WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

Покровская Екатерина Сергеевна

Факторы неспецифической иммунологической резистентности слюны жвачных животных

06.02.02

биологические науки

Д-220.012.01

Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных

420075, г. Казань, Научный городок -2, тел. (843)  239-53-20

E mail: vnivi@mail.ru

Предполагаемая дата защиты диссертации –  25 декабря 2012г.

На правах рукописи

ПОКРОВСКАЯ ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНА

ФАКТОРЫ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ  ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ

РЕЗИСТЕНТНОСТИ СЛЮНЫ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань - 2012

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Научный руководитель:  доктор биологических наук, профессор

Гильмутдинов Рустам Якубович

Официальные оппоненты: Садыков Нариман Султанович - заведующий  лабораторией по хранению и изучению

  штаммов особо опасных болезней 

  ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»,

  доктор ветеринарных наук, профессор

  Хаертынова Ильсияр Мансуровна-заведующая кафедрой инфекционных болезней

ГОУ ДПО «Казанская государственная

медицинская академия Федерального агентства

по здравоохранению и социальному развитию»,

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная

  сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина»

Защита диссертации состоится «25» декабря  2012 г. в «1000» часов на заседании диссертационного совета Д–220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» по адресу: 420075, г. Казань, Научный городок - 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»

(г. Казань)

Электронный вариант автореферата и текст объявления о защите размещены на официальном сайте ВАК РФ http://www.mon.gov.ru/  и сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»: www.vnivi.ru

Автореферат разослан «22» ноября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат вет. наук В.И. Степанов

  1. Общая характеристика работы

1.1



Актуальность темы. Технологии лабораторной диагностики регулярно пополняются новыми методиками, позволяющими выявлять на ранней стадии и в короткие сроки многие заболевания. В современной ветеринарной науке и практике при исследовании неспецифических факторов иммунитета ограничиваются, как правило, изучением сыворотки крови. Между тем, внимание ученых в последнее время привлекают, в качестве альтернативы,  возможности использования слюны для экспресс-диагностики различных патологий (Денисов А.Б. и др., 2006 и др.), в частности ее иммунологические, биохимические, физические и другие свойства (Барер Г.М. и др., 2003; Bucki R.  et al., 2004; Busamia B. et al., 2010).

Тем не менее, большинство известных в медицине методик получения слюны не нашли широкого применения в ветеринарной практике. Кроме того, изучение слюны животных осуществляется в значительно меньших объемах, причем зарубежными исследователями (Larmas M., Scheinin A., 1971; Stevens C., Hume I., 1995 и др.). Бактерицидные свойства слюны, несомненно, будут определяться состоянием оральной микрофлоры (качественный и количественный состав). При этом необходимым условием правильной оценки состояния полости рта и выявляемых в ней изменений является четкое представление о "норме".

Неспецифический иммунитет слюны обеспечивается лизоцимом, комплементом, пропердином, различными гликопротеинами, катионными антимикробными пептидами и т.д. (Мартынова В.А., Голосова Т.В., 1989; Smith D., Taubman M., 1992; Ahmad M. et al., 2004 и др.), исследования которых в данном аспекте немногочислены. Используемые в ветеринарии методики их определения изначально разработаны применительно к сыворотке крови человека, поэтому большинство вопросов реализации этого направления относительно слюны животных на сегодня не решены.

Большая часть исследований бактерицидной активности (БА) сыворотки крови проводится с использованием тест-культуры E. сoli (Красильников А.П., Романовская Т.Р., 1999; Crokaert F. et al., 1988 и др.), несмотря на констатацию зависимости ее величины от вида, а также концентрации, фазы роста тест-культуры и длительности инкубирования проб (Максимлюк К.Н., Телишевская Л.Я., 1995; Саруханов В.Я., Исамов Н.Н., 2001; Малев А.А., 2009; Benge G., 1988; Igumbor E., Osayande D., 2000). Влияние же перечисленных факторов на величину бактерицидной активности слюны животных на сегодня вообще не оценено.

       Изучение у животных различных видов таких неспецифических факторов как лизоцим, комплемент, пропердин и др. является важным и актуальным в раскрытии механизмов естественной резистентности и иммунитета в целом. Слюна в  качестве объекта этих исследований расширяет диагностические, превентивные и терапевтические возможности  врачей.

       1.2 Цель и задачи исследований. Целью работы являлось изучение методологических вопросов оценки неспецифических иммунологических показателей слюны у жвачных животных для повышения информативности путем минимизации влияния на них аналитических и преаналитических процедур.

       В соответствии с указанной целью решались следующие задачи:

- сравнить эффекты растворов цитрата натрия (2 %), пилокарпина гидрохлорида (1 %) и прозерина (0,05 %) на слюноотделение жвачных животных;

       - изучить качественный и количественный состав микрофлоры полости рта коров и овец;

- определить зависимость величины бактерицидной активности слюны от методических факторов (вида и  концентрации тест-культуры, времени инкубирования проб, преаналитических процедур, сезона года);

       - исследовать факторы неспецифического иммунитета слюны и сыворотки крови коров и овец в сравнительно-видовом аспекте;

       - установить степень корреляции бактерицидной активности слюны жвачных с основными факторами неспецифического иммунитета (лизоцимом, комплементом и пропердином) и биохимическими показателями.

1.3 Научная новизна работы. Впервые показана возможность использования M. lysodeikticus в качестве единой тест-культуры при параллельной оценке бактерицидной и лизоцимной активности слюны. Адаптирована применительно к слюне жвачных методика Л.С. Резниковой (1967) по определению комплементарной активности сыворотки крови. Выявлено влияние преаналитических процедур на величины бактерицидной и комплементарной активности слюны жвачных.  Установлена степень корреляция бактерицидной активности слюны жвачных с основными факторами неспецифического иммунитета (лизоцимом, комплементом, пропердином) и биохимическими показателями. Определена скорость слюноотделения жвачных животных при воздействии фармакологических препаратов (цитрата натрия, пилокарпина гидрохлорида и прозерина).

       1.4 Практическая значимость работы. Для оценки неспецифической иммунологической резистентности организма предлагается новый объект исследования - слюна.

Показана зависимость величины бактерицидной, комплементарной и лизоцимной активности, содержания пропердина слюны жвачных от видовых, сезонных и гендерных характеристик. Обоснована возможность использования M. lysodeikticus  для унификации методов параллельной оценки бактерицидной и лизоцимной активности.  Выявлено влияние аналитических процедур (вида и концентрации тест-культуры микроба, длительности инкубации проб, предварительного центрифугирования и фильтрования) на величину бактерицидной активности слюны жвачных. Обнаружена связь факторов неспецифического иммунитета слюны с микробным пейзажем ротовой полости. Подготовлено методическое указание «Определение комплементарной активности слюны жвачных животных модифицированной методикой Л.С. Резниковой», утвержденное ректором ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», профессором Г.Ф. Кабировым (ноябрь, 2012 г.). 

1.5 Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням «Инфекционные болезни» (Москва, 2011) и научно-практических конференциях: «Научное обеспечение инновационного развития ветеринарной медицины и животноводства» (Казань, 2011); «Актуальные проблемы научного и кадрового обеспечения инновационного развития АПК» (Казань, 2012); «Научно-техническое творчество молодежи – путь к обществу, основанному на знаниях» (Москва, 2012); «Научное обеспечение устойчивого развития отраслей животноводства Российской Федерации» (Новочеркасск, 2012).

1.6 Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 5 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

       1.7 Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Видовые, сезонные и гендерные различия в бактерицидной, лизоцимной, комплементарной активности и содержании пропердина в слюне жвачных. Модификация применительно к слюне жвачных методики Л.С. Резниковой (1967) по определению  комплементарной активности сыворотки крови.

2.  Зависимость величины бактерицидной активности слюны  от вида используемой тест-культуры, ее концентрации, длительности инкубации проб, преаналитических процедур, а также от сезона года.

3.  Степень корреляции бактерицидной активности слюны исследуемых животных с основными факторами неспецифического иммунитета и биохимическими показателями.

       1.8 Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 165 страницах компьютерного текста, состоит из Введения, разделов «Обзор литературы», «Материалы и методы исследований», «Результаты собственных исследований и их обсуждение», а также Выводов, Практических предложений и Списка литературы. Работа содержит 24 таблицы, проиллюстрирована 28 рисунками. Список использованной литературы включает 310 библиографических источников, в том числе 217 на иностранном языке и 8 ссылок на интернет-сайт.

2  Материалы и методы исследований

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» (г. Казань) в течение 2009-2012 гг.

Исследования проведены на клинически здоровых нестельных коровах черно-пестрой породы в возрасте 4-6 лет массой 300-400 кг (30 животных), содержавшихся  на молочно-товарной ферме ООО «Серп и Молот», с. Шапши Высокогорского района РТ, благополучной по инфекционным заболеваниям, овцах породы прекос в возрасте 2-х лет массой 40-45 кг (по 10 животных разного пола), верблюдицах в возрасте 6-ти лет массой 500-600 кг (2 животных), содержавшихся в условиях МУБП «Казанский зооботсад», а также студентах-волонтерах в возрасте 23-25 лет массой 50-70 кг (5 человек). При изучении методов фармакологической стимуляции слюноотделения у жвачных животных использовались растворы цитрата натрия (2 %); пилокарпина гидрохлорида (1 %); прозерина (0,05 %). Сбор слюны для исследований проводили после активации секреции 1 %-ным раствором пилокарпина гидрохлорида в дозах 2,5 мл на овцу, по 15 мл на корову и верблюдицу.

Собранную слюну  сразу замораживали, а после размораживания одну ее половину центрифугировали при 3 тыс. об./мин в течение 10 мин (одну часть надосадочной жидкости фильтровали через мембранные фильтры фирмы «Millipore» (США) диаметром пор 0,22 мкм, другую – нет), оставшуюся половину использовали нецентрифугированной. Кровь у животных получали из яремной вены стерильно специальными системами во флаконы емкостью 250 мл; у людей  - из локтевой вены в вакуумные пробирки «Vacutainer», а слюну – по методике Т.Б. Андреевой (1965) методом сплевывания. Сыворотку крови получали по методике Н.И. Гурьянова (1992). После размораживания ее стерилизовали механически аналогично слюне. 

       При определении БА слюны и сыворотки крови жвачных по методике О.В. Смирновой, Т.А. Кузьминой (1966), согласно рекомендации А.А. Малева  и др. (2009; 2011), использовали тест-культуры микроорганизмов, относящихся к разным группам по Граму: E. coli (штамм М-7) и B. subtilis (штамм 83 ГКИ им. Л.А. Тарасевича) и M. lysodeikticus (штамм 2665 ГКИ им. Л.А. Тарасевича) в концентрациях 1 млн. микробных клеток, 30 млн. микробных клеток  и 1 млн. микробных клеток  в 1 мл пробы соответственно. Продолжительность инкубации проб слюны составила 5, 5 и 3 ч; сыворотки крови – 5, 3 и 3 ч соответственно.





       Лизоцимную активность слюны определяли по С.С. Киселю (1972), комплемента - по Л.С. Резниковой (1967), пропердина - по Г.С. Томилке, И.С. Старостиной (1984).        Биохимические показатели (общий белок, аланинаминотрансфераза - АЛТ, аспартатаминотрансфераза - АСТ, креатинин, мочевина, щелочная фосфатаза, холестерин, глюкоза, общий билирубин, альбумин) слюны определяли на биохимическом анализаторе фирмы «Daytona» с использованием реактивов фирмы  «Randox» (Англия).

       При изучении микробного пейзажа ротовой полости жвачных бактериоскопическим и бактериологическим методами применяли: бактериоло-гический набор (тампон на металлическом стержне в среде Amies с углем) фирмы «Himedia» (Индия); 5 %-ый кровяной агар;  желточно-солевой агар; растительно-молочную среду; среду Эндо; сахарный бульон и колумбийский агар; среду Сабуро с полимиксином; набор коммерческих тест-систем MICRO-LA-TEST фирмы «PLIVA-Lachema Diagnostica» (Чешская республика); идентифика-ционные полоски ОКСИтест, ПИРАтест, ВПтест, ОНПтест; набор красок для простого и сложного методов окрашивания; иммерсионное масло.

       Цифровой материал подвергался статистической обработке методами вариационной статистики (Плохинский Н.А.,  1978) с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (± m), коэффициента вариации (Сv), уровня достоверности (р) и коэффициента корреляции (r) с использованием программы Microsoft Excel.

       Выражаю глубокую благодарность канд. биол. наук Малёву А.А., сотрудникам МУЗ «ГДЦ по ЛДИЗ» (г. Казань) за оказание помощи при выполнении данной работы.

  1. Результаты собственных исследований

3.1 Методы фармакологической стимуляции слюноотделения у жвачных животных

       Примененный нами местно 2 %-ый раствор цитрата натрия не вызывал выраженного усиления секреции слюны у животных. Интенсивность и продолжительность саливации у овец после инъекции 5 мл на животное 1 %-ого раствора пилокарпина гидрохлорида составили 14 мл/мин и 3 ч; после инъекции 2,5 мл на животное – 9 мл/мин и 1 ч соответственно. После введения овцам 0,05 %-го раствора прозерина в дозе 10 мл на животное в период активации саливации (2 ч; 6,4 мл/мин) отмечали тахипноэ и незначительное истечение из носа; 5 мл на животное - усиления слюноотделения и изменений в общем состоянии не отмечалось. Выявив наибольшую эффективность раствора пилокарпина и сопоставимость дозовых его эффектов, данный раствор в дозе 15 мл на животное использовался для аналогичных исследований у коров и верблюдиц. При этом скорость саливации составляла 66 и 72 мл/мин соответственно, а усиление секреции слюны отмечалось в течение 1 часа.

3.2  Микрофлора ротовой полости жвачных

Симбиотическая микрофлора организма-хозяина является высоко информативным показателем состояния как организма в целом, так и полости рта в частности, формируя и влияя на их бактерицидные свойства. Микробный пейзаж ротовой полости жвачных представлен, в основном, грамположительными кокками. У коров чаще всего встречались транзиторные виды микробов, у овец – облигатные. Наименьшая обсемененность полости рта жвачных транзиторными микробами отмечалась в осеннее-зимний период. У овцематок чаще идентифицировались облигатные, у баранов – транзиторные грамположительные кокки, причем у последних видовой спектр микробов был разнообразнее.

3.3 Методологические аспекты изучения бактерицидной активности  слюны  жвачных

3.3.1 Бактерицидная активность слюны и сыворотки крови жвачных относительно различных видов тест-культур

Установлено, что величина бактерицидной активности слюны коров и овец при использовании тест-культур E. coli, B. subtilis и M. lysodeikticus  равнялась соответственно 59,8 и 51,6 %; 66,7 и 61,4 %; 69,6 и 64,9 %; сыворотки крови – соответственно 81,6 и 75,4 %; 42,1 и 35,8 %; 45,2 и 39,1 %.

При использовании B. subtilis и M. lysodeikticus  бактерицидная активность слюны была выше, чем сыворотки крови:  у коров на 36,9 и 35,1 %, у овец – на 41,7 и 39,8 % соответственно;  при использовании E. coli, наоборот, ниже у коров и овец на 26,7 и 31,6 % соответственно. В первом случае это можно объяснить преобладанием лизоцима и иных антибактериальных факторов, действующих против грамположительных микробов; во втором – невысокой активностью комплемента в слюне. Величина бактерицидной активности слюны при использовании культур B. subtilis и M. lysodeikticus была выше, чем при использовании культуры E.coli у коров на 10,3 и 14,1 %, у овец – на 16 и 20,5 % соответственно.

3.3.2 Влияние концентрации тест-культуры и длительности инкубирования проб на величину бактерицидной активности  слюны и сыворотки крови жвачных

Результаты исследования бактерицидной активности размороженной фильтрованной слюны и сыворотки крови жвачных представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что для слюны и сыворотки крови оптимальной являлась концентрация M. lysodeikticus и E. coli в 1 млн. микробных клеток, B. subtilis – в 30 млн. микробных клеток в 1 мл пробы. Продолжительность инкубации проб слюны при использовании  культур E. coli и  B.subtilis составляла 5 ч,  M. lysodeikticus – 3 ч; сыворотки крови – с E. coli – 5 ч, с B. subtilis и M. lysodeikticus – 3 ч.

Таблица 1 – Зависимость величины бактерицидной активности (%) слюны и сыворотки крови жвачных животных от концентрации тест-микроба и длительности инкубирования проб.

Исследуемая жидкость

Длительность инкубации, ч

Концентра-ция тест-микроба, млн.бак.

кл./ мл

Вид животного

Вид тест-микроба

E. coli

B. subtilis

M. lysodeikticus

M±m

Cv,%

M±m

Cv,%

M±m

Cv,%

Слюна

3

30

Корова

-75,6±8,5

22,6

12,8±2,2

34,7

  12,2±3,2

52,1

Овца

-84,3±5,2

12,3

  7,4±2,3

49,2

  7,9±1,7

42,9

1

Корова

14,8±2,3

30,5

100±0

0

  68,9±1,5

4,3

Овца

9,6±2,3

47,8

100±0

0

  63,5±1,4

4,5

4

30

Корова

-39,7±5,0

25,2

33,2±2,5*

15,1

  -7,2±1,7*

45,1

Овца

-46,8±6,8

29,1

28,4±2,0*

13,7

  -13,3±3,2*

48,3

1

Корова

31,1±3,2

20,7

100±0

0

35,2±1,9*

8,9

Овца

27,5±2,7*

19,6

100±0

0

27,5±2,0*

9,4

5

30

Корова

  -13,1±3,3*

50,4

67,3±2,2*

6,6

  -25,8±7,44*

57,6

Овца

  -16,6±3,0*

36,7

60,6±2,3*

7,1

  -36,2±5,1*

28,0

1

Корова

55,4±2,3*

8,3

  100±0

0

20,1±1,9*

10,5

Овца

50,6±2,2*

8,1

  100±0

0

13,9±2,8*

21,5

Сыворотка крови

3

30

Корова

-116,2±14,2

24,5

44,5±2,0

9,1

  -14,5±4,5

61,5

Овца

-149,7±20,5

27,4

34,6±2,5

15,5

  -36,7±5,4

29,6

1

Корова

22,4±2,8

20,1

  100±0

0

  44,6±2,1

8,2

Овца

18,5±2,9

31,4

  100±0

0

  41,2±2,6

12,7

4

30

Корова

-58,0±9,2

31,8

27,9±2,0*

14,3

-25,6±14,2****

32,7

Овца

  -67,2±7,1*

21,1

20,9±2,8*

19,8

  -69,5±6,3

18,2

1

Корова

  46,3±3,0*

12,8

  100±0

0

21,8±2,0

10,2

Овца

  41,8±3,1*

13,5

  100±0

0

17,3±2,8*

32,7

5

30

Корова

-12,4±4,3*

69,3

-7,6±1,9*

50,4

  -78,7±4,4*

11,1

Овца

-20,2±6,8*

66,6

-14,8±4,3*

68,5

  -112,3±12,1*,****

21,6

1

Корова

  83,5±2,1*

5,1

  100±0

0

  14,3±2,7

19,8

Овца

72,3±2,3*

7,9

  100±0

0

  9,8±2,7*

55,9

Примечание: *, **, ***,**** - уровни достоверности, соответственно р 0,001; 0,01; 0,05 и 0,1.

3.3.3  Зависимость величины бактерицидной активности слюны коров и овец от преаналитических процедур

Слюна является неоднородной жидкостью, что, на наш взгляд, может сказаться на результатах нефелометрии и величине бактерицидной активности. Бактерицидная активность размороженной интактной слюны у коров и овец при использовании тест-культур E. coli, B. subtilis и M. lysodeikticus  составила соответственно 46,7 и 41,3 %; 53,5 и 47,6 %; 56,1 и 50,3 %; центрифугированной – соответственно 54,1 и 48,2 %; 59,3 и 54,5 %; 63,3 и 56,5 %; фильтрованной – соответственно 59,8 и 51,6 %; 66,7 и 61,4 %; 69,6 и 64,9 %. Продемонстрировано повышение величины бактерицидной активности слюны коров и овец и снижение ее вариабельности после проведения преаналитических процедур: центрифугирования и фильтрования (с использованием тест-культур E. coli, B. subtilis и M. lysodeikticus у коров в среднем на 15,8 и 28; 10,8 и 24,7; 12,8 и 24 % соответственно; у овец - на  16,7 и 24,9; 14,5 и 28,9; 12,3 и 29 % соответственно). Фильтрование интактной слюны позволяет удалить посторонние микробы, способные вызывать прирост оптической плотности наряду с тест-микробом.

3.3.4 Сезонная вариабельность бактерицидной активности слюны и сыворотки крови жвачных животных

Результаты исследования сезонной вариабельности бактерицидной активности слюны и сыворотки крови коров и овец представлены в таблице 2.

Как следует из таблицы 2, максимальные значения бактерицидности слюны и сыворотки крови у коров и овец отмечались  летом; что, предположительно, связано с интенсивной антигенной (бактериальной) нагрузкой на организм животного в этот период. Минимальные значения бактерицидности наблюдались весной и зимой. Вероятно, это определяется низкими температурами среды, губительными для большинства микробов; несбалансированностью рационов в данные периоды и гиподинамией животных.

Таблица 2 – Сезонная вариабельность бактерицидной активности (%) слюны

и сыворотки крови жвачных животных

Исследуемая жидкость

Сезон

года

Вид животного

Вид тест-микроба

E. coli

B. subtilis

M. lysodeikticus

M±m

Cv,%

M±m

Cv,%

M±m

Cv,%

Слюна

Зима

Корова

52,9±1,4*

7,9

56,4±0,9*

5,0

61,4±1,1*

5,6

Овца

43,8±1,0*

6,9

53,1±1,1*

5,9

56,0±0,8*

4,3

Весна

Корова

50,1±1,1*

6,5

58,6±1,2*

6,1

64,2±1,0*

4,6

Овца

46,4±0,9*

6,0

52,6±1,1

6,2

61,6±1,1

5,2

Лето

Корова

59,8±0,7

3,5

66,7±1,0

4,7

69,6± 1,3

3,2

Овца

51,6±0,9

5,5

61,4±0,8

3,9

64,9± 2,2

5,8

Осень

Корова

56,4±1,1

5,8

62,8±1,2**

5,8

66,8±1,1

4,7

Овца

49,2±1,1****

6,7

55,6±1,0*

5,5

58,4±1,0*

5,2

Сыворотка крови

Зима

Корова

76,0±1,0*

3,9

34,9±0,9*

7,9

37,7±0,9*

6,8

Овца

68,6±0,8*

3,6

27,9±1,0*

10,5

31,8±1,0*

9,2

Весна

Корова

74,1±1,0*

4,1

37,6±1,2*

9,2

40,1±0,9*

6,3

Овца

70,7±1,1*

4,5

33,4±1,0

8,9

36,6±1,1****

8,7

Лето

Корова

81,6±0,9

3,5

42,1±1,3

9,0

45,2±2,1

9,9

Овца

75,4±0,7

2,6

35,8±1,1

9,3

39,1±2,3

11,3

Осень

Корова

79,5±1,0****

3,8

40,5±0,9****

6,4

42,7±0,8

5,9

Овца

73,4±0,9

3,8

30,9±1,0*

10,0

34,2±0,9

8,1

  Примечание: *, **, ***,**** - уровни достоверности, соответственно р 0,001; 0,01; 0,05 и 0,1.

3.4 Методологические аспекты изучения комплементарной активности слюны жвачных

Модифицирована применительно к слюне жвачных методика Л.С. Резниковой (1967) по определению комплементарной активности сыворотки крови путем замены стандартного ряда проб одной, куда вносится по 1 мл гемолитической системы и исследуемой жидкости. При этом величина комплементарной активности (% гемолиза) повысилась у слюны человека с 20,4 до 65,4; у коров – с 6,6 до 14,7; овец – с 5,7 до 12,3; у сыворотки крови человека с 85,6 до 165; коровы – с 9,4 до 31,6; овцы – с 8,4 до 28,7.

Нами установлена невысокая активность комплемента в слюне жвачных. Предположительно, это связано с низкой ионной силой слюны; наличием в ней главных гликопротеинов (кислые, богатые пролином, белки) и внеклеточных полимеров, затрудняющих доступ белков системы комплемента к клеточной стенке эритроцитов, а также пониженной способностью sIgА, IgG, Ig M  слюны активировать комплемент и связывать  его компоненты, исключающей повреждающее воздействие комплекса антиген-антитело на слизистые оболочки. Вероятно этим объясняется слабый фагоцитоз в полости рта.

Комплементарная активность  интактной слюны человека, коров и овец  (89,3; 23,7 и 20,5 % гемолиза соответственно) была выше центрифугированной (65,4; 14,7 и 12,3% гемолиза соответственно) и фильтрованной (71,4; 16,8 и 14,2 % гемолиза соответственно) соответственно на 26,8 и 20,1 %; 38 и 29,1 %; 40 и 30,7 %. Это, на наш взгляд, связано с оседанием при центрифугировании деградированного муцина и других компонентов размороженной слюны, а также наличием в интактных образцах микробов, способных инактивировать комплемент путем адсорбции и выделения антикомплементарных веществ (Резникова Л.С., 1967).

3.5 Лизоцимная активность слюны и сыворотки крови коров и овец

Лизоцимная активность слюны и сыворотки крови коров (37,3 и 19,6 %) превышала таковую овец (26,6 и 15,6 %) в 1,4 и 1,3 раза соответственно. Максимальные ее значения у слюны и сыворотки крови коров наблюдались в летне-осенний (40,3 и 22,6 %), у овец - в весенне-летний (29,1 и 18,6 %) периоды. Величина лизоцимной активности слюны превышала таковую сыворотки крови у коров - в 1,8 раза, у овец  - 1,6 раза.

3.6 Содержание пропердина в слюне и сыворотке крови коров и овец

Выявлено, что содержание пропердина в слюне и сыворотке крови у коров (110 и 473 мкг/мл) выше, чем у овец (66 и 269 мкг/мл) на 40 и 43,1 % соответственно. Количество пропердина в летне-осеннее время  в слюне и сыворотке крови коров (133 и 495 мкг/мл) и овец (82,2 и 294 мкг/мл) было выше на 17,3 и 4,4 % соответственно, чем в зимне-весеннее. Концентрация пропердина в сыворотке крови превышала таковую в слюне у коров в 3,7; у овец – в 3,6 раза. Мы связываем это с нестойкостью пропердина, высокой концентрацией магния в слюне околоушных желез жвачных (McDougall E., 1948). Вероятно, этим объясняется невысокая комплементарная активность слюны.

3.7 Половые различия в величине комплементарной, лизоцимной активности и содержании пропердина в слюне мелкого рогатого скота

Комплементарная активность и уровень пропердина в слюне у баранов (20,2 % гемолиза и 85,7 мкг/мл) была выше, чем у овцематок (17,8% гемолиза и 73,6 мкг/мл) в 1,1 и 1,2 раза соответственно, а лизоцимная активность наоборот, ниже в 1,1 раза (у самцов 28,4 %, у самок 30,7 %). На наш взгляд, это объясняется различием гормонального статуса самцов и самок (в первую очередь половыми гормонами).

3.8 Корреляция бактерицидной активности слюны жвачных с факторами неспецифического иммунитета  и биохимическими показателями

Химический состав слюны, несомненно, влияет на ее бактерицидные свойства. Можно предположить разную степень участия лизоцима, комплемента, пропердина  слюны жвачных в формировании ее бактерицидности.

При использовании в качестве тест-культуры E. coli  отмечалась достоверная (во всех случаях р<0,01) положительная корреляция в зимнее время у коров между бактерицидной активностью слюны и АЛТ (r=0,23), креатинином (r=0,56); у овец – общим белком (r=0,41), креатинином (r=0,45), холестерином (r=0,23). В весеннее время у коров – глюкозой (r=0,51); у овец – общим белком (r=0,66), креатинином (r=0,59). В летнее время у коров – АЛТ (r=0,36), глюкозой (r=0,41); у овец – холестерином (r=0,50), глюкозой (r=0,22). В осеннее время у коров – АЛТ (r=0,28); у овец – общим белком (r=0,64), креатинином (r=0,66).

       При использовании в качестве тест-культуры B. subtilis наблюдалась достоверная (во всех случаях р<0,01) положительная корреляция в зимнее время у коров между бактерицидной активностью слюны и общим белком (r=0,55), креатинином (r=0,69), холестерином (r=0,22); у овец – общим белком (r=0,44), креатинином (r=0,52), глюкозой (r=0,20). В весеннее время у коров – холестерином (r=0,39); у овец – общим белком (r=0,48), креатинином (r=0,73). В летнее время у коров – холестерином (r=0,33); у овец – креатинином (r=0,54). В осеннее время у коров – общим белком (r=0,73),  холестерином (r=0,58), альбумином (r=0,43); у овец – общим белком (r=0,49), АСТ (r=0,24), креатинином (r=0,48).

       При использовании в качестве тест-культуры M.lysodeikticus выявлялась достоверная (во всех случаях р<0,01) положительная корреляция в зимнее время у коров между бактерицидной активностью слюны и общим белком (r=0,73), креатинином (r=0,62); у овец – общим белком (r=0,36), креатинином (r=0,56). В весеннее время у овец – общим белком (r=0,52), креатинином (r=0,76). В летнее время у коров – креатинином (r=0,37), глюкозой (r=0,70); у овец – АЛТ (r=0,20), креатинином (r=0,66). В осеннее время у коров – креатинином (r=0,44), мочевиной (r=0,34), щелочной фосфатазой (r=0,59), холестерином (r=0,25), глюкозой (r=0,22), альбумином (r=0,55); у овец – общим белком (r=0,21), АСТ (r=0,56), креатинином (r=0,56), холестерином (r=0,26).

Степень корреляции бактерицидной активности слюны коров и овец с основными факторами неспецифического иммунитета (лизоцимом, комплементом и пропердином) представлена в таблице 3.

Согласно таблицы 3, у коров бактерицидность слюны в большей степени обусловливалась активностью лизоцима (р<0,01; r=0,54) и комплемента (р<0,01; r=0,57), тогда как у овец, кроме того, и содержанием пропердина (р<0,01; r=0,42).

Таблица 3 – Степень корреляции бактерицидной активности слюны жвачных

с основными факторами неспецифического иммунитета

Вид животного

Тест-культура

Сезон

Лизоцим

Пропердин

Комплемент

Корова

E.coli

Зима

0,31

0,21

0,22

Весна

0,76

0,32

0,63

Лето

-0,18

0,36

-0,03

Осень

0,60

-0,77

0,65

B.subtilis

Зима

0,70

0,15

0,67

Весна

0,34

0,27

0,39

Лето

0,05

-0,26

0,18

Осень

0,75

-0,46

0,55

M.lysodeikticus

Зима

0,78

0,02

0,79

Весна

0,53

0,19

0,50

Лето

-0,26

0,28

-0,22

Осень

-0,45

0,79

-0,61

Овца

E. coli

Зима

0,59

0,56

0,72

Весна

0,75

  0,50*

0,52

Лето

0,03

0,37

0,57

Осень

0,72

0,61

0,74

B. subtilis

Зима

0,62

  0,57*

0,60

Весна

0,19

  0,42*

0,64

Лето

0,58

  0,68*

0,75

Осень

0,72

0,72

0,63

M.lysodeikticus

Зима

0,68

  0,42*

0,72

Весна

0,40

  0,58*

0,63

Лето

0,69

0,76

0,46

Осень

0,62

0,26

0,47

       Примечание: уровень достоверности корреляции р<0,01; * - р>0,1

Выводы

  1. Величины комплементарной, лизоцимной активности и содержание пропердина в слюне и сыворотке крови у коров были выше, чем у овец (на 16,3 и 9,2; 37,3 и 19,6; 40 и 43,1 % соответственно). Максимальные значения лизоцимной активности слюны и сыворотки крови коров наблюдались в летне-осенний; у овец - в весенне-летний периоды; содержание пропердина – в обоих случаях в летнее-осеннее время.  Комплементарная активность и уровень пропердина в слюне самцов была выше на 11,9 и 14,1 % соответственно, а лизоцимная активность, наоборот, ниже на 7,5 %.
  2. Модифицирована применительно к слюне жвачных методика Л.С. Резниковой (1967) по определению комплементарной активности сыворотки крови путем замены стандартного ряда проб одной, куда вносится по 1 мл гемолитической системы и исследуемой жидкости. При этом, процент гемолиза в образцах слюны коров и овец  повышался на 55 и 54 % соответственно.
  3. Обоснована возможность использования M. lysodeikticus при параллельной оценке бактерицидной и лизоцимной активностей для унификации методов их определения. Для повышения величины бактерицидной активности слюны и сыворотки крови установлены концентрации тест-культур (1 млн. микробных клеток в 1 мл пробы - для E. coli и M. lysodeikticus; 30 млн. микробных клеток в 1 мл пробы - для B. subtilis) и продолжительность инкубирования проб (со слюной при использовании  E. coli и  B. subtilis - 5 ч,  M. lysodeikticus – 3 ч; с сывороткой крови – с E. coli – 5 ч, с B. subtilis и M. lysodeikticus – 3 ч).
  4. Бактерицидная активность слюны для грамположительных тест-культур была выше, чем для грамотрицательных. Предварительные центрифугирование и фильтрование снижали комплементарную активность  слюны коров и овец на 38-40 и 29-31 % соответственно, тогда как бактерицидная активность возрастала на 13-15 и 26-28 % соответственно.
  5. Отмечен максимум бактерицидной активности летом и минимум – весной, зимой. Показана связь факторов неспецифического иммунитета слюны с микробным пейзажем ротовой полости, представленным, в основном, грамположительными кокками. У коров чаще встречались транзиторные виды микробов, у овец – облигатные. Наименьшая обсемененность полости рта жвачных транзиторными микробами  наблюдалась в осенне-зимний период. У овцематок чаще идентифицировались облигатные, у баранов – транзиторные грамположительные кокки и видовой спектр микробов у них был разнообразнее.
  6. Установлена положительная корреляция (во всех случаях р0,01) бактерицидной активности слюны жвачных с биохимическими показателями (общий белок, r=0,43;  аланинаминотрансфераза, r=0,23;  холестерин, r=0,26; креатинин, r=0,54 и глюкоза, r=0,32) и основными факторами неспецифического иммунитета. У коров бактерицидность слюны в большей степени обусловливалась активностью лизоцима (р<0,01; r=0,54) и комплемента (р<0,01; r=0,57), тогда как у овец, кроме того, и содержанием пропердина (р<0,01; r=0,42).
  7. Выявлена высокая положительная корреляция (во всех случаях р<0,01) между бактерицидной активностью, ее составляющими слюны и сыворотки крови жвачных. У коров и овец она составляла для бактерицидной активности r=0,53 и r=0,49; для лизоцимной активности r=0,83 и r=0,51; для комплементарной активности r=0,73 и r=0,39; для пропердина r=0,61 и r=0,74.
  8. 1 %-ый раствор пилокарпина гидрохлорида показал наибольший стимулирующий эффект на слюноотделение жвачных по сравнению с растворами прозерина (0,05 %) и цитрата натрия (2 %). Появление первых выраженных признаков активации слюноотделения не зависело от видовой принадлежности животного, отличия отмечались лишь в скорости слюноотделения.

Практические предложения

  1. Предлагается новый объект исследования неспецифической иммунологической резистентности у жвачных животных - слюна.
  2. При определении бактерицидной активности слюны рекомендуется использовать тест-культуры микроорганизмов, относящихся к разным группам по Граму. При параллельной оценке бактерицидной и лизоцимной активности для унификации методов их определения предпочтительно применять в качестве грамположительной тест-культуры M. lysodeikticus. Нами предложена модификация гемолитического метода Л.С. Резниковой (1967) для определения комплементарной активности слюны.        
  3. Для повышения величины бактерицидной активности слюны вносить в 1 мл пробы по 1 млн. микробных клеток E. coli и M. lysodeikticus; 30 млн. микробных клеток B. subtilis; инкубировать пробы со слюной 5; 3 и 5 ч соответственно. Варабельность величины бактерицидной активности слюны снижается с 11 % до 5 и 3 % соответственно центрифугированием при 3000 об./мин в течение 10 мин и мембранной фильтрацией (диаметр пор 0,22 мкм). Учитывать сезонную вариабельность величины бактерицидной активности слюны и связь ее неспецифических факторов иммунитета с микробным пейзажем ротовой полости.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Малев, А.А.  Роль концентрации и длительности инкубации тест-культуры при определении бактерицидной активности сыворотки крови / А.А. Малев, М.К. Махамат, Е.С. Покровская и др. // Инфекционные болезни: Материалы Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. – Москва, 2011. – Т. 9. – С. 223.
  2. Покровская, Е.С. Методологические аспекты получения слюны у сельскохозяйственных животных / Е.С. Покровская, А.А. Малев, Р.Я. Гильмутдинов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана. – 2011. – Т. 208. – С. 95-99.*
  3. Покровская, Е.С. Сезонная вариабельность видового спектра микрофлоры ротовой полости крупного и мелкого рогатого скота / Е.С. Покровская, А.А. Малев, Р.Я. Гильмутдинов и др. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана. – 2012. – Т. 209. – С. 266-272.*
  4. Покровская, Е.С. Методологические аспекты исследования комплементарной активности слюны и сыворотки крови жвачных животных / Е.С. Покровская, А.А. Малев, Р.Я. Гильмутдинов и др. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана. – 2012. – Т. 210. – С. 165-172.*
  5. Махамат, М.К. Бактерицидная активность слюны и сыворотки крови крупного и мелкого рогатого скота при гельминтозах / М.К. Махамат, Р.Я. Гильмутдинов, Е.С. Покровская // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана. – 2012. – Т. 211. – С. 99-104.*
  6. Покровская, Е.С. Бактерицидная активность слюны и сыворотки крови жвачных животных по отношению к различным видам тест-культур / Е.С. Покровская, Н.Н. Хуснутдинов, Н.С. Караганова // Актуальные проблемы научного и кадрового обеспечения инновационного развития АПК: Сборник статей научно-практической конференции. – Ученые записки Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана. - Казань, 2012. – Т. 212. – С. 123-127.
  7. Покровская, Е.С. Влияние преаналитических процедур на величину бактерицидной активности слюны жвачных животных / Е.С. Покровская, Р.Я. Гильмутдинов, М.К. Махамат // Актуальные проблемы научного и кадрового обеспечения инновационного развития АПК: Сборник статей научно-практической конференции. – Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана. - Казань, 2012. – Т. 212. – С. 127-131.
  8. Покровская, Е.С. Бактерицидные свойства слюны и сыворотки крови жвачных животных / Е.С. Покровская, М.К. Махамат // Научно-техническое творчество молодежи – путь к обществу, основанному на знаниях: сборник докладов IV Международной научно-практической конференции. – Москва, 2012. – С. 336-339.
  9. Гильмутдинов, Р.Я. Слюна – новый объект диагностических исследований у животных / Р.Я. Гильмутдинов, А.В. Иванов, М.К. Махамат, Е.С. Покровская // Достижения науки и техники АПК. - 2012. - № 11.- С. 47-50.*
  10. Покровская, Е.С. Сезонная вариабельность бактерицидной активности слюны и сыворотки крови коров и овец // Научное обеспечение устойчивого развития отраслей животноводства Российской Федерации: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. – Новочеркасск, 2012. - С. 60-63.

* - публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.