WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ХЛОПОВА НАТАЛИЯ СЕРГЕЕВНА

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОРГАНОСПЕЦИФИЧНЫХ ПРОФИЛЕЙ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ У СВИНЕЙ



Специальность 06.02.10 – Частная зоотехния, технология  производства продуктов животноводства

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва  2012

Работа выполнена на кафедре разведения и племенного дела ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А.Тимирязева»

Научный руководитель:

Глазко Татьяна Теодоровна, доктор

сельскохозяйственных наук, профессор

Официальные оппоненты:

Букаров Нурмагомед Гаджикулиевич, доктор биологических наук, профессор,

ОАО «Московское» по племенной работе,

начальник лаборатории иммуногенетической

экспертизы;


Киселев Андрей Леонидович,

доктор биологических наук, профессор

Московской государственной академии

ветеринарной медицины и биотехнологии 

имени К.И. Скрябина

Ведущая организация:

ФГБОУ Российская академия менеджмента в животноводстве

Защита диссертации состоится «21___» декабря 2012 года, в 11.00___ часов на заседании диссертационного совета Д 220.056.02 при ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный заочный университет» по адресу: 143900, Московская область, г. Балашиха, ул. Ю. Фучика, д.1, ауд. 114.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный заочный университет»

Автореферат разослан  «16____» ноября 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент               Т.В. Кракосевич

  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность темы исследования. Развитие животноводства требует ускорения селекционного процесса, что невозможно без увеличения надежности оценки генетического потенциала племенного поголовья. В этих целях разрабатываются методы применения молекулярно-генетических маркеров развития желательного фенотипа (количества и качества конечной продукции, устойчивости к условиям содержания, контроля наличия наследственных заболеваний и инфицированности патогенами) (Зиновьева Н.А. и др., 2010). ДНК микроматрицы (матрицы ДНК проб) позволяют осуществлять одновременное генотипирование многих геномных участков по мононуклеотидным полиморфизмам (Single Nucleotide Polymorphisms – SNP), оценивать активность транскрипции различных генов (профили генной экспрессии - ПГЭ). Включение генетических маркеров в селекционные программы увеличивает надежность селекционной работы при сохранении оптимального уровня генетического разнообразия, обеспечивает проведение отбора и подбора животных с учетом генотипической оценки (Дунин  И.М. и др., 1994; Калашникова Л.А. и др., 2001; Харченко П.Н., Глазко В.И., 2006; Эрнст Л.К., 2008). В свиноводстве с использованием ДНК микроматриц получено огромное количество данных о ткане- и органоспецифической экспрессии генов как у здоровых свиней (Lin C.S., Hsu C.W., 2005; Li M.Z. et al., 2008; Damon M. et al., 2012), так и при различных патологических состояниях  (Chomwisarutkun K. et al., 2011; Maak S. et al., 2009). Выявлены определенные ассоциации между SNP в структурных и регуляторных областях генов и желательным развитием хозяйственно-полезных признаков (Wyszynska-Koko J. et al., 2006; Guiatti В. et al., 2011). Однако низкая воспроизводимость таких данных ограничивает внедрение маркерной селекции в животноводство. Это может быть связано с рядом причин: сложностью систем регуляции генной экспрессии (Шихов И.Я., 2007; Cheon Y. et al., 2005), возможностью перекрестной гибридизации ДНК проб (Okoniewski M. J., Miller C. J., 2006), техническими и статистическими погрешностями обработки данных (Nguyen T.T. et al., 2010), изменчивостью вкладов генотипической и паратипической компонент в проявление признака в разных условиях окружающей среды. В этой связи особую актуальность приобретают исследования возможных причин неоднозначности выявленных ассоциаций между ПГЭ, SNP регуляторных областей предполагаемых «критических» генов и желательным проявлением хозяйственно-полезныхпризнаков.

Целью работы являлось повышение надежности прогнозирования развития основных хозяйственно-полезных признаков у свиней на основе использования современных методов молекулярно-генетического анализа.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Оценить и проанализировать профили генной экспрессии почек, печени, сердца и тимуса у свиней породы ландрас на основе использования метода гибридизации флуоресцентно-меченных ДНК;

2. Сопоставить результаты полученных оценок экспрессии структурных генов с пробами ДНК микроматриц, гомологичных к разным участкам кДНК;

3. Провести анализ индивидуальной изменчивости оценок экспрессии структурных генов и выявить факторы, её определяющие в группе свиней породы ландрас;

4. Оценить степени взаимосвязи показателей мясной продуктивности у свиней двух- и трехпородных помесей в различных половозрастных группах на основе ассоциаций мононуклеотидного полиморфизма регуляторных областей (промоторов) ключевых генов контроля липидного метаболизма (Lep, Scd) и миогенеза (Myf-6, Myod);

5. Оценить уровень изменчивости показателей мясной продуктивности и скорости роста помесных животных в зависимости от структуры комплексных генотипов по мононуклеотидным полиморфизмам в промоторах генов Lep, Scd, Myf-6, Myod, Opn.

Научная новизна исследований. Впервые выявлены факторы, влияющие на изменчивость оценок экспрессии генов в разных органах и тканях отдельных особей, и между разными животными. Выявлен фактор (перекрестная гибридизация), связанный с наличием гомологичных последовательностей как внутри отдельных структурных генов, так и между разными генами, что приводит к перекрестной гибридизации проб ДНК микроматриц с кДНК более чем одной мРНК. Показано, что индивидуальная изменчивость экспрессии разных генов тесно связана с функциональными особенностями кодируемых ими белков и количеством метаболических путей, в регуляции которых они участвуют. Впервые выявлены и описаны две, хорошо идентифицируемые, составляющие органоспецифичного ПГЭ, одна включает гены, экспрессия которых отличается у разных животных, обозначенная нами как «вариабельная» часть ПГЭ, и другая объединяет гены, оценки экспрессии которых не имели индивидуальной изменчивости, составляющие, по нашему определению, «конститутивную» часть ПГЭ. Впервые получены данные о том, что продукты генов  «вариабельной» части профиля участвуют в контроле в два раза большего количества метаболических путей и находятся в более сложных межгенных сетевых взаимоотношениях по сравнению с генами «конститутивной» части, что позволяет выделить в качестве ведущего фактора индивидуальной изменчивости их экспрессии средовую компоненту. На основании генотипирования SNP в регуляторных последовательностях (промоторах) ключевых генов липидного обмена и миогенеза обнаружено, что ассоциации между моногенными и комплексными генотипами с характеристиками сальности свиней и динамикой миогенеза зависят от пола, возраста исследуемых животных, а также от особенностей типа скрещивания (двух- и трехпородные помеси).

Практическая значимость работы. Обнаруженная в работе подразделенность ПГЭ на конститутивную и вариабельную части, обусловленная вовлеченностью генов в разное количество метаболических путей, позволяет планировать подбор генов для получения органоспецифичных ПГЭ в целях повышения надежности выявления генов, экспрессия которых вносит определяющий вклад в проявление хозяйственно-полезных характеристик свиней.

Впервые получены и проанализированы данные об ассоциациях между мононуклеотидными полиморфизмами промоторов генов кандидатов контроля липидного обмена и миогенеза, как отдельных, так и комплексных генотипов, и проявлением характеристик сальности и динамики миогенеза. Показано, что выявленные моногенные и комплексные генотипы могут быть непосредственно использованы для прогноза проявления хозяйственно-полезных характеристик с учетом ограничений надежности таких связей возрастом, полом и типом скрещивания свиней (двух- и трехпородные помеси).

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Воспроизводимость оценок ПГЭ зависит от наличия/отсутствия перекрестной гибридизации между пробами ДНК микроматриц и участками гомологии внутри- и между кДНК мРНК разных генов.

2) Подразделенность ПГЭ на конститутивную и вариабельную части обусловлена функциональными особенностями кодируемых белков и их участием в контроле разного количества метаболических путей.

3) Ассоциации между молекулярно-генетическими маркерами – мононуклеотидными полиморфизмами промоторов генов кандидатов контроля проявления мясной продуктивности у свиней приемлемы для прогноза развития признаков продуктивности с учетом ограничений надежности такого прогноза возрастом, полом и типом скрещивания животных (двух- и трехпородные помеси).

Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертации были представлены в виде докладов на VI Международном научном симпозиуме «Прикладные исследования для улучшения производства свинины и их влияние на развитие сельских территорий» (Быдгощ-Торунь, Польша, 2012); III Международном симпозиуме для аспирантов и студентов аграрный вузов (Быдгощ-Торунь, Польша, 2012), 25й Международной конференции «Генетические Дни» (Вроцлав, Польша, 2012); Международной конференции «Достижения в микрочиповых технологиях» \ AMT (Гамбург, Германия, 2011); 7й и 8й международных конференциях по биоинформатике регуляции генома и структурной/системной биологии / ВGRS\SB (Новосибирск, 2010; 2012); Международной московской конференции по вычислительной молекулярной биологии / МССМВ (Москва, 2009; 2011); XVI, XVII и XIX Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2009; 2010; 2012); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 145-летию академии имени К.А. Тимирязева (Москва, 2010); Международной конференции по бионаукам и биотехнологии / ICBB (Осло, Норвегия, 2009), 49й встрече американского общества по клеточной биологии / ASCB (Сан-Диего, США, 2009); Международной научно-технической конференции: нанотехнологии и наноматериалы (Москва, 2009); 62-й Международной студенческой научной конференции (Москва, 2009) Международной научно-практической конференции Нанотехнологии в сельском хозяйстве (Москва, 2008).

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 24 научных работы общим объемом 6,3 п.л. с личным вкладом автора (75%), включая 4 статьи в рецензируемых научных журналах, определенных ВАК Минобрнауки РФ и 1 статью в иностранном англоязычном издании.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах компьютерного текста, включает введение, три главы (обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные результаты и их обсуждение), заключение, выводы и предложения производству. Основной текст диссертации включает 18 таблиц и 20 рисунков. Библиографический список включает 192 литературных источника, в том числе 178 - на английском языке.

  1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. В анализ были включены 6 свиней женского пола в возрасте шести месяцев породы ландрас. У каждого животного не менее, чем в двух повторностях анализировали экспрессию более 15 тысяч структурных генов из 22 – 26 тысяч имеющихся у высших млекопитающих в 5-ти различных органах (печень, почки, тимус, сердечная мышца, скелетная мышца). Анализ ПГЭ проводился отдельно по каждой ткани и каждому животному. Все животные содержались в сходных условиях, образцы тканей были получены в день убоя животных на экспериментальной базе Университета штата Миннесота, США.

Исследование однонуклеотидных полиморфизмов в генах-кандидатах липидного метаболизма и миогенеза проводилось в группе двухпородных (крупная  белая х дюрок; n=356 голов, 163 самца и 193 самки), и трехпородных (крупная  белая х дюрок х ландрас; n=256 голов, 131 самец и 125 самок) помесей. Схема исследований представлена на рисунке 1.

Характеристики продуктивности исследованных животных (табл. 1) получены на 3 племенных хозяйствах расположенных в провинции Порденоне и Верона, Италия. Сбор образцов мышц для дальнейшего анализа ДНК проводился в момент забоя животных на скотобойне или на перерабатывающем предприятии.


Рис. 1 Схема исследований

Таблица 1

Уровень развития основных хозяйственно-полезных признаков свиней

двух- и трехпородных помесей

Показатель продуктивности

Двухпородные помеси

Трехпородные помеси

пол

N

М ± m

пол

n

М ± m

Толщина шпика над 6-7 грудными позвонками, мм

162

29.11±0.415

95

28.67±0.521

131

30.68±0.563

107

29.44±0.555

Глубина длиннейшей мышцы спины, мм M. longissimus dorsi

131

66.99±0.554

95

67.49±0.659

162

65.25±0.662

107

66.09±0.666

Среднесуточный прирост живой массы

от рождения до отъема  (ADG1-AverageDailyGain 1), кг

152

0.28±0.005

95

0.27±0.005

127

0.28±0.005

91

0.27±0.007

от отъема до 10 недель  (ADG2-AverageDailyGain 2), кг

192

0.33±0.003

124

0.33±0.004

155

0.33±0.004

113

0.33±0.004

от рождения до убоя   (ADG3-AverageDailyGain 3), кг

161

0.61±0.004

95

0.61±0.007

131

0.60±0.005

107

0.59±0.007

Масса туши, кг

161

132.64±0.936

95

133.75±1.288

131

132.10±1.098

107

132.11±1.302

Предубойная живя масса, кг

161

164.48±1.211

95

166.67±1.593

131

163.86±1.362

107

164.53±1.607

Структура микроматриц. Для выявления ПГЭ использовались микроматрицы, разработанные и напечатанные в рамках проекта SPAM (Garbeetal., 2010). На каждой микроматрице были представлены зонды к 15204 генам, из которых 12271 ген был представлен 1 пробой и 2933 гена от 1-14 пробами. Для создания проб использовались 70-нуклеотидные синтетически синтезированные последовательно­сти, комплементарные к белок-кодирующим участкам геномной ДНК свиней.

Метод генотипирования. Генотипирование по полиморфным локусам в области промотора генов стеарил-КоА-десатуразы (Scd) [-233 T/C], лептина (Lep) [-11606 C/T; -12109 T/A], белка детерминации миобластов (Myod) [-38 G/A], миогенетического фактора 6 (Myf6) [-375 T/C], остеопонтина (Opn) [-24 G/A] выявляли методом конкурентной аллель-специфической полимеразной цепной реакции, основанной на принципе резонансного переноса энергии флуоресценции - «KASParGenotypingSystems» (Kbioscience).

Выделение нуклеиновых кислот. Выделение РНК проводилось с использованием набора реагентов «RNeasyMiniKit» (QIAGEN), затем были получены кДНК с применением набора реагентов «Array350 Expression Array Detection Kit for Microarrays» (Genisphere). Выделение ДНК для генотипирования промоторных областей генов-кандидатов липидного метаболизма и миогенеза выполняли методом фенол-хлороформной экстракции с предварительной обработкой каждого образца протеиназой K.

Анализ первичных данных ПГЭ. Сканирование микроматриц проводилось на ScanArray 5000 (GSI Lumonics) с использованием компьютерной программы Scan Array Express. Данные сканирования были распакованы и обработаны при помощи процедуры Blue Fuse for microarrays. В результате были получены числовые данные, характеризующие интенсивность сигнала гибридизации (с.и.) генов в каждом споте микроматрицы для каждого из образцов в отдельности. Деление генов на функциональные группы проводилось в соответствии с базой данных Национального центра биотехнологической информации (National Center for Biotechnological Information, NCBI). Поиск гомологичных последовательностей в GenBank осуществлялся с помощью алгоритмов семейства BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Корреляционный анализ проведен с расчетом коэффициентов корреляции Пирсона (пакет Statistica 7.0). Принадлежность генов к различным метаболическим путям определялась в соответствии с базой данных KEGG pathway (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html), и софтом GNCPro (http://gncpro.sabiosciences.com/gncpro/gncpro.php).

Анализ первичных данных генотипирования. Математическую обработку результатов генотипирования по каждому гену в отдельности проводили с использованием прикладных статистических программ SPSS 17.0 (SPSS statistics), Statistica 7.0 (Stat Soft Inc.). Достоверность различий в распределении частот аллелей и генотипов оценивали с использованием критерия 2 с поправкой Иэйтса (Med Calc Software 12.0.3). Для поиска зависимостей в экспериментальных данных путём исследования значимости различий в средних значениях выполнялся дисперсионный анализ (ANOVA) и метод оценки эмпирического попарного значения Тьюки [Li M. et al., 2008; Li Y. et al., 2011]. Определение сайтов посадки факторов транскрипции и их изменение в соответствии с полиморфизмами в промоторах генов липидного метаболизма и миогенеза проводилось при помощи софта MatInspector (GenomatixSoftware). Все использованные процедуры анализа первичных данных лицензированы и широко используются в международной практике [Cartharius K., 2003; Cartharius K.et al., 2005; Guiatti D. et al., 2011; Garbe J.R. et al., 2010]

  1. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ


3.1 Влияние перекрестной гибридизации проб микроматриц с транскриптами разных генов на результаты оценок органоспецифичных профилей генной экспрессии.

Для оценки влияния одного из источников ошибок – перекрестной  гибридизации - был выполнен сравнительный анализ ПГЭ печени и почек у свиней. Среди 600 наиболее интенсивных сигналов гибридизации кДНК зрелых мРНК выделены транскрипты, к которым на ДНК микроматрицах присутствовало более, чем одна проба. Суммарно в печени выделено 12 таких транскриптов, в почках - 9. Сравнение с.и. разных участков одного и того же гена с пробами ДНК-микроматриц позволило выделить две основные группы генов: одна - с различиями до 4500 условных единиц свечения между с.и. различных участков кДНК одной и той же мРНК с пробами ДНК микроматриц, другая - с различиями более 10000 условных единиц свечения. Все рассмотренные случаи воспроизводимых отличий между с.и. разных проб ДНК микроматриц к кДНК мРНК генов печени (SERPINA3-2, FGA) и почек (ATP6,CgA, Ub) типичны для генов, принадлежащих к супергенным семействам (табл.2).

Таблица 2

Множественные участки гомологии в кДНК мРНК одного или  разных генов

Ген

пробы

Гомология участков внутри транскрипта, между кДНК разных генов

альфа-1-антихе­мотрипсин 2

(SERPINA3-2)

1

SERPINA3-2 84% (1027 – 1096); SERPINA3-1 86%; SERPINA3-3 81% (1045 – 1114); SERPINA3-6 81% (772 – 841); LOC100153899 100% (1096 – 1165); LOC100156752 100%  (753 – 822); LOC100156325 80% (1096 -1165)

2

SERPINA3-289% (1082 до 1150); SERPINA3-6 89% (809 - 877)

3

SERPINA3-2 100% (1194 – 1263); SERPINA3-2 89% (1295 - 1328)

фибрино­пептид А

(FGA)

1

gb:FD606208.1 100% (535 до 604), 80% (509  и  563)

2

100%  (209 – 278)

АТФ синтаза  А цепь

(ATP6)

1

+ цепь 100% (191 – 260) (377 - 446); - цепь 100% (124 до 55)

2

100% + цепь в прямой последовательности и в комплементарном варианте, - цепь

3

100% + цепь

хромогра­нин А

(CgA)

1

100% + цепь (120 – 189; 300 – 369; 592 – 661), - цепь прямая последовательность (193 – 124)

2

100% + цепь (31-100; 85-154; 120-189; 195-264);

убиквитин

(Ub)

1

100% + цепь (149-218); - цепь (399-330)

2

100% + цепь (177-246; 405-474; 630-699)

3

100% + цепь (83-152)

4

100% + цепь (138-207; 367-435; 593-661)

Для всех исследованных случаев наблюдались выраженные отличия по интенсивности гибридизации между разными пробами к последовательностям кДНК синтезированных по мРНК одного и того же гена, в связи с количеством в нем участков гомологии в кДНК мРНК других генов, а также с присутствием/отсутствием гомологичных последовательностей в кДНК мРНК плюс и минус цепей. Полученные данные свидетельствуют о том, что такая «перекрестная» гибридизация разных участков кДНК с одной и несколькими пробами ДНК микроматриц может являться источником ошибок при сравнительной оценке интенсивности экспрессии различных генов, что особенно существенно для генов, принадлежащих к супергенным семействам.

3.2. Органоспецифические особенности профилей генной экспрессии в печени и почках свиней.

Суммарный сравнительный анализ различий в интенсивности экспрессии генов в печени и почках, отличавшихся по уровню экспрессии более, чем на 20000 условных единиц свечения, позволил выявить 40 генов, экспрессия которых была существенно выше в клетках почек, по сравнению с клетками печени. Больше половины из них (26) являлись генами, продукты которых относятся к белкам, представляющим сигнальную и транспортную системы клетки и непосредственно участвующим в ионном обмене между внеклеточным пространством и цитоплазмой, а также между цитоплазмой и внутренним матриксом митохондрий. Продукты 10 генов относятся к факторам регуляции транскрипции и убиквитин-зависимого каскада, 3 гена кодируют белки рибосом и 1 ген – субъединицу динактинового комплекса, непосредственно участвующего в контроле цитокинеза. В целом, основные отличия в профилях генной экспрессии между клетками почек и печени оказались связанными с генами, контролирующими меж- и внутриклеточный ионный обмен, а также механизмы клеточного деления. Это объясняется доминирующим участием почек в поддержании ионного баланса в крови млекопитающих (по сравнению с печенью), а также сниженной активностью цитокинеза в печени (полиплоидизацией гепатоцитов). Таким образом, выявленные отличия в профилях генной экспрессии клеток почек и печени соответствуют функциональным и гистологическим особенностям этих органов.

3.3. Сложность спектра профиля генной экспрессии печени свиней.

Сравнительный анализ ПГЭ печени и почек по генам, интенсивность гибридизации которых отличалась более чем на 20000 условных единиц свечения между органами, позволил выделить группу генов, с конститутивной экспрессей и группу из 24 генов, уровень экспрессии которых варьировал от одного животного к другому. Среди них были определены 11 генов, по которым уровень экспрессии у исследованных животных высокодостоверно коррелировал в печени и почках (r=0,96-1,00; Р<0,05; Р<0,01). Это свидетельствует, что их экспрессия находится под влиянием общих для обоих органов регуляторных факторов. Оказалось также, что при рассмотрении отдельно ПГЭ печени 24 гена вариабельной части профиля разбиваются на функциональные группы, между которыми были определены статистически достоверные коэффициенты корреляции в уровнях экспрессии генов у разных животных (r=0,95-1,00; Р<0,05; Р<0,01, Р<0,001). В итоге, были выделены 8 таких групп - 6 генов, продукты которых участвуют в формировании кровяного сгустка (FGB, FGG, VTN, F2, PAI2,PLG); 6 генов - в транспорте и метаболизме липидов (ApoС3, Apo-E, ApoA-I, AGP2, PRBP, FHR2); 5 генов представляют маркеры клеток крови и лизосом (TMEM8, PAI2, ST7, AGAP1, NAGA); продукты 3 генов участвуют в апоптозе клеток (CLU, TNFRSF19, PLG), экспрессия 3 генов регулируется гормонами (FGB,ALR,VTN).Три группы, включающие в себя по 2 гена, относились к транспортной системе Са2+ (Grin2b, KLHL1), кодировали белки межклеточного матрикса (HAPLN2, AHSG) и отражали функциональную активность митохондрий (ALR, TrpRS).

Сравнительный анализ данных ПГЭ печени, полученных в наших исследованиях и представленных в работе проф. Зао С. и др. (Zhao et al., 2005), выполнивших анализ ПГЭ в ряде органов свиней аналогичных по происхождению и физиологическому состоянию с животными, исследованными нами, позволил получить полные совпадения по органоспецифичному ПГЭ печени свиней только по 27 из 102 генов (~27%). Эти 27 генов имели конститутивную экспрессию в печени, превосходящую порог в 400 с.и. у всех исследованных животных. Основные отличия были обусловлены вариабельной частью ПГЭ, гены которой так же подразделяются на функциональные группы, внутри которых получены статистически достоверные коэффициенты корреляции (r=0,96-1,00; P<0,05, P<0,01) при сравнении уровней экспрессии генов у разных животных, что по нашему мнению, отражают отличия в действии экзо- и эндогенных факторов, регулирующих их транскрипцию.

Обращает на себя внимание функциональная близость групп генов, внутри которых получены высокодостоверные коэффициенты корреляции в уровнях экспрессии генов у разных животных при сравнении ПГЭ печени и почек в наших исследованиях, а также при сравнении ПГЭ печени полученных нами и проф. Зао С. и др.

3.4. Функциональные особенности генов с вариабельной и конститутивной экспрессией.

В базе данных KEGG Metabolic pathway из 27 генов с конститутивной экспрессией и 25 – с выраженными индивидуальными отличиями по уровню экспрессии между животными (вариабельная часть ПГЭ), были представлены 17 и 18 генами, соответственно. Продукты генов первой группы участвовали в 25 метаболических путях, что соответствует, в среднем, по 1,5 пути на один ген, а на каждый ген второй группы приходилось по 3 метаболических пути (рис. 2).

Рис. 2. Количество метаболических путей, в регуляции которых участвуют гены вариабельной и конститутивной части ПГЭ

Таким образом, гены вариабельной части ПГЭ участвуют в большем количестве метаболических путей, чем гены конститутивной части ПГЭ. В этой связи можно ожидать, что гены вариабельной части ПГЭ имеют более сложную сеть генных взаимодействий, чем гены конститутивной части. Для выяснения этого, с использованием софта GNC Pro (SABiosciences, USA) построены графы, характеризующие сетевые функциональные взаимодействия между генами в обеих группах. Полученные данные наглядно демонстрируют большую сложность сетевых взаимоотношений между генами вариабельной части ПГЭ по сравнению с конститутивной (рис 3).

       

Рис. 3. Функциональное взаимодействие генов в группе с вариабельной (А) и конститутивной (Б) экспрессией

3.5. Влияние генетической компоненты изменчивости на толщину шпика и скорость прироста живой массы.

В одну из групп вариабельной части ПГЭ печени входили гены, продукты которых непосредственно участвуют в контроле липидного метаболизма. Очевидно, что генетически детерминированный полиморфизм регуляторных геномных элементов, в частности, промоторов структурных генов, может вносить существенный вклад в изменчивость экспрессии генов, критических для проявления желательных фенотипических признаков. В литературе накоплено много данных о связи SNP полиморфизма в промоторах ключевых генов липидного метаболизма с толщиной шпика у свиней (Chen C.C. et al., 2004; Liu D. et al., 2011; Oliveira Peixoto J. et al., 2006).

В наших исследованиях, в целях оценки вклада генетически детерминированного полиморфизма регуляторной области (промоторов) ключевых генов липидного метаболизма и миогенеза  в изменчивость показателей толщины шпика и скорости прироста живой массы было выполнено генотипирование SNP в промоторах генов Lep, Scd, Myod, Myf6 и Opn, а также оценено их влияние на сайты посадки факторов регуляции транскрипции (ТФ) и рассчитаны ассоциации выявленных генотипов с проявлением сальных и мясных показателей у двух и трехпородных помесей свиней.

3.5.1. Влияние SNP на чувствительность к сайтам посадок ТФ.

Выявлен ряд предполагаемых сайтов распознавания факторов регуляции транскрипции, некоторые из которых отсутствовали на альтернативном варианте аллеля. Следовательно, можно заключить, что эффекты SNP обуславливают вариабельность экспрессии генов в связи с изменением последовательности ДНК критичной для посадки ТФ (табл. 3).

Таблица 3

Факторы регуляции транскрипции, потенциальные сайты связывания с которыми могут быть изменены в результате SNP в промоторах генов Myf-6, Myod, Lep, Opn, Scd

Гены

аллельный вариант

Сайты посадок «новых» факторов транскрипции, вызванных мутациями в промоторных областях

Цепь

Точка мутации (выделено жирным) и последовательность, критичная для посадки ТФ (выделено подчеркиванием)

Myf-6

-375 T/C

С

ТФ семейства grainyhead

+

atccccGGTTgtt

ТФ с парным доменом Pax-4/Pax-6

+

aatCCCCggttgttttgaa

T

Печеночный ядерный фактор 1

+

tGTTAatccctggttgt

Myod

-38 G/A 

G

ТФ семействаKruppel

+

cttgccgctgGGGTtgg

Lep

-12109 T/A 

А

Октамерсвязывающие белки

-

gttTTGCaaatgtcatt

T

Гомеодоменные ТФтипа bicoid

+

tttgCTAAacctaaatt

мяРНКактивирующийбелковыйкомплекс

+

ctaaaCCTAaatttgcaat

Lep

-11606 C/T

T

ТФс мотивом GATA

-

agcgGATAaggaa

Opn

-24 G/A

A

цАМФ-зависимые ТФ

-

aaaatattttGTAAgaaatat

ТФ предпочтительно связывающиеся с АТ-богатыми участками

-

gcaaaATATtttgtaagaaat

ТФсемействаPAR/bZIP

-

aaatattttGTAAgaaa

ТФ семейства ССААТ/энхансер-связывающихся белков

-

aatattttGTAAgaa

ТФ с доменом forkhead

+

tcttacAAAAtattttg

ТФ предпочтительно связывающиеся с АТ-богатыми участками

+

acaaaATATtttgcaggaaaa

Scd

-233 T/C

C

ядерныйрецептор ROR-alpha и Rev-erb alpha

+

ggaaatacagGACAcggtcgccc

ТФbasonucleinrDNA (PolI)

-

tgggcgaccgTGTCctgta

ТФ PAX-5

+

acaggACACggtcgcccactgccagctct

3.5.2. Анализ ассоциаций отдельных мононуклеотидных полиморфизмов (SNP) в промоторных областях генов кандидатов контроля признаков продуктивности.

Генотипирование полиморфных локусов генов Lep, Scd, Myod, Myf6, Opn выявило существенные отличия по распределению аллелей и генотипов по SNP промоторов изучаемых генов (табл.4). По генотипам SNP промотора гена Lep двух- и трехпородные помеси оказались более генетически гомогенными, чем по SNP промоторов других генов, включенных в анализ. По SNP генотипам промоторов генов Myf-6, Opn, Scd, Myod гетерозиготность, в среднем, была выше на 15% у свиней, полученных от двухпородного скрещивания, по сравнению с трехпородными помесями.

Анализ ассоциаций выявленных генотипов по SNP, с толщиной шпика над 6-7 грудным позвонком (BF) в группах животных, попадающих в экстремальные 5%-ные интервалы распределения значений этого признака, выявил, что двухпородные помеси с генотипом AG по гену Opn отличаются, в среднем, большей толщиной шпика по сравнению с животными с генотипом AA (P<0,01). Следует подчеркнуть, что такая ассоциация выявлена только по SNP гена Opn и не имеет универсального характера, поскольку обнаруживается только у двухпородных помесей.

Таблица 4

Частоты встречаемости аллелей и генотипов (%) по полиморфным сайтам промоторных районов ключевых генов липидного метаболизма и регуляции миогенеза в изученных группах помесных животных

Полиморфный вариант

Генотипы, аллели

Частоты встречаемости аллелей и генотипов

2

p

двухпородные помеси

трехпородные помеси

Myf-6

-375 T/C

N=355

N=252

CC

4.5

20.2

35.470

P < 0.001

TC

30.7

60.3

51.487

P < 0.001

TT

64.8

19.5

119.940

P < 0.001

C

19.85

50.4

61.284

P < 0.001

T

80.15

49.6

61.284

P < 0.001

Opn

-24 G/A

N=354

N=253

AA

46.9

97.6

172.067

P < 0.001

GA

53.1

2.4

172.067

P < 0.001

A

73.45

98.8

68.731

P < 0.001

G

26.55

1.2

68.731

P < 0.001

Lep

-12109 T/A

N=350

N=246

AA

2.0

6.9

7.760

-

TA

29.4

25.6

0.858

-

TT

68.6

67.5

0.0378

-

A

16.7

19.7

0.691

-

T

83.3

80.3

0.691

-

Lep

-11606 C/T

N=352

N=255

CC

67.0

60.8

2.216

-

TC

31.0

31.0

0.00790

-

TT

2.0

8.2

11.568

P < 0.001

C

82.5

76.3

3.163

-

T

17.5

23.7

3.163

-

Scd

-233 T/C

N=346

N=254

CC

24.3

0.8

63.909

P < 0.001

TC

67.9

30.7

79.745

P < 0.001

TT

7.8

68.5

239.549

P < 0.001

C

58.3

16.2

106.012

P < 0.001

T

41.7

83.8

106.012

P < 0.001

Myod

-38 G/A

N=339

N=243

AA

16.2

40.3

41.216

P < 0.001

AG

53.4

54.3

0.0170

-

GG

30.4

5.4

53.815

P < 0.001

A

42.9

67.5

33.420

P < 0.001

G

57.1

32.5

33.420

P < 0.001

При анализе всей выборки животных наибольшее количество ассоциаций выявлено у двухпородных помесей между генотипами SNP промотора гена Opn с толщиной шпика, а также с характеристиками мясной продуктивности (P<0,05). Однако выявленные ассоциации оказались зависимыми от принадлежности животных к определенному типу скрещивания и полу (табл.5). У трехпородных помесей, независимо от их половой принадлежности, наблюдались статистически достоверные ассоциации между SNP генотипами всех изучаемых генов и среднесуточными приростами живой массы в разные периоды онтогенеза (P<0,05,P<0,01,P<0,001) (табл.5).

Таблица 5

Показатель уровня статистической достоверности ассоциаций характеристик продуктивности с полиморфизмами в промоторной области генов с учетом половой принадлежности

Показатель

Уровень статистической достоверности

Двухпородые помеси с учетом половой принадлежности

Трехпородные помеси без учета половой принадлежности

Opn

Scd

Myf6

Lep C/T

Myf6

Opn

Lep T/A

Lep C/T

Scd

Myod

Толщина шпика над 6-7 грудными позвонками

*


*




Глубина длиннейшей мышцы спины

M. longissimus dorsi


*






Среднесуточный прирост от рождения до отъема (ADG1)





*

***

*

*

**

***

Среднесуточный прирост от отъема до 10 недель (ADG2)



*


***

***


**

***

Среднесуточный прирост от рождения до дня забоя (ADG3)

*




Масса туши

*

Предубойная живя масса

*

* P<0,05; ** P<0,01; ***P<0,001

3.5.3. Анализ влияния межгенных взаимодействий на уровень развития хозяйственно-полезных признаков.

При анализе SNP гена лептин [T/A] обнаружено, что генотип ТТ ассоциирован с низкими среднесуточными приростами. Однако при рассмотрении одновременного влияния аллелей 6 полиморфных генов в группе животных с высокими приростами по этому SNP неоднократно встречался генотип ТТ. По второму SNP гена лептин [T/С] без учета генотипов по остальным генам генотип СС оказался ассоциированным с низкими среднесуточными приростами животных. В то же время у животных с высоким среднесуточным приростом с определенным сочетанием аллелей по другим генам по SNP гена лептин [T/С] так же обнаруживается генотип СС. Аналогичная ситуация наблюдалась и по SNP промоторов генов Opn и Scd. То есть, при анализе отдельных генов обнаруживается влияние некоторых SNP генотипов на различия животных по характеристикам прироста живой массы. Однако, сцепление такого влияния разных генов в наших исследованиях не обнаружено.


Заключение

Выполненный нами анализ свидетельствует о том, что противоречия в оценках органоспецифичных ПГЭ обусловлены протяженными участками гомологии нуклеотидов в разных генах, приводящих к перекрестной гибридизации одной пробы с кДНК мРНК разных генов (или с разными участками внутри одного гена), влиянием экзогенных факторов, а так же генетической гетерогенностью животных, обусловленной наличием SNP в промоторных участках генов, влияющих на экспрессию генов-кандидатов контроля проявления хозяйственно-полезных признаков.

Выводы

  1. Выявлены различия в оценках экспрессии отдельных генов, представленных на ДНК микроматрицах более чем одной пробой. Эти различия обусловлены протяженными участками гомологии нуклеотидов в разных генах. Как правило, такие гены принадлежат к супергенным семействам, имеющим общее происхождение, обусловливающее наличие общих функциональных участков (доменов).
  2. Различия в оценках экспрессии структурных генов печени и почек свиней породы ландрас определены по генам ионного баланса крови, метаболизма ксенобиотиков, полиплоидизации клеток (в частности, динактин 3 - p22), что обусловлено функциональными и гистологическими отличиями между органами животного.
  3. Данные полученных профилей генной экспрессии по образцам печени и почек свиней породы ландрас можно условно подразделить на конститутивную  часть, включающую гены, уровень экспрессии которых постоянен у исследованных животных, и вариабельную часть, объединяющую гены, уровень экспрессии которых различается у разных животных.
  4. Гены вариабельной части находятся под влиянием общих для печени и почек регуляторных факторов, о чем свидетельствует статистически достоверная (Р<0,05; Р<0,01) корреляция (r=0,96-1,00) между оценками уровня экспрессии в разных органах у разных животных. Гены, отнесенные к вариабельной части профиля, участвуют в два раза большем количестве метаболических путей, образуют более многообразные и сложные межгенные взаимодействия по сравнению с генами, отнесенными к конститутивной части профиля.
  5. Выявлены статистически достоверные взаимосвязи показателей развития мясной продуктивности и скорости роста у свиней двух- и трехпородных помесей с мононуклеотидным полиморфизмом регуляторных областей (промоторов) ключевых генов контроля липидного метаболизма (Lep, Scd) и миогенеза (Myf-6, Myod), а так же определены факторы, лимитирующие достоверность прогноза исследуемых селекционных показателей у свиней: пол, возраст, тип скрещивания.
  6. Уровень изменчивости показателей мясной продуктивности и скорости роста помесных животных зависит от структуры комплексных генотипов по мононуклеотидным полиморфизмам в промоторах генов Lep, Scd, Myf-6, Myod, Opn.

Предложения производству

  1. При включении в селекционную работу с применением мировых генетических ресурсов импорт генетического материала для увеличения точности и надежности прогноза мясной продуктивности свиней следует учитывать характеристики экспрессии генов, входящих в конститутивную часть ПГЭ.
  2. Для повышения уровня достоверности прогноза мясной продуктивности у двухпородных помесей свиней (крупная белая х дюрок) следует использовать оценку генотипов: по промоторам стеарил-КоА-десатуразы, остеопонтина и лептина у самцов, и по миогенному фактору 6 - у самок для прогноза скорости роста их живой массы.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации


Статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных ВАК Минобрнауки РФ

  1. Glazko T.T., Khlopova N.S., Fahrenkrug S., Glazko V.I. Gene expression profiles in liver and kidney of pig // IZVESTIA Timiryazev Agricultural Academy. Scientific-theoretical Journal of the Russian State Agrarian University – Moscow Agricultural Academy named after K.A. Timiryazev. - 2009. - Special Issue March-May. -  P.  55-60.
  2. Глазко В.И., Хлопова Н.С., Глазко Т.Т., Фаренкруг С. Сравнение профилей генной экспрессии в печени и почках свиней (Susscrofa) // Доклады Российской Академии сельскохозяйственных наук: Научно-теоретический журнал. – 2010. - № 1. – С. 34-39.
  3. Хлопова Н.С. Глазко Т.Т.,  Глазко В.И. Конститутивная и вариабельная компоненты профилей генной экспрессии печени свиней // Вавиловский журнал генетики и селекции. – 2011. – Т. 15. - №1б. - С. 130-138.
  4. Хлопова Н.С. Стефанон Б., Гуатти Д., Глазко Т.Т., Глазко В.И. Мононуклеотидные полиморфизмы (SNP) промоторов генов кандидатов контроля характеристик продуктивности свиней // Доклады Российсой Академии сельскохозяйственных наук.- 2012.-№4.- С. 39-45.

Статьи в других изданиях:

  1. Glazko T., Khlopova N., Fahrenkrug S., John G., Glazko V. Gene Expression Profiles in Porcine Tissues of Liver and Kidney // Journal of Life Sciences. – 2011. – V. 5. – №3. – P. 192-200.
  2. Хлопова Н.С., Глазко Т.Т. Оценки транскрипции с использованием ДНК микроматриц // Нанобиотехнологии в сельском хозяйстве:  Доклады международной научно-практической конференции. М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева,  2008. - С. 66.
  3. Хлопова Н.С. ДНК-микроматрицы (ДНК-биочипы) для сравнения профилей генной экспрессии в печени и почках свиней // Сборник студенческих научных работ. Вып. 15. М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2009. - С. 170-173.
  4. Хлопова Н.С. Анализ профилей генной экспрессии и возможные источники ошибок // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». [Электронный ресурс] - М.:: Изд-во МГУ, 2009. - С. 31.
  5. Глазко В.И., Хлопова Н.С., Глазко Т.Т. Нанобиотехнологии в исследованиях молекулярных основ хромосомного и клеточного фенотипов Нанотехнологии и наноматериалы // Нанотехнологии и наноматериалы: материалы международной научно-технической конференции (МГОУ). М.: Изд-во МГОУ, 2009. - С. 299 -304.
  6. Khlopova N.S., Glazko V.I., Glazko T.T. Comparative analysis of gene expression profiles in liver and kidney of pigs // Proceedings of the international Moscow Сonference on Сomputational Molecular Biology. Moscow, 2009. - P. 159-160.
  7. Khlopova N.S., Glazko V.I., Glazko T.T. Differentiation of gene expression profiles data for liver and kidney of pigs // World Academy of Science Engeneering and Technology. Oslo, Norway, July 2009. Vol 55. - P. 267-270.
  8. Khlopova N., Glazko T., Glazko V. Genomics Methods in Investigation of Chromosome and Cell Phenotypes // ASCB Regular Abstracts. San-Diego, USA, 2009, - P. 628-629.
  9. Хлопова Н.С. Reproducing and variable part of organ-specific gene expression profiles in liver and kidney of pigs // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2010». Отв. Ред. И.А. Алекшовский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев, А.В. Андриянов. [Электронный ресурс] – М.: МАКСПресс, 2010.
  10. Хлопова Н.С. Анализ Вариабельной части профилей генной экспрессии у свиней и возможные источники ошибок, связанных с перекрестной гибрилизациецией //  Международная конференция молодых ученых и специалистов, посвященная 145-летию РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева: Сборник статей. В 2-х т. М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2010. - Т. 1. - C. 333-336.
  11. Khlopova N.S., Glazko T.T. Variable part of gene expression profiles in Liver and kidney of pigs // Proceedings of the Seventh International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology. Novosibirsk, 2010. - P. 132.
  12. Khlopova N.S., Glazko T.T., Glazko V.I. DNA microarrays in revealing organspesific gene expression profiles in pigs // Proceedings of the VI Moscow International congress Biotechnology: state of the art & prospect of development, part 1. Moscow, 2011.  - P. 426-427.
  13. Khlopova N.S., Glazko T.T. DNA-microarrays and complexity of gene expression variability in porcine tissues // Proceedings of the conference Advances in Microarray Technology. Hamburg, Germany, 2011.  - P.67.
  14. Khlopova N., Glazko T. Individual differences in gene expression in liver and kidney (Susscrofa) // Proceedings of the international Moscow conference on Computational molecular biology. Moscow, 2011.  - P.163-165.
  15. Хлопова Н.С. Вариабельная часть профилей генной экспрессии (ПГЭ) и факторы, влияющие на нее: материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2012». Отв. ред. А.И. Андреев, А.В. Андриянов, Е.А. Антипов, К.К. Андреев, М.В. Чистякова. [Электронный ресурс]. - М.: МАКС Пресс, 2012.
  16. Khlopova N.S., Glazko T.T., Guiatti D., Stefanon B. Associations between promoter polymorphisms in key genes of lipid metabolism and miogenesis and economically valuable traits in pigs // The 8th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology: Abstracts. Novosibirsk, 2012.- P.144.
  17. Poi F., Khlopova N. New algorithm for identification of individual differences in gene expression. The 8th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology: Abstracts. Novosibirsk, 2012.- P.248.
  18. Khlopova N.S., Glazko T.T., Guiatti D. Stefanon B. Association of SNPs in the promoter region of candidate genes for growth and carcass traits andtheir manifestation in pigs // Book of Abstracts of the 25th International Conference “Genetic Days”, Wrocaw, Poland, 2012.-P.13-14.
  19. Khlopova N.S., Glazko T.T., Guiatti D., Stefanon B. Effect of promoter polymorphisms in key genes of lipid metabolism and myogenesis and its associations with production traits of pigs // VIth International Scientific Symposium“Application of scientific researchers in pig production improvement and their influence on rural areas development”, University of Technology and Life Sciences in Bydgoszcz, 2012. – P. 79.
  20. Khlopova N.S., Glazko T.T. Key genes of economically valuable traits in pigs and complex character of its expression variability // IIIrd International Scientific Symposium for PhD Students and Students of Agricultural Colleges “Innovative researches in the field of animal breeding and production”. University of Technology and Life Sciences in Bydgoszcz, 2012. – P. 177.

Подписано в печать 14.11.2012 г.

Формат 60х84 1/16. Печать офсетная. Объем 1,0 п.л.

Заказ Тираж  100  экз.

Издательство ФГБОУ ВПО РГАЗУ

143900,  Балашиха 8 Московской области




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.