WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

       На правах рукописи

ГЛОТОВА

АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОСТЕОПЛАСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА НА ОСНОВЕ АНТИОКСИДАНТА «ТИОФАН»
ДЛЯ ЗАМЕЩЕНИЯ ДЕФЕКТА КОСТНОЙ ТКАНИ

06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных,

патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Саранск – 2012

Работа выполнена на кафедре химии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новосибирский государственный педагогический университет»

Научный руководитель:  доктор биологических наук

Сахаров Андрей Валентинович

Официальные оппонентыдоктор биологических наук, профессор

Зенкин Александр Сергеевич

(Мордовский государственный университет
им. Н. П. Огарёва, г. Саранск, заведующий кафедрой)

кандидат биологических наук, доцент

Грызлова Лариса Владимировна

(Мордовский государственный педагогический институт им. М. Е. Евсевьева, г. Саранск, доцент кафедры)

Ведущая организация:           Красноярский государственный аграрный университет, г. Красноярск

Защита диссертации состоится «24» мая 2012 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.117.15 при ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарёва» по адресу:
г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке
им. М. М. Бахтина Мордовского государственного университета
им. Н. П. Огарёва.

Объявление о защите и автореферат диссертации размещены на официальном сайте Мордовского государственного университета
им. Н. П. Огарёва www.mrsu.ru и интернет-сайте ВАК http://vak2.ed.gov.ru

Автореферат разослан «____» апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Романова Т. А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.



Актуальность темы. Одной из наиболее важных задач хирургической стоматологии, челюстно-лицевой и пластической хирургии является разработка технологий управления репаративной регенерацией костной ткани и восстановления дефектов костного органа. Пристальное внимание исследователей к проблеме восстановления дефектов костной ткани обусловлено высокой частотой ортопедических патологий и разнообразием послеоперационных осложнений (А. И. Грудянов и др., 2003; R. Xin et al., 2005; Л. А. Григорьянц и др., 2007; Л. А. Дмитриева и др., 2007; Л. Хенч, 2007; А. В. Павленко и др., 2008; М. А. Тихоновский и др., 2008).
В отечественной и зарубежной литературе приводятся сведения об успешном использовании для восстановления объема утраченной костной ткани биоматериалов или их синтетических аналогов (С. Mangano et al., 2003;
А. В. Волков, 2005; Е. И. Шишацкая, 2007; Т. Б. Бухарова и др., 2009;
Н. С. Сергеева и др., 2009; Р. В. Деев и др., 2011). Использование биокомпозиционных материалов на основе гидроксиапатита, коллагена и сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ) характеризуется высокой эффективностью, широким диапазоном возможного применения и способствует более активному течению регенерации в костной ране
(В. Н. Борисов и др., 1999; М. В. Дунаев и др., 2005; С. Ю. Иванов и др., 2005; А. А. Кулаков и др., 2009).

Уменьшение сроков формирования органотипического регенерата в области костного дефекта достигается дополнительным введением в состав остеопластических композиций различных биологически активных веществ (H. Iwata et al., 2002; А. А. Булатов и др., 2005; К. С. Десятниченко и др., 2006; Н. В. Дедух и др., 2008). По данным клинических испытаний и экспериментальных исследований на животных наиболее эффективными остеопластическими материалами зарекомендовали себя препараты «Остеопласт», «AlgOss», «Биальгин», «Биоматрикс», «Остеоматрикс», «Коллапан» и др. (К. С. Десятниченко и др., 2004; А. В. Волков, 2005;
Л. А. Григорьянц и др., 2007; Л. А. Дмитриева и др., 2007; Г. Н. Берченко и др., 2008; А. В. Павленко и др., 2008). Область применения этих материалов различна – от заполнения костных дефектов после удаления зуба и воспалительных процессов в тканях челюсти до масштабных остеозамещающих операций (Л. А. Григорьянц и др., 2007;
К. С. Десятниченко и др., 2008; И. Я. Бозо и др., 2010).

Несмотря на широкий выбор современных материалов для костной пластики, многие из известных препаратов имеют ряд существенных недостатков, связанных со свойствами биодеградации и биосовместимости, отсутствием стабильно прогнозируемой эффективности, что негативно отражается на сроках формирования и качестве регенерата.

Анализ публикаций зарубежных и отечественных авторов свидетельствует, что в настоящее время отмечается повышенный интерес исследователей к поиску новых и совершенствованию известных остеопластических материалов для восстановления дефектов костной ткани (Л. А. Григорьянц и др., 2007; Р. В. Деев и др., 2007; А. М. Савинцев и др., 2007; Н. В. Дедух и др., 2008; К. С. Десятниченко и др., 2008; А. В. Павленко и др., 2008; Т. Б. Бухарова и др., 2009; Н. С. Сергеева и др., 2009; И. Я. Бозо и др., 2010; О. А. Соловьёва, 2010; А. И. Ярёменко и др., 2011). Наиболее перспективные подходы к восстановлению костных дефектов основываются на достижениях тканевой инженерии. Ключевым аспектом данного подхода является получение имплантатов-носителей с заданными свойствами, способных оказывать селективное действие на клетки тканей реципиента, индуцируя миграцию остеогенных клеток-предшественников из стволовых компартментов, их пролиферацию и дифференцировку (А. В. Волков, 2005; А. С. Гусева и др., 2007; А. М. Савинцев и др., 2007; Д. С. Десятниченко и др., 2008; И. Я. Бозо и др., 2010; Р. В. Деев и др., 2007, 2011). Важно отметить, что при использовании остеозамещающих технологий должны учитываться не только свойства материала для замещения костного дефекта, но и структурно-функциональные особенности костной ткани. Тесная гисто-топографическая связь костной ткани и желтого костного мозга, с высоким содержанием в его клетках жирных кислот, определяет возможность развития реакций свободнорадикального перекисного окисления липидов (СПОЛ) в условиях хирургической травмы костного органа.

Установлено, что развитие СПОЛ в пределах поврежденного компартмента оказывает негативное влияние на процесс регенерации костной ткани (Н. К. Зенков и др., 2001; Е. Б. Меньщикова и др., 2006, 2008). Роль активных кислородных метаболитов (АКМ) в механизмах репаративной регенерации костной ткани остается одной из наименее изученных проблем свободнорадикальной биологии и медицины (Ю. А. Владимиров и др., 1991, 2002; Е. Б. Меньщикова и др., 2006). Тканезамещающая технология, таким образом, должна не только обеспечивать восстановление костного дефекта, но и снижать повреждающее действие свободных радикалов. Использование антиоксидантов в комплексной профилактике и терапии патологических состояний, сопровождающихся активизацией оксидативных процессов в организме, научно обосновано. По данным многочисленных научных исследований А. Е. Просенко и др. (2000–2010) антиоксидант нового поколения «Тиофан» является высокоэффективным полифункциональным синтетическим антиоксидантным соединением, который не имеет отечественных и зарубежных аналогов, и его интенсивные исследования продолжаются до настоящего времени. В этой связи разработка тканезамещающей технологии с использованием нового остеопластического материала на основе антиоксиданта «Тиофан» определяет актуальность настоящего исследования.

1.2. Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучить свойства нового остеопластического материала на основе антиоксиданта «Тиофан» in vitro и in vivo при пластике дефекта костной ткани в эксперименте на лабораторных животных.

Задачи исследования:

  1. Получить новый остеопластический материал на основе антиоксиданта «Тиофан» для замещения дефекта костной ткани.
  2. Изучить параметры биосовместимости и биодеградации нового остеопластического материала при его подкожной имплантации лабораторным животным.
  3. Исследовать цитотоксические свойства остеопластического материала в культуре клеток in vitro.
  4. Провести сравнительное изучение процессов липопероксидации в организме экспериментальных животных в условиях хирургической травмы нижней челюсти и замещения дефекта костной ткани остеопластическим материалом на основе антиоксиданта «Тиофан» и широко используемым в хирургической стоматологии материалом «КоллапАн-М».
  5. Оценить эффективность восстановления дефекта костной ткани при использовании нового остеопластического материала на основе антиоксиданта «Тиофан» и остеопластического материала «КоллапАн-М» в сравнительном аспекте.

1.3. Научная новизна. Впервые получен новый остеопластический материал «ТИОПРОСТ» на основе антиоксиданта нового поколения «Тиофан» для замещения дефектов костной ткани.

В эксперименте на лабораторных животных впервые исследованы параметры биосовместимости и биодеградации остеопластического материала «ТИОПРОСТ» на основе антиоксиданта «Тиофан» при его подкожной имплантации. Изучены цитотоксические свойства на культуре клеток in vitro остеопластического материала «ТИОПРОСТ». Впервые проведено замещение дефекта костной ткани нижней челюсти у лабораторных животных с использованием нового остеопластического материала «ТИОПРОСТ» на основе антиоксиданта «Тиофан». Впервые исследованы показатели остеоиндуктивности, остеокондуктивности, биоинтеграции и биодеградации остеопластического материала «ТИОПРОСТ». Исследованы особенности посттравматической регенерации костной ткани при замещении дефекта нижней челюсти материалом «ТИОПРОСТ» и материалом «КоллапАн-М» в сравнительном аспекте.

Основные положения, выносимые на защиту:

        1. Остеопластический материал «ТИОПРОСТ» на основе антиоксиданта «Тиофан» имеет оптимальные показатели биодеградации и не проявляет заметных провоспалительных и токсических свойств in vivo и
          in vitro.
        2. Интенсивные свободнорадикальные процессы на уровне организма и тканей нарушают ход пролиферации и дифференцировки клеток остеогенного дифферона в зоне поврежденного компартмента в условиях хирургической травмы костного органа.
        3. При имплантации в область дефекта костной ткани остеопластический материал «ТИОПРОСТ» обладает оптимальными показателями остеокондукции, остеоиндукции, биоинтеграции, биодеградации и достоверно снижает сроки формирования органотипического регенерата по сравнению с материалом «КоллапАн-М» более чем на 1 месяц.

1.4. Научно-практическая значимость работы. Получен новый остеопластический материал «ТИОПРОСТ» на основе антиоксиданта «Тиофан» для замещения дефектов костной ткани. Свойства «ТИОПРОСТа» позволяют надежно и максимально полно заполнить объем костного дефекта данным материалом и в течение 15–18 минут придать костному органу требуемую анатомическую форму. Данные свойства остеопластического материала «ТИОПРОСТ» чрезвычайно актуальны при проведении органосохраняющих операций. При имплантации в область костного дефекта материал «ТИОПРОСТ» в процессе биодеградации оптимизирует развитие фаз воспаления в ране, способствует прорастанию кровеносных сосудов в тканеинженерной матрице и миграции малодифференцированных клеток из реципиального ложа дефекта с их последующей тканеспецифической дифференцировкой. Полученные результаты позволяют считать материал «ТИОПРОСТ» тканеинженерной матрицей для замещения дефектов костной ткани. Разработанный метод замещения дефектов костной ткани остеопластическим материалом «ТИОПРОСТ» статистически достоверно сокращает период посттравматической регенерации костной ткани у лабораторных животных более чем на 1 месяц и количество осложнений на 92,64% по сравнению с широко используемым в челюстно-лицевой хирургии материалом «КоллапАн-М».

Данные исследования особенностей развития свободнорадикальных процессов на уровне организма и тканей в условиях хирургической травмы костного органа и при замещении дефекта костной ткани остеопластическим материалом «ТИОПРОСТ» позволяют уточнить роль АКМ в процессе посттравматической регенерации костной ткани. Разработанный метод замещения дефектов костной ткани с использованием материала «ТИОПРОСТ» доказывает перспективность использования полифункционального серосодержащего антиоксиданта «Тиофан» для оптимизации остеогенеза в ветеринарной и медицинской практиках.

1.5. Реализация результатов исследования. Результаты диссертационного исследования относительно роли АКМ и антиоксидантов в посттравматической регенерации костной ткани используются в лекционном курсе по дисциплине «Гистология, цитология и эмбриология человека», который читается в Новосибирском государственном медицинском университете, Красноярском государственном аграрном университете, лекционных курсах «Биология клетки» и «Патология клетки», читаемых в Новосибирском государственном педагогическом университете, в научно-исследовательской работе НИИ физиологии СО РАМН.

1.6. Апробация результатов исследования. Результаты экспериментальной работы доложены и обсуждены на 2-м научно-практическом симпозиуме с международным участием «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2009), VI Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы биологической науки и образования в педагогических вузах» (Новосибирск, 2010), I Международной научно-практической конференции «Беккеровские чтения» (Волгоград, 2010), VIII Всероссийской конференции с международным участием «Биоантиоксидант» (Москва, 2010), VII Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы биологической науки и образования в педагогических вузах» (Новосибирск, 2011).

1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 – в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.8. Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 177 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, библиографического списка цитируемой литературы, который включает 213 источников, из них 125 российских и 88 – зарубежных авторов и приложения. Работа иллюстрирована 76 рисунками и 5 таблицами.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования проведены на базе лаборатории морфологии НИИ химии антиоксидантов федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новосибирский государственный педагогический университет» и лаборатории молекулярно-клеточных механизмов терапевтических заболеваний НИИ терапии СО РАМН.





Получение остеопластического материала включало определение оптимального соотношения исходных компонентов: антиоксиданта «Тиофан», полярного растворителя диметилсульфоксида (ДМСО) и раствора «Рингер». Критериями оценки материала являлись его способность к гелеобразованию, продолжительность процесса кристаллизации, влияние на данные характеристики температуры, рН раствора, содержание катионов и анионов.

Оптимальное соотношение компонентов остеопластического материала определяли эмпирическим методом по массе конечного продукта в контрольно-аналитической лаборатории НИИ химии антиоксидантов. Способность материала к гелеобразованию и его последующей кристаллизации определяли методом полуколичественного анализа в зависимости от температуры нагревания исходных компонентов и содержания ионов в растворе. Адгезивные свойства определяли методом физико-механического анализа. Для этого проводили испытание на измерение усилия отрыва полученного материала от образцов нативной костной ткани с помощью универсальной машины «РТ-250-М-2» после закрепления образцов кости в пневмозажимах.

Оценка биосовместимости полученного остеопластического материала in vivo проведена на мышах-самцах линии ICR массой 35 г при его подкожной имплантации в соответствии со стандартами серии ГОСТ Р ИСО 10993 «Оценка биологического действия медицинских изделий»
(01.01.2002 г.). Все манипуляции на животных осуществляли под хлороформным наркозом с соблюдением правил асептики и антисептики, в соответствии с международными принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Мышам контрольной и опытных групп
(4 группы животных по 50 особей) по средней линии спины наносили полнослойную рану кожи длиной 2 см. Браншами хирургических ножниц формировали карман, основание которого располагали на расстоянии 10 мм от линии разреза. Мышам 1-й опытной группы в сформированный карман раны помещали пластину из материала «ТИОПРОСТ» овальной формы диаметром 5 мм и толщиной 1 мм. Животным 2-й опытной группы поверхность раны орошали 1%-м раствором ДМСО в течение 1 мин. Животным контрольной группы рану оставляли свободной. У животных всех групп после завершения операционного вмешательства рану зашивали хирургическим шелком № 1. С мышами интактной группы хирургических манипуляций не производилось. Мышей всех групп по 10 особей в каждой выводили из эксперимента на 3, 7, 14, 30 и 40-е сутки после операции.

Реакцию тканей кожи мышей оценивали методом морфологического анализа. Вырезанные блоки ткани фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина и проводили по стандартной методике. Для изучения общей морфологической картины срезы окрашивали гематоксилином и эозином (Б. Ромейс, 1954; Э. Пирс, 1962). Суммарные кислые ГАГ оценивали в реакции с альциановым синим по Стидмену
(Р. Лилли, 1969). Коллагеновые волокна окрашивали по Маллори (Х. Луппа, 1980).

Исследование полученного материала на цитотоксичность проводили на культуре перитонеальных макрофагов in vitro в соответствии с положениями ГОСТ Р ИСО 10993 «Оценка биологического действия медицинских изделий». Результат оценивали в течение 1–3-х суток по содержанию погибших клеток в монослое на подложке из материала «ТИОПРОСТ». Подсчет погибших клеток осуществляли в проходящем свете по их интенсивному окрашиванию метиленовым синим в концентрации
1:10 000.

Исследование посттравматической регенерации костной ткани нижней челюсти крыс проведено на самцах крыс линии Вистар массой 250–300 г
(n = 180). Животным трех групп под эфирным наркозом производили дефект нижней челюсти стоматологическим бором диаметром 3,5 мм на глубину
2 мм. Крысам контрольной группы костную рану не лечили; животным 1-й опытной группы костный дефект заполняли остеопластическим материалом «ТИОПРОСТ»; крысам 2-й опытной группы – материалом «КоллапАн-М». Животным всех групп в течение 7 суток послеоперационного периода внутримышечно вводили антибиотик линкомицин в дозе 5 мг/кг массы тела один раз в сутки. Крыс по 10 особей в каждой группе под эфирным наркозом выводили из эксперимента на 3, 7, 14, 30, 60 и 90-е сутки после предварительного взятия крови из подчелюстной вены, собирающей кровь от соответствующего участка ветви челюсти с произведенным дефектом.
В плазме крови животных всех групп оценивали уровень липопероксидации по содержанию продуктов СПОЛ – малонового диальдегида (МДА), диеновых конъюгатов (ДК), а также активности каталазы (КАТ).
В результате нарушения целостности стенки кровеносных сосудов при хирургической травме костного органа и высвобождении при гемолизе эритроцитов большого количества ионов Fe2+ последние способны вовлекаться в общий окислительный процесс и взаимодействовать по механизму реакции Фентона с перекисью водорода. В этой связи функциональное состояние системы антиоксидантной защиты оценивали исключительно по активности КАТ.

Содержание МДА в плазме крови определяли в реакции с трихлоруксусной (ТХУ) и с 2-тиобарбитуровой кислотами (ТБК)
(М. И. Душкин, 1998). Содержание ДК определяли в реакции с гептан-изопропаноловой смесью (И. Д. Стальная, 1977). Активность КАТ определяли в реакции перекиси водорода с добавлением молибдата аммония (М. А. Королюк, 1988).

Для проведения морфологического анализа у животных всех групп после их выведения из эксперимента в течение 5 мин. выпиливали фрагмент костной ткани нижней челюсти, включающий интактные участки и область регенерата. Материал фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина в течение 12 суток, промывали в проточной воде и помещали в декальцинирующий раствор. Декальцинацию костной ткани проводили в течение 14 суток в 10%-м растворе этилендиаминтетраацетата на боратном буфере с рН 7,2. После дегидратации в растворах «Isoprep» (Россия) материал заливали в гистомикс. Срезы толщиной 10–15 мкм монтировали на предметные стекла, окрашивали гематоксилином Бёмера и эозином. Суммарные кислые ГАГ определяли в реакции с альциановым синим по Стидмену, коллаген выявляли по Маллори. Локализацию фибрина в ткани определяли по Касону (Р. Лилли, 1969; Х. Луппа, 1980), а кальция по методу Косса (Р. Лилли, 1969).

Измерение морфометрических характеристик проводили с помощью комплекса программ AxioVision (Carl Zeiss, Германия). Статистическую обработку данных проводили на основе вычисления средних арифметических (х) и их ошибок (Sx). Различия показателей оценивали методом вариационной статистики по t-критерию Стьюдента и считали достоверным при р 0,05. Все расчеты проводили по общепринятым формулам с использованием пакета программ Microsoft Excel 2007.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение остеопластического материала для замещения дефектов костной ткани

Получение остеопластического материала для замещения дефектов костной ткани основывалось на образовании насыщенного раствора антиоксиданта «Тиофан» в полярном растворителе ДМСО при 30°С, последующем осаждении конечного продукта раствором «Рингер» и его выделением центрифугированием. Известные химические свойства используемых компонентов определяют возможность получения материала, обладающего ярко выраженной антиоксидантной активностью, способного после заполнения им дефекта костной ткани изменять в заданном режиме физическое состояние от гелеобразного вещества с высокими адгезивными свойствами до твердого кристаллического вещества с пористой структурой.

Первый этап процесса получения остеопластического материала включал определение оптимальной концентрации антиоксиданта «Тиофан»
в ДМСО. В результате проведенных исследований эмпирическим путем удалось установить, что при нагревании «Тиофана» с ДМСО до 30°С насыщенный раствор образуется при соотношении 1:22 (по массе) соответственно.

Второй этап заключался в определении оптимального соотношения компонентов «Тиофан», ДМСО и «Рингер». В серии экспериментов установили, что при добавлении раствора «Рингер» к полученной смеси ДМСО с антиоксидантом «Тиофан» в количестве, превышающем в 25 раз массу антиоксиданта, получается продукт с наибольшим выходом. Масса полученного продукта относительно исходного количества антиоксиданта соответствует соотношению 1:1,4. В результате двух последовательных этапов получения остеопластического материала оптимальным количеством исходных компонентов – антиоксиданта «Тиофан», ДМСО и раствора «Рингер» – является соотношение 1:22:25 (по массе) соответственно.

Третий этап заключался в изучении изменений физического состояния полученного вещества, которое при нагревании до 55°С приобретает состояние геля. При охлаждении от 37 до 18–22°С в течение 15–18 мин. материал становится пластичным и позволяет создать трехмерную пористую конструкцию требуемой геометрической формы. В течение последующих
25–30 мин. при температуре 18–22°С материал приобретает твердую пористую структуру. С точки зрения исследованных характеристик полученный материал может быть использован для замещения дефектов костной ткани в качестве остеопластического материала.

Получение остеопластического материала, кроме определения оптимального соотношения входящих в его состав компонентов, включало изучение влияния рН среды и различных концентраций ионов Fe2+ на адгезивные свойства материала и скорость образования трехмерной пористой конструкции. Принимая во внимание, что при травме костного органа происходит существенное изменение метаболизма в очаге повреждения и изменение кислотно-щелочного равновесия со сдвигом рН в сторону ацидоза, исследовалось влияние рН на адгезивные свойства остеопластического материала, которые являются одной из важных характеристик, обеспечивающих надежность его фиксации в нативной костной ткани.

В экспериментах in vitro на изолированных образцах нативной трубчатой кости при моделировании дефекта и последующим его замещением остеопластическим материалом выявлена зависимость адгезивных свойств материала от его рН среды. Установлено, что при измерении прочности на разрыв между костью и остеопластическим материалом, показатель усилия отрыва в пробах со слабощелочным (рН 7,6–8,0) значением реакционной среды превышает данный показатель в пробах материала с нейтральным
(рН 7,4) и слабокислым (рН 6,8–7,0) значением рН реакционной среды на 15,46 и 20,34% соответственно (см. табл.).

Влияние концентрации ионов водорода

на усилие отрыва остеопластического материала от кости

Реакция рН-среды остеопластичес-

кого мате-

Усилие риала

на отрыв (Н)

7,4

6,8–7,0

7,6–8,0

51,99 ± 0,93

48,99 ± 0,51

61,5 ± 2,86

Примечание. Усилие отрыва медицинского клея «Сульфакрилат» составляет 23,58 Н.

Результаты количественного анализа влияния ионов Fe2+ на физико-химические свойства материала показали, что использование раствора «Рингер» с добавлением ионов Fe2+ в составе соли Мора независимо от концентрации улучшает адгезивные свойства остеопластического материала. Полученные результаты in vitro позволяют полагать, что в условиях in vivo увеличение концентрации железа в костной ране при травме и повреждении сосудов не будет оказывать существенного влияния на адгезивные свойства остеопластического материала.

Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что полученный остеопластический материал в своем составе содержит 64,2% антиоксиданта «Тиофан», 21,3% ДМСО, 14,4% воды и менее 0,1% хлоридов натрия, кальция, калия. Остеопластический материал способен направленно изменять свои физико-химические свойства в заданный интервал времени от гелеобразного до состояния твердого кристаллического вещества. Материал обладает оптимальными адгезивными свойствами и способен заполнять объем костного дефекта, обеспечивая при этом его надежную фиксацию в костном органе. Контролируемый процесс кристаллизации материала позволяет создавать пористо-ячеистую структуру с размером пор 100–500 мкм. Можно полагать, что компоненты, входящие в состав материала, воздействуя на окружающие ткани, будут проявлять антирадикальные и противопероксидные свойства, а входящий в состав материала ДМСО на начальных этапах постоперационного периода способен выполнять функцию антикоагуляции. Полученный авторами остеопластический материал получил название «ТИОПРОСТ».

3.2. Изучение тканевой реакции на новый остеопластический материал при его подкожной имплантации и цитотоксических свойств в культуре клеток in vitro

Результаты морфологического анализа показали, что в образцах кожи животных контрольной группы на 3-и сутки наблюдения отчетливо заметна область дефекта кожи, отграниченная от окружающих тканей лейкоцитарным валом. Среди клеток воспалительного инфильтрата преобладают сегментоядерные нейтрофилы. В поле зрения встречаются моноциты, единичные лимфоциты и макрофаги. На периферии и в центре раны заметны отложения фибрина, тканевой детрит и эритроциты с признаками гемолиза.

У мышей 1-й опытной группы на 3-и сутки наблюдения демаркационный вал вокруг имплантата отсутствует. Тканевое ложе вокруг имплантированного материала характеризуется интенсивным окрашиванием межклеточного вещества гематоксилином и эозином. В отличие от образцов кожи мышей контрольной и 2-й опытной групп в окружающей имплантат ткани содержание нейтрофилов и лимфоцитов имеет достоверно низкий показатель, а также регистрируется повышение процентного содержания моноцитов и макрофагов. Низкое содержание в исследуемых образцах тканей кожи мышей 1-й опытной группы клеток воспалительного инфильтрата, а также признаков выраженного повреждения клеток и компонентов межклеточного вещества тканей кожи могут свидетельствовать об «экономной и рациональной реакции» со стороны нейтрофильных лейкоцитов на имплантируемый материал, а также завершении на данном сроке наблюдения стадий альтерации и экссудации воспаления. Можно полагать, что в процессе деградации материала в ране, за счет его мощных противопероксидных и антиоксидантных свойств, происходит инактивация избыточного количества АКМ, экспрессируемых, главным образом, лейкоцитами.

У мышей контрольной группы на 7-е сутки после операции реакция кожи на повреждение характеризуется интенсивным воспалением и задержкой регенерации. При морфологическом анализе в области раны определяется молодая грануляционная ткань с большим количеством сосудов. Среди компонентов межклеточного вещества регистрируется высокое содержание нейтрофилов и малодифференцированных фибробластов.

У животных 1-й опытной группы через 7 суток после операции материал «ТИОПРОСТ» отграничен от окружающей ткани рыхло расположенными тонкими извитыми коллагеновыми волокнами, архитектоника которых не имеет выраженных отличий от соответствующих образцов кожи интактных животных. При постановке реакции на сГАГ заметно, что имплантат отграничен от дермы и гиподермы умеренно альцианпозитивным основным веществом. Отсутствие избытка коллагена в ткани вокруг материала указывает на  скоординированность во времени синтеза данного белка и ГАГ. По данным морфометрического анализа снижение в тканях кожи мышей 1-й опытной группы нейтрофилов на 61,97%, а также повышение процентного содержания макрофагов с признаками высокой функциональной активности на 76,23% по сравнению с контролем свидетельствуют о завершении в исследуемых тканях мышей опытной группы острой фазы воспаления и активизации процессов репарации.

Следует отметить, что данная закономерность сохраняется в течение всего периода наблюдения. С нашей точки зрения, ограничение цитотоксического эффекта АКМ за счет выполнения антиоксидантных свойств материалом «ТИОПРОСТ» обеспечивает защиту клеток фибробластического дифферона от их летального повреждения АКМ и способствует реализации фибробластами специфических свойств в виде синтеза белков и протеогликанов, т. е. их дифференцировки. У мышей контрольной и 2-й опытной групп исследуемые показатели во все периоды наблюдения не имели выраженных различий. Отсутствие выраженных признаков воспаления и фиброза в области ложа имплантата в течение 3–40-х суток наблюдения доказывает биосовместимость материала «ТИОПРОСТ» с тканями кожи реципиента. Полученные результаты исследования показали, что у мышей 1-й опытной группы при подкожной имплантации полученного материала его деградация во временном аспекте сопряжена с пролиферацией фибробластов, их дифференцировкой и замещением материала к 40-м суткам эксперимента органотипическим регенератом в отличие от мышей контрольной и 2-й опытной групп. Опираясь на публикации (А. А Клишов, 1990; А. М. Панин, 2002; В. Г. Гололобов и др., 2006; А. А. Кулаков, 2009), завершение деградации «ТИОПРОСТ» в течение 40 суток является оптимальным показателем и сопоставимо по срокам с аналогичным показателем широко используемых в практической медицине современных материалов для замещения дефектов тканей (А. В. Волков, 2005;
Л. А. Григорьянц и др., 2007; А. А. Кулаков и др., 2009).

При изучении цитотоксических свойств «ТИОПРОСТ» в условиях in vitro установлено, что культивирование перитонеальных макрофагов на подложке из данного материала в течение 1–3-х суток не оказывает влияния на гибель данных клеток. При инкубировании перитонеальных макрофагов выживаемость клеток не имеет статистически достоверных отличий с контролем, что свидетельствует об отсутствии у «ТИОПРОСТ» цитотоксических свойств.

3.3. Сравнительное изучение репаративной регенерации костной ткани при использовании тканеинженерной матрицы на основе материала «ТИОПРОСТ» и материала «КоллапАн-М»

При исследовании образцов костной ткани крыс контрольной группы, полученных на 3-и сутки после травмы, установлено, что полость дефекта заполнена фибрином, лейкоцитами, тканевым детритом и многочисленными эритроцитами с признаками гемолиза. Среди клеток воспалительного инфильтрата преобладают полиморфноядерные лейкоциты. По всему периметру раны фибрин отграничивает торцы опилов челюсти от некротических масс и клеток воспаления.

Результаты биохимического анализа плазмы крови, полученной из вены, собирающей кровь от участка повреждения, показали, что содержание МДА и ДК в образцах крыс контрольной группы превышает данные показатели животных интактной группы на 53,42 и 81,2% соответственно.
С нашей точки зрения, высокий уровень первичных и вторичных продуктов СПОЛ при травме обусловлен мощной генерацией, преимущественно нейтрофилами, АКМ в поврежденном тканевом компартменте
(Е. Б. Меньщикова и др., 2006). Кроме того, вовлечение ионов Fe2+, высвобождающихся при гемолизе эритроцитов в области костной раны по механизму реакции Фентона, способствует повышению уровня АКМ и усилению СПОЛ в пределах поврежденного участка костной ткани
(В. И. Кулинский, 1999; Н. К. Зенков и др., 2001; Е. Б. Меньщикова и др., 2008). Установленное превышение активности КАТ (рис. 1) в плазме венозной крови животных контрольной группы на данном сроке наблюдения в 5,26 раза, по сравнению с нормой (плазма крови животных интактной группы), может объясняться адаптивной реакцией на повреждение и связано с участием данного фермента в разложении токсической перекиси водорода. Безусловно, что повышение активности АКМ и развитие СПОЛ в пределах поврежденного компартмента оказывает влияние на течение репаративной регенерации костной ткани. Это утверждение подтверждается результатами сравнительного анализа репаративной регенерации костной ткани при самозаживлении и использовании остеопластического материала «ТИОПРОСТ».

В исследуемых образцах костной ткани животных 1-й опытной группы на 3-и сутки послеоперационного периода весь объем костного дефекта заполнен материалом «ТИОПРОСТ», который плотно прилегает к торцам опилов кости. На гистологических препаратах видно, что материал имеет пористую структуру. При этом поры материала анастомозируют между собой и формируют узкие каналы, пронизывающие весь объем тканеинженерной матрицы. Важно отметить, что на светооптическом уровне в полости каналов идентифицируются малодифференцированные клетки, единичные эритроциты, нейтрофилы и лимфоциты. Можно полагать, что входящий в состав «ТИОПРОСТ» ДМСО за счет реализации функции антикоагуляции препятствует свертыванию белков крови в каналах тканеинженерной матрицы и обеспечивает перемещение крови в ее каналах. Данное свойство материала и интеграция «ТИОПРОСТ» с опилами костного органа определяет возможность для врастания кровеносных сосудов непосредственно из ложа костного дефекта в каналы тканеинженерной матрицы, а также миграции стволовых клеток из реципиальных тканевых

Рис. 1. Изменение активности каталазы в плазме крови крыс

 

Рис. 2. Изменение содержания продуктов свободнорадикального перекисного окисления липидов в плазме венозной крови крыс: а – МДА; б – ДК

Примечания:

  1. На рис. 1, 2 * – достоверное различие 1-й опытной группы относительно контрольной группы (*р 0,05; **р 0,01; ***р 0,001); – достоверное различие 2-й опытной группы относительно контрольной группы (р 0,05); – достоверное различие 1-й опытной группы относительно 2-й опытной группы (р 0,05).
  2. На рис. 1, 2  интактная группа;  контрольная группа;       1-я опытная группа; 2-я опытная группа.

ниш в матрицу гематогенным путем.

У крыс 1-й опытной группы доказательством интенсивного ангиогенеза на участке повреждения являетсяналичие кровеносных сосудов на поверхности костной раны в области формирующегося периоста уже на 3-и сутки послеоперационного периода. Низкое содержание клеток воспаления среди волокнистых компонентов соединительной ткани формирующегося периоста, а также в каналах остеопластического материала позволяют считать, что стадии альтерации и экссудации воспаления у животных 1-й опытной группы завершились уже в течение первых 3-х суток после травмы костного органа. Незначительное изменение тинкториальных свойств костного матрикса, в том числе на периферии гаверсовых каналов, а также низкое содержание в костном матриксе остеоцитов с признаками летального повреждения свидетельствуют о высоком уровне антиоксидантной защиты материалом «ТИОПРОСТ» костной ткани на участке ее повреждения.

У крыс контрольной группы при самозаживлении костной раны деструкция межклеточного вещества костной ткани на границе с дефектом проявляется в форме некроза остеоцитов и периостеоцитарного лизиса матрикса, в том числе на периферии гаверсовых и фолькмановских каналов. Отсутствие выраженных признаков повреждения клеток и костного матрикса, а также острого воспаления в ране и окружающих ее тканях после заполнения дефекта челюсти материалом «ТИОПРОСТ» позволяет считать, что в течение первых 3-х суток специфические антиоксидантные свойства данного материала ограничивают развитие СПОЛ (рис. 1, 2) прежде всего за счет снижения свободнорадикальной активности клеток воспаления. Доказательством данного утверждения является статистически достоверное превышение уровня активности КАТ в плазме крови крыс 1-й опытной группы по сравнению с аналогичными образцами плазмы крови животных 2-й опытной и контрольной групп на 18,98 и 31,35% соответственно.

В образцах костной ткани животных 2-й опытной группы через 3-е суток после ее повреждения и заполнения раны материалом «КоллапАн-М» края опилов костного органа ровные и по периметру отграничены от «КоллапАн-М» лейкоцитарным валом. Поверхность дефекта покрыта слоем фибрина, среди которого определяются клетки воспаления и некротические массы. Следует отметить, что наличие широкого спектра антимикробных компонентов в составе «КоллапАн-М» заметно снижает активность воспалительной реакции в ткани по сравнению с контролем, но его действие не превосходит противовоспалительный эффект «ТИОПРОСТ». Это убедительно доказывается не только результатами морфологического анализа, но и согласуется с полученными результатами биохимического исследования. В плазме крови крыс 2-й опытной группы содержание ДК статистически достоверно превышает соответствующий показатель крыс 1-й опытной группы на 34,1% (рис. 2). При более выраженном повреждении ткани логично ожидать более мощной ответной реакции организма и повышение уровня активности системы антиоксидантной защиты. С нашей точки зрения, низкая активность КАТ у крыс 2-й опытной группы на сроке 3-х суток наблюдения, по сравнению с животными 1-й опытной группы, объясняется перенапряжением активности клеток тканей, осуществляющих синтез данного фермента в области костной раны. Можно полагать, что в динамике развития воспаления в промежуток времени с 1-х до 3-х суток у крыс 2-й опытной группы происходит снижение адаптивных возможностей клеток травмированной ткани в отношении обеспечения противопероксидной защиты. Признаки более выраженного повреждения ткани и снижение активности КАТ в исследуемых образцах костной ткани крыс 2-й опытной группы сохраняются практически в течение 1 месяца наблюдения.

Высокое содержание нейтрофилов в исследуемых образцах ткани крыс контрольной и 2-й опытной групп и их незначительное содержание у крыс 1-й опытной группы позволяет считать, что при травме костного органа ключевая роль в развитии СПОЛ и, как следствие, деструкция клеток и косного матрикса на ранних сроках принадлежит нейтрофилам.

У крыс 1-й опытной группы на сроке 7 суток послеоперационного периода в отличие от животных контрольной и 2-й опытной групп в области дефекта впервые отчетливо становятся заметны признаки развития репаративного процесса и впервые регистрируются признаки биодеградации остеопластического материала. Результаты морфологического анализа образцов костной ткани позволили выявить особенности морфогенетических механизмов регенерации у животных данной группы. Уже на 7-е сутки после заполнения костного дефекта остеопластическим материалом «ТИОПРОСТ» источниками активного заселения регенерата остеогенными клетками являются периост и гаверсовые каналы, расположенные по всему периметру ложа дефекта. В костной ткани на границе опилов челюсти и имплантированной тканеинженерной матрицы отмечается лизис межклеточного вещества, расширение гаверсовых каналов и каналов остеопластического материала. Заметно, что полости гаверсовых каналов нативной костной ткани и сообщающихся с ними каналами имплантируемого материала выполнены обильно васкуляризированной соединительной тканью. В периваскулярном пространстве располагаются многочисленные малодифференцированные клетки, а на внутренней поверхности каналов локализуются остеобласты с признаками высокой функциональной активности. Полученные результаты позволяют считать, что специфические свойства «ТИОПРОСТ» опосредуются через антиоксидантную активность и оказывают влияние на пролиферацию и дифференцировку остеогенных клеток на участке взаимодействия костной ткани реципиента и имплантата. Это позволяет признать наличие у данного остеопластического материала выраженных остеоиндуктивных свойств.

Уже через 7 суток после имплантации «ТИОПРОСТ» в область костного дефекта отмечается расширение каналов материала за счет его биодеградации. Как и при его подкожной имплантации мышам, биодеградация «ТИОПРОСТ» сопряжена с его замещением обильно васкуляризированной грануляционной тканью, в которой, кроме клеток различного уровня дифференцировки, идентифицируются клетки Пирогова–Лангханса. Признаки деградации «ТИОПРОСТ» при несовершенном фагоцитозе гигантскими макрофагами данного материала позволяют считать, что биодеградация материала в области его имплантации будет происходить медленно, преимущественно за счет растворения антиоксиданта «Тиофана» и диффузии его молекул в ткань. Медленная биодеградация является желаемым результатом при замещении дефектов костной ткани любым остеопластическим материалом.

У животных контрольной и 2-й опытной групп процесс репарации происходит иначе. Высокое содержание клеток воспаления, а также присутствие макрофагов в тканях раны определяет развитие СПОЛ, что подтверждается результатами биохимического анализа. Содержание МДА
и ДК в образцах плазмы крови крыс контрольной группы превышают данные показатели крыс 1-й опытной группы на 27,81 и 54,47% соответственно, а в плазме крови крыс 2-й опытной группы значения МДА и ДК выше соответствующих значений крыс 1-й опытной группы на 15,01 и 33,92% соответственно. Доказательство низких темпов репарации костной ткани у животных контрольной и 2-й опытной групп основывается на морфологическом анализе состояния потенциальных источников регенерации на участке повреждения. В области ложа дефекта в матриксе костной ткани челюсти заметны пустые остеоцитарные лакуны, а также присутствуют остеоциты с признаками необратимого повреждения. Нарушение тинкториальных свойств межклеточного вещества костной ткани и ее мозаичное окрашивание  гематоксилином и эозином указывает на развитие глубоких деструктивных процессов. Основываясь на полученных результатах, камбиальный слой формирующегося периоста у крыс данных групп является основным источником заселения костного дефекта остеогенными клетками.

У крыс контрольной группы периост наползает по стенкам опилов челюсти, покрытых фибрином, повторяя, таким образом, контуры ложа дефекта. Одним из свидетельств влияния АКМ на клетки различных тканей в области формирующегося регенерата является сладж-феномен в капиллярах периоста вследствие потери отрицательного заряда эритроцитами. Можно полагать, что при продолжительном сроке течения воспаления и вяло текущей стадии пролиферации на более поздних сроках наблюдения полного восстановления дефекта за счет новообразованной костной ткани сложно ожидать. По данным публикаций Г. И. Лаврищевой (1996) , В. Г. Гололобова (2006) невозможность полного восстановления анатомической структуры костного органа в области дефекта является одним из исходов регенерации. В рамках проведенного исследования развитие такого варианта регенерации было отмечено в 12,43% случаев. У крыс 2-й опытной группы ложе дефекта костной ткани по всему периметру отграничено от «КоллапАн-М» мощным лейкоцитарным валом, препятствующим врастанию кровеносных сосудов из костной ткани реципиального ложа в область дефекта. На основании полученных результатов можно считать, что основным источником поступления остеогенных клеток при использовании «КоллапАн-М» является формирующийся периост. Лишь на поздних сроках происходит врастание соединительной ткани от поверхности периоста в центральную область дефекта по направлению ко дну ложа дефекта и последующим заселением регенерата остеогенными клетками.

Выявленные морфогенетические особенности репаративной регенерации костной ткани у крыс на сроках 3–7-х суток при самозаживлении костной раны, а также при использовании материала «ТИОПРОСТ» и «КоллапАн-М» сохраняются в последующие сроки наблюдения. При сравнительном морфологическом анализе темпов регенерации и качественных характеристик остеогенеза преимущество материала «ТИОПРОСТ» становится очевидным.

Уже через 14 суток после травмы костного органа у крыс контрольной группы регенерат занимает 2/3 объема дефекта и выполнен грануляционной тканью с высоким содержанием в ее структуре нейтрофилов. При постановке гистохимической реакции на один из важных для остеогенеза компонентов кальций последний выявляется в составе грануляционной ткани в виде редких крупных скоплений, что указывает на локализацию в ткани конгломератов из погибших клеток. Лишь в области ложа дефекта в межклеточном веществе формирующейся костной ткани на периферии сосудистых каналов заметны редкие, диффузно расположенные пылевидные отложения кальция. При этом признаки активного остеогенеза наблюдаются лишь в области ложа дефекта.

В образцах костной ткани животных 1-й опытной группы через
14 суток послеоперационного периода дефект с поверхности покрыт сформированным периостом. Полость дефекта полностью выполнена грубоволокнистой костной тканью, среди которой идентифицируются остатки материала «ТИОПРОСТ». Полученные результаты позволяют считать, что формирование регенерата в области костного дефекта происходит за счет последовательных процессов биодеградации материала «ТИОПРОСТ» и заполнения полости каналов интенсивно васкуляризированной примитивной костной тканью. При гистохимическом определении кальция его повышенное содержание отмечается на границе опилов и регенерата, а также в центральных отделах регенерата в зоне активного остеогенеза. Локализация кальция среди компонентов межклеточного вещества определяется в виде диффузно расположенных мелкогранулярных структур округлой формы. Полученные результаты гистохимического анализа позволяют считать, что при замещении дефекта костной ткани материалом «ТИОПРОСТ» его свойства опосредуются через механизм антирадикальной защиты остеобластов и оказывают положительное влияние на интенсивность транспорта кальция на участке напряженного остеогенеза. Это позволяет уже к 14-м суткам заполнить весь объем костного дефекта грубоволокнистой костной тканью.

В образцах костной ткани крыс 2-й опытной группы через 14 суток послеоперационного периода полость дефекта выполнена грануляционной костной тканью. Среди компонентов межклеточного вещества идентифицируется высокое содержание лейкоцитов, заметен клеточный детрит и частицы «КоллапАн-М». Кальций выявляется в виде мелких частиц, равномерно распределенных в структуре межклеточного вещества ткани регенерата.

Таким образом, у животных обеих опытных групп морфология регенерата на 14-е сутки наблюдения имеет выраженные различия.
В образцах крыс 1-й опытной группы деградация «ТИОПРОСТа» сопряжена с его замещением интенсивно васкуляризированной грубоволокнистой костной тканью. У крыс 2-й опытной группы в ткани регенерата сохраняются признаки воспаления, а остеобласты имеют признаки низкой функциональной активности.

Через 30 суток в образцах костной ткани крыс контрольной группы регенерат дефекта в области ложа представлен молодой костной тканью, объем которой составляет около 1/3 объема всего регенерата. На поверхности формирующихся костных трабекул идентифицируются функционально активные остеобласты. В области торцов опилов регенерат выполнен волокнистой тканью с признаками интенсивной васкуляризации.

На гистологических препаратах костной ткани животных 1-й опытной группы к 30-м суткам наблюдения дефект более чем на 2/3 представлен формирующейся пластинчатой костной тканью. На поверхности между периостом и регенератом локализованы небольшие участки, заполненные материалом «ТИОПРОСТ», который имеет признаки резорбции и замещения его костной тканью. Следует отметить, что по всему периметру дефекта регенерат интегрирован с костной тканью нижней челюсти.

В аналогичных образцах костной ткани крыс 2-й опытной группы дефект по всему периметру краев опилов нижней челюсти и ложа выполнен формирующейся грубоволокнистой костной тканью. Кроме остеогенных клеток в составе регенерата определяются нейтрофилы и макрофаги, идентифицируются частицы материала «КоллапАн-М». Именно в этот период наблюдения наиболее отчетливы различия по срокам и качеству регенерации между животными обеих опытных групп. С нашей точки зрения, они обусловлены морфогенетическими особенностями регенерации. У крыс 1-й опытной группы выселение остеогенных клеток происходит из гаверсовых каналов тканевого ложа дефекта, периоста и сосудов регенерата с их последующей дифференцировкой. У животных 2-й опытной группы основным источником остеогенных клеток является периост.

По данным биохимического анализа у крыс контрольной и 2-й опытной групп превышен уровень продуктов СПОЛ в плазме крови по сравнению с соответствующими образцами крыс интактной и 1-й опытной групп (рис. 2). Так, в плазме крови крыс контрольной группы содержание МДА и ДК превышает данные показатели животных интактной группы на 27,07 и 67,69% соответственно, а в плазме крови животных 2-й опытной группы – на 18,06 и 50,65% соответственно.

У крыс контрольной группы на 60-е сутки после повреждения костного органа регенерат представлен грубоволокнистой костной тканью.
У животных 1-й опытной группы раневой дефект полностью выполнен молодой пластинчатой костной тканью, которая консолидируется с костной тканью опилов нижней челюсти. Структурно регенерат представлен растущими остеонами первого типа с хорошо выраженным центральным каналом и узким ободком остеоида, под слоем которого видны многочисленные активные остеобласты.

В соответствующих образцах костной ткани животных 2-й опытной группы на 60-е сутки наблюдения новообразованная костная ткань определяется в виде периостальной манжетки на поверхности раневого дефекта между краями опилов и в центре регенерата. При постановке гистохимической реакции на коллаген в матриксе костной ткани отчетливо заметны признаки его демаскировки, что указывает на несовершенный остеогенез. По данным биохимического анализа на 60-е сутки после повреждения костного органа содержание МДА и ДК в плазме крови крыс 1-й опытной группы имеет достоверно низкий показатель по сравнению с контролем.

Регенерат крыс 1-й опытной группы на 90-е сутки наблюдения по морфологии и тинкториальным свойствам не имеет заметных отличий от интактных участков костной ткани нижней челюсти, и в его структуре преобладают зрелые остеоны второго типа. Связывая высокие темпы регенерации и качество костного матрикса с влиянием на данные характеристики материала «ТИОПРОСТ», становится очевидным роль свободнорадикальных процессов и антиоксидантных соединений в механизмах регенерации костной ткани. Доказательство данного заключения подтверждается результатами анализа плазмы крови. Содержание МДА и ДК в образцах крыс 1-й опытной группы не имеет различий с аналогичными показателями крови интактных животных.

При морфологическом исследовании костной ткани крыс контрольной и 2-й опытной групп на поверхности раневого дефекта через 90 суток обнаруживается широкий слой периостальной костной мозоли. В структуре костного матрикса регенерата выявляются демаскированный коллаген и альцианпозитивные участки, что придает формирующейся костной ткани «пятнистый» вид. Данные тинкториальные свойства костной ткани являются одним из признаков несовершенного остеогенеза, свидетельствующего о несформированных механизмах моделирования и ремоделирования костной ткани, находящейся на стадии созревания. У крыс обеих групп регенерат лишь в центре выполнен созревающей костной тканью, в структуре которой преобладают остеоны первого типа. Следует отметить, что в межклеточном веществе регенерата крыс 2-й опытной группы в данный период присутствуют крупные частицы «КоллапАн-М».

Таким образом, проведенное морфологическое исследование показало, что регенерация костной ткани с использованием материала «ТИОПРОСТ» более чем на 1 месяц опережает таковую при применении материала «КоллапАн-М». Положительное влияние на формирование  органотипического регенерата обусловлено антирадикальными и противопероксидными свойствами антиоксиданта «Тиофана», входящего в состав «ТИОПРОСТ». Полученные данные свидетельствуют о целесообразности использования полифункциональных серосодержащих антиоксидантных соединений для оптимизации остеогенеза при повреждении костной ткани. Их использование обосновано активным вовлечением металлов переменной валентности в свободнорадикальный процесс при повреждении кровеносных сосудов и гемолизе эритроцитов. Кроме того, генерация клетками воспаления АКМ и тканевая гипоксия определяют интенсивное течение свободнорадикальных процессов, оказывающих негативное влияние на клетки остеогенного дифферона в пределах поврежденного компартмента. Обладая выраженными антиоксидантными свойствами, «ТИОПРОСТ» опосредованно оказывает влияние на развитие воспаления в ране, а именно, ограничивает продолжительность стадий альтерации и экссудации, защищает клетки остеогенного дифферона от свободнорадикального повреждения, создает в тканевом компартменте благоприятные условия для пролиферации и дифференцировки остеогенных клеток.

Исследованиями установлено, что остеопластический материал «ТИОПРОСТ» при заполнении им дефекта костной ткани образует пористую трехмерную структуру, которая выполняет поддерживающую функцию, не обладает провоспалительными свойствами и активно биодеградирует в течение первого месяца, полностью исчезая в период между 60-и и 90-и сутками послеоперационного периода. Несомненным преимуществом использования данного материала для замещения дефектов костной ткани является отсутствие риска инфицирования реципиента, поскольку в его составе отсутствуют компоненты животного происхождения. Полученные результаты позволяют заключить, что «ТИОПРОСТ» является перспективным материалом для разработки тканеинженерных конструкций как самостоятельно, так и в качестве носителя клеток.

ВЫВОДЫ

  1. Материал для создания тканеинженерных конструкций, способный в течение 25–30 минут при 18–22°С изменять физическое состояние от гелеобразного вещества с выраженными адгезивными свойствами до твердого кристаллического вещества с пористой структурой, получен при использовании антиоксиданта «Тиофан», ДМСО и раствора «Рингер» в соотношении 1:22:25 (по массе).
  2. Материал «ТИОПРОСТ» при подкожной имплантации  лабораторным животным полностью биодеградирует в течение 40 суток наблюдения, не проявляет выраженных провоспалительных свойств, что является показателем его биосовместимости с тканями кожи реципиента.
  3. Культивирование перитонеальных макрофагов in vitro на подложке из материала «ТИОПРОСТ» в течение 1–3 суток не влияет на жизнеспособность данных клеток, что указывает на отсутствие у «ТИОПРОСТ» цитотоксических свойств.
  4. Использование для замещения костного дефекта «ТИОПРОСТ» статистически достоверно снижает показатели липопероксидации в плазме крови по сравнению с материалом «КоллапАн-М» в течение двух месяцев послеоперационного периода.
  5. При имплантации «ТИОПРОСТ» в область костного дефекта данный материал демонстрирует выраженные остеокондуктивные, остеоиндуктивные свойства, способствует прорастанию кровеносных сосудов из реципиального ложа дефекта в каналы материала и миграции малодифференцированных клеток с их последующей тканеспецифической дифференцировкой.
  6. Материал «ТИОПРОСТ» более чем на 1 месяц опережает регенерацию костной ткани нижней челюсти крыс в отличие от материала «КоллапАн-М».

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

  1. «ТИОПРОСТ» рекомендуется к использованию в качестве остеопластического материала для замещения дефектов костной ткани.
  2. Отсутствие цитотоксических свойств у «ТИОПРОСТ», а также возможность создавать тканеинженерные матрицы требуемой конфигурации позволяют рекомендовать данный материал для разработки тканеинженерных конструкций как самостоятельно, так и в качестве носителя клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Руднева, А. А. Экспериментальное изучение биосовместимости тканеинженерной матрицы на основе нового ветеринарного препарата «ТИОПРОСТ-М» / А. А. Руднева // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2010. – № 3. – С. 76–81.
  2. Руднева, А. А. Реакция тканей кожи на синтетический материал «ТИОПРОСТ», разработанный для использования в тканевой инженерии /
    А. А. Руднева, А. В. Сахаров, А. А. Макеев и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2010. – Т. 5. – № 1. – С. 53–57.
  3. Сахаров, А. В. Сравнительное изучение репаративной регенерации костной ткани при использовании тканеинженерной матрицы на основе материала «ТИОПРОСТ» и материала «КоллАпан-М» / А. В. Сахаров,
    А. А. Глотова, А. А. Макеев и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2011. – Т. 6. – № 4. – С. 89–94.

В других изданиях:

  1. Руднева, А. А. Использование геля на основе антиоксиданта тиофана для регенерации костной ткани / А. А. Руднева, А. В. Сахаров,
    А. А. Макеев, А. Е. Просенко // Проблемы и перспективы современной науки: межвуз. сб. науч. тр. – Томск, 2009. – С. 109.
  2. Руднева, А. А. Разработка нового остеопластического материала на основе антиоксиданта тиофана // А. А. Руднева, А. В. Сахаров,
    А. А. Макеев, А. Е. Просенко // Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия: матер. 2-го науч.-практ. симпозиума с междунар. участием. – Волгоград, 2009. – С. 99–100.
  3. Руднева, А. А. Разработка нового остеопластического материала на основе антиоксиданта тиофана и морфологическое изучение тканевой реакции при его подкожной имплантации / А. А. Руднева,
    А. В. Сахаров, А. А. Макеев, А. Е. Просенко // Проблемы биологической науки и образования в педагогических вузах: матер.
    VI Всерос. науч.-практ. конф. – Новосибирск, 2010. – С. 61–68.
  4. Руднева, А. А. Морфологическое изучение тканевой реакции при подкожной имплантации нового остеопластического материала /
    А. А. Руднева // Бюллетень СГМУ. – 2010. – № 1 (выпуск XXIV). –
    С. 155–156.
  5. Руднева, А. А. Изучение адгезивных свойств нового остеопластического материала на основе антиоксиданта тиофана /
    А. А. Руднева // Студент и научно-технический прогресс: матер.
    XLVIII междунар. науч. студ. конф. – Новосибирск, 2010. – С. 37.
  6. Руднева, А. А. Исследование биосовместимости нового остеопластического материала на основе антиоксиданта тиофана при его подкожной имплантации / А. А. Руднева // Беккеровские чтения: матер. I междунар. науч.-практ. конф. – 2010. – С. 78–82.
  7. Руднева, А. А. Влияние антиоксиданта тиофана на посттравматическую регенерацию костной ткани / А. А. Руднева,
    А. В. Сахаров, А. А. Макеев, А. Е. Просенко // Биоантиоксидант: матер. VIII междунар. конф. – М., 2010. – С. 407–409.
  8. Руднева, А. А. Исследование посттравматической регенерации костной ткани при использовании препарата «Коллапан» и остеопластического материала на основе антиоксиданта тиофана в сравнительном аспекте / А. А. Руднева, А. В. Сахаров, А. А. Макеев,
    А. Е. Просенко // Проблемы биологической науки и образования в педагогических вузах: матер. VII Всерос. науч.-практ. конф. – Новосибирск, 2011. – Вып. 7. – С. 61–68.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.