WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

НОВИКОВА Мария Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ГРИППА ПТИЦ A/H5N1, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Покров – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Научный руководитель:

Доктор биологических наук,

профессор  Власов Николай Анатольевич

(Россельхознадзор)

                       

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарных наук,

профессор                         Кушнир Анатолий Тимофеевич

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Доктор биологических наук,

старший научный сотрудник  Ярыгина Елена Игоревна

(ФГБОУ ВПО МГАВМиБ)

Ведущая организация – Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности  (ГНУ ВНИТИБП),  г. Щелково.

       Защита диссертации состоится «_24_» мая 2012 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская область, г. Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Тел./факс: 8 (49243) 6-21-25.

       С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

       Автореферат разослан « 19 » _апреля_ 2012 г.

Размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniivvim.ru  и на официальном сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ru

Ученый секретарь

диссертационного совета

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии,

кандидат биологических наук 

  Е.А. Балашова

1. Общая характеристика работы

1.1.

Актуальность темы

Высокопатогенный грипп птиц – высококонтагиозное вирусное генерализованное заболевание птиц, характеризующееся высокой смертностью, сопровождается кровоизлияниями и воспалительными процессами во внутренних органах, мозге и коже, гибель птицы может достигать 100%. Высокопатогенный грипп птиц (ВПГП) относится к болезням, подлежащим обязательному уведомлению Всемирной организации здравоохранения животных [3, 6, 12].

В 2003-2004 гг. резко обострилась ситуация в странах Юго-Восточной Азии и Дальнего Востока в связи с возросшим количеством случаев регистрации вспышек ВПГП подтипа H5N1 среди домашних птиц [9]. В результате эпизоотии ВПГП H5N1 2003-2004 гг. погибло 60 человек, потери среди домашних птиц составили 150 миллионов голов [7]. С начала 2005 г. случаи выявления ВПГП регистрировали в Китае, Тайланде, Вьетнаме, Гонконге, Индонезии и Камбодже [7, 9, 15].

Вирус гриппа (ВГ) подтипа H5N1 является патогенным для широкого круга диких, в том числе водоплавающих птиц [4, 8, 14, 15]. Данный факт был установлен в течение эпизоотии гриппа птиц А/H5N1 в странах юго-восточной части Азии, а затем и Европы в 1996-2007 гг. Особенно масштабной была вспышка ВПГП H5N1 в популяции диких водоплавающих птиц провинции Qinghai (северо-запад Китая) [4]. Вирус генетически близкородственный штаммам, выделенным в северо-западном Китае, вызвал вспышки болезни среди диких и домашних птиц в России в 2005-2007 гг., а так же странах Европы и Африки. [1, 2, 11, 13].

В период с 2008 по 2010 годы на территории Российской Федерации (РФ) спорадически выявляли изоляты вируса ВПГП/H5N1, генетически отличные от изолятов подгруппы Qinghai. При этом в 2009-2010 гг. ВПГП/H5N1 регистрировали только у диких птиц в Республике Тыва.

Следует отметить, что для детального молекулярно-генетического анализа изолятов вируса гриппа птиц (ВГП) необходимо определить полную первичную структуру генома, что является достаточно трудоемким и длительным процессом. Однако далеко не всегда требуется столь детальная генетическая характеристика. При этом, в литературных источниках, посвященных генетическому анализу изолятов ВПГП/H5N1, неоднократно описаны молекулярные детерминанты, определяющие такие важные биологические свойства вируса, как рецепторную специфичность, патогенность для различных видов животных, резистентность к медицинским препаратам, применяемым для профилактики и лечения гриппа в здравоохранении [5, 7, 16, 17].

Тем не менее, до настоящего времени не разработаны методы, позволяющие при проведении эпизоотологического расследования охарактеризовать ключевые свойства исследуемых изолятов ВГП в достаточно сжатые сроки, без проведения полного сиквенса генома изолята. Такая экспресс-характеристика «полевых» штаммов ВГП позволит своевременно корректировать планы противоэпизоотических мероприятий и избежать необоснованных финансовых расходов, что особенно важно в условиях рыночной экономики.

Для осуществления молекулярно-генетической характеристики целесообразно разработать и применять на практике методы по определению первичной структуры генома исследуемых изолятов ВГП, а также определению нуклеотидных последовательностей фрагментов генов (PB2, H, N, M, NS), включающих генетические маркеры, обуславливающие биологические свойства изолятов вируса ВПГП A/H5N1, выделенных на территории РФ в последние годы (2005-2010 гг.). В зависимости от поставленной задачи, использование данных методов позволит с максимальной степенью эффективности охарактеризовать молекулярно-генетические свойства исследуемых изолятов вируса ВПГП/H5N1.

1.2. Степень разработанности проблемы.

В результате многочисленных исследований установлено, что генетические маркеры, влияющие на биологические свойства изолятов вируса ВПГП A/H5N1, выделенных на территории РФ в последние годы определены нуклеотидными последовательностями генов PB2, H, N, M и NS.

Всемирной организацией здравоохранения животных рекомендованы к применению в диагностической практике утвержденные и соответствующие ее стандартам протоколы ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ, позволяющие быстро выявить и идентифицировать ВГП [12]. Среди них указаны несколько систем для индикации ВГП с праймерами на ген М, а также системы идентификации различных подтипов, особенно H5, H7.

В то же время определение полных нуклеотидных последовательностей генома изолятов ВГП и их детальная молекулярно-генетическая характеристика являются приоритетными задачами для референтных лабораторий, осуществляющих диагностику ГП. Кроме того, для обеспечения возможности принятия своевременных мер по профилактике и ликвидации ГП необходимо на основании данных о молекулярных детерминантах определяющих биологические свойства ВГП разрабатывать методы, позволяющие делать прогнозы развития эпизоотической ситуации.

1.3. Цели и задачи исследований

Изучить молекулярно-генетические свойства вирусов гриппа птиц, выделенных на территории РФ, с помощью оптимизированного метода определения первичной структуры генома и разработать метод определения молекулярных детерминант патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса гриппа.

В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:

- оптимизировать метод определения первичной структуры генома изолятов ВГП/H5N1 генетической подгруппы Qinghai на основе ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования;

- определить полные нуклеотидные последовательности генома изолятов ВГП/H5N1, выделенных в 2005-2006 гг. и изучить их молекулярно-генетические свойства;

- осуществить сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генома изолятов вируса ВПГП/H5N1, выделенных в 2008-2010 гг. в России, с таковыми изолятов ВГП подтипа H5N1, выявленных и выделенных в странах Евразии в течение 2008-2011 гг.

- разработать метод, позволяющий охарактеризовать молекулярные детерминанты патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса ВПГП A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

1.4. Научная новизна исследований

Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома 5 изолятов ВГП/H5N1, выделенных на территории РФ в течение 2005-2006 гг., и изучены их молекулярно-генетические свойства.

Оптимизирован метод определения первичной структуры генома изолятов ВГП/H5N1 генетической подгруппы Qinghai на основе ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Разработан метод определения молекулярных маркеров патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса ВПГП A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования с оригинальной системой праймеров.

1.5. Практическая значимость работы

Получены малекулярно-генетические характеристики 5 изолятов вируса гриппа птиц, выделенных на территории Российской Федерации.

Разработаны «Методические положения по определению первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 генетической подгруппы Qinghai c помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования», которые утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 19.01.2012 г.

Разработаны «Методические положения по определению молекулярных детерминант патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования», которые утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 19.01.2012 г.

1.6. Соответствие диссертации паспорту научной специальности

В соответствии с формулой специальность 06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» представляет собой область науки, изучающая систематику, структуру, физиологию, биохимию, генетику, экологию патогенных микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов), имеющих ветеринарное значение, эпизоотологические и экологические закономерности возникновения, распространения инфекционных болезней и иммунологию сельскохозяйственных, домашних и диких животных, изучающая и разрабатывающая методы, средства и организационные основы диагностики, лечения, профилактики и ликвидации этих болезней. В диссертационной работе приведены результаты исследований по разработке методов определения полных нуклеотидных последовательностей изолятов вируса ВПГП/H5N1, а также генетических маркеров, обуславливающих биологические свойства вируса, на основе ПЦР, их применению в лабораторной диагностике болезни, а также изучению молекулярно-биологических свойств изолятов ВГП.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам 1, 4, 5 паспорта специальности.

1.7. Апробация результатов работы

Результаты исследований по теме диссертации заслушаны и обсуждены на заседаниях учёного совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2008-2011 гг. Основные материалы диссертации были опубликованы и доложены на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010» (г. Москва, 2010 г.), Международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых – в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2010 г.).

1.8. Публикации научных исследований

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 2 работы опубликованы в изданиях, включенных в перечень ВАК РФ.

1.9. Основные положения, выносимые на защиту:

Метод определения первичной структуры генома изолятов ВГП/H5N1 генетической подгруппы Qinghai на основе ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования, позволяющий сократить количество амплифицируемых фрагментов генома.

Первичная структура генома изолятов ВГП/H5N1 генетической подгруппы Qinghai, выделенных в РФ в 2005-2006 гг.

Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генома изолятов вируса ВПГП/H5N1, выделенных в 2008-2010 гг. в России, с таковыми изолятов ВГП подтипа H5N1, выявленных и выделенных в странах Евразии в течение 2008-2011 гг.

Метод определения молекулярных маркеров патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса ВПГП A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования, позволяющий охарактеризовать ряд молекулярно-генетических свойств вируса данного подтипа в сжатые сроки.

1.10. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения. Список литературы включает 172 источников. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 19 таблицами.

Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2008-2011 гг. в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

1.11. Личный вклад соискателя

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывал к.б.н. Андриясов А.В. Автор выражает искреннюю благодарность коллективу лаборатории «Диагностики болезней сельскохозяйственных животных» за помощь и консультации при проведении исследований и оформлении отдельных глав диссертации.

2. Собственные исследования

       2.1. Материалы и оборудование

2.1.1. Вирус гриппа птиц

В работе использованы изоляты (21 изолят) вируса ВПГП/H5N1, выделенные из проб патологического материала, отобранных в различные промежутки времени в период с 2005 г. по 2010 г. Изоляты были отобраны на территории различных регионов Российской Федерации (республики Адыгея, Дагестан, Калмыкия, Тыва, Алтайский, Краснодарский и Приморский края, Волгоградская, Курганская, Новосибирская, Ростовская, Тульская и Тюменская области) и Украины (Крым) от различных видов домашних (гусь, индейка, курица, утка) и диких птиц (голубь, дикая утка, лебедь, пеганка, чомга) с целью последующей оценки изменений в структуре изолятов вируса, произошедших за указанный период времени.

2.1.2. Нуклеотидные последовательности ВГП

Для сравнительного и последующего филогенетического анализов были использованы полноразмерные нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные последовательности изолятов и штаммов вируса ВПГП подтипа H5N1 восьми сегментов генома, выделенных в период с 1996 г. по 2011 г. и опубликованные в международной базе данных GenBank электронного ресурса NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html).

2.1.3. Коммерческие наборы, ферменты

В процессе выделения РНК из образцов патологического материала, постановки ОТ-ПЦР, очистки наработанных ДНК-фрагментов, нуклеотидного секвенирования применяли коммерческие наборы следующих производителей: ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Qiagen, Applied Biosystems, Promega, Fermentas.

2.1.4. Растворы, буферные смеси, реагенты

Для приготовления растворов использовали химические реактивы компаний “Promega” (США), “Sigma” (США), а также отечественные реактивы категорий х.ч., о.с.ч.

2.1.5. Праймеры

В работе использовали оригинальные системы праймеров (таблицы 1 и 5) для определения полной нуклеотидной последовательности генома изолятов вируса ВПГП подтипа H5N1 генетической сублинии Qinghai (генетический клад 2.2.); праймеры для амплификации и определения первичной структуры фрагментов генома изолятов высокопатогенного ВГП/H5N1, выделенных в 2008-2011 гг. (генетический клад 2.3.2.).

2.2. Методы исследования

2.2.1. Подбор праймеров для ОТ-ПЦР

Выбор праймеров проводили с помощью сравнения и анализа полных нуклеотидных последовательностей штаммов и изолятов вируса ВПГП подтипа H5N1 генетической линии A/goose/Guangdong/96, кладов 2.2., 2.3.2., опубликованные в базе данных GenBank электронного ресурса NCBI и программы BioEdit.

2.2.2. Экстракция суммарной РНК

Вирусную РНК выделяли из ЭЭЖ, содержащей ВГП с помощью набора для выделения РНК/ДНК РИБО-сорб-100 согласно инструкции производителя.

2.2.3. Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция

Реакцию обратной транскрипции и собственно ПЦР проводили в одну стадию с использованием набора Qiagen OneStep RT-PCR Kit.

При адаптации метода ОТ-ПЦР для выявления генома вируса ВПГП/H5N1 были оптимизированы концентрации компонентов реакционной смеси, температурно-временной режим реакции. Реакцию проводили с использованием 25 мМ р-ра хлорида магния (Promega) и олигонуклеотидных праймеров. Реакционная смесь для проведения ОТ-ПЦР в расчете на одну реакцию (V= 20 мкл) состоит из 9,75 мкл деионизованной воды, 5,0 мкл буфера 5x для ОТ-ПЦР, 1,25 мкл раствора MgCl2 25мМ, 1,0 мкл раствора dNTP 10 мМ, 1,0 мкл раствора прямого праймера 10пмоль/мкл, 1,0 мкл раствора обратного праймера 10пмоль/мкл, 1,0 мкл смеси ревертазы и полимеразы. В приготовленную для ОТ-ПЦР смесь вносили 5,0 мкл выделенной РНК. Амплификацию проводили при следующих температурных режимах: 500С – 30 мин., 950С – 10 мин., и 37 циклов: 950С – 40 с, 550С – 40 с, 720С – 1 мин, по окончании всех циклов 720С – 7 мин.

2.2.4. Учет результатов ОТ-ПЦР

Результаты исследования учитывали путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в 2 % агарозном геле, окрашенном 0,001 % раствором бромида этидия.

2.2.5. Очистка продуктов ПЦР

По окончании электрофоретической реакции и анализу ее результатов фрагменты кДНК генома ВГП вырезали непосредственно из геля скальпелем и очищали с помощью набора ДНК-сорб-В согласно модернизированной нами инструкции производителя.

2.2.6. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов кДНК

Прямое секвенирование фрагментов кДНК ВГП осуществляли с помощью набора BigDye Terminator Cycle Sequencing kit («Applied Biosystems», США) согласно инструкции производителя.

Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов генома проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 согласно рекомендациям производителя (Applied Biosystems).

Амплифицированные фрагменты имели размер от 680 до 1080 п. н. При этом применение метода автоматического секвенирования позволило «прочитывать» нуклеотидные последовательности изолятов ВГП длиной 700-800 н. о. Для получения нескольких перекрывающихся фрагментов и более достоверного прочтения последовательности, для секвенирования использовали дополнительно подобранные внутренние праймеры.


2.2.7. Компьютерный анализ и сравнение первичных структур нуклеиновых кислот

Анализ нуклеотидных последовательностей ВГП проводили с помощью программы BioEdit версия 7.0.5.3. Выравнивание последовательностей осуществляли посредством программы множественного выравнивания ClustalW. Построение филогенетических деревьев проводили с помощью алгоритма NJ (в том числе с использованием метода численного ресэмплинга «бутстреп») в реализации пакета MEGA, версия 3.1. Для поиска наиболее близких последовательностей к последовательностям изучаемых в работе изолятов пользовались электронным ресурсом Megablast NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Для сравнения выбирали опубликованные ранее в международной базе GenBank последовательности изолятов ВГП/H5N1(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/).

3. Результаты собственных исследований

3.1. Оптимизация метода определения первичной структуры генома изолятов вируса ВПГП A/H5N1 генетической подгруппы Qinghai c помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования

В двухлетний период с 2005 по 2007 гг., прошедший с момента проникновения вирусов ВПГП H5N1 за пределы восточной и юго-восточной Азии, с различной полнотой были определены нуклеотидные последовательности нескольких сот изолятов вируса. Неоднократно проводили филогенетический анализ этих последовательностей [8, 11]. Результаты этого анализа показали, что все изоляты вируса ВПГП/H5N1, выделенные в России, Европе, Африке и западных регионах Азии, относятся к азиатской генетической линии A/Goose/Guangdong/1/96 ВГП H5N1, сублинии Qinghai, впервые выделенных от диких водоплавающих птиц в северо-западном Китае в 2005 году [4]. Нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные последовательности ВГП этой сублинии, выделенных в различных странах и континентах, широко представлены в международной базе GenBank.

В результате анализа нуклеотидных последовательностей изолятов вируса ВПГП A/H5N1 генетической линии A/goose/Guangdong/1/96, сублинии Qinghai были выбраны необходимые для амплификации и последующего секвенирования фрагменты восьми генов. Методом сравнительного анализа последовательностей определили консервативные участки, фланкирующие выбранные фрагменты генома, и осуществили дизайн олигонуклеотидных праймеров, таким образом, чтобы они были полностью идентичны консервативным участкам.

В результате проведенных исследований были выбраны системы праймеров для амплификации фрагментов полного генома в ОТ-ПЦР и последующего секвенирования (табл. 1).

Выявление генома вируса ВПГП/H5N1 в пробах аллантоисной жидкости эмбрионов SPF кур и последующее определение нуклеотидных последовательностей включает четыре этапа: выделение суммарной РНК из вируссодержащего материала, амплификацию фрагментов генома с помощью ОТ-ПЦР, детекцию амплифицированных фрагментов методом электрофореза, секвенирование.

В качестве исходного материала для выделения суммарной РНК вирусов ВПГП/H5N1 использовали вируссодержащую аллантоисную жидкость эмбрионов SPF кур.

При адаптации метода ОТ-ПЦР для выявления генома вируса ВПГП/H5N1 и последующего нуклеотидного секвенирования с целью повышения чувствительности, специфичности и скорости анализа были так же оптимизированы следующие параметры реакции: концентрации компонентов реакционной смеси, температурно-временной режим реакции.

Оптимизированный вариант ОТ-ПЦР за счет подбора системы праймеров и изменения вышеуказанных параметров реакции позволил на 29 % сократить количество амплифицируемых 22 фрагментов генома (в исходном варианте 31), а так же сэкономить время постановки реакции и сократить расходы на реагенты.

В ходе реакции амплифицировали фрагменты кДНК размером 640 - 1080 п. н. Анализ продуктов амплификации проводили электрофорезом в 2 % агарозном геле, окрашенном 0,001 % раствором бромида этидия.

Оптимизация условий выделения РНК и постановки ОТ-ПЦР проведена с использованием изолятов вируса ВПГП A/H5N1, выделенных в различных регионах Российской Федерации и Автономной Республики Крым, в период с 2005 по 2007 гг.

Таблица 1

Олигонуклеотидные пары праймеров, используемые для амплификации фрагментов генома изолятов вируса ВПГП A/H5N1 генетической подгруппы Qinghai в ОТ-ПЦР

Ген

Пары праймеров для ОТ-ПЦР (праймеры для секвенирования)

Длина фрагмента н.п.

Кол-во фраг-ов

PB2

QPBA1F- QPBA1077R (324F, 657F, 399R, 732R)

1080

4

QPBA657F- QPBA1404R (1077R, 996F)

750

QPBA996F- QPBA2057R (1327F, 1683F, 1404R, 1758R)

1050

QPBA1683F- QPBA2319R (1986F, 2057R)

640

PB1

QPBB1F- QPBB1039R (314F, 652F, 385R, 727R)

1040

4

QPBB652F- QPBB1402R (970F, 1039R)

750

QPBB970F- QPBB2044R (1333F, 1669F, 1402R, 1744R)

1070

QPBB1669F- QPBB2319R (1970F, 2044R)

650

PA

QPA1F- QPA826R (371F, 455R)

825

4

QPA746F- QPA1543R (1125F, 1196R)

800

QPA1125F- QPA1916R (1472F, 1543R)

800

QPA1472F- QPA2212R (1846F, 1916R)

740

H

QHA1F- QHA767R (359F, 449R)

770

3

QHA683F- QHA1421R (1013F, 1082R)

750

QHA1013F- QHA1760R (1349F, 1421R)

750

NP

QNP1F- QNP835R (415F, 487R)

835

3

QNP415F- QNP1216R (775F, 835R)

800

QNP775F- QNP1556R (1149F, 1216R)

780

N

QNA20F- n1_nov_934r (358F, 698F, 427R, 769R)

915

2

QNA698F- QNA1387R (1051F, 1120R)

700

M

QMP20F- QMP1022R (358F, 665F, 415R, 715R)

1000

1

NS

QNS20F- NS878R (322F, 625F, 385R, 694R)

860

1

*В скобках указаны праймеры, используемые дополнительно для секвенирования соответствующих фрагментов генома изолятов вируса ВПГП/H5N1.

Применение метода автоматического секвенирования с использованием наборов BigDye Terminator Cycle Sequencing kit позволило «прочитывать» нуклеотидные последовательности изолятов ВГП длиной 700-800 н. о. Однако, для секвенирования фрагментов генома дополнительно использовали праймеры c целью получения нескольких перекрывающихся фрагментов для более достоверного прочтения последовательности.

В некоторых случаях максимальное число перекрывающихся фрагментов достигало шести. Минимальное количество перекрывающихся фрагментов равнялось двум. С помощью внутренних праймеров определяли последовательности фрагментов длиной 400-450 н. о., в некоторых случаях с генами M и NS – менее 350 н. о. и таким образом, повышали надежность исследований.

С использованием разработанной методики по определению первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 генетической подгруппы Qinghai c помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования достоверно определены последовательности всех генов пяти изолятов вируса ВПГП A/H5N1 (A/goose/Altai/0318/05, A/swan/Kalmykia/0540/05, A/turkey/Tula/0551/05, A/wild_duck/Tumen/0233/05, A/grebe/Tyva/0805/06).

3.2. Генетический анализ изолятов вируса ВПГП/H5N1

С помощью разработанного метода для детальной молекулярно-генетической характеристики вируса и изучения его биологических свойств проведен анализ полноразмерных нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей генома пяти изолятов вируса ВПГП/H5N1, выделенных в различных регионах РФ на протяжении второй половины 2005 г. и в 2006 г.

В результате проведенного филогенетического анализа было установлено, что ближайшими аналогами исследуемых изолятов по всем сегментам генома, являются высоковирулентные ВГП, выделенные в мае-июне 2005 г. во время вспышки ВПГП/H5N1 у диких птиц водного и околоводного комплексов (гуси, чайки) в северо-западном Китае [4]. В работе представлено филогенетическое древо по последовательностям гена Н (рис. 1).

В результате проведенного сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей изученных изолятов установлено, что отличия между ними находятся в пределах 0,14-1,39%.

Последовательности вирусов, выделенных в 2005 г., гомологичны между собой более чем на 99% по всем сегментам генома. По генам PB2, PB1, PA, NP, N изолят A/grebe/Tyva/0805/06 сходен с остальными исследованными вирусами на 99% и более, однако по генам M, NS и особенно H наблюдаются несколько большие отличия (максимальное для Н – 1,39%).

Наиболее гомологичными являются аминокислотные последовательности белков PB2 (по одной замене), за исключением изолята A/turkey/Tula/0551/05, у которого выявлено пять замен по сравнению с другими характеризуемыми ВГП, PA (2-3 замены), NP (1-2 замены), М1 (0-1 замены), М2 (0-2 замены). Аминокислотные последовательности белка М1 полностью идентичны у четырех изолятов кроме A/swan/Kalmykia/0540/05. Наибольшей степенью отличия обладают последовательности белка NS1 (3-5 замен).

Рис. 1. Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена Н штаммов и изолятов ВГП генетической линии A/Goose/Goangdong/1/96 (H5N1)

*Цифрой 1 обозначены изоляты и штаммы генетической сублинии Qinghai, выделенным шрифтом – изоляты, описываемые в работе.

Проведен сравнительный анализ аминокислотных остатков белков изолятов ВГП, определяющих степень патогенности, рецепторную специфичность вируса и его чувствительность к некоторым лекарственным препаратам в соответствии с известными данными литературы.

Гемагглютинин является одним из основных белков, определяющих видовую специфичность вируса гриппа и его патогенность. Рецепторная специфичность ВГ варьирует в зависимости от вида организма, от которого выделили вирус. ВГ человека распознают сиалилолигосахариды, заканчивающиеся N-ацетилсиаловой кислотой, связанной с галактозой 2,6 связью (Neu5 aс 2-6Gal), вирусы гриппа птиц и лошадей распознают N-ацетилсиаловую кислоту, связанную с галактозой 2,3 связью (Neu5 aс 2-3Gal). Наличие глутамина (Q) в позиции 226 и глицина (G) в позиции 228 (нумерация указана по последовательности подтипа Н3) указывает на то, что вирус несет сайт, который связывается с поверхностным рецептором Neu5 acα (2-3)- Gal, характерным для клеток птиц [5]. В рецептор-связывающем участке гемагглютинина исследуемых изолятов в указанных позициях находятся аминокислотные остатки, характерные для ВГП.

Согласно данным литературы в структуре гемагглютинина есть несколько аминокислот, расположенных в области связывания с рецепторами, и являющиеся консервативными для изолятов от птиц и отличающиеся от соответствующих аминокислот у изолятов тех же подтипов, выделенных от млекопитающих [1, 2]. Предположительно, даже минимальные изменения в молекуле гемагглютинина могут привести к изменению спектра хозяев вируса [1].

В табл. 2 указаны аминокислотные остатки белка гемагглютинина, определяющие рецепторную специфичность, характерную для вирусов гриппа птиц подтипа Н5 и ВГ человека. В исследованных изолятах во всех указанных позициях находятся аминокислотные остатки, характерные для ВГП.

Вирусы ВПГП H5N1 способны инфицировать человека, не смотря на то, что их гемагглютинин преимущественно взаимодействует с 2,3 клеточными рецеп-торами [1, 17]. Существует предположение, что инфицирование человека изоля-тами от птиц определяется не только изменениями в рецептор-связывающем доме-не HA, но и в структуре других белков вируса. В табл. 3 указаны аминокислотные остатки белков, определяющие спектр хозяев ВГ человека и ВГП [1, 13].

Таблица 2

Аминокислотные остатки белка гемагглютинина, определяющие рецепторную специфичность вируса гриппа

№ (по Н3 подтипу)

Altai/

318/05

Tumen/

233/05

Tula/

551/05

Kalmykia/

540/05

Tyva/

805/06

ВГ птиц/

H5

ВГ человека

136

S

S

S

S

S

S

T

153

W

W

W

W

W

W

-

158

N

N

N

D

N

N/D

N

159

N

N

N

N

D

N

S

183

H

H

H

H

H

H

-

190

E

E

E

E

E

E

D

194

L

L

L

L

L

L

I

221

S

S

S

S

S

S

P

222

K

R

K

K

K

K

-

225

G

G

G

G

G

G/N

D

226

Q

Q

Q

Q

Q

Q

L/I

227

S

S

S

S

S

S

A

228

G

G

G

G

G

G

S

У всех исследованных изолятов в трех позициях (627K белка PB2, за исключением изолята A/turkey/Tula/0551/05, 33I белка NP, 28V белка M2 кроме A/swan/Kalmykia/0540/05) находятся аминокислотные остатки, характерные для ВГЧ. Во всех остальных позициях отмечены аминокислотные остатки, характерные для ВГП.

Полученные данные указывают на то, что описываемые в работе изоляты ВГП/H5N1 обладают выраженным тропизмом к клеткам птиц и практически не имеют аминокислотных замен, связанных с инфекционностью для человека.

В результате сравнительного анализа аминокислотной последовательности гемагглютинина характеризуемых изолятов было установлено, что сайт протеолитического разрезания белка имеет структуру SPQGERRRKKR, характерную для высоковирулентных изолятов ВГП.

Таблица 3

Аминокислотные остатки, определяющие спектр хозяев вируса гриппа

Белок/№ позиции

Altai/

318/05

Tumen/

233/05

Tula/

551/05

Kalmykia/

540/05

Tyva/

805/06

ВГ птиц

ВГ человека

PB2

44

A

A

A

A

A

A

S

81

T

T

T

T

T

T

M

199

A

A

A

A

A

A

S

271

T

T

T

T

T

T

A

588

A

A

A

A

A

A

I

613

V

V

V

V

V

V

I

627

K

K

E

K

K

E

K

661

A

A

A

A

A

A

T

674

A

A

A

A

A

A/S

T

701

D

D

D

D

D

D

N

702

K

K

K

K

K

K

R

PA

28

P

P

P

P

P

P

L

55

D

D

D

D

D

D

N

65

S

S

S

S

S

S

L

100

V

V

V

V

V

V

A

356

K

K

K

K

K

K

R

382

E

E

E

E

E

E

D

400

S

S

S

S

S

Q/T/S

L

409

S

S

S

S

S

S

N

552

T

T

T

T

T

T

S

NP

33

I

I

I

I

I

V

I

61

I

I

I

I

I

I

L

100

R

R

R

R

R

R

V

109

I

I

I

I

I

I

V

136

L

L

L

L

L

L

M

214

R

R

R

R

R

R

K

283

L

L

L

L

L

L

P

293

R

R

R

R

R

R

K

313

F

F

F

F

F

F

Y

375

D

D

D

D

D

D

G/E

M1

137

T

T

T

T

T

T

A

M2

16

E

E

E

E

E

E

G

20

S

S

S

S

S

S/N

N

28

V

V

V

F

V

I

I/V

55

L

L

L

L

L

L

F

78

Q

Q

Q

Q

Q

Q

K

NS1

227

E

E

E

E

E

E

G

NS2

70

S

S

S

S

S

S

G

С использованием методов обратной генетики было показано, что единичная аминокислотная замена Е (глутаминовая кислота) на К (лизин) в позиции 627 в белке PB2 приводит к увеличению вирулентности для млекопитающих [17]. Вирусы ВПГП H5N1 с К627 в РВ2 проявляли нейровирулентные свойства при заражении мышей, тогда как вирусы с Е627 не являлись летальными и их распространение ограничивалось легкими животных.

У четырех исследованных изолятов в позиции 627 в РВ2 расположен лизин. У изолята A/turkey/Tula/0551/05 в описываемой позиции – глутаминовая кислота.

Белок нейраминидаза играет существенную роль в освобождении новообразованных вирусных частиц от поверхностных сиаловых кислот зараженной клетки. У всех представленных в исследовании изолятов вируса ВПГП/H5N1 выявлена 20-аминокислотная делеция в позициях (49-68) в структуре ножки нейраминидазы.

Делеция в гене нейраминидазы описана Matrosovich и соавт. [19], как следствие адаптации вируса ВПГП H5N1 водоплавающих птиц к наземной домашней птице.

Делеция 5 аминокислот в белке NS1 в позициях 80-84, а также ранее описанная 20-аминокислотная делеция в позициях 49-68 нейраминидазы указывают на то, что исследуемые изоляты относятся к генотипу Z вирусов ВПГП/H5N1, выделенных позднее 2000г [7]. К данному генотипу относятся практически все вирусы ВПГП H5N1, выделенные в странах Азии, Европы и Африки в 2005-2007 гг. Предполагалось, что констелляция генов вирусов генотипа Z еще не полностью адаптирована к клеткам организма домашних птиц, что возможно повлечет за собой дальнейшую эволюцию ВГП генотипа по средствам мутаций или реассортаций в геноме [9].

Присутствие в исследуемых вирусах в позиции 92 аспарагиновой кислоты (D) в белке NS1 указывает на их способность подавлять противовирусный ответ на основе интерферонов в организме хозяина [2]. Аспарагиновая кислота в данной позиции ассоциирована с резистентностью к антивирусным цитокинам в клетках организма свиней [16].

Наличие аминокислотных остатков L26 (лейцин), V27 (валин), A30 (аланин), S31 (серин), G34 (глицин) в белке М2 исследуемых изолятов ВГП указывает на их потенциальную чувствительность к амантадину и римантадину [1, 2]. В позиции 275 белка NА расположен гистидин, указывающий на чувствительность вируса к озельтамивиру – ингибитору нейраминидазной активности вируса, применяемому для профилактики и лечения гриппа [13].

3.3. Разработка метода определения генетических маркеров изолятов вируса ВПГП/H5N1, выделенных в России

На первом этапе разработки метода было необходимо определить филогенетические связи вирусов ВПГП/H5N1, выделенных в России в 2008-2010 гг., и азиатских изолятов 2007-2011 гг. Изоляты, выделенные в России в 2008-2010, принадлежат кладу 2.3.2 азиатской линии A/Gs/Gd/96 вируса ВПГП/H5N1 по гену Н (рис. 2).

Рис. 2. Дендрограмма, построенная по последовательностям гена Н изолятов вируса ВПГП/H5N1

*Цифрой 1 обозначены изоляты генетического клада 2.3.2. линии A/Gs/Gd/96.

Появление этого клада относится к 2003-2005 гг. и был представлен изолятами из южного Китая (в т.ч. Гонконга) и Вьетнама. Предположительно, в 2007 году произошла реассортация генов Н и NP клада 2.3.2 с остальными сегментами другого широко распространенного в это время в Китае клада 2.3.4 [10]. Такая констелляция наблюдалась у изолятов из Японии, Южной Кореи и России (A/chicken/Primorsky/85/08), выделенных в 2008 г.

В 2009 г. в провинции Qinghai западного Китая [18], Монголии [10] и России от диких перелетных птиц были выделены вирусы клада 2.3.2, которые по 7 сегментам генома были близки вирусам 2008 года, но значительно отличались от последних по сегменту РА. Вычисленные значения различий нуклеотидных последовательностей изолятов A/chicken/Primorsky/85/08 и A/grebe/Tyva/100/09 представлены в табл. 4.

Таблица 4

Отличие нуклеотидных последовательностей сегментов генома изолятов Primorsk/85/08 и Tyva/100/09 (в%).

Название

PB2

PB1

PA

H

NP

N

M

NS

A/chicken/Primorsky/85/08

-

-

-

-

-

-

-

-

A/grebe/Tyva/100/09

2.3

1.0

5.4

2.0

1.0

0.9

1.4

1.85

К сформированной в 2009 году констелляции генов относятся вирусы ВПГП/H5N1, выделенные в Монголии и России в 2010 г., а так же в 2011 г. в Японии среди диких водоплавающих птиц.

На основании литературных данных было определено, что генетические маркеры, влияющие на биологические свойства изолятов вируса ВПГП A/H5N1,  расположены в генах PB2, H, N, M, NS.

С учетом этого был осуществлен подбор праймеров (таблица 5) для ОТ-ПЦР и последующего нуклеотидного секвенирования фрагментов генома изолятов ВПГП/H5N1.

Преимущественно для анализа привлекали последовательности ВГП генетического клада 2.3.2., поскольку именно изоляты данного клада широко распространены в странах юго-восточной части Азии и потенциально могут быть занесены на территорию РФ с мигрирующими на большие расстояния водоплавающими птицами.

Таблица 5

Праймеры для амплификации и определения первичной структуры фрагментов генов вируса ВПГП A/H5N1 кладов 2.2., 2.3.2.

Обозначение

Ген

Длина фрагмента н.п.

Цель использования

APBA1683F

PB2

450

маркер вирулентности для млекопитающих (позиция аминокислоты: 627)

2135RPB2

aivH5_av_667F

Н

530

сайт разрезания белка гемагглютинина для определения потенциальной патогенности вируса для птиц

aivH5_av_1197R

AAH410F

690

определение видовой специфичности вируса по аминокислотам в рецепторсвязывающем участке НА (позиция аминокислот: 226, 228)

H5gg_1100R

n1_nov_450f

N

650

маркеры резистентности к озельтамивиру (тамифлю (позиция аминокислот: 275, 293, 295)

AAN1100R

MP665F

М

330

маркеры резистентности к препаратам (амантадин, ремантадин (позиция аминокислот: 26, 27, 30, 31, 34)

MP1003R

NS20F

NS

540

маркер регуляции экспрессии белков в инфицированных клетках, влияет на вирулентность вируса (позиция аминокислоты в белке NS1: 92)

NS563R

Оптимизацию параметров реакции проводили по тому же принципу, что и для методики определения первичной структуры генома изолятов вируса ВПГП/H5N1 сублинии Qinghai с использованием изолятов вируса ВПГП A/H5N1 различных генетических подгрупп, выделенных в регионах Российской Федерации и Автономной Республике Крым в период с 2005 по 2010 гг.

С помощью оптимизированной ОТ-ПЦР проводили амплификацию фрагментов генома изолятов вируса ВПГП/H5N1 (6 фрагментов, включающих основные молекулярные детерминанты) и после этапов секвенирования и компьютерного анализа в краткие сроки (1 – 2 суток) получали информацию о молекулярных маркерах, определяющих эпизоотологически значимые свойства вируса.

4. Выводы

  1. Оптимизирован метод по определению первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 генетической подгруппы Qinghai c помощью ОТ-ПЦР и секвенирования, с помощью которого определены полные нуклеотидные последовательности генома пяти исследуемых изолятов вируса ВПГП/H5N1.
  2. Проведен детальный молекулярно-генетический анализ полных нуклеотидных последовательностей пяти исследуемых изолятов вируса ВПГП/H5N1, в результате которого установлено, что отличия между ними находятся в пределах 0,14-1,39%, а их ближайшими аналогом являются высоковирулентные ВГП, выделенные в мае-июне 2005 г. во время вспышки ВПГП/H5N1 у диких птиц водного и околоводного комплексов (гуси, чайки) в северо-западном Китае.
  3. Проведенный филогенетический анализ по гену Н изолятов ВГП Н5N1, выделенных на территории Российской Федерации в 2008-2010 гг. показал, что все они относятся к генетическому кладу 2.3.2 азиатской линии вируса A/goose/Guangdong/1/96 ВПГП/H5N1.
  4. Результаты филогенетического анализа исследуемых изолятов наглядно демонстрируют, что степень изменчивости вирусов гриппа, распространявшихся по территории Российской Федерации в 2005 -2006 году была незначительной.
  5. Проведенный в ходе исследований анализ генетических маркеров вирулентности, рецепторной специфичности и резистентности к препаратам, применяемым для профилактики и лечения гриппа у человека, показал, что изученные изоляты вируса гриппа, за исключением изолята A/turkey/Tula/0551/05, обладают высокой инфекционностью и вирулентностью для домашних кур и индеек, а также потенциально вирулентны для млекопитающих. Установлено, что все исследованные изоляты обладают маркерами чувствительности к препаратам, применяемым для лечения и профилактики гриппа в здравоохранении.
  6. Применение в диагностике разработанного метода по определению генетических маркеров патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования позволяет охарактеризовать ряд молекулярно-генетических свойства вирусов данного подтипа в сжатые сроки (1 – 2 суток).

5. Практические предложения

Метод по определению первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 генетической подгруппы Qinghai c помощью ОТ-ПЦР и секвенирования может быть использован в лабораторной практике для последующей подробной характеристики нуклеотидных последовательностей.

Применение в диагностике  метода по определению генетических маркеров патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования рекомендуется для характеристики ряда молекулярно-генетических свойств вирусов данного подтипа.

«Методические положения по определению первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 генетической подгруппы Qinghai c помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования» и  «Методические положения по определению молекулярных детерминант патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования», утвержденные директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 19.01.2012 г., рекомендованы для практического применения в научно-исследовательских и диагностических лабораториях.

6. Список использованной литературы

1.        Изоляты вируса гриппа подтипа H5N1, выделенные от домашней птицы в Курганской области в 2005 году: молекулярно-генетическая характеристика / О. И. Киселев, В. М. Блинов, М. М. Писарева [и др.] // Молекулярная биология. – 2008. – Т.42, №1. – С.78-87.

2.        Изоляция и молекулярная характеристика вирусов гриппа А/H5N1, выделенных во время вспышек гриппа у птиц в 2005 г. в европейской части России: выделение штамма вируса с мутацией устойчивости к озельтамивиру / С.Б. Яцышина, А.М. Шестопалов, В.А. Евсеенко [и др.] // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. –  2008. – № 1. – С. 26-34.

3.        Alexander, D. J. A review of avian influenza in different bird species // Vet. Microbiol. – 2000. – Vol. 74. – P. 3-13.

4.        Avian flu: H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl / H. Chen, G.J. Smith, S.Y. Zhang [et al.] // Nature – 2005. - Vol. 436. –P. 191-192.

5.        Avian influenza a viruses differ from human viruses by recognition of sialyloligosaccharides and gangliosides and by a higher conservation of the HA receptor-binding site / M.N. Matrosovich, A.S. Gambaryan, S. Teneberg [et al.] // Virology. – 1997. – Vol. 233. – P. 224-234.

6.        Avian influenza in Italy 1997-2001 / I. Capua, S. Marangon, M. dalla Pozza [et al.] // Avian Dis. – 2003. - Vol. 47. – P. 839-843.

7.        Evolution and adaptation of H5N1 influenza virus in avian and human hosts in Indonesia and Vietnam / G. Smith, T. Naipospos, T. Nguyen [et al.] // Virology. – 2006. – Vol. 350. – P. 258-268.

8.        Feare, C. J. The role of wild birds in the spread of HPAI H5N1 // Avian Dis. – 2007. – Vol. 51. – P. 440-447.

9.        Genesis of highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in Eastern Asia / K.S. Li, Y. Guan, J. Wang [et al.] // Nature. – 2004. – Vol. 430. – P. 209-213.

10.        Genetic analyses of H5N1 avian influenza virus in Mongolia, 2009 and its relationship with those of eastern Asia / H.M. Kang, D. Batchuluun, M.C. Kim [et al.] // Vet. Microbiol. – 2011. – Vol. 147. – P. 170-175.

11.        Genome analysis linking recent european and african influenza (H5N1) viruses / S. L. Salzberg, C. Kingsford, G. Cattoli [et al.] // Emerging Infect. Dis. – 2007. – Vol. 13. – P. 713-718.

12.        Highly pathogenic avian influenza // Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines/ O.I.E. - 2009.

13.        Highly pathogenic avian influenza subtype H5N1 in Africa: a comprehensive phyligenetic analysis and molecular characterization of isolates / G. Cattoli, I. Monne, A. Fusaro [et al.] // PLoS. – 2009. – Vol. 4. – P. 1-9.

14.        Highly pathogenic H5N1 influenza virus infection in migratory birds / J. Liu, H. Xiao, F. Lei [et al.] // Science. – 2005. – N 309. – P. 1206.

15.        Investigation of outbreaks of highly pathogenic H5N1 avian influenza in waterfowl and wild birds in Hong Kong in late 2002 / T. M. Ellis, R. B. Bousfield, L. A. Bissett [et al.] // Avian Pathol. – 2004. – Vol. 33. – P. 492–505.

16.        Lee, C.W. Avian influenza virus: prospects for prevention and control by vaccination / C.W. Lee, D.L. Suarez //Anim. Health. Res. Rev. – 2005. – № 6. – P. 1-15.

17.        Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses / M. Hatta, P. Gao, P. Halfmann, Y. Kawaoka // Science. – 2001. – Vol. 293, № 5536. – P. 1773-1775.

18.        New avian influenza virus (H5N1) in wild birds, Qinghai, China / Y. Li, L. Liu, Y. Zhang [et al.] // Emerging Infect. Dis. – 2011. – Vol. 17. – P. 265-267.

19.        The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties / M. Matrosovich, N. Zhou, Y. Kawaoka, R. Webster // J. Virol. – 1999. – Vol. 73, № 2. – P. 1146-1155.

7. Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Молекулярная характеристика гемагглютинина изолятов вируса гриппа птиц А/Н5N1, выделенных на территории Российской Федерации в 2005 году / А.В. Андриясов, М.В. Новикова, И.П Пчёлкина, Л.О. Щербакова, С. Н. Колосов, Н.Г. Зиняков, И.А. Чвала, Т.Б. Манин, Н.С. Мудрак, В.В.Дрыгин // Ветеринария и кормление. – 2010. – № 6. – С. 8-10.
  2. Молекулярная характеристика изолята вируса гриппа птиц А/Н5N1, выделенного в Республике Тыва в 2009 году / А.В. Андриясов, М.В. Новикова, Н.Г. Зиняков, И.А. Чвала, И.П Пчёлкина, Н.С. Мудрак, В.В.Дрыгин // Молекулярная диагностика – 2010: сб. тр. VII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – М., 2010. – Т. 2. – С. 42-44.
  3. Новикова, М.В. Идентификация подтипа изолятов вируса гриппа птиц, выделенных в Российской Федерации в 2005-2007 годах / М.В. Новикова,  А.В.  Андриясов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2011. – Т. 9. – С. 75-84.
  4. Новикова, М.В. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1, выделенных в России в 2005 году / М.В. Новикова,  А.В.  Андриясов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2011. – Т. 9. – С. 63-74.
  5. Изучение молекулярно-биологических свойств изолятов вируса гриппа птиц A/H5N1, выделенных в Российской Федерации и Республике Крым в 2005 году / М.В. Новикова, А.В. Андриясов, И.А. Чвала, Н.Г. Зиняков, Н.А. Власов // Ветеринария. – 2011. – № 10. – С. 30-33.

8. Список сокращений

ВГ – вирус гриппа

ВГП – вирус гриппа птиц

ВПГП – высокопатогенный грипп птиц

ГП – грипп птиц

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

н. о. – нуклеотидное основание

ОТ-ПЦР – обратно транскриптазная полимеразная цепная реакция

РНК – рибонуклеиновая кислота

ЭЭЖ – экстра эмбриональная жидкость

SPF – свободный от специфических патогенов

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии,

г. Покров Владимирской области

Тираж 80 экз.

 



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.