экономический ущерб, затраты на проведение ветеринарных мероприятий, коэффициенты заболеваемости и смертности животных при отдельных болезнях, суммарный экономический эффект, экономическую эффективность ветеринарных мероприятий на единицу затрат и суммарный индекс. Увеличение показателя суммарного индекса свидетельствует о снижении экономической эффективности анализируемых способов терапии больных животных.

Расчет и анализ экономической эффективности применения Субтилбена в форме гранул и таблеток и Лаксубтила в форме суспензии проведен в хозяйствах благополучных, скомпрометированных и неблагополучных по инфекционным энтеритам телят.

Субтилбен и Лаксубтил превосходят препарат-аналог Биоспорин по затратам на лечение, предотвращенному экономическому ущербу и экономическому эффекту в сомони, полученному в результате терапии.

В расчете на 1 сомони затрат экономическая эффективность Субтилбена в форме гранул и таблеток и Лаксубтила в форме суспензии при лечении инфекционных энтеритов телят составила соответственно 4,5 и 5,2 сомони, что больше соответственно в 3 и 4 раза, чем соответствующий показатель у Биоспорина.

При терапии инфекционных энтеритов телят Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лакскбтил в форме суспензии по суммарному индексу соответственно в 3 и 4 раза эффективнее известного препарата Биоспорин.

Таким образом, Субтилбен и Лаксубтил обладают высокой экономической эффективностью при лечении инфекционных энтеритов телят.

ВЫВОДЫ

1. Инфекционные энтериты молодняка КРС вызываются бактериальной флорой (E. coli, S. dublin и Pr. vulgaris), которая циркулирует в хозяйствах Северного, Центрального и Южного Таджикистана и северо-восточного региона Украины и выделяется от коров больных эндометритами и маститами.

2. Морфологические, культуральные, ферментативные свойства, отсутствие патогенности, высокая антагонистическая активность и физиолого-биологические свойства штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 обусловливают их использование при изготовлении пробиотиков.

3. Эффективной питательной средой для выращивания B. subtilis является состоящая из 0,25% пептона, 0,25% картофельного крахмала, 0,125% глюкозы, 0,01% хлорида натрия и 10% бентонита.

4. Модифицированый контактно-сорбционный метод обезвоживания биомассы, содержащей бактериальную суспензию штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 и бентанито-пектиновую смесь может быть использован в производственной технологии пробиотиков на основе штаммов B. subtilis.

5. Действующие вещества в форме порошков на основе штаммов B. subtilis (BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26) проявляют высокую бактериостатическую (0,3 – 0,6 мг/мл) и бактерицидную активность (0,6 – 1,2 мг/мл) в отношении исследованных тест-культур (E. coli, S. dublin и Pr. vulgaris).

6. Действующие вещества в форме порошков на основе штаммов B. subtilis (BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26) в соответствии с требованиями ГОСТа Р 52337-2005 относятся к нетоксичным препаратам микробиологического синтеза, не оказывают отрицательного влияния на поведение, аппетит, прием воды, состояние слизистых оболочек и шерстного покрова лабораторных животных не отличается от контрольных, не влияют на динамику массы тела, не вызывают повышения температуры тела и не изменяют характер локомоторной активности, стереотипное поведение и выносливость животных, не оказывают раздражающее действие на кожу и слизистые оболочки глаз.

7. Пробиотик Лаксубтил в форме суспензии в отношении исследованных тест-культур (E. coli, S. dublin и Pr. vulgaris) проявляют высокую бактериостатическую (75 – 150 мкл/мл) и бактерицидную активность(150 – 300 мкл/мл).

8. Пробиотик Лаксубтил в соответствии с требованиями ГОСТа Р 52337-2005 относится к нетоксичным препаратам микробиологического синтеза, при энтеральном введении в максимальной дозе (25000 мг/кг) не вызывает гибели экспериментальных животных (в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76 относится к VI классу токсичности, то есть к нетоксичным веществам).

9. Пробиотик Лаксубтил в форме суспензии не обладает хронической токсичностью при оральном введении лабораторным животным. При изучении раздражающего свойства препарата установлено, что кожа кроликов на месте нанесения препарата оставалась гладкой, эластичной, неутолщенной, безболезненной и без признаков гиперемии, не наблюдали гиперемии слизистой глаз, инъекции сосудов склеры, слезотечения.

10. Пробиотик Лаксубтил позитивно влияет на количество лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина и уровень гематокрита. Гематологические показатели крови телят как опытной, так и контрольной групп находились в пределах нормы. Препарат не оказывает существенного влияния на биохимические показатели крови молодняка КРС.

11. При инфекционных энтеритах телят оптимальная терапевтическая доза пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток – 0,3, Лаксубтил в форме суспензии – 5,0 мл/кг массы тела.

12. Пероральное применение этих пробиотиков в комплексе с ветеринарно-санитарными мероприятиями обеспечивает сохранность 90,0 – 94,8% больных телят.

13. Профилактическая эффективность пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии превышает соответствующий показатель у препарата-аналога (Биоспорин), использующегося в хозяйствах Таджикистана, на 20 – 30%.

14. Пробиотики Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии целесообразно ввести в комплекс ветеринарно-санитарных мероприятий при инфекционных энтеритах молодняка КРС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Инструкция по изготовлению и контролю ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и пастереллеза сельскохозяйственных животных (утв. ГУВ МСХ РТ, 1999 г.).

2. Технические условия на ассоциированную вакцину против сальмонеллеза и пастереллеза сельскохозяйственных животных (утв. ГУВ МСХ РТ, 1999 г.).

3. Наставление по применению ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и пастереллеза сельскохозяйственных животных (утв. ГУВ МСХ РТ, 1999 г.).

4. Инструкцию по изготовлению и контролю иммунобиотика Субтилбен для профилактики и лечения желудочно-кишечных и респираторных болезней животных и пчел (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.).

5. Технические условия на иммунобиотик Субтилбен (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.).

6. Наставление по применению иммунобиотика Субтилбен для профилактики и лечения желудочно-кишечных и респираторных болезней животных и пчел (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.).

7. Инструкция по изготовлению и контролю препарата «Шодмон» (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.).

8. Технические условия на препарат «Шодмон» (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.).

9. Наставление по применению препарата «Шодмон» для профилактики и лечения бактериозов животных и птиц (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.).

10. Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации колибактериоза новорожденных животных (утв. СГВН МСХ РТ, 2009 г.).

11. Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации ротавирусной инфекции телят (утв. СГВН МСХ РТ, 2009 г.).

12. Инструкция о мероприятиях по борьбе с сальмонеллезом новорожденных животных (утв. СГВН МСХ РТ, 2009 г.).

13. Решение 26-го заседания Межправительственного совета по сотрудничеству в области ветеринарии СНГ от 24.11.2004 г. (Душанбе) о практическом использования препарата Субтилбен в ветеринарной практике СНГ.

14. Научно-обоснованная система получения здорового молдняка и профилактики желудочно-кишечных болезней новорожденных телят: Рекомендации (утв. СГВН МСХ РТ, 11.09.2012 г.).

15. Рекомендация по профилактике и лечению пневмоэнтеритов телят (утв. СГВН МСХ РТ, 11.09.2012 г.).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Физико-химические и биологические особенности координационного соединения дибаферол / И.Т. Сатторов, Н.Р. Сатторов, З.Н. Юсупов, У.Р. Раджабов, Ш.А. Турдиев // Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях: матер. Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 60-летию ТаджНИВИ – Душанбе, 2003. – С. 145 – 146.

2. Способ определения состава и получения противомикробных препаратов / И.Т. Сатторов, Сатторов Н.Р., З.Н. Юсупов, У. Раджабов, Ш.А. Турдиев // Мониторинг распространения и предотвращения особо опасных болезней животных: матер. II междунар. науч. конф. – Самарканд, 2004. – С. 200 – 201.

3. Сатторов Н.Р. Рациональный способ сушки иммунобиотика субтилбен на минеральных и раcтительных адсорбентах / Н.Р. Сатторов, Н.Р. Хасанов // Матер. науч.-производ. конф. молодых ученых, посвящ. 15-летию независимости РТ, 2700-летию г. Куляба, 75-летию ТАУ и 100-летию У. Рахматзода. – Душанбе 2006. – С. 40 – 41.

4. Сатторов Н.Р. Эффективность препарата «Шодмон» при лечении инфекционных энтеритов телят / Н.Р. Сатторов // Ветеринария. – Душанбе, 2006. – №2. – С. 37 – 38.

5. Хасанов Н.Р. Усули бо эътимоди пешгирии колибактериози гусолахои навзод / Н.Р. Хасанов, Н.Р. Сатторов // Матер. науч.-производ. конф. молодых ученых, посвящ. 15-летию независимости РТ, 2700-летию г. Куляба, 75-летию ТАУ и 100-летию У. Рахматзода. – Душанбе 2006. – С. 36 – 37.

6. Хасанов Н.Р.Усули самарабахши парвариши B.subtilis / Н.Р. Хасанов, Н.Р. Сатторов // Матер. науч.-производ. конф. молодых ученых, посвящ. 15-летию независимости РТ, 2700-летию г. Куляба, 75-летию ТАУ и 100-летию У. Рахматзода. – Душанбе 2006. – С. 37.

7. Хасанов Н.Р. Этиологияи беморихои омехтаи узвхои хозима ва нафаскашии гусолахо / Н.Р. Хасанов, Н.Р. Сатторов // Матер. науч.-производ. конф. молодых ученых, посвящ. 15-летию независимости РТ, 2700-летию г. Куляба, 75-летию ТАУ и 100-летию У. Рахматзода. – Душанбе 2006. – С. 38 – 39.

8. Истифодаи штамхои мухталифи Bacillus subtilis барои тайёр намудани пробиотики субтилбен / И.Т. Саттори, Н.Р. Сатторов, Н.Р. Хасанов, А. Сафаралиев // Кишоварз. – 2008. – №1. – С. 12 – 13.

9. Комплексные антибактериальные препараты и их эффективность при болезнях животных / И. Саттори, Ш.А. Турдиев, Н.Р. Хасанов, Н.Р. Сатторов, Н.Ф. Шеров // Доклады ТАСХН. – №1 (19). – Душанбе, 2009. – С. 40 – 43.

10. Профилактическая эффективность пробиотика лаксубтил при желудочно-кишечных болезнях телят / И.Т. Саттори, Н.Р. Сатторов, М.М. Каримов // Биобезопасность и зоонозные инфекции: Матер. Междунар. конф. – Алматы, 2009 г. – С. 65.

11. Саттори И. Изучение противомикробных свойств пробиотика лаксубтил / И. Саттори, Н.Р. Сатторов, М.М. Каримов // Овцеводство, козоводство и шерстиное дело / Тимирязевская МСХА. – М., 2009. – №4. – С. 78 – 80.

12. Сатторов Н.Р. Распространение мастита и эндометрита КРС в животноводческих хозяйствах Республики Таджикистан / Н.Р. Сатторов, С.Т. Баротов // Кишоварз / ТАУ. – Душанбе, 2009. – №3. – С. 16 – 18.

13. Изменение морфологических и биохимических показателей крови коров в зависимости от применения оптимального способа и дозы пробиотика при лечении субклинического мастита / Н.Р. Сатторов, Н.Р. Хасанов, С.Т. Баротов // Кишоварз. – 2010. – №3. – С. 29 – 31.

14. Координационное соединение меди (II) с дибазолом, проявляющее противомикробную активность / Н.Р. Хасанов, И.Т. Саттори, Н.Р. Сатторов, З.Н. Юсупов, У.Р. Раджабов, Р.Б. Имомов // Вестн. Таджикского национального университета. – №3 (59). – Душанбе, 2010. – С. 200 – 204.

15. Применение пробиотикалаксубтил при пневмоэнтерите телят / Н.Р. Сатторов, Ш.А. Турдиев, М. Каримов // Тр. Сумского национального аграрного университета. – Сумы, 2010. – С. 33 – 34.

16. Эффективность лактовита при лечении мастита коров в сухостойном периоде / Н.Р. Сатторов, С.Т. Баротов // Чавононваилмимуосир. – Душанбе, 2010. – С. 358 – 361.

17. Сатторов Н.Р. Рациональный способ сушки культуры B. subtilis контактно-сорбционным методом / Н.Р. Сатторов // Вестн. Сумского национального аграрного университета. – Сумы, 2011. – №1 (28). – С. 66 – 68.

18. Синтез, идентификация и биологические свойства координационных соединений Fe (II) и Cu (II) с азолами / И. Саттори, Н.Р. Сатторов, З.Н. Юсупов, У. Раджабов // Естественные и технические науки. – М., 2011. – №3. – С. 52 – 56.

19. Sattori I. Application of useful microorganisms for correction of natural microflora / I. Sattori, N.R. Sattorov // Research and Clinical Application of Traditional Medicine in Xinjiang and Neighboring Countries in Past and Present: Матер. науч.-производ. конф. – Синцзян, 2011. – С. 30 – 34.

20. Sattorov N.R. Etiological role of bacterial agents in the occurrence of infectious pnevmoenteridies calves / N.R. Sattorov // Veterinary Problems of Central Asia – Food Security: The Use of Modern Ways of Diagnostics and Prevent of Infectious Diseases of Animals: матер. науч.-производ. конф., посвящ. 20-летию независимости РТ и 80-летию ТАУ им. Ш. Шотемура. – Душанбе, 2011. – С. 23 – 24.

21. Сатторов Н.Р. Доклиническое исследование пробиотика лаксубтил / Н.Р. Сатторов // Вестник Авицена, 2012 г. №4-С.45-46

22. Сатторов Н.Р. Изучение острой токсичности пробиотичекого препарата лаксубтил / Н.Р. Сатторов, Н.Р. Хасанов, М. Каримов // Кишоварз. – 2012. – №3. – С. 32 – 34.

23. Сатторов Н.Р. Изучение хронической токсичности препарата лаксубтил / Н.Р. Сатторов, Н.Р. Хасанов // Кишоварз. – 2012. – №3. – С. 36 – 38.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.