WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

ОБЪЯВЛЕНИЕ

Крючкова Марина Анатольевна

Фармако-токсикологическая  и биологическая оценка препарата  дермадекс  при трихофитии и микроспории  животных

06.02.03

биологические науки

Д-220.012.01

Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности

420075, г. Казань, Научный городок -2, тел. (843)  239.53.20

E mail: vnivi@mail.ru

Предполагаемая дата защиты диссертации – 11  декабря  2012г.

На правах рукописи





крючкова марина анатольевна



ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ  И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРЕПАРАТА ДЕРМАДЕКС 

ПРИ ТРИХОФИТИИ И МИКРОСПОРИИ  ЖИВОТНЫХ


06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»), г. Казань.

Научный руководитель:  доктор биологических наук, профессор

  Тремасов Михаил Яковлевич


Сунагатуллин Фарук Ахмадуллович доктор биологических наук, профессор,

заведующий кафедрой ветеринарной хирургии ФГБОУ ВПО  «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана»

Ежкова  Асия  Мазетдиновна

доктор биологических наук, заведующая отделом животноводства ГНУ «Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения РАСХН»

Официальные  оппоненты:


Ведущая организация:  Всероссийский научно-исследовательский

н  институт ветеринарной санитарии,

  гигиены и экологии РАСХН (г. Москва)

Защита состоится «____» ____________2012 года в 1000  часов на заседании диссертационного совета Д – 220.012.01 при Федеральном центре токсикологической, радиационной и биологической безопасности (420075, г. Казань, Научный городок – 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань)

Автореферат разослан «____» __________2012 г. и размещен на официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» www.vnivi.ru и на официальном сайте ВАК РФ www.vak2.ed.gov.ru.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук  В.И. Степанов 

1 Общая характеристика работы


1.1

Актуальность темы. Дерматомикозы относятся к наиболее распространенным грибковым инфекциям. Основными возбудителями дерматомикозов являются грибы рода Trichophyton, Microsporum и Epidermophiton, которые обитают и размножаются в слое эпидермиса, кератине, луковицах волос. Клинически болезнь протекает тяжело и несет реальную эпидемиологическую опасность. Поэтому борьба с дерматофитозами животных является одной из приоритетных задач ветеринарной микологии. Она актуальна как с точки зрения обеспечения здоровья животных, так и с медицинской точки зрения, учитывая роль животных в эпидемиологии дерматофитозов человека  (А.Х. Саркисов, 1971; Ю.Ф. Борисович, Л.В. Кирилов, 1987; А.Ф. Кузнецов, 2001; О.А. Беспалов и др., 2003; М.Г. Маноян и др., 2008).

В настоящее время для лечения дерматомикозов используется ряд эффективных, но дорогостоящих препаратов импортного производства (ламизил, микозолон и др). Что касается арсенала отечественных противогрибковых средств, то он по-прежнему представлен ундецином, нитрофунгином, йодсодержащими соединениями, которые не всегда дают удовлетворительные результаты, поскольку выздоровление наступает менее чем у 50-70% больных и наблюдаются частые рецидивы. При химиотерапии  дерматомикозов гризеофульвином наблюдается излечение у 70-83% больных, однако при этом необходимо учитывать наличие побочных эффектов (С.В. Петрович, 1989; А.А. Кубанова и др., 1995; А.В. Лештаева, 2001; Л.А. Абрамова, 2003; E.F. Donovan,  H. Bohl, 1960).

С целью повышения эффективности и уменьшения негативных проявлений химиотерапии дерматомикозов актуально изыскание новых нетоксичных противогрибковых средств с высокой антифунгальной активностью.

В последние годы  все более возрастает интерес к лекарственным средствам на основе серосодержащих соединений (В.П. Федотов и др., 1987, 1990; В.А. Коряковский и др., 1992;  А.Ф. Исмагилов и др., 2003).  При их  использовании очаги микоза разрешаются в течение 20-30 дней. Известно, что в период заражения микозам и при максимальных клинических проявлениях заболевания увеличивается содержание серосодеожащих аминокислот (цистина, цистеина, глутатиона и др.), уменьшается уровень SH – групп и SS- связей в тканях,  что приводит к патологической кератинизации эпидермиса, который в период выздоровления после проведенной соответствующей терапии возвращается к исходным границам. Наличие у сероорганических соединений выраженных фунгицидных и фунгистатических свойств и постоянная потребность в противогрибковых средствах стали стимулом для разработки нового антимикотического средства, содержащего 2-меркаптобензтиазол, глицерин и диметилсульфоксид. Это комплексное средство получило название «Дермадекс». Все компоненты препарата доступны для  производства в промышленных масштабах (М.Я. Тремасов, А.И. Сергейчев и др., 2005).

1.2 Цель и задачи исследований. Целью работы явилась оценка фармако-токсикологических параметров и эффективности препарата дермадекс при микроспории и трихофитии животных; разработка требований к оценке качества новой лекарственной формы.

Для реализации поставленной цели были определены следующие задачи:

  • Оценить показатели токсичности, безвредности, фунгицидной и фунгистатической активности антимикотического препарата дермадекс.
  • Изучить терапевтическую эффективность дермадекса при микроспории и трихофитии на экспериментально зараженных и спонтанно больных животных.
  • Стандартизация и контроль качества препарата дермадекс.

1.3 Научная новизна. На основании определения острой токсичности и кумулятивных свойств дермадекса установлена принадлежность его к малоопасным средствам (4 класс опасности по классификации химических соединений по ГОСТу 12.1.007.76). Доказана безвредность длительного применения исследуемого средства: отсутствие его влияния на функциональное состояние печени животных, эмбриотоксичности, тератогенности, канцерогенности, мутагенности и аллергизирующих свойств.

Установлено, что дермадекс обладает выраженным фунгицидным и фунгистатическим действием в отношении грибов дерматофитов.

Проведена стандартизация и контроль качества препарата дермадекс.

Выявлена высокая противогрибковая эффективность дермадекса при микроспории и трихофитии в эксперименте и на спонтанно больных животных.

1.4 Практическая ценность работы. Обоснована возможность применения дермадекса в качестве местной терапии при микроспории и трихофитии животных без комбинации его с антимикотиками системного действия.

По результатам проведенных исследований разработаны Технические условия (ТУ 9337-010-00492374-2010) и Инструкция по применению Дермадекса для лечения трихофитии и микроспории животных (Утверждена заместителем руководителя Россельхознадзора  21 апреля 2011 г).

1.5 Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2007-2011 г.г., республиканских, всероссийских, международных научно – практических конференциях и симпозиумах (Казань 2007, 2008, 2009, 2010; Москва 2008, 2009, 2010, 2011; Троицк 2008; Санкт Петербург 2009).

1.6 Публикации. По материал диссертационной работы опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1.7 Основные положения, выносимые на защиту:

  • Фармако-токсикологическая оценка препарата дермадекс.
  • Эффективность препарата дермадекс при лечении трихофитии и микроспории животных
  • Стандартизация и оценка качества новой лекарственной формы противогрибкового препарата дермадекс.

1.8 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 137  страницах компьютерного текста и  состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 12 рисунками. Список использованной литературы включает 228 источников,  из них 74 – иностранных.


2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнена в отделе токсикологии Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности, результаты апробированы в хозяйствах Кукморского района Республики Татарстан в течение 2008-2012 гг.

Для изучения фармако-токсикологических свойств и степеней безопасности дермадекса использовали его лекарственную форму, содержащую  в качестве действующего вещества 2-меркаптобензтиазол (1,9%), в качестве вспомогательных компонентов глицерин и диметилсульфоксид.  Препарат представляет собой прозрачную жидкость ярко-желтого цвета, со специфическим запахом, приготовленную в секторе по производству химиотерапевтических препаратов отдела токсикологии ФГБУ «ФЦТРБ - ВНИВИ».

Экспериментальные исследования проведены на 640 белых крысах, 436 белых мышах, 60 морских свинках, 55 кроликах, 20 собаках, 30 кошках и 14 телятах. Животные для опытов подбирались по принципу аналогов с учетом пола, породы, возраста, живой массы.

Общетоксическое действие изучаемого средства исследовалось на лабораторных животных согласно Методическим указаниям по доклиническому изучению общетоксического действия фармакологических веществ  (М., 2000, 2005).

  Гематологические исследования проводили общепринятыми методами (А.А. Кудрявцев, 1976; В.В. Меньшиков, 1987).

Биохимические исследования крови. Содержание общего белка устанавливали рефрактометрически, количественное соотношение белковых фракций – нефелометрическим методом на КФК-2 (И.П. Кондрахин, 2004). Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по количеству малонового диальдегида (МДА) в плазме и эритроцитах (М.С. Гончаренко, A.M. Латинова, 1985). Активность холинэстераз в сыворотке крови, гомогенатах печени и мозга, изучали по методу Хестрина.

Для исследования влияния дермадекса на антитоксическую функцию печени использовали гексеналовый тест (A.H. Conney, 1967).

Для оценки аллергизирующего действия дермадекса применяли комплекс методик, описанных в требованиях к постановке эксперимен­тальных исследований по обоснованию предельно допустимых концен­траций промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы (М.,1997). Оценку влияния длительного введения дермадекса на неспецифическую резистентность организма животных осуществляли по состоянию фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов крови по методике Кост и  Стенко (В.Г. Дорофейчук, 1968; Н.И. Блинов, 1985).

Фунгистатическая и фунгицидная  активность препарата изучена in vitro по методике, описанной Миловановой С.Н., Степанищевой З.Г. в модификации Бочарниковой О.С, Лещенко В.М., 1971. Изучение проводили на музейных штаммах Trychophyton verrucosum 480, Microsporum lanosum 22, Trychophyton gypseum seu mentagrophytes 210, а также на полевых штаммах, выделенных от больных животных.

Физико-химические и биологические свойства препарата исследовали согласно методике, описанной Государственной Фармакопеи XII, часть 1, 2008. Определение стабильности дермадекса проводили методом «ускоренного старения».

Канцерогенные свойства препарата оценивали на кроликах путем аппликации его на кожу уха (3 раза в неделю) в течение 6 месяцев.

Эмбриотоксическое и тератогенное действие оценивали в соответствии с методическими указаниями по изучению эмбриотоксического действия фармакологических веществ и влияния их на репродуктивную функцию.

Мутагенное действие дермадекса изучали по методу Эймса с использованием тесторных штаммов бактерий Salmonella typhimurium, любезно предоставленные д.б.н., профессором, зав. кафедрой генетики КПФУ Барабанщиковым Б.И.

Лечебно-профилактическую эффективность дермадекса при дерматомикозах у животных оценивали в опытах на телятах, кроликах, собаках и кошках.

При выполнении отдельных этапов работы принимали участие доцент к.б.н. Титова В.Ю., с.н.с., к.б.н. Матросова Л.Е., за что выражаем им признательность.

Обработку цифрового материала проводили методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стьюденту на персональном компьютере с использованием программ Excel.


3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Изучение фармако-токсикологических свойств дермадекса 

  3.1.1 Острая токсичность дермадекса при внутрижелудочном введении

Эксперименты проведены на 36 мышах и 36 крысах. Препарат вводили с помощью атравматичного зонда с оливой в диапазоне доз для мышей от 10000 до 20000 мг/кг, для крыс – от 13000 до 23000 мг/кг, каждую дозу испытывали на 6 мышах и крысах.

Установлено, что препарат в дозе 10000 мг/кг для мышей и 13000 мг/кг для крыс видимых изменений в поведении и общем состоянии животных не вызывал. По мере увеличения доз (для мышей 12000-18000 мг/кг; для крыс 15000-21000 мг/кг) исследуемого средства, через 2,5-5 ч после введения отмечалось общее угнетение животных. Клинические признаки интоксикации исчезали в среднем через 3-5 часов. Гибель животных, как правило, происходила через 25-60 ч после введения препарата.

При вскрытии погибших животных были обнаружены изменения на слизистых желудочно-кишечного тракта в виде гиперемии, отдельных геморрагий. В печени - умеренное кровенаполнение, в почках - сглаженность коркового и мозгового слоев.

Параметры токсичности при внутрижелудочном введении дермадекса составили для мышей: МПД - 10000 мг/кг; ЛД50 - 15400±284 мг/кг; ЛД100 -20000 мг/кг; для крыс: МПД - 13000 мг/кг; ЛД50 - 18700±301 мг/кг;  ЛД100 - 23000 мг/кг.

3.1.2 Острая токсичность дермадекса при подкожном введении

Эксперименты проведены на 36 животных (мыши, крысы). Исследуемое средство вводили подкожно, в диапазоне доз для мышей от 3000 до 13000 мг/кг, для крыс – от 6000 до 16000 мг/кг.

В дозе 3000 мг/кг  для мышей и 6000 мг/кг для крыс дермадекс не оказывал влияния на поведение и общее состояние животных. Характер интоксикации при подкожном введении дермадекса в дозах 5000-11000 мг/кг для мышей и 8000-14000 мг/кг – для крыс был идентичен картине отравления их при внутрижелудочном применении препарата.

Параметры токсичности при подкожном введении исследуемого препарата составили для мышей: МПД - 3000 мг/кг; ЛД50 - 7650±284 мг/кг; ЛД100 - 13000 мг/кг; для крыс: МПД - 6000 мг/кг; ЛД50 - 11400±281 мг/кг; ЛД100-16000 мг/кг.

При вскрытии погибших животных отмечены незначительные изменения, подобные картине при внутрижелудочном использовании исследуемого средства, за исключением, гиперемии слизистой желудочно-кишечного тракта – она в данном случае отсутствовала.

3.1.3 Острая токсичность дермадекса при накожном применении

Опыты проведены на 36 крысах и 36 мышах. Мышам исследуемый препарат наносили втирающими движениями на выстриженный участок кожи спины размером 2x2 см в дозах 3000-30000 мг/кг, крысам – размером 4x4 см, в дозе 5000-40000 мг/кг. Наблюдение за животными вели в течение 30 дней. За данный период времени заметных изменений в клиническом статусе животных не отмечалось. При диагностическом вскрытии животных видимых изменений внутренних органов не обнаружено. При накожном нанесении исследуемого средства в вышеуказанных дозах гибели подопытных животных не наблюдалось, поэтому определить параметры токсичности не представлялось возможным.

3.1.4 Изучение субхронической токсичности и кумулятивных свойств дермадекса

Опыты проведены на 20 белых крысах обоего пола, разделенных на две группы по 10 животных в каждой. Животным опытной группы вводили дермадекс внутрижелудочно атравматичным металлическим зондом, контрольной группы - дистиллированную воду из расчета 1 мл на 100 г массы тела. Исследуемый препарат вводили в дозе 1/10 от ранее установленной однократной ЛД50, в течение 4-х дней. Далее, каждые последующие 4 дня, вводимую дозу препарата увеличивали в 1,5 раза. Первые клинические признаки в виде незначительного угнетения общего состояния в опытной группе животных наблюдали на 8 сут эксперимента. Спустя 2-3 ч общее состояние животных было удовлетворительное. На 17 сут введения препарата у крыс отмечали угнетение  общего состояния. Симптомы интоксикации проходили через 3-5 часов. Начиная с 18 сут и до конца опыта (24 сут), животные после введения препарата находились в состоянии угнетения. Такое состояние у крыс наблюдалось в течение 4-6 часов.

При паталогоанатомическом исследовании подопытных крыс установлено, что почки и печень несколько увеличены в размерах, границы слоев почек слегка сглажены; слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта умеренно гиперемирована, отмечены отдельные точечные кровоизлияния, а у 2 животных - признаки отека легких.

Кроме того, в течение 24 сут проводили взвешивание подопытных животных. В целом, на 24 сут эксперимента, среднее значение массы контрольной группы животных, в сравнении с опытной группой животных, увеличилось на 10% (р<0,05).

Таким образом, при длительном применении дермадекса в возрастающих дозах токсическое действие его не проявлялось, отмечалось лишь незначительное снижение массы животных. За весь период опыта гибели подопытных крыс не наблюдали, что свидетельствует об отсутствии кумулятивного действия дермадекса.

3.1.5 Влияние дермадекса на гематологические  и биохимические показатели при длительном применении

Влияние дермадекса на гематологические и биохимические показатели при внутрижелудочном применении в дозе 380 мг/кг и накожном нанесении изучали на 30 белых крысах. Животные были разделены на 3 группы. Первой группе дермадекс втирали на предварительно выстриженный участок кожи в межлопаточной области размером 4x4 см, второй - проводили внутрижелудочное введение. Контрольным животным вводили дистиллированную воду. Процедуры выполняли ежедневно, однократно в течение 30 дней. До начала эксперимента и на 10 и 30 сут проводили исследование крови.

В результате исследований не выявили значительных изменений гематологических и биохимических показателей при длительном использовании исследуемого препарата. Так, при внутрижелудочном применении дермадекса количество сегментоядерных нейтрофилов к 30 сут увеличилось на 10% (р<0,05). Уровень альбуминов был меньше на 10% (р<0,05) по сравнению с исходными данными. Однако эти изменения не выходили за рамки физиологических норм.

3.1.6 Влияние дермадекса на перекисное окисление липидов

Для определения процессов перекисного окисления липидов в плазме и эритроцитах крови использовали 28 белых крыс, разделенных на 4 группы. Контрольной группе  вводили дистиллированную воду. Опытным животным первой группы дермадекс втирали накожно в дозе 380 мг/кг на предварительно выстриженный участок кожи размером 4х4 см, второй и третьей – препарат вводили внутрижелудочно, соответственно в дозах 380 мг/кг (1/50 ЛД50) и 3800 мг/кг (1/5 ЛД50). Исследование МДА проводили до опыта, на 10 и 30 сут эксперимента.

Отмечается уменьшение содержания МДА в плазме у опытных животных, получавших дермадекс внутрижелудочно в дозе 380 мг/кг, к 10 сут эксперимента на 12% (р<0,05). Это позволяет предположить о проявление антиоксидантных свойств дермадекса при указанном способе введения. Внутрижелудочное использование дермадекса в дозе 1/5 ЛД50 сопровождалось, напротив, увеличением содержания МДА в плазме, начиная с 10 сут и достигал к 30 сут 36,6% (р<0,001), что не исключает повреждающего действия исследуемого средства в высоких дозах на биологические системы.

  Исследуемое средство при накожном применении в дозе 380 мг/кг достоверно не изменяло содержание малонового диальдегида.

3.1.7 Влияние дермадекса на факторы неспецифической резистентности организма

Опыты проведены на 30 белых крысах, разделенных на три группы по 10 в каждой: 1-ой группе (контроль) вводили внутрижелудочно воду; 2-ой – внутрижелудочно дермадекс в дозе 380 мг/кг; 3-й – исследуемое средство наносили накожно в той же дозе. Оценивали: фагоцитарную активность (ФА), фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ), фагоцитарную емкость (ФЕ) и активность лизоцима. 

У крыс  пpи ежедневном внутрижелудочном введении дермадекса в дозе 380 мг/кг на 10 сут эксперимента отмечалось достоверное увеличение показателей ФА и ФЧ на 11,3% и 12,2% (р<0,05), соответственно.

При длительном накожном нанесении дермадекса наблюдалось достоверное увеличение ФА, ФЧ и ФИ к 30 сут эксперимента на 10%, 14% (р<0,05) и 25% (р<0,01), соответственно. Показатели ФЕ и активности лизоцима за период исследования оставались практически без изменений.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать заключение, что дермадекс не понижает уровень естественной резистентности организма животных.

3.1.8 Влияние дермадекса на активность холинэстераз

Эксперименты проводили в течение 30 сут на  двух группах белых крыс, по 10 в каждой. Животным 1-ой группы ежедневно внутрижелудочно вводили дистиллированную воду; 2-й – дермадекс в дозе 380 мг/кг. Через 30 сут животных декапитировали и исследовали активность холинэстеразы (ХЭ) в сыворотке крови, гомогенатах печени и мозга.

Результаты свидетельствуют, что использование дермадекса внутрижелудочно в дозе 380 мг/кг не оказывает влияния на активность ХЭ сыворотки крови.

В гомогенате мозга регистрировали увеличение активности фермента при применении дермадекса на 6,3%, а в сыворотке – на 14,3% (р<0,05).

В гомогенате печени достоверного изменения активности фермента не наблюдалось.

3.1.9 Влияние дермадекса на антитоксическую функцию печени

Исследование проводили на 2 группах белых крыс по 10 животных в каждой. Опытной группе животных в течение 30 сут внутрижелудочно вводили дермадекс в дозе 380 мг/кг, контрольной - дистиллированную воду. Через 24 ч после последнего введения  испытуемого средства внутрибрюшинно вводили гексенал из расчета 80 мг/кг. По переходу животного в «боковое положение» устанавливали наступление сна. Выход животного из бокового положения с последующими движениям регистрировали как его пробуждение. Эксперименты показали, что дермадекс не оказывает влияния на продолжительность и характер гексеналового сна. Так, у животных опытной и контрольной групп гексеналовый сон наступал через 3,7±0,5 и 3,8±0,5 мин, а продолжительность сна составляла 26,2±3,1 и 23,1±2,4 мин, соответственно.

Результаты свидетельствуют, что дермадекс в дозе 380 мг/кг, примененный в течение 30 сут, не влияет на антитоксическую функцию печени.

3.1.10 Изучение раздражающего и аллергизирующего действия

дермадекса

Для исследования аллергизирующих свойств дермадекса использовали провокационную кожную пробу и лабораторный иммунологический тест - реакцию специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ). Изучение местного раздражающего действия на кожу проводили на морских свинках. Животные подбирались по 8 в каждой группе. Дермадекс наносили на кожу в дозах 380 мг/кг (1/50 ЛД50) и 3800 мг/кг (1/5 ЛД50). В качестве контроля использовали дистиллированную воду. Экспозиция исследуемого препарата составила 4 часа. Реакцию кожи регистрировали по окончанию экспозиции, через 1 и 16 ч после однократной аппликации. Критериями раздражающего действия препарата служили эритема и отек, которые регистрировали в баллах.

Многократные эпикутанные аппликации дермадекса в вышеуказанных дозах проводили на 8 морских свинках по 5 раз в неделю в течение 4 недель (всего 20 аппликаций). Первое тестирование проводили после 10 аппликаций. Оценку сенсибилизации - через сутки после последней аппликации. Интенсивность развивающейся сенсибилизации оценивали в баллах визуально.

В качестве следующего теста, отражающего сенсибилизацию in vitro, была проведена реакция специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ). Кровь животных забирали через 48 ч после нанесения разрешающей дозы дермадекса (380, 3800 мг/кг). Реакцию считали положительной при уровне лизиса у подопытных животных 10% и более.

Выраженность раздражающего эффекта дермадекса в дозе 3800 мг/кг по окончании экспозиции составила 2,0±0,05 балла; через 1 ч - 1,5±0,2 балла; через 16 ч - 0 балл. При аппликации дермадекса в дозе 380 мг/кг - наблюдали слабую эритему, которая проходила в течение часа.

При многократных эпикутанных аппликациях на 14 сут нанесения дермадекса клинических признаков раздражения на коже не отмечалось. После 20 аппликаций в очагах нанесения исследуемого средства отмечалась лишь сухость кожи.

Определение провокационной кожной пробы на морских свинках, показало, что в целом реакция кожи у животных была выражена слабо (не превышала 1,3±0,04 балла) и статистически не имела различия.

При проведении иммунологического теста получены следующие данные: РСЛЛ после длительного применения препарата в дозе 380 мг/кг - 6,7±0,17%; а в дозе 3800 мг/кг - 7,8±0,04%, что свидетельствует об  отсутствии аллергизирующих свойств у дермадекса.

Таким образом, дермадекс обладаем умеренно раздражающим действием, но сенсибилизации не вызывает.

3.2 Изучение канцерогенных, мутагенных, эмбриотоксических и тератогенных свойств дермадекса

3.2.1  Изучение канцерогенных свойств дермадекса

Опыты проведены на 300 белых мышах, 300 белых крысах, 24 кроликах. Мыши и крысы были разделены на 3 группы по 50 голов обоего пола, из которых: опытной группе накожно наносили раствор ДМСО, 2-й – дермадекс в дозе 380 мг/кг, а контрольной – дистиллированную воду. Волосы на месте нанесения предварительно выстригали. По мере отрастания шерсти проводили повторную стрижку. Кроликам наносили исследуемые средства на кожу уха: опытной группе дермадекс, контрольной - ДМСО. Смазывание кожи проводили 3 раза в неделю, в течение 6 месяцев. В ходе работы соблюдались все необходимые условия, представленные в методике. Осуществляли ежемесячный контроль массы тела животных  вскрытие и гистологическое исследование всех погибших животных.

В ходе проведения эксперимента отмечалось равномерное увеличение массы тела в обеих группах.

За период проведенных исследований у подопытных животных после нанесения исследуемых средств заметных изменений кожи и общего состояния не отмечалось. Опухолевидных образований на коже и других структурах организма не обнаружено. Часть животных как опытных, так и контрольных групп - погибла, что является естественным отходом. Среди кроликов гибели не наблюдалось.

Результаты гистологических исследований тканей печени, почек, селезенки и кожи подопытных животных не выявили патологических изменений.

Гематологические показатели периферической крови у кроликов в течение 6 мес имели ряд изменений, однако все они происходили в пределах физиологической нормы.

Таким образом, дермадекс при длительном накожном нанесении опытным животным в указанной дозе не оказывает канцерогенного действия, о чем свидетельствует отсутствие опухолей на коже и внутренних органах, а также изменений основных гематологических показателей.

3.2.2 Изучение мутагенных свойств дермадекса

Опыты по  выявлению возможной мутагенной активности и учета генных мутаций дермадекса проведены с использованием теста Эймса на индикаторных штаммах сальмонелл. Согласно методике было выполнено 2 этапа исследований: определение токсичности дермадекса для тестерных штаммов сальмонелл ТА-98 и ТА-100  и полуколичественный метод учета генных мутаций с метаболической активацией in vitro.

Дермадекс готовили в диметилсульфоксиде в стандартных разведениях (1:1; 1:10; 1:100 мкг/мл).

В ходе эксперимента установлено, что дермадекс не оказывает подавляющего действия на штаммы, а в концентрациях (1:10 и 1:100)  вызывает некоторую стимуляцию роста микроорганизмов. Мутагенная активность дермадекса не выявлена как в условиях метаболической активации, так и без нее.

3.2.3 Изучение эмбриотоксических и тератогенных свойств дермадекса

Оценку эмбриотоксического и тератогенного действия дермадекса в дозе 380 мг/кг проводили на самках белых крысах. Первая группа служила биологическим контролем, вторая (опытная) – получала препарат дермадекс накожно, третья – внутрижелудочно.

Анализ экспериментов показал, что беременные крысы хорошо переносили исследуемый препарат. При введении дермадекса с 1 по 19-е сут беременности существенной разницы в группах между показателями эмбриотоксической и тератогенной активности не отмечалось.

При осмотре плодов невооруженным глазом и при помощи бинокулярной лупы, количество выявленных аномалий эмбрионов всех опытных групп при воздействии дермадекса находилось в пределах допустимых норм для данного вида животных.

Полученные результаты свидетельствуют, что дермадекс не обладает эмбриотоксическим и тератогенным действием.

3.3 Изучение антимикотического действия дермадекса

Для изучения фунгистатической активности дермадекса использовали метод двукратных серийных разведений и метод диффузии в агар.

Для этих целей готовили два параллельных ряда разведений дермадекса в жидкой среде Сабуро, с засеянными тест-культурами (Trychophyton verrucosum и Microsporum lanosum). Пробирки выдерживали в термостате при температуре 270С в течение 14 суток. Чувствительность к препарату определяли по его минимальной дозой, при которой рост гриба не наблюдается. Отсутствие роста гриба в первых 5 пробирках при наличие роста в контрольной пробирке свидетельствует об активности и специфичности препарата (таблица 1).

       Из данных приведенных в таблице 1 видно, что дермадекс обладает значительной противогрибковой активностью. В результате исследования определена минимальная концентрация дермадекса, при которой происходило максимальное подавление роста колоний гриба рода Trychophyton verrucosum и Microsporum lanosum. Так, при дозе 0,75 мкг/мл, наблюдали полное прекращение роста гриба. В то время как при использовании в качестве контроля ДМСО отсутствие роста гриба отмечали лишь при дозе 1000 мкг/мл.

Таблица 1 - Фунгистатическое действие Дермадекса

Вид

гриба

Доза препарата, мкг/мл

1000

100

50

25

12,5

6,25

3,12

1,54

0,75

0,38

0,19

0,095

0,047

Опыт (Дермадекс)

Trychophyton verrucosum

-

-

-

-

-

-

-

-

-

±

+

+

+

Microsporum lanosum

-

-

-

-

-

-

-

-

-

±

+

+

+

Контроль (ДМСО)

Trychophyton verrucosum

-

±

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Microsporum lanosum

-

±

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Фунгицидное свойство дермадекса изучали путем погружения тест – культур грибов в препарат на 10, 15, 20, 30, 45, 60, 75 и 90 минут. Дермадекс проявлял фунгицидную активность в отношении Trychophyton verrucosum, Microsporum lanosum, начиная с 15-20 мин воздействия.

Таким образом, из вышеизложенных данных следует, что дермадекс обладает выраженными фунгистатическими свойствами.

3.4 Изучение лечебного действия дермадекса на экспериментальных и спонтанно больных микроспорией и трихофитией животных

Оценка терапевтического действия исследуемого препарата проведена на экспериментально воспроизведенных моделях дерматофитий и спонтанно больных животных. В модельных экспериментах кроликов и морских свинок, заражали штаммами грибов Trychophyton verrucosum и Microsporum lanosum, которых лечили аппликациями дермадекса. Лечение контрольных животных не проводили. Для наблюдения за изменением гематологических показателей проводили забор крови в опытной и контрольной группах кроликов до начала лечения и на 5-, 10-, 20-, 30-е сут лечения.

Спонтанно больных животных составляли: домашние животные (телята, собаки, кошки) и животные, заболевшие в условиях вивария (кролики, морские свинки). У животных преобладали поражения средней тяжести. Дермадекс втирали двух-трех кратно (один раз в день) ватным тампоном на пораженные участки в течение 1-2 мин без удаления дерматофитийных корочек. Под влиянием дермадекса корочки в очагах разрыхлялись и легко удалялись механическим путем.

Через 7-8 сут после начала лечения на пораженных участках признаков заболевания не оставалось, воспалительная реакция исчезала, корочки размягчались, при микроскопировании патологического материала, взятого из очагов заражения, патогенные грибы не были обнаружены.

Анализируя исходные гематологические показатели, установили, что количество гемоглобина было уменьшено, а число лейкоцитов и эритроцитов близко к норме.

После обработки животных дермадексом существенных изменений  гематологических показателей подопытных животных не обнаружено. Количество гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, содержание белка оставалось в пределах физиологической нормы, хотя и отмечали тенденцию к увеличению этих показателей.

Некоторые данные опыта представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Клинико-гематологические и биохимические показатели телят, больных трихофитией, при лечении дермадексом (n=7)

       

Показатель

Срок исследования, сут

исход

5

15

опыт

Температура, 0С

  38,7±0,2

  38,7±0,1

38,7±0,1

Пульс, уд/мин

52,0±0,75

52,0±0,75

53,20±0,75

Дыхание, дв/мин

  20,50±0,75

  21,30±0,75

23,50±0,78*

Гемоглобин, г/л

  78,30±0,61

86,40±0,45*

94,2±0,9**

Эритроциты, х1012/л

  6,51±0,70

7,10±0,55

7,50±0,92**

Лейкоциты, х109/л

7,24±0,58

7,52±0,61

9,03±0,84**

Общий белок, г/л

  58,40±0,33

  62,30±0,27

70,10±0,28**

контроль

Температура, 0С

  38,50±0,19

  38,60±0,18

38,8±0,2

Пульс, уд/мин

  51,0±0,6

  51,7±0,6

55,0±0,9

Дыхание, дв/мин

  20,6±0,6

  20,6±0,6

21,6±0,6

Гемоглобин, г/л

  62,10±0,57

70,90±0,64*

73,10±0,96**

Эритроциты, х1012/л

5,19±0,69

5,50±0,55

6,48±0,87**

Лейкоциты, х109/л

6,0±0,4

6,00±0,59

7,00±0,75**

Общий белок, г/л

53,0±0,31

50,0±0,28

60,0±0,22*

*р<0,05; **р<0,01

Согласно данным таблицы 2, на протяжении всего периода исследования температура, количество сердечных сокращений и дыхательных движений не претерпевали существенных изменений и оставались в пределах физиологических норм. 

После обработки животных дермадексом в опытной группе уровень гемоглобина к 15 сут эксперимента увеличился на 20% (р<0,01), количество эритроцитов, лейкоцитов и общего белка – на 15,2%, 24,7%, 20% (р<0,01), соответственно, по сравнению с исходными данными. У животных, не подвергнутых лечению, к 15 сут эксперимента происходило увеличение количества гемоглобина,  эритроцитов, лейкоцитов, общего белка на 17,7%, 25%, 17% (р<0,01), 13,2% (р<0,05), соответственно. Общее физиологическое состояние животных и аппетит не нарушались.

Таким образом, можно сделать заключение о том, что применение дермадекса для лечения трихофитии и микроспории животных сопровождается быстрым и эффективным их клиническим выздоровлением.

3.5 Стандартизация и контроль качества препарата дермадекс

  Для обеспечения оптимального уровня качества препарата в процессе его производства, хранения и применения необходима разработка качественных и количественных методов контроля.

Таблица 3 - Физико-химические и биологические свойства препарата Дермадекс (взяты средние показатели от трех серий)

Показатель

Результат

Внешний вид

Прозрачная жидкость желтого цвета

Температура кипения, С

180,0±2,0

Температура замерзания, С

-21,0±2,0

Плотность при 20С, г/см3

1,16±0,03

Показатель активности водородных ионов (рН при 20С)

7,0±0,7

Прозрачность (в качестве эталона использовали  ДМСО)

Прозрачный

Окраска

Не превышает эталон № 4б

Массовая доля

2-меркаптобензтиазола, %

1,90±0,1

Подлинность 2-меркаптобензтиазола

Должен выдерживать испытание

Активность

Обладает фунгистатической активностью в отношении возбудителей дерматомикозов

Микробиологическая чистота

Должен выдерживать испытание

Безвредность в тест - дозе на мышах

Безвреден

Стабильность лекарственной формы определяли методом «ускоренного старения» и в условиях естественного хранения при комнатной температуре (24 мес).

В процессе эксперимента определяли рН, прозрачность, окраску, массовую долю 2-меркаптобензтиазола, активность и микробную чистоту в соответствии с методами контроля, изложенными в ТУ. Показатели качества испытанных серий дермадекса практически не изменялись как при температуре 500С через промежутки времени, соответствующие 6, 12, и 24 мес хранения, так и в естественных условиях хранения. Массовая доля 2-меркаптобензтиазола оставалась практически на исходном уровне.

В результате исследований установлено, что максимальная допустимая температура хранения, обеспечивающая стабильность качества препарата, составляет от 0С до +30С, а срок годности при данных условиях – 24 месяца. Таким образом, дермадекс является стабильным средством, стойким при хранении.

3.6 Определение сроков выведения остаточных количеств мебетизола из организма

Исследования проводили на кроликах породы шиншиллы массой 2,0 – 2,5 кг. На выстриженные участки кожи (5х5 см) трижды, с интервалом 24 ч, наносили дермадекс в двойной терапевтической дозе (160 мг/кг). Через 1, 2 сут после последнего нанесения препарата убивали по 2 животных. Определяли содержание мебетизола в коже, печени, почках, лёгких, сердце и мышцах.

Уже через сутки после трёхкратного нанесения дермадекса остаточных количеств  действующего вещества – мебетизола – не выявляется. Отсутствие мебетизола в организме кроликов через 2-е сут после последнего применения препарата даёт основание рекомендовать использование в пищу человека мяса и мясопродуктов животных, подвергнутых лечению дермадексом.

3.7 Сравнительная терапевтическая эффективность дермадекса с другими антимикотическими средствами

Эффективность дермадекса испытывали в сравнительном плане с  2% салициловой мазью, серной мазью, мазью ЯМ БК, 1% клотримазоловой мазью и 1% Экодакс кремом  на морских свинках, экспериментально заражённых микроспорией (возбудитель M. canis). Животные были разделены на 6 групп по 4 животных в каждой.

Первой группе на поражённые участки кожи ежедневно, дважды в день, наносили салициловую мазь; второй группе в таком же порядке наносили серную мазь; третьей группе наносили дважды в день мазь ЯМ БК; четвёртой группе наносили дважды в день клотримазоловую мазь; пятой группе наносили Экодакс крем дважды в день; шестой группе на поражённые участки кожи наносили препарат дермадекс 1 раз в сутки с интервалом 24 ч в течение 3-х дней.

Все препараты наносили в соответствии с инструкцией по применению. Наблюдение за всеми животными велось в течение 30-ти дней.

В 1-ой и 2-ой группах эффекта от применения препаратов не наблюдалось. В 3-ей и 4-ой группах животные выздоравливали на 25 – 28 день. В 5-ой группе выздоровление наступало на 15 – 20 сут после начала лечения. В 6-ой группе через 5 – 7 дней наблюдалось очищение кожи от чешуек и к 10 – 12 дню отмечался рост волос на поражённых участках.

4 ВЫВОДЫ

1. Дермадекс – антимикотическое средство, разработанное на основе активных серосодержащих компонентов, по ГОСТу 12.1.007-76 относится к малоопасным средствам (4 класс опасности по классификации химических соединений) и не обладает кумулятивными свойствами.

2. При длительном (30 сут) накожном и внутрижелудочном применении в дозе 380 мг/кг (1/50 ЛД50 пероральная токсичность для крыс) дермадекс не вызывает изменений гематологических показателей периферической крови; неспецифической резистентности организма; не влияет на функциональное состояние печени, не изменяет коэффициент массы органов и их гистологическую структуру, не оказывает отрицательного влияния на содержание общего белка и его фракций, активность холинэстераз сыворотки крови, гомогенатов печени, мозга.

3. При местном применении  в дозах 380 и 3800 мг/кг (1/50  и 1/5 ЛД50)  дермадекс умеренно раздражает кожу и слизистую оболочку глаза животных, не оказывает аллергизирующего действия при длительном (20 сут) накожном применении.

4. В дозе 380 мг/кг дермадекс не проявляет эмбриотоксического, тератогенного, мутагенного и канцерогенного действия.

5. Препарат in vitro проявляет выраженную фунгистатическую и фунгицидную активность  по отношению к грибам рода Trychophyton и  Microsporum.

6. Дермадекс при наружном нанесении в дозе 0,2 мл/см 2 1-3 раза с интервалом  24 ч  в зависимости от степени поражения, обеспечивает быстрое (5-10 дней) и полное выздоровление животных.

  7. Дермадекс является стабильным средством, стойким при хранении. Максимальная допустимая температура хранения, обеспечивающая стабильность и качество препарата, составляет от 0С до +30С, а срок годности при данных условиях – 24 месяца.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для лечения дерматомикозов животных предложено  антимикотическое средство – Дермадекс, которое рекомендовано использовать наружно на пораженные участки до появления тонкого влажного, блестящего слоя (0,2 мл на 1 см2) 1-3 раза с интервалом 24 ч в зависимости от степени поражения, не удаляя корочек.

2. На основе проведенных исследований разработаны Технические условия (ТУ 9337-010-00492374-2010) и Инструкция по применению Дермадекса для лечения трихофитии и микроспории животных (Утверждена заместителем руководителя Россельхознадзора  21 апреля 2011 г).

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ  

  ДИССЕРТАЦИИ

  1. Сергейчев А.И., Титова В.Ю., Крючкова М.А. Случаи заболевания кожи у импортируемого скота.  // Ветеринарный врач. –  Казань, 2007. –  №3. – С. 65-66. * 

2. Сергейчев А.И., Титова В.Ю., Тремасов Ю.М., Крючкова М.А. Опыт лечения трихофитии и микроспории животных: Матер. науч.- практ. конф. ветеринарных фармакологов РФ. Троицк: УГАВМ, 2007. С. 287-289.

3. Крючкова М.А., Матросова Л.Е. Влияние дермадекса на факторы неспецифической резистентности организма животных: Матер. науч.- практ. конф. молодых ученых и специалистов.  Казань, 2008. – С. 62-63.

4. Титова В.Ю.,  Матросова Л.Е., Крючкова М.А. Средство для лечения дерматомикозов. // Матер. II съезда микологов России. – М., 2008  – Т. 2. – С. 304.

5. Крючкова М.А., Матросова Л.Е., Титова В.Ю. Антимикотическая активность дермадекса. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – М., 2009. – №2. – С. 150-151.*

6. Крючкова М.А., Матросова Л.Е. Оценка эмбриотоксических и тератогенных свойств дермадекса. // Современные проблемы ветеринарной фармакологии и токсикологии: Матер. второго съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России. Казань, 2009. – С. 290-292.

7. Крючкова М.А., Матросова Л.Е.  Изучение лечебного действия дермадекса при экспериментальной микроспории и трихофитии лабораторных животных. // Вопросы Нормативно – правового  регулирования в ветеринарии. – Санкт Петербург,  2009. – №4. – С. 51. *

8. Титова В.Ю.,  Матросова Л.Е.,  Крючкова М.А. Эффективность  дермадекса при дерматомикозах.  //  Иммунопатология, аллергология, инфектология. – М., 2010. – №1. – С. 172.*

9. Крючкова М.А., Матросова Л.Е. Определение стабильности антимикотического средства Дермадекс.: Матер. Междунар. науч. - практ. конф., посвящ. 50-летию Федерального Центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности. Казань, 2010. – С. 81-83.

10. Крючкова М.А., Матросова Л.Е., Тремасов М.Я. Контроль качества препарата Дермадекс. // Матер. Междунар. науч. конф. «Лекарственные препараты для животных (Разработка, производство, эффективность и качество)» –  М., 2011. – С. 93-94.

* - статьи, рекомендуемые ВАК РФ

 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.