WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

казимиров олег викторович

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ТЕТРАГОЛДА ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ ПОРОСЯТ

06.02.03 – ветеринарная фармакология и токсикология

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Воронеж - 2012

Работа выполнена в отделах фармакологии и микробиологии, вирусологии и иммунологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии

Научные руководители:

доктор биологических наук

Востроилова Галина Анатольевна

доктор ветеринарных наук, профессор, чл.-корр. РАСХН, заслуженный деятель науки РФ 

Шахов Алексей Гаврилович

Официальные оппоненты:

Жуков Иван Васильевич

доктор ветеринарних наук, ОГБУ Липецкая областная ветеринарная лаборатория, директор

Скогорева Анна Михайловна

кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры паразитологии и эпизоотологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет им. Императора Петра I»

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова»

Защита состоится «29» мая 2012 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета ДМ 006.004.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии (ВНИВИПФиТ) по адресу: 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИВИПФиТ Россельхозакадемии

Автореферат  разослан «28» апреля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н., доцент  Ермакова Т.И.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы. Антимикробные лекарственные средства занимают одно из ведущих мест в фармакотерапии, как по номенклатуре препаратов, так и по частоте их применения. Это связано с тем, что бактериальные возбудители инфекционных заболеваний отличаются большим разнообразием и разной чувствительностью к антимикробным препаратам. Однако многие из них оказывают и негативный эффект. В отдельных случаях проявляют побочное действие на макроорганизм, затрудняют диагностику инфекций, оказывают селекционно-генетическое влияние на микроорганизм по формированию у последних устойчивости к антибактериальным средствам. Проблема резистентности микроорганизмов к различным антимикробным препаратам проявилась вскоре после начала их широкого применения в клинической практике. Поэтому актуален поиск высокоэффективных, малотоксичных антибактериальных препаратов, к которым длительное время не формируется резистентность у патогенной микрофлоры (Ефанова Л.И., 1997; Шахов А.Г., 1999).

В литературе все чаще появляются сообщения о так называемой множественной устойчивости микроорганизмов, когда у возбудителя наблюдается резистентность одновременно к 3 - 5  и более препаратам. Развитие устойчивости микроорганизмов к антибактериальным средствам является одним из основных факторов, ограничивающих эффективность их применения (Шахов А.Г., 2003).

Для предупреждения развития и борьбы с уже сформировавшейся антибиотикорезистентностью штаммов микроорганизмов предложены различные пути: одновременное использование двух и более антибиотиков (Толяронок Г.Е., 2006; Гулий О.И. и др., 2007); оптимизация применения препаратов уже имеющихся на вооружении (Воробейчиков Е.В. и др., 2006; Шабунин С.В., 2008., Bottner A.  et al., 2000); поиск препаратов, отличающихся по механизму действия от антибиотиков (Шкиль Н.А. и др., 2006).

Актуальность проблемы терапии инфекционных болезней, вызванных полирезистентными штаммами бактерий, не вызывает сомнения. Возможными путями её решения может явиться либо синтез новых антибактериальных средств, либо оптимизация применения имеющихся на вооружении препаратов (Шабунин С.В., 1999).

Комбинированная антибиотикотерапия в последние десятилетия является преобладающей при многих бактериальных инфекциях. В связи с широким распространением в крупных животноводческих хозяйствах желудочно-кишечных и респираторных болезней, вызываемых ассоциацией бактериальных возбудителей, целесообразно для лечения больных животных применять комплексные химиотерапевтические препараты, обладающие широким спектром антимикробного действия за счет того, что каждый компонент активен в отношении определенного возбудителя микробной ассоциации, нередко устойчивого к одному из входящих в комбинацию веществ (Ролинсон Г.Н., 1971; Шабунин С.В., 1999). Терапевтическая широта таких препаратов достигается многокомпонентностью, а выраженная антимикробная активность - синергическим или аддитивным эффектом (Шуклин В.П., 1997; Шабунин С.В., 1999).

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы является фармакологическое обоснование применения тетраголда при колибактериозе свиней и внедрение его в клиническую практику. Для её выполнения были поставлены следующие задачи:

1. Изучить антимикробную активность Тетраголда в опытах in vitro и in vivo.

2. Изучить влияние препарата на ультраструктуру эшерихий.

3. Изучить влияние тетраголда на организм клинически здоровых поросят.

4. Изучить фармакокинетику и остаточные количества тетраголда в организме поросят.

5. Определить оптимальную терапевтическую дозу и схему применения тетраголда при колибактериозе поросят.

6. Изучить фармакодинамику тетраголда у больных колибактериозом поросят.

7. Провести клинические испытания тетраголда при колибактериозе  поросят в производственных условиях.

Научная новизна. Впервые в опытах in vitro и in vivo изучена антимикробная активность Тетраголда в отношении возбудителя колибактериоза свиней; влияние его на ультраструктуру эшерихий; терапевтическая эффективность при колибактериозе поросят и дана фармако-токсикологическая характеристика препарата. Научная новизна подтверждена патентом на изобретение РФ «Препарат для лечения колибактериоза у молодняка сельскохозяйственных животных» № 2008127112 от 03.07.2008 г.

Практическая значимость работы. Разработан новый комплексный антибактериальный препарат, технология его промышленного производства и контроль качества, которые вошли в нормативно-техническую документацию  на препарат (Инструкция по применению Тетраголда от 17.11.2008 г. и ТУ по изготовлению и контролю опытной партии Тетраголда 10590965-0034-2008 от 17.11.2008 г.), согласованную с Главным государственным ветеринарным инспектором по Воронежской области. Материалы исследований вошли в «Практическое руководство по обеспечению продуктивного здоровья свиней» (2012).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 10-ти печатных работах, в том числе три статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 патенте и 1 практическом руководстве.

Апробация работы. Материалы диссертации апробированы и получили положительную оценку на Международной научно-практической конференции, посвящённой 65-летию Ульяновской ГСХА «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008); Международной научно-практической конференции, посвящённой 125-летию ветеринарии Курской области «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Курск, 2008); Международной научно-практической конференции «Молодость, талант, знания – ветеринарной медицине и животноводству» (Троицк, 2010); Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ГНУ ВНИВИПФиТ «Актуальные проблемы болезней обмена веществ у сельскохозяйственных животных в современных условиях» (Воронеж, 2010); Международной научно-практической конференции «От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины» (Саратов, 2011).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах, иллюстрирована 19 таблицами, 10 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений. Список литературы состоит из 253 источников, в том числе 90 иностранных авторов.

Основные положения,  выносимые на защиту:

  • научное обоснование состава нового комплексного антибактериального препарата тетраголд;
  • антимикробная активность препарата и влияние его на ультраструктуру эшерихий;
  • влияние препарата на организм клинически здоровых поросят;
  • оптимальная схема и терапевтическая доза тетраголда при колибактериозе поросят;
  • влияние тетраголда на клинические, морфологические, биохимические и иммунологические показатели больных колибактериозом поросят;
  • лечебная эффективность тетраголда при колибактериозе поросят;
  • экономическая эффективность применения тетраголда при колибактериозе поросят.

2. МАТЕРИАЛ, ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Диссертация выполнена в 2007-2011 г.г. в отделах фармакологии и микробиологии, вирусологии и иммунологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии в соответствии с планом научно-исследовательских работ по заданиям 08.04.01. «Разработать методы ранней диагностики, эффективные средства и способы профилактики и лечения массовых незаразных и вызываемых условно-патогенными микроорганизмами заболеваний у молодняка высокопродуктивных животных» (№ гос. рег. 15070.3666026906.06.8.001.2) программ фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации Россельхозакадемии на 2006-2010 г.г. 

Экспериментальные и научно-производственные опыты проведены в соответствии с требованиями к врачебно-биологическому эксперименту по подбору аналогов, постановке контроля, соблюдению одинаковых условий кормления и содержания животных в период проведения работы и учета результатов (И.Т. Фролов, 1965). Перед экспериментом лабораторных животных выдерживали в течение 2 недель в карантинных условиях на стандартном пищевом рационе (И.П. Западнюк с соавт., 1983). Животных брали в эксперимент после внутригрупповой адаптации. Доступ их к воде и корму был свободным, световой режим естественным.

Этиологическую структуру желудочно-кишечных заболеваний  изучали на основании эпизоотологического обследования хозяйств, результатов бактериологических, серологических и молекулярно-генетических исследований патологического материала от павших и убитых с диагностической целью больных животных.

Бактериологические исследования проводили общепринятыми классическими методами согласно утвержденным наставлениям. При бактериологических исследованиях использовали фекалии, тонкий отдел кишечника, брыжеечные лимфатические узлы, кровь из сердца, селезенку, почки, печень, трубчатую кость, головной мозг. Патологический материал исследовали не позднее 2 часов после его взятия. Посевы патологического материала проводили на мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), МПА с 5% крови барана, среду Эндо. Посевы инкубировали при температуре 37оС в течение 24 часов, после чего учитывали характер роста микроорганизмов. У выделенных чистых культур изучали тинкториальные, морфологические и культурально-биохимические свойства. Чувствительность выделенных штаммов микроорганизмов к антибиотикам определяли методом индикаторных бумажных дисков. Оценку результатов проводили путем измерения величины зоны задержки роста культур (ЗЗР). Патогенность выделенных штаммов микроорганизмов определяли биопробой на белых мышах.

Изучение антимикробной активности и оптимального соотношения компонентов в препарате тетраголд проводили методом серийных разведений в опытах in vitro (В.И. Антонов, 1986; М.А. Сидоров с соавт., 1995) совместно с аспирантом отдела фармакологии ВНИВИПФиТ В.В. Черновым и ведущим научным сотрудником отдела микробиологии, вирусологии и иммунологии, кандидатом ветеринарных наук Л.Ю. Сашниной, которым автор выражает искреннюю признательность за оказанную помощь и плодотворное сотрудничество.

В качестве тест-культур использовали референтные и полевые (патогенные) штаммы E. сoli разных серовариантов - возбудителей желудочно-кишечных болезней поросят, типированных по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим и серологическим свойствам.

Минимальную бактериостатическую концентрацию (МБсК) изучаемых препаратов определяли методом серийных разведений в мясопептонном бульоне (МПБ); минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) – путем высева из пробирок с прозрачной средой на плотные питательные среды (МПА), не содержащие препарат.

Индекс специфической защиты тетраголда определен на модели эшерихиозной инфекции белых мышей (n=160) массой 18-20 г.





Группы формировали по принципу аналогов по 10 животных, при этом учитывали массу тела, развитие и клиническое состояние. Животные контрольных групп лечению не подвергались. За подопытными животными вели клиническое наблюдение в течение 15 дней, учитывали заболеваемость, гибель, сроки выздоровления. Специфичность гибели определяли бактериологическим методом путем выделения исходных культур микроорганизмов.

Заражение животных проводили внутрибрюшинно смывом суточной агаровой культуры возбудителя. Разведение культуры делали на стерильном физиологическом растворе. Концентрацию микробных клеток определяли по стандарту мутности. В предварительных опытах была определена DLM культуры эшерихий, которая составила – 4,0 млн м.к.

С профилактической целью препарат вводили однократно одновременно с заражением в дозе 200,0 мг/кг. С терапевтической целью лечение мышей начинали через 6 часов после заражения. Препарат вводили один раз в сутки внутрижелудочно в той же дозе в течение 5 дней.

О терапевтической эффективности препарата судили по количеству выживших мышей после окончания лечения и числу мыше-дней для каждой группы через 15 дней после инфицирования.

Изучение влияния Тетраголда на ультраструктуру эшерихий проводили в лаборатории биофизики ГНУ ВНИИЭВ им. Я.Р. Коваленко (зав. лабораторией – кандидат биологических наук Надточей Г.А.). В исследованиях использовали культуру Escherichia  coli 866 в фазе логарифмического роста, выращенную на МПБ из расчета 500 тыс. микробных клеток на 1 мл среды в условиях усиленной аэрации. Препарат добавляли к 5-ти часовой культуре в минимальной бактерицидной концентрации (6,25 мкг/мл) и в концентрации  в 4 раза ее превышающую – 25,0 мкг/мл. Время инкубации составляло 3 часа.

Контролем служила культура эшерихий без препарата. Для приготовления электронно-микроскопических препаратов опытные и контрольные культуры центрифугировали 20 минут при 3000 оборотов/мин. Осадок 3 раза отмывали физиологическим раствором. Затем бактериальные клетки помещали в 2,5% глутаровый альдегид на S-коллидиновом буфере, после чего проводили постфиксацию и заливку в эпоновые смолы.

Срезы получали на ультратоме LKB III - 8802А, контрастировали  2%-ным водным раствором уранил ацетата и цитратом свинца  в течение 10 минут и просматривали в электронном микроскопе марки JEM-100 CX II фирмы JEOL при ускоряющем напряжении 80 кВольт  и разрешающей способности 3 ангстрема. При этом применяли инструментальное увеличение 10000-19000.

Изучение влияния тетраголда на организм клинически здоровых животных проведено на 18 поросятах 30-35-дневного возраста, которые были разделены на три группы. Контрольным животным препарат не применяли (1-я группа). Поросятам опытных групп тетраголд применяли перорально в дозах 200,0 (терапевтическая доза) и 600,0 мг/кг массы тела (3-х кратная терапевтическая доза) в течение 14 дней с интервалом между введениями 24 часа.

Изучение фармакокинетики и остаточных количеств тетраголда в организме поросят проведено в направлении определения в биоматериале содержания сульфадимезина, триметоприма и колистина.

Определение сульфадимезина проводили спектрофотометрически. Метод основан на цветной реакции диазотированной сульфаниловой кислоты с α-нафтолом в сильнощелочной среде. Реакция специфична для сульфаниламидов. Гепаринизированную кровь, плазму или сыворотку крови в количестве 0,2-1 мл в зависимости от предполагаемого содержания препарата доводили дистиллированной водой до 3 мл. Пробы выдерживали до полного гемолиза, после чего осаждали белки трихлоруксусной кислотой. После осаждения белков пробы центрифугировали.

Мочу разводили водой в 20-100 раз в зависимости от предполагаемого содержания препарата и фильтровали. Навеску органов и тканей в количестве 0,1-0,5 г в зависимости от предполагаемого содержания препарата тщательно растирали в фарфоровой ступке с кварцевым песком, добавляя небольшое количество дистиллированной воды, после чего всю массу количественно переносили в мерную центрифужную пробирку и объем дистиллированной водой доводили до 3 мл. Белки осаждали трихлоруксусной кислотой, перемешивали содержимое стеклянной палочкой, а затем пробы центрифугировали. Содержание сульфадимезина определяли в надосадочной жидкости спектрофотометрически.

Определение триметоприма в биоматериале проводили микробиологическим методом диффузии в агар с тест-культурой Bacillus pumillus 8241 (стандарт ВГНКИ) с добавлением в среду ингибитора активности сульфаниламидов – пара-аминобензойной кислоты до концентрации 150,0 мкг/мл.

Определение колистина в биоматериале проводили микробиологическим методом диффузии в агар с тест-культурой Bordetella bronchiseptica AТСС 4617 (стандарт ВГНКИ) аналогично выполнению методики определения триметоприма в биоматериале.

При проведении исследований руководствовались «Методическими указаниями по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства» № 3049-84 от 29.06.84 г.

Клинические опыты по изучению химиотерапевтической эффективности тетраголда проводили на поросятах 5-15 дневного возраста (n=198 гол.) в двух хозяйствах, стационарно неблагополучных по колибактериозу: ООО «Племенное» Воловского района Липецкой области и ООО «Бекон» Мантуровского района Курской области.

Диагноз на заболевание колибактериозом устанавливали комплексно на основании данных клинического обследования животных, бактериологического исследования патологического материала, патологоанатомического вскрытия павших поросят, с учетом эпизоотической ситуации в хозяйстве.

При определении клинического статуса больных поросят проводили измерение ректальной температуры, устанавливали частоту и характер пульсовой волны. Методами осмотра, бимануальной пальпации и перкуссии оценивали состояние печени, тонкого и толстого отделов кишечника, а также проводили макроскопическое исследование фекалий (учитывали частоту дефекации; количество фекалий, выделяемое за одну дефекацию и за сутки; консистенцию и форму фекалий; цвет, запах и наличие примесей крови, слизи, гноя).

Общее состояние животных оценивали общепринятыми методами (В.Г. Колб, В.С. Камышников, 1982; И.П. Кондрахин с соавт., 2004). Морфологический анализ крови проводили на гематологическом анализаторе «АВХ Micros 60», биохимические исследования – на анализаторе «Hitachi-902» в соответствии с «Методическими рекомендациями по применению биохимических методов исследований крови животных» (2005).

Для характеристики неспецифической иммунологической резистентности организма определяли показатели гуморального звена: бактерицидную активность (%); лизоцимную (мкг/мл); комплементарную (% гемолиза) активность сыворотки крови и клеточного звена: фагоцитарную активность лейкоцитов, фагоцитарный индекс и фагоцитарное число в соответствии с «Методическими рекомендациями по оценке и коррекции неспецифической резистентности животных» (2005).

Экономическую эффективность применения препарата определяли согласно «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий» (1997).

Статистическая обработка результатов проведена с пользованием пакетов прикладных программ «Microsoft Excel», «Statistica 5,0» на PC «Pentium III». Достоверность отличий оценивали методом парных сравнений, используя t-критерий Стъюдента (Лакин Г.Ф., 1990).

За помощь при проведении комплексных исследований выражаем искреннюю признательность сотрудникам отдела физико-химических методов исследования (зав. отделом – кандидат биологических наук Шушлебин В.И.), лаборатории биофизики ГНУ ВНИИЭВ им. Я.Р. Коваленко (зав. лабораторией – кандидат биологических наук Надточей Г.А.) и специалистам свиноводческих хозяйств, в которых проводились производственные опыты.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение антимикробной активности тетраголда и оптимального соотношения компонентов в препарате

Было изучено 5 композиций препарата в сравнении с сульфадимезином, колистином и триметопримом. Соотношение компонентов в препарате было следующим (в вес. %): К1 – 15,0:2,5:3,0; К2 – 12,0:3,0:2,4; К3 - 12,0:3,0:3,0; К4 - 18,0:2,0:3,6 и К5 - 15,0:3,0:3,0. В качестве тест культуры использовали референтный штамм Е. coli 26.

Как видно из данных таблицы 1, в опытах in vitro был выявлен устойчивый эффект усиления антимикробного действия сульфадимезина, колистина и триметоприма при комбинированном применении. Установлено, что одновременное воздействие их на эшерихии в опытах in vitro приводит к снижению МБсК каждого компонента в пяти композициях: колистина с 1,56 мкг/мл до 0,09-1,0 мкг/мл, триметоприма с 50,0 до 0,075-1,8 мкг/мл и сульфадимезина – с 50,0 до 0,37-9,0 мкг/мл. Следовательно, сочетанное применение трех компонентов позволяет снизить дозы этих препаратов в несколько раз, сохранив при этом их высокую активность.

Таблица 1

Антимикробная активность (МБсК) колистина, сульфадимезина,

триметоприма и различных композиций препарата, мкг/мл

Композиция

К

С

Т

Композиция

В пересчете на

С

К

Т

К1

1,56

50,0

50,0

12,5

1,88

0,31

0,38

К2

3,12

0,37

0,094

0,075

К3

12,5

1,50

0,38

0,38

К4

50,0

9,00

1,00

1,80

К5

3,12

0,47

0,094

0,094

Обозначения: К – колистин; С – сульфадимезин; Т – триметоприм; К1 – композиция 1; К2 – композиция 2; К3 – композиция 3; К4 – композиция 4; К5 – композиция 5

Таким образом, изучение антимикробной активности различных композиций препарата и отдельных компонентов показало наличие взаимоусиливающего (синергидного) действия в отношении E. coli 26. В опытах in vitro установлено, что наиболее активными являются композиции 1, 2 и 5.

С учетом полученных результатов в опытах in vitro в дальнейшей работе в опытах in vivo были испытаны 3 композиции (К1, К2 и К5). Определение их эффективности проводили в модельных опытах при экспериментальном заражении белых мышей Escherichia coli.

В контрольной группе животных, не подвергавшихся обработке тетраголдом, была зафиксирована 100%-ная гибель мышей.

Наибольшую активность при эшерихиозной инфекции проявили композиции К2 и К5. Применение данных композиций через 6 часов после заражения сдерживало развитие инфекции в 80,0% случаев. При применении композиции 1 индекс защиты составил 60,0%.

Следует отметить, что гибель мышей во всех опытных группах по сравнению с контролем была зафиксирована в более отдаленные сроки.

Профилактическая эффективность композиций 1 и 2 при эшерихиозной инфекций была ниже соответственно на 20,0% и 10,0%, чем при применении композиции 5. Сохранность животных составила 30,0, 40,0 и 50,0% соответственно, при 100,0% гибели животных контрольной группы.

Также отмечено увеличение суммарной продолжительности жизни белых мышей в зависимости от применяемой композиции. При эшерихиозной инфекции этот показатель соответственно был на уровне 72 дней (композиция 1), 87 дней (композиция 2) и 98 дней (композиция 5). Суммарная продолжительность жизни мышей в контрольной группе составила 27 дней.

Таким образом, наиболее высокий индекс защиты белых мышей обеспечило применение композиции 5, в связи с этим более детально была изучена ее антимикробная активность.

Согласно данным, представленным в таблице 2, тетраголд обладает выраженными антимикробными свойствами. Активность препарата в отношении музейных штаммов эшерихий составила 1,56 - 6,25 мкг/мл, полевых -  6,25-25,0 мкг/мл. Бактерицидное действие препарата в отношении изученных культур превышало бактериостатическое соответственно в 2 раза.

Таблица 2

Антимикробная активность тетраголда  (мкг/мл)

Культура

микроорганизмов

МБсК

МБцК

Escherichia coli 57/853

3,12

6,25

Escherichia coli 26

1,56

3,12

Escherichia coli О4

6,25

12,5

Escherichia coli 866

3,12

6,25

Escherichia coli О(III) (п)

25,0

50,0

Escherichia coli О78 (п)

6,25

12,5

Escherichia coli К88 (п)

12,5

25,0

Escherichia coli К99 (п)

25,0

50,0

3.2. Влияние Тетраголда на ультраструктуру E.coli

Исходные клетки E.coli имели морфологию, типичную для этого вида микроорганизмов (рис. 1 а, б). Клеточная стенка эшерихий имела трехслойную волнистую структуру, обусловленную наружным бимолекулярным липидо-протеиновым слоем. Цитоплазматическая мембрана плотно прилегала к цитоплазме по всей поверхности клетки, имела хорошую очерченность. Слои наружной оболочки, периплазматического пространства и цитоплазматической мембраны четко видны и дифференцированы. У делящихся клеток так же на всем протяжении клеточной стенки хорошо заметна типичная трехслойная структура.

Рис. 1 а, б. КС – клеточная стенка; Н – нуклеоид; МС – мезосомальные структуры; Ц – цитоплазма; Р – рибосомы; ЦПМ – цитоплазматическая мембрана; П – перетяжка деления. Ув. 19000.

Внутри клеток цитоплазма гомогенна, нуклеоид хорошо просматривался и занимал большую часть цитоплазмы, вокруг него обнаруживали электронно-плотный слой рибосомального аппарата и мембранные структуры клетки.

При действии на культуру E.coli тетраголда в минимальной бактерицидной концентрации (6,25 мкг/мл) в течение 3-х часов морфологическим изменениям подвергалось около 68% клеток (рис. 2а), проявляющимся утолщением микробной клетки и ее стенки, образованием на наружном слое многочисленных выростов, частичным или полным лизисом отдельных участков с выходом составляющих компонентов за пределы клетки, отслоением мембраны от цитоплазмы, приобретающей мелкозернистую структуру меньшей электронной плотности с обширными зонами лизиса, нарушением процесса деления клеток.

Рис. 2 а, б. КС – клеточная стенка; РКС – участки частичного и полного расплавления клеточной стенки; Ц – цитоплазма; ЛЦ – зоны цитоплазмы меньшей электронной плотности в местах, прилегающих к лизированной клеточной стенке; ЛН – лизированный нуклеоид; П – перетяжка между дочерними клетками. Ув. 19000.

Рис. 3 а, б. ЛК – лизированные клетки; КС – клеточная стенка; ЛДК – лизированная делящаяся клетка; Ц – цитоплазма, локализованная по периферии клетки; ЛКС – участок расплавления клеточной стенки; ЛН – электронно-прозрачный участок лизированного нуклеоида; ПК – погибшая клетка. Ув. 19000.

Воздействие 4МБцК (25,0 мкг/мл) тетраголда приводило к более существенным структурным изменениям 95% клеток, проявляющимся уменьшением размера клеток, их утолщением, потерей клеточной стенкой волнистой трехслойной структуры, наличием на всей ее поверхности рыхлого материала и расплавлением у отдельных клеток стенки с выходом содержимого цитоплазмы, лизисом цитоплазматической мембраны и цитоплазмы с образованием на месте последних обширных электронно-разряженных областей, заполненных остатками мембранных структур, лизисом нуклеоида и выявлением на его месте электронно-прозрачного слоя.

Обнаруженные изменения клеток эшерихий под влиянием тетраголда обусловлены комбинацией колистина, триметоприма и сульфаниламида, входящих в состав препарата.

3.3. Влияние тетраголда на организм клинически здоровых поросят

В опыте по изучению влияния тетраголда на организм клинически здоровых поросят было установлено, что препарат в терапевтической и в три раза превышающей ее дозах не оказывал существенного влияния на клинический статус, скорость роста, поведение и аппетит поросят. показатели клинического состояния поросят всех групп в течение всего опыта находились в пределах нормы.

В период всего опыта поросята контрольной и опытных групп были подвижны, аппетит выражен, рефлексы сохранены. Нарушений функций пищеварения и мочеотделения не установлено. Препарат в указанных дозах не снижал скорости роста поросят.

Многократное применение его в терапевтической (200,0 мг/кг) и в 3 раза превышающей ее (600,0 мг/кг) дозах существенно не влияло на морфологические, биохимические и иммунологические показатели крови поросят.

Моча животных опытных и контрольной групп во все периоды исследования соответствовала норме: прозрачная, светло-желтого цвета, рН 6,2-7,0, удельный вес – 1,018-1,022, белок, углеводы, билирубин, уробилин, индикан и кетоновые тела не регистрировали, что свидетельствует о том, что тетраголд в испытанных дозах не проявляет нефротоксического действия.

3.4. Фармакокинетика и остаточные количества препарата тетраголд

в организме поросят

Фармакокинетические исследования показали, что уже через 30 минут после введения препарата активнодействующие вещества (сульфадимезин, триметоприм и колистин) обнаруживаются в крови поросят. Как видно из данных, представленных на рисунке 4, максимальная концентрация сульфадимезина в сыворотке крови достигает максимума через 3 часа (26,84±0,21 мкг/мл), после чего она начинает плавно снижаться, но при этом продолжает оставаться до 24 часов на уровне минимальной подавляющей концентрации для эшерихий.

Максимальная концентрация триметоприма в сыворотке крови также достигает максимума через 3 часа (10,57±0,27 мкг/мл), после чего она начинает плавно снижаться, продолжая оставаться до 24 часов на уровне минимальной бактериостатической концентрации для эшерихий. Максимальная концентрация колистина (2,17±0,07 мкг/мл) в плазме крови достигает максимума через 2 часа и превы-

Рис. 4. Содержание сульфадимезина и триметоприма в крови поросят после однократного перорального введения тетраголда в дозе 0,2 г/кг

шает МБсК по колистину в 4 раза, хотя и составляет 2-3% от введенной дозы (рис. 5). Затем его концентрация начинает снижаться и к 6 часам становится равной МБсК по колистину. К 9 часам колистин отсутствует в крови поросят.

В тоже время изучение антимикробной активности тетраголда показало наличие синергидного эффекта у данного препарата, т.е. в данном случае колистин способствует сни-жению МБсК сульфадимезина и триметоприма для изученных культур микроорганизмов. Эти данные позволяют назначать тетраголд один раз в

Рис. 5. Содержание колистина в крови поросят после однократного  перорального введения тетраголда в дозе 0,2 г/кг

сутки, так как при курсовом применении препарата, концентрации сульфадимезина и триметоприма превышает МБсК для эшерихий (соответственно 2,51 и 0,5 мкг/мл).

Таким образом, однократное  введение тетраголда в дозе 0,2 г/кг обеспечивает терапевтическую концентрацию активнодействующих веществ в организме поросят в течение 24 часов.

Определение остаточных количеств тетраголда в органах, тканях и биологических жидкостях поросят через 7 суток после последнего применения препарата показало, что сульфадимезин, триметоприм и колистин отсутствовали во всех объектах исследования.

Таким образом, срок возможного убоя животных на мясо после применения тетраголда должен быть не менее 7 суток.

3.5. Отработка оптимальной дозы и схемы применения тетраголда

поросятам-сосунам при колибактериозе

Опыты по отработке оптимальной терапевтической дозы и схемы применения тетраголда при колибактериозе поросят проведены в ООО «Агрофирма Ливенское мясо» Ливенского района Орловской области.

Животные первой группы (n=19) служили контролем. Для их лечения применяли байтрил 10% согласно инструкции по его применению. Животным второй (опытная, n=17) группы применяли тетраголд внутрь ежедневно два раза в сутки индивидуально в течение 5 дней в дозе 0,1 г/кг массы тела. Животным третьей (опытная, n=17) группы применяли тетраголд внутрь ежедневно один раз в сутки индивидуально в течение 5 дней в дозе 0,2 г/кг массы тела. За животными проводили ежедневное клиническое наблюдение, при этом учитывали общее состояние, падеж, сроки выздоровления.

Проведенные исследования показали, что тетраголд обладает высокой терапевтической эффективностью при лечении колибактериоза поросят-сосунов. По сравнению с контролем при применении тетраголда уменьшился срок выздоровления в первой опытной группе на 39,4%, во второй – на 43,9%. Среднесуточные приросты массы тела поросят опытных групп за семидневный период опыта были выше, чем в контроле соответственно на 5,4 и 20,5%. Наиболее эффективной оказалась  доза 0,2 г/кг массы тела с интервалом введения 24 часа. При сравнении с контролем (байтрил 10%) и опытной группой, получавшей тетраголд два раза в сутки в дозе 0,1 г/кг, терапевтическая эффективность была выше соответственно на 42,1 и 11,8% с более быстрым выздоровлением поросят.

3.6. Лечебная эффективность тетраголда при колибактериозе поросят

Лечебную эффективность тетраголда изучали в сравнении с сульф гранулятом и спектам-пастой (базовые варианты) в опыте на поросятах 3–7 дневного возраста в свиноводческих хозяйствах ООО «Бекон» Мантуровского района Курской области (базовый вариант сульф гранулят) и ООО «Племенное» Воловского района Липецкой области (базовый вариант – спектам-паста).

Указанные хозяйства стационарно неблагополучны по колибактериозу. Заболевание возникало в период массовых опоросов и протекало со значительным охватом восприимчивого поголовья. Наиболее высокие заболеваемость и летальность регистрировали среди поросят 3–7 дневного возраста, которые, как правило, заболевали погнёздно.

В первом опыте по изучению терапевтической эффективности тетраголда было сформировано две группы животных с выраженными клиническими признаками колибактериоза. Поросятам первой группы (n=72) тетраголд применяли в дозе 0,2 г/кг в течение 5 дней с интервалом 24 часа. Лечение животных второй группы (n=67) проводили сульф гранулятом в соответствии с инструкцией по его применению. Во второй опыт было взято 59 больных колибактериозом животных. Поросятам опытной группы (n=29) применяли тетраголд по той же схеме и в тех же дозах, что и в первом опыте, а животным (n=30) базового варианта - спектан-пасту в соответствии с инструкцией по применению.

Химиотерапевтические средства вводили перорально в виде взвеси в воде, индивидуально, в объёме 4 мл на животное.

В период лечения, а также после него в течение 15 дней за поросятами вели клиническое наблюдение за общим состоянием, учитывали температурную реакцию, длительность и течение болезни, сроки наступления выздоровления, а также падёж и среднесуточный прирост массы тела (на 1-й и 15-й дни эксперимента). Результаты клинических испытаний представлены в таблице 3.

Таблица 3

Сравнительная терапевтическая эффективность тетраголда при колибактериозе поросят

Показатели

Группы животных 

Тетраголд

Сульф

гранулят

Тетраголд

Спектам-паста

Количество животных, подвергнутых обработке, гол.

72

67

29

30

Продолжительность применения препарата, дн.

5

5

5

5

Количество выздоровевших животных, гол.

%

65

90,3

58

86,6

27

93,1

27

90,0

Количество павших животных, гол.

%

-

-

1

1,5

-

-

1

3,3

Осталось больных животных, гол.

%

7

9,7

8

11,9

2

6,9

2

6,7

Средняя масса тела одного животного, кг: в начале

в конце опыта

2,07

3,91

2,0

3,63

1,70

3,97

1,30

3,15

Среднесуточный прирост массы тела, г

122,7

108,7

151,3

123,3

При использовании тетраголда уже на 2–3 день у большинства поросят значительно улучшилось общее состояние, практически полностью восстановился аппетит, нормализовалась температура тела, полностью прекращалась диарея, исчезли признаки обезвоживания, восстановилась двигательная активность (купировались явления угнетения, атаксии, дисметрии и другие признаки поражения центральной и периферической нервной системы). В базовом варианте лечебный эффект регистрировали на 3 –  4 день. У 45% поросят к этому сроку, а у остальных животных на 5 – 6 день лечения прекратилась диарея при общем удовлетворительном состоянии, а также практически полностью восстановились аппетит и двигательная активность.

Во втором опыте наблюдения показали, что уже после второй дачи тетраголда у 50 % поросят улучшилось клиническое состояние, на третий день полностью прекратился диарейный синдром, у 90 % поросят восстановилась двигательная активность и нормализовался аппетит, исчезли признаки поражения нервной системы. В базовом варианте лечебный эффект регистрировали на 4 – 5 день.

По результатам двух опытов было установлено, что тетраголд является эффективным терапевтическим средством при колибактериозе поросят. Применение его обеспечивает выздоровление 90,3-93,1% животных. По лечебной эффективности препарат превосходит базовые варианты (сульф гранулят и спектам-пасту) в среднем на 3,4% . Среднесуточный прирост массы тела в опытной группе был больше, чем в базовых вариантах на 12,9 и 22,7%.

3.7. Изучение влияния тетраголда на морфологические, биохимические и 

иммунологические показатели крови больных колибактериозом поросят

В сыворотке крови больных поросят-сосунов значительно была снижена концентрация альбуминов до 31,4% (при норме 40-50%), а содержание -глобулинов и -глобулинов повышено, что свидетельствует о перераспределении фракций белка в ответ на воздействие возбудителя инфекции.

Энергетическая обеспеченность их была значительно ниже, чем клинически здоровых поросят, об этом свидетельствует более низкий уровень глюкозы, общих липидов и, наоборот, повышенное содержание холестерина.

При изучении иммунного статуса у поросят с диарейным синдромом в крови отмечено повышение количества лейкоцитов и снижение содержания лимфоцитов по сравнению с аналогичными показателями у здоровых поросят.

При изучении гуморальных факторов естественной резистентности установлено увеличение у больных поросят бактерицидной, комплементарной и лизоцимной активности сыворотки крови, вероятно, обусловленное с одной стороны повышением уровня белков системы комплемента в острую стадию заболевания, а с другой – обезвоживанием организма. При этом отмечено значительное угнетение фагоцитарной активности лейкоцитов, снижение фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса.

В конце терапевтического курса произошло, хотя и не значительное, увеличение количества эритроцитов (на 10,5%) и гемоглобина (8,8%), снижение содержания лейкоцитов на 21,1%. Выздоровление поросят характеризовалось нормализацией лейкограммы – снижалось количество палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов соответственно в 2,5 раза и на 32,0%, эозинофилов - на 53,1%, увеличивалось количество моноцитов в 1,9 раза и лимфоцитов - на 45,3%, что свидетельствовало об уменьшении воспалительного процесса в организме. Происходила нормализация обменных процессов: увеличение уровня глюкозы - на 30,7%, липидов – на 11,9%, снижение содержания холестерина - на 35,2%.

Повышение количества общего белка сыворотки крови по сравнению с нормой (69,8±1,08 г/л) произошло за счет глобулиновых фракций при одновременном уменьшении концентрации альбуминов, что, по всей видимости, связано с нарушением водного баланса организма, вызванного диареей при колибактериозе. Поэтому снижение этого показателя практически до нормы, а также повышение содержания альбуминов на 21,6% с одновременным снижением количества α-, β- и - глобулинов свидетельствовало о косвенном положительном влиянии тетраголда, направленном на устранение диспротеинемии и, следовательно, на угасание инфекционного процесса.

Препарат способствовал нормализации общей неспецифической резистентности организма, проявляющейся снижением комплементарной - на 17,3 %, бактерицидной - на 13,8 % и лизоцимной активности сыворотки крови практически в 3 раза. В то же время под действием препарата происходило повышение фагоцитарной активности лейкоцитов - на 9,4%, фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса в 2,2 раза.

Также происходила нормализация обменных процессов: увеличение уровня глюкозы - на 30,7%, липидов – на 11,9%, снижение содержания холестерина - на 35,2%.

3.8. Экономическая эффективность применения препарата тетраголд при колибактериозе поросят

Экономическую эффективность лечебных мероприятий с использованием антибактериального препарата Тетраголд проводили в свиноводческом хозяйстве ООО «Племенное» Воловского района Липецкой области на 156 больных животных 5-15-дневного возраста. Препарат назначали в дозе 0,2 г/кг массы тела 1 раз в сутки в течение 5 дней. В период проведения опыта за животными вели клиническое наблюдение, учитывали сроки выздоровления. В начале опыта и после лечения проводили взвешивание поросят.

Фактический ущерб, нанесенный заболеванием, составил 4180,8 руб., затраты на проведение ветеринарных мероприятий - 1337,2 руб. Предотвращенный экономический ущерб из расчета на общее поголовье восприимчивых животных был равен 9422,88 руб. Экономический эффект, полученный в результате осуществления лечебных мероприятий с применением тетраголда составил 8085,68 рубля, на один рубль затрат – 6,05 рубля.

4. ВЫВОДЫ

1. Новый комплексный антибактериальный препарат тетраголд, действующими веществами которого являются сульфадимезин, триметоприм и колистин, обладает достаточно высокой активностью в отношении возбудителя колибактериоза. Минимальная бактериостатическая и бактерицидная концентрации препарата в отношении эшерихий составили соответственно 1,56-25,0 и 3,12-50,0 мкг/мл.

2. Использование комбинации сульфадимезина, триметоприма и колистина в препарате дает выраженный синергидный эффект, проявляющийся снижением МБсК колистина с 1,56 мкг/мл до 0,09-0,3 мкг/мл, триметоприма с 50,0 до 0,075-1,8 мкг/мл и сульфадимезина – с 50,0 до 0,37-9,0 мкг/мл.

3. Тетраголд обладает профилактической и терапевтической эффективностью при экспериментальной эшерихиозной инфекции белых мышей. Индекс защиты при профилактике инфекции составил 50,0%, при терапии – 80,0% при 100,0% гибели животных контрольной группы.

4. Выявленные изменения в ультраструктуре эшерихий под действием тетраголда обусловлены синергидным эффектом составляющих его компонентов. Воздействие минимальной бактерицидной концентрации препарата (6,25 мкг/мл) на эшерихии проявляется утолщением микробной клетки и ее стенки, образованием на наружном слое многочисленных выростов, частичным или полным лизисом отдельных участков с выходом составляющих компонентов за пределы клетки, отслоением мембраны от цитоплазмы, приобретающей мелкозернистую структуру меньшей электронной плотности с обширными зонами лизиса, нарушением процесса деления клеток.

Воздействие четырехкратной бактерицидной концентрации тетраголда (25,0 мкг/мл) вызывает более выраженные изменения, проявляющиеся уменьшением размера клеток, их утолщением, потерей клеточной стенкой волнистой трехслойной структуры, наличием на всей ее поверхности рыхлого материала и расплавлением у отдельных клеток стенки с выходом содержимого цитоплазмы, лизисом цитоплазматической мембраны и цитоплазмы с образованием на месте последних обширных электронно-разряженных областей, заполненных остатками мембранных структур, лизисом нуклеоида и выявлением на его месте электронно-прозрачного слоя.

  5. При пероральном введении тетраголда в дозах 200,0 и 600,0 мг/кг в течение 14 дней клинически здоровым поросятам он не оказывает существенного влияния на их клинический статус, скорость роста, поведение и аппетит, на морфологические,  биохимические и иммунологические показатели крови.

6. При пероральном введении тетраголда составляющие его компоненты сульфадимезин и триметоприм быстро всасываются в кровь и проникают во многие органы и ткани. Максимальное содержание их в сыворотке крови поросят наблюдается через 3 часа в концентрациях 26,84 и 10,57 мкг/мл соответственно. Концентрация сульфадимезина и триметоприма при курсовом применении тетраголда поддерживается на уровне МБсК для эшерихий. Колистин практически не всасывается из желудочно-кишечного тракта и его  концентрация  в сыворотке крови поросят достигает максимума  (2,17 мкг/мл) через 2 часа.

7. Тетраголд обладает высокой терапевтической эффективностью при колибактериозе поросят. Применение его в дозе 200,0 мг/кг один раз в сутки в течение 5 дней обеспечивает выздоровление животных в 90,3-93,1% случаев.

8. Применение тетраголда при колибактериозе поросят способствует нормализации морфологических и биохимических показателей крови, характеризующейся увеличением содержания эритроцитов (на 10,5%) и гемоглобина (на 8,8%), количества моноцитов и лимфоцитов -  в 1,9 и 1,5 раза, уровня глюкозы, липидов, альбуминов соответственно - на 30,7, 11,9 и 21,6%,  снижением количества лейкоцитов и эозинофилов на 21,1 и 53,1%, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов – в 2,5 и 1,5 раза, холестерина - на 35,2%, а также общей неспецифической резистентности организма, проявляющейся снижением комплементарной, бактерицидной соответственно - на 17,3 и 13,8% и лизоцимной активности сыворотки крови практически в 3 раза, повышением фагоцитарной активности лейкоцитов - на 9,4%, фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса в 2,2 раза.

9. Применение тетраголда при лечении больных колибактериозом поросят является экономически выгодным. Эффективность лечебных мероприятий составляет 6,05 рубля на один рубль затрат.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для лечения больных колибактериозом поросят рекомендуется применять тетраголд в дозе 200,0 мг/кг один раз в сутки в течение 5 дней.

2. Основные научные положения работы и ее практические результаты рекомендуется использовать в производственных условиях ветеринарными специалистами, а также в учебном процессе студентами, аспирантами и научными работниками ветеринарного профиля.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Востроилова Г.А. Фармако-токсикологические свойства тетраголда / Г.А. Востроилова, В.В. Чернов, О.В. Казимиров // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: матер. междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 65-летию Ульяновской ГСХА. – Ульяновск, 2008. – Т.3. – С. 24–27.

2. Чернов В.В. Общее действие препарата тетраголд и его влияние на качество мяса / В.В. Чернов, О.В. Казимиров // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: матер. междунар. науч.-практ. конф. посвященной 125-летию ветеринарии Курской области. – Курск, 2008. – С. 412–413.

3. Казимиров О.В. Лечебная эффективность тетраголда при колибактериозе поросят в условиях производства / О.В. Казимиров // Актуальные проблемы болезней обмена веществ у сельскохозяйственных животных в современных условиях: матер. междунар. науч.-практ. конф., посвященной 40-летию ГНУ ВНИВИПФиТ. – Воронеж: «Истоки», 2010. – С. 122–125.

4. Казимиров О.В. Лечение желудочно-кишечных болезней бактериальной этиологии у молодняка свиней тетраголдом / О.В. Казимиров, В.В. Чернов // Труды Всероссийского совета молодых ученых и специалистов аграрных образовательных и научных учреждений. Том 3: «Молодость, талант, знания – ветеринарной медицине и животноводству»: матер. междунар. науч.-практ. конф. – Троицк: УГАВМ, 2010. – С. 54–56.

5. Казимиров О.В. Вияние тетраголда на организм поросят в субхроническом опыте / О.В. Казимиров // Основные проблемы и перспективы развития ветеринарной медицины в обеспечении животноводства Прикаспийского региона Российской Федерации. – Махачкала: ГНУ ПЗНИВИ, 2010. – С. 31–33.

*6. Казимиров О.В. Сравнительная теапевтическая эффективность тетраголда при колибакериозе поросят / О.В. Казимиров, Ю.Н. Бригадиров, Е.В. Михайлов // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана. – 2011. – Т. 205. – С. 94–98.

7. Казимиров О.В. Экономическая эффективность применения Тетраголда при колибактериозе поросят / О.В. Казимиров // От теории – к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины: матер. междунар. науч.-практ. конф., посвященной 121 годовщине создания ГНУ Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт РАСХН 20-21 сентября 2011 г. – Саратов: СНИВИ, 2011. – С. 98–102.

*8. Бригадиров, Ю.Н. Комплексная система мероприятий по профилактике и борьбе с респираторными и желудочно-кишечными болезнями свиней в современных условиях производства // Ю.Н. Бригадиров, О.В. Казимиров, С.В. Борисенко, М.Л. Бердников, Е.В. Михайлов, А.Н. Модин, Н.А. Борисенко, О.А. Манжурина, В.В. Давыдова // Ветеринарная патология. – 2011. – № 4. – С. 40–45.

*9. Казимиров, О.В. Лечебная эффективность новых комплексных антимикробных препаратов при желудочно-кишечных заболеваниях поросят бактериальной этиологии  / О.В. Казимиров, Ю.Н. Бригадиров, М.Л. Бердников, С.В. Борисенко, Е.В. Михайлов, А.Н. Модин // Достижения науки и техники АПК журнал. – 2012. – № 1. – С. 33–34.

10. Патент №2366414 РФ, С1. Препарат для лечения колибактериоза у молодняка сельскохозяйственных животных / С.В. Шабунин, Г.А. Востроилова, Т.Е. Рогачёва, В.В. Чернов, О.В. Казимиров № 2008127112/15., заявлено 03.07.2008., опубликовано 10.09.2009, Бюлл. № 25.

_____________________________________________________

* - публикации в научных изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.