WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ПЛИТОВ ИВАН СЕРГЕЕВИЧ

ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА

САЛЬМОНЕЛЛЕЗА И ЭШЕРИХИОЗА ПТИЦ

06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

МОСКВА 2012

Работа выполнена на кафедре «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (ФГБОУ ВПО «МГУПП»), Министерства  образования и науки РФ.

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор 

Ленченко Екатерина Михайловна

ФГБОУ ВПО «МГУПП»

Официальные оппоненты:

Степаненко Петр Петрович

доктор ветеринарных наук, профессор кафедры Микробиологии и иммунологии

ФГБОУ ВПО «МГУПП»

Пирожков Михаил Константинович

доктор ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник лаборатории качества и стандартизации лекарственных средств против бактерийных болезней животных

ФГБУ «ВГНКИ»

Ведущая организация:

Государственное научное учреждение «Научно-исследовательский институт птицеперерабатывающей промышленности» Россельхозакадемии РФ (ГНУ НИИПП)

Защита состоится « » 2012 г. в « » часов на диссертационного совета Д 212.148.09 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (109316, Москва, ул. Талалихина, 33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств».

Автореферат разослан                                                               2012 г.

Автореферат размещен на сайте

Министерства образования и науки РФ                                       2012 г.

       

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, доцент  И. М. Нитяга

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В структуре инфекционной патологии птиц по статистическим данным более 60,0 % составляют болезни бактериальной этиологии, из числа которых в период 2007-2011 гг. массовая доля сальмонеллеза составила  11,7 %,  эшерихиоза – 63,0 % (Венгеренко Л. А., 2009,  2011; Фисинин В. И., 2007, 2011).

В  этиологии  сальмонеллеза  птиц  участвуют  микроорганизмы  S. typhimurium и S. enteritidis, а также S. gallinarum и S. pullorum, вызывающие пуллороз птиц отряда Куриные. Этиологическая структура эшерихиоза наиболее часто представлена серогруппами О1, О2, О26, О55, О78, О138 (Бессарабов Б. Ф., 1980, 2007; Кожемяка Н. В., 1982, 2008; Грошева Г. А., 1983; Стрельников А.  П., 1987; Радчук Н. А., 1990; Гусев А. А. и соавт., 1992; Козак С. С., 1992, 2011; Тугаринов О. А., 1993;  Сидоров М. А. и соавт. 1995; Панин А. Н. и соавт., 1995;  Ленев С. В., 1996; Шустер Б. Ю., 1996; Субботин В. В., 1997;  Куликовский А. В., 1998,  2011;  Малик Н. И.  и соавт., 1998; Яременко Н. А., 1998; Каврук Л. С. и соавт., 1999; Пирожков М. К., 1999, 2002; Степаненко  П. П., 1999; Виноходов В. О., 2000; Ленченко Е. М., 2000, 2011; Капустин А. В., 2001; Степаненко И. П., 2001; Венгеренко Л. А., 2003; Андреева Н. Л.  и соавт., 2004; Бовкун Г. Ф., 2004; Салаутин В. В., 2004; Борисенкова А. Н. и соавт., 2004; Светоч Э. А., 2004;  Крупальник В. Л., 2005; Скородумов Д. И. и соавт., 2005; Гусев В. В., 2006; Павлова И. Б., 2007; Галазин Н. М. и соавт., 2007; Рождественская Т. Н., 2009, 2011; Кононенко А. Б. и соавт, 2011; Смирнов Д. Д., 2011; Eickhoff T. C., 1981; M. D. Galvez A., 1989; Collins, 2001; Janice Y. C., 2011). Установлено, что при  болезнях бактериальной этиологии в биотопе желудочно-кишечного тракта диких и синантропных птиц преобладают микроорганизмы родов Salmonella, Escherichia, Staphylococcus, Streptococcus, Pasteurella (Белоусова Р. В., 1977; Сюрин В. Н., 1979;  Бессарабов Б. Ф.,  2005, Багрецова А. Л.,  2005;  Бондарев А. Ю., 2009). Циркулирующие среди поголовья птицы микроорганизмы характеризуются устойчивостью к химиотерапевтическим препаратам, в частности, установлена устойчивость энтеробактерий к антибиотикам  тетрациклинового ряда, природным и полусинтетическим пенициллинам (Пилипейко В. Г. и соавт., 2002; Хиштова Н. С., 2008; Шурахова Ю. Н. и соавт., 2011). При проведении мониторинговых исследований распространенности сальмонеллеза и эшерихиоза птиц целесообразным представляется применение эффективных методов индикации, оценки антагонистической активности, чувствительности к антибиотикам и дезинфицирующим средствам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, циркулирующих среди поголовья птицы при массовых желудочно-кишечных болезнях, что и определило актуальность темы диссертационной работы.

Цель исследований: изучить этиологическую структуру сальмонеллеза и эшерихиоза птиц с применением эффективных диагностических питательных сред и тест-систем для индикации и идентификации таксономически сходных видов энтеробактерий.

Задачи исследований:

- провести ретроспективный анализ данных по распространенности инфекционных болезней птиц бактериальной этиологии;

- изучить ростообеспечивающие и ингибирующие свойства дифференциально-диагностических питательных сред и чувствительность иммунохроматографической тест-системы «Singlepath ® Salmonella» для индикации и идентификации микроорганизмов;

- изучить эффективность схем бактериологического исследования на наличие микроорганизмов рода Salmonella и Escherichia;

- изучить количественный и видовой состав микроорганизмов в микробиоценозах кишечника птиц;

- изучить видовой состав патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из патологоанатомического материала птиц;

- изучить этиологическую структуру сальмонеллеза и эшерихиоза птиц;

- изучить антагонистическую активность, чувствительность к антибиотикам, устойчивость к дезинфицирующим средствам выделенных изолятов энтеробактерий

Научная новизна. Установлено, что при желудочно-кишечных болезнях птицы в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта доминируют  культуры микроорганизмов, отнесенные к видам: Escherichia coli – 41,2 %; Salmonella typhimurium – 12,8 %; Salmonella enteritidis – 10,7 %; Proteus vulgaris – 7,0 %. Установлено, что этиологическая структура сальмонеллеза представлена видами – S. enteritidis (45,8 %), S. typhimurium (54,2 %); эшерихиоза, серогруппами – О2 (32,14 %), О15 (25,0 %), О1 (21,43 %), О78 (21,43 %), соответственно. При определении адгезивных антигенов установлено, что из 9 изолятов E. coli, отнесенных к серогруппе О2, адгезивными свойствами обладали 4 изолята (K99, 987P, F41, A20); из 7 изолятов, отнесенных к серогруппе О15, – 4 изолята (K99, A20); из 6 изолятов, отнесенных к серогруппе О1, – 3 изолята (A20); из 6 изолятов, отнесенных к серогруппе О78, – 4 изолята (K88, A20). С применением модифицированного метода изучения антагонистической активности бактерий установлено, что биологически активные вещества, продуцируемые изолятами E. coli, угнетают рост бактерий S. typhimurium с зоной задержки роста 1,4±0,1 мм; S. enteritidis – 1,6±0,1 мм; C. freundii – 1,5±0,2 мм; P. mirabilis – 0,6±0,1 мм; K. pneumonia – 1,3±0,1 мм. Из изолятов энтеробактерий, выделенных при желудочно-кишечных болезнях птиц, 21,4 % штаммов были чувствительны к антибиотикам группы цефалоспоринов (цефазолин, цефатоксим); 19,1 % – фторхинолонов (офлоксацин, ципрофлоксацин); 16,7 % – аминогликозидов (канамицин, амикацин). Среди изолятов энтеробактерий выделены штаммы, устойчивые к антибиотикам группы макролидов (эритромицин, олеандомицин) и природных пенициллинов (оксациллин), – 21,4 % соответственно.

Практическая значимость работы. На основании экспериментальных данных по изучению межпопуляционных взаимодействий таксономически сходных видов энтеробактерий модифицирована методика определения антагонистической активности микроорганизмов и разработаны «Методические рекомендации по определению антагонистической активности микроорганизмов», утвержденные секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 8 от 22 июня 2010 года). Результаты исследований используются в учебном процессе на ветеринарно-санитарном факультете ФГБОУ ВПО «МГУПП» по дисциплине «Эпизоотология».

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях кафедры «Инфекционные и паразитарные болезни» МГУПБ (М., 2008-2011); на Международной научной конференции молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания» (М., 2009); на VI Международном ветеринарном конгрессе по пти­цеводству (М., 2010).

Основные положения, выносимые на защиту:

• результаты ретроспективного анализа данных по распространенности инфекционных болезней птиц бактериальной этиологии;

• количественный и видовой состав  энтеробактерий,  доминирующих в микробиоценозах кишечника при желудочно-кишечных болезнях птиц;

• этиологическая структура сальмонеллеза и эшерихиоза птиц;

• антагонистическая активность, чувствительность к антибиотикам, устойчивость к дезинфицирующим средствам выделенных изолятов энтеробактерий

Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных статей, в том числе 4 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, выводов, библиографии, приложения. Работа изложена на 142 страницах компьютерного текста, содержит 16 таблиц, 18 рисунков. Библиографический список включает 171 источник, из них 51 иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена с 2008 по 2011 гг. на кафедре «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств». Часть исследований проводилась в отделе диагностики бактериальных болезней ФГБУ «ЦНМВЛ».

В опытах были использованы паспортизированные штаммы: Salmonella typhimurium № 5715; Salmonella enteritidis № 204; Escherichia coli О2, № 388; Escherichia coli О78:К80, № 320; Escherichia coli О138:К81, № 723; Klebsiella  pneumonia № 24; Staphylococcus  aureus № 123; Proteus vulgaris Н2091,  полученные из коллекции ФГБУ ВГНКИ, Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. Изучение ростообеспечивающих, дифференциальных и ингибирующих свойств питательных сред проводили в соответствии с «Рекомендациями по организации и проведению контроля качества питательных сред для ветеринарных лабораторий» (М., 2011). При учете количественного состава энтеробактерий в микробиоценозах кишечника цыплят учитывали КОЕ микроорганизмов (lg/г) в определенном объеме (0,1 мл) разведения feces (Эпштейн-Литвак Р. В., 1969; Субботин В. В., 1999). С целью выделения возбудителей сальмонеллеза и эшерихиоза исследования проводили в соответствии с методическими указаниями: «Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды» (М., 1990); «Методические указания по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных» (М., 2000). Для оценки этиологической значимости патогенных и условно-патогенных энтеробактерий при желудочно-кишечных болезнях исследования проводили в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» (М., 1999). Пробы пищевых продуктов для бактериологических исследований от­бирали в количествах, предусмотренных нормативными документами: ГОСТ 26668-85 (СТСЭВ 3013-81) «Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологического анализа»; ГОСТ 7269-79 «Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести»; СанПиН 2.3.2.560-96 и 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов»; ГОСТ 10444.15-94 «Продукты пище­вые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факульта­тивно-анаэробных микроорганизмов»; ГОСТ 30519-97 (ГОСТ Р 50474-93) «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)»; ГОСТ 30519-97 (ГОСТ Р 50480-93) «Продукты пищевые. Методы выявления бактерий рода Salmonella». Идентификацию выделенных культур проводили в соответствии с классификационной системой «Bergy s manual…1984-1989». Биологические свойства микроорганизмов изучали, используя общепринятые методы (Герхардт Ф.  и соавт., 1984; Сидоров М.А.  и соавт.,  1995; Скородумов Д.И. и соавт., 2005). В экспериментах использовали иммунохроматографическую тест-систему «Singlepath ® Salmonella» («Merck», Германия), латекс-агглютинационный экспресс-тест «Salmonella latex kit» («Oxoid», Англия), питательные среды «ВСА», «Эндо» («Hi-media», Индия), «Rambach agar», «XLT-4 agar», «Cromocult Coliform agar» («Merck», Германия). Биохимические свойства микроорганизмов изучали с использованием сред Гисса и множественной тест-системы «API» («BioMrieux», Франция). Серогрупповую принадлежность сальмонелл определяли в реакции агглютинации на стекле с диагностическими сыворотками (ФГУП «Курская биофабрика»), в соответствии с рекомендациями, изложенными в «Наставлениях по применению наборов сывороток сальмонеллезных О-комплексных и монорецепторных О- и Н-агглютинирующих для идентификации  сальмонелл в РА на стекле» (М., 1997).  Серогрупповую принадлежность эшерихий определяли в реакции агглютинации с диагностическими сыворотками (ФГУП «Армавирская биофабрика»), в соответствии с рекомендациями, изложенными в «Наставлении по применению агглютинирующих О-коли сывороток» (М., 1998). Для определения адгезивных антигенов эшерихий использовали агглютинирующие сыворотки К88, К99, 987Р, F41, А20 любезно предоставленные профессором Эдуардом Арсеньевичем Светочем (ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии).

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам изучали методами серийных разведений, диффузии в агар (Навашин С. М., Фомина И. П., 1982), с использованием микробиологического анализатора «MicroTax». Антагонистические свойства микроорганизмов изучали общепринятыми методами (Егоров Н. С., 1979; Степаненко П. П., 1999) и с применением мембранных фильтров (Павлова И. Б., Ленченко Е. М., 1997). Исследования по устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующим средствам проводили в соответствии с методическими указаниями «О порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринарной практики» (М., 1987), «Проведение дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора» (М., 2002).  Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием методического руководства «Теория статистики» и программы «Statgraphics» (Шмойлова Р. А., 2006).

Выражаем благодарность д-ру биол. наук, проф. Павловой И. Б. (ВНИИВСГЭ) за оказание консультативной помощи при выполнении опытов по оценке антагонистической активности микроорганизмов, д-ру вет. наук Белоусову В. И. (ФГБУ «ЦНМВЛ») за оказание консультативной помощи при проведении ретроспективного анализа данных статистической отчетности по бактериальным болезням птиц.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Анализ данных о распространенности инфекционных болезней птиц бактериальной этиологии

В период с 2008 по 2011 гг. был проведен ретроспективный анализ первичных данных отчетности ветеринарных лабораторий субъектов РФ в соответствии с «Журналом сведений о работе ветеринарных лабораторий» форма № 4-Вет (ФГБУ «ЦНМВЛ»). При анализе данных по инфекционным болезням птицы бактериальной этиологии установлено, что до 49,0 % поступившего материала (патологический материал, инкубационные и товарные яйца, эмбрионы задохлики, feces) было исследовано на наличие возбудителей сальмонеллеза, 25,0 % – эшерихиоза. От общего количества проведенных исследований – 216723 исследованных проб наибольший процент положительных результатов, составляли эшерихиоз, стрептококкоз и сальмонеллез; диагноз эшерихиоз регистрировался в 63,0 % случаев, сальмонеллез  – 17,3 %. От общего количества положительных результатов (24200) 60,0 % составлял эшерихиоз, 13,0 % – стрептококкоз, 12,5 % – сальмонеллез, 6,2 % – стафилококкоз, 6,0 % – псевдомоноз, 2,0 % – пастереллез, 0,5 % – условно-патогенные микроорганизмы (табл. 1).

Таблица 1

Результаты анализа данных о структуре инфекционных болезней птиц бактериальной этиологии

Диагноз

Год

2008

2009

2010

2011

Источник выделения, % положительных случаев

(патологический материал, эмбрионы задохлики, feces)

I

II

III

I

II

III

I

II

III

I

II

III


Сальмонеллез

39,3

9,2

51,5

41,2

8,7

50,1

42,4

7,9

49,7

41,7

8,9

49,4


Эшерихиоз

42,5

14,3

43,2

45,3

13,9

40,8

44,9

17,4

37,7

43,2

14,1

42,7


Псевдомоноз

54,1

33,7

12,2

52,3

36,8

10,9

55,1

27,3

17,6

53,8

24,1

22,1


Стафилококкоз

44,6

31,7

23,7

48,3

34,1

17,6

45,6

33,8

20,6

45,1

30,4

24,5


Стрептококкоз

48,9

28,7

22,4

50,2

28,4

21,4

49,7

30,1

20,2

50,4

29,3

20,3

Условные обозначения: I – патологический материал; II – эмбрионы задохлики; III – feces

В  структуре инфекционной патологии птиц бактериальной этиологии в период с 2008 по 2011 годы массовая доля сальмонеллеза и эшерихиоза составляла 12,3 и 64,0 % соответственно (рис. 1).

Рис. 1. Результаты анализа данных статистической отчетности о структуре

инфекционных болезней птиц бактериальной этиологии

3.2. Сравнительная характеристика эффективности

дифференциально-диагностических сред в опытах с референтными штаммами микроорганизмов

Для оценки дифференциально-диагностических свойств сред взвесь микроорганизмов, содержащую около 1000 бактериальных клеток в 1 мл (стандарт мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича), вы­севали по 0,1 мл на поверхность исследуемой среды, культивировали при 37 °С 24 ч. При оценке свойств  сред «ВСА» и «Эндо», «Rambach agar», «XLT-4 agar», «Cromocult Coliform agar» в опытах с чистой культурой микроорганизмов и со смешанной суспензией микроорганизмов ростообеспечивающие и ингибирующие свойства сред существенно не отличались (табл. 2, 3).

Таблица 2

Сравнительная оценка ростообеспечивающих свойств сред

для индикации сальмонелл (M±m)

Среда

Количество выросших колоний, КОЕ

S. typhimurium

S. enteritidis

E. coli

P. vulgaris

S. aureus

ВСА

81,33±1,63

90,17±1,47

70,00±1,41

79,67±0,89

-

Эндо

86,25±2,31

86,40±2,13

81,20±1,47

81,10±0,89

-

Rambach agar 

92,00±1,41

97,30±1,03

89,50±1,04

79,00±3,74

-

XLT-4 agar

91,70±1,32

96,70±1,12

87,20±1,44

71,10±2,67

-

  Условные обозначения: «-» нет роста микроорганизмов

Таблица 3

Сравнительная оценка ингибирующих свойств сред

для индикации сальмонелл (M±m)

Среда

Количество колоний микроорганизмов КОЕ

S. typhimurum

E. coli

S. enteritidis

E. coli

S. typhimurium

P. vulgaris

S. enteritidis

P. vulgaris

S. typhimurum

S. aureus

S. enteritidis

S. aureus

ВСА

45,7±2,1

25,6±3,5

42,3±3,4

13,4±2,7

41,3±2,6

24,7±4,1

43,2±3,9

21,17±2,40

47,3±1,8

44,10±2,67

Rambach agar

41,60±1,96

33,8±4,5

39,2±3,7

41,2±2,1

42,3±3,7

23,2±2,9

47,3±3,3

22,6±3,5

48,3±3,7

48,2±3,6

  Условные обозначения: «–» нет роста микроорганизмов

Микроорганизмы S. typhimurium и S. enteritidis, образующие сероводород, на среде «ВСА» формировали черные колонии с характерным металлическим блеском; микроорганизмы E. coli и P. vulgaris, не образующие сероводород, формировали светло-зеленые колонии. Микроорганизмы S. enteritidis и S. typhimurium формировали розово-красные колонии на среде «Rambach agar» и черные колонии на среде «XLT-4 agar»; микроорганизмы  E. coli формировали на среде «Rambach agar» сине-зеленые колонии, на среде «XLT-4 agar» –желтые колонии; микроорганизмы P. vulgaris формировали на среде «Rambach agar» колонии оранжевого цвета, на среде «XLT-4» – бесцветные колонии. Дифференцирующее действие среды «Rambach agar» основано на том, что входящий в состав среды пропиленгликоль ферментируется сальмонеллами до кислоты, которая, воздействуя на pH-индикаторы, окрашивает колонии в красный цвет. Применение среды позволяло дифференцировать розово-красные колонии сальмонелл от сине-зеленых колоний эшерихий и оранжево-желтых колоний протея. Входящий в состав среды дезоксихолат натрия ингибировал феномен "роения" протея и рост S. aureus. Индикацию сальмонелл на среде «XLT-4 agar» проводили по черной окраске колоний, обусловленной продукцией сероводорода  при ферментации лизина и отсутствии или малой интенсивности, ферментации ксилозы, лактозы и сахарозы.  На среде «Cromocult Coliform agar»  E. coli формировали колонии фиолетового цвета; S. typhimurium, S. enteritidis и P. vulgaris –  бесцветные колонии. В целом ростообеспечивающие и ингибирующие свойства изученных питательных сред существенно не отличались, вместе с тем хромогенные среды «Rambach agar», «XLT-4 agar» ,«Cromocult Coliform agar» отличались более выраженными дифференциальными свойствами по сравнению со  средами «Висмут-сульфит агар», «Эндо».

3.3. Сравнительная оценка эффективности схем

бактериологического исследования на наличие

микроорганизмов рода Salmonella и Escherichia

Оценка эффективности схем бактериологического исследования на наличие сальмонелл. Исследовали па­тологический материал от сельскохозяйственных птиц (n=40); пробы feces сельскохозяйственных, а также синантропных птиц (n=50); охлажденное мясо птицы (n=20). Исследования на наличие сальмонелл проводили по схемам: схема I «Индикация и идентификация сальмонелл с применением среды «ВСА»; схема II – с применением среды «Rambach agar»; схема III – с применением среды «XLT-4 agar». Идентификацию сальмонелл,  выделенных из патологического материала, по схеме I проводили на 5-е сутки исследования, из 84 типичных колоний были идентифицированы 10 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды – 11,9 %;  по схеме II – на 4-е сутки исследования, из 16 типичных колоний были идентифицированы 10 культур микроорганизмов рода  Salmonella, специфичность среды – 62,5 %; по схеме III – на 4-е сутки исследований, из 19 типичных колоний идентифицировано 10 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды – 52,6        %. Идентификацию сальмонелл,  выделенных из feces, по схеме I проводили на 4-е сутки исследования, из 38 типичных колоний было идентифицировано 14 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды – 36,8 %; по схеме II – на 4-е сутки исследования, из 19 типичных колоний были идентифицированы 14 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды – 73,7 %; по схеме III – на 4-е сутки исследований, из 21 типичных колоний идентифицировано 14 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды составила – 66,6 %. Идентификацию сальмонелл,  выделенных из охлажденного мяса, по схеме I проводили на 4-е сутки исследования, из 15 типичных колоний были идентифицированы 10 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды – 66,6 %; по схеме II – на 4-е сутки исследования, из 12 типичных колоний были идентифицированы 10 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды – 83,3 %; по схеме III – на 4-е сутки исследования, из 13 типичных колоний было идентифицировано 10 культур микроорганизмов рода Salmonella, специфичность среды – 76,9 % (табл. 4).

Таблица 4

Сравнительная характеристика эффективности

схем бактериологического исследования на наличие

микроорганизмов рода Salmonella

Исследуемый материал

Схема исследования

(продолжительность, сутки)

Количество типичных колоний

Количество культур микроорганизмов рода Salmonella

Всего

%

Патологический материал (n=40)

I (5)

84

10

11,9

II (4)

16

10

62,5

III (4)

19

10

52,6

Feces (n=50)

I  (4)

38

14

36,8

II (4)

19

14

73,7

III (4)

21

14

66,6

Охлажденное мясо (n=20)

I (4)

15

10

66,6

II (4)

12

10

83,3

III (4)

13

10

76,9

Для оценки чувствительности и специфичности иммунохроматографической тест-системы «Singlepath ® Salmonella», принцип действия которой заключается в  учете результата наличия возбудителей сальмонеллеза в материале за счет связывания комплекса «антиген-антитело», взвеси культур микроорганизмов S. enteritidis, S. typhimurium, E. coli,  содержащие от 10 до 108 бактериальных клеток в 1 мл по стандарту мутности ГИСК им. Л. А.Тарасевича,  высевали в лунку тест-планшета. В качестве контроля производили посев культур  на среды «Висмут-сульфит агар»,  «Rambach agar», культивировали в течение 24 ч при 37 °С и учитывали рост характерных колоний. С применением тест-системы «Singlepath ® Salmonella» учет результатов можно проводить как при посеве чистых культур микроорганизмов Salmonella spp., так и смешанных культур микроорганизмов S. enteritidis, S. typhimurium, E. coli в концентрациях от 100 бактериальных клеток в 1 мл суспензии. Объектом исследования служили охлажденные куриные окорочка  (n = 20): 1 группа – контаминация культурой S. enteritidis (опыт); 2 группа – контаминация культурой S. typhimurium (опыт); 3 группа – контаминация культурами S. enteritidis и E. сoli (опыт); 4 группа – не контаминированные образцы (контроль). Исследуемые пробы m=25 г, погруженные в пептонную воду в соотношении 1:5, контаминировали взвесью микроорганизмов в концентрациях от 107 до 102  бактериальных клеток в 1 мл суспензии и помещали в термостат при 37 С на 24 ч. С использованием тест-пластин «Petrifilm 3M» определяли количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ),  сред «Эндо», «Висмут-сульфит агар», «Rambach agar», «XLT-4», «Cromocult Coliform agar» - наличие бактерий группы кишечных палочек (БГКП) и сальмонелл. Индикацию микроорганизмов Salmonella spp. проводили по трем схемам: схема 1 – среда предобогащения  среда обогащения  среда ВСА; схема 2 – среда предобогащения среда обогащения среда «Rambach agar» и «XLT-4»; схема 3 – среда предобогащения среда обогащения  иммунохроматографическая система «Singlepath ® Salmonella». Установлено, что КМАФАнМ составило: при посеве разведения 103 – 59,20±4,57; 104 – 24,70±5,24; 105– 8,90± 4,23. С применением схемы 1 индикацию сальмонелл осуществляли на 4-е сутки исследования, применение схемы 2 позволяло провести индикацию  сальмонелл на 3 сутки исследования. Применение схемы 3 позволяло провести индикацию микроорганизмов Salmonella spp. на 2-е сутки исследований. При учете результатов после внесения 160 мкл прогретой жидкой среды накопления через 20 мин проявлялись 2 красные полоски, что указывало на наличие в пробе сальмонелл.  Результаты, полученные с помощью иммунохроматографической тест-системы, подтверждали пересевом проб на плотные дифференциально-диагностические среды. Тест-система позволяла в течение 24 ч при первоначальной концентрации в исследуемом образце от 100 бактериальных клеток Salmonella spp. проводить  индикацию и идентификацию возбудителей сальмонеллеза. 

Оценка эффективности схем бактериологического исследования на наличие эшерихий. Исследования на наличие эшерихий проводили по схемам: схема I «Индикация и идентификация эшерихий с применением среды «Эндо»; схема II с применением среды «Chromocult Coliform agar». Идентификацию эшерихий,  выделенных из патологического материала, по схеме I проводили на 7-е сутки исследования, из 78 типичных колоний были идентифицированы 20 культур микроорганизмов рода Escherichia, специфичность среды – 25,6 %; из feces – на 6-е сутки исследования, из 47 типичных колоний были идентифицированы 27 культур микроорганизмов рода Escherichia, специфичность среды – 57,4 %.  Идентификацию эшерихий,  выделенных из патологического материала, по схеме II проводили на 6-е сутки исследования, из 36 типичных колоний были идентифицированы 20 культур микроорганизмов рода Escherichia, специфичность среды – 55,5 %; из feces птиц – на 5-е сутки исследования, из 34 типичных колоний были идентифицированы 27 культур микроорганизмов рода Escherichia, специфичность среды – 79,4 % (табл. 5).

Таблица 5

Сравнительная характеристика

схем бактериологического исследования на эшерихиоз

Исследуемый материал

Схема исследования

(продолжительность, сутки)

Количество типичных колоний

Количество идентифицированных культур микроорганизмов Escherichia coli

Всего

%

Патологический материал (n=40)

I

78

20

25,6

II

36

20

55,5

feces (n=50)

I

47

27

57,4

II

34

27

79,4

3.4. Результаты оценки кишечных микробиоценозов птиц

с синдромом желудочно-кишечных болезней

3.4.1. Количественный и видовой состав бактерий в микробиоценозах кишечника клинически здоровых птиц

Для выявления изменений экологического равновесия в биотопе желудочно-кишечного тракта клинически здоровых цыплят проводили бактериологические  исследования feces, учитывая количественный и видовой состав энтеробактерий, лактобактерий и бифидобактерий. Количество  микроорганизмов (КОЕ) в 1 г рассчитывали путем высева 0,1 мл различных разведений исследуемого материала на чашки Петри с плотными дифференциально-диагностическими  питательными  средами.

Количество выросших колоний эшерихий при посеве пробы feces (m=1,0 г), с последующим высевом на плотные дифференциально-диагностические среды составило при исследовании проб от суточных цыплят: для среды «МПА» – 0, «Эндо» – 0, «Rambach agar» – 0; от цыплят в возрасте 3 суток:  «МПА» – 3,98±0,78, «Эндо» – 4,06±0,11, «Rambach agar» – 4,12±0,12; при исследовании цыплят в возрасте 5 суток: «МПА» – 7,61±0,64, «Эндо» – 7,37±0,22, «Rambach agar» – 7,93±0,15; при исследовании цыплят в возрасте 15 суток: «МПА» – 8,71±0,37, «Эндо» – 8,89±0,15, «Rambach agar» – 9,22±0,52. Определение видового состава микроорганизмов на хромогенных средах позволило сократить расход пита­тельных сред, стерильной бактериологической посуды и времени проведе­ния анализа. Для количественного учета лактобактерий использовали среду «MRS agar», бифидобактерий – «Bifidobacterium agar». Количество лактобактерий в зависимости от возраста цыплят составило: 1 сут. – 4,21±0,31; 3 сут. – 4,94±0,35; 5 сут. – 6,47±0,34; 15 сут. – 9,42±0,38. Количество бифидобактерий составило: 1 сут. – 0; 3 сут. – 5,17±0,41; 5 сут. – 6,78±0,44; 15 сут. – 8,47±0,61.

Биохимическую идентификацию выделенных культур энтеробактерий выполняли с применением сред Гисса и набора «API 20E», предназначенного для ускоренной биохимической идентификации 104 таксонов грамотрицательных палочек в течение 18-24 ч. Тест-система состоит из прозрачной полимерной пластинки с 20 микропробирками объемом 0,25 мл, содержащими дегидратированные субстраты для определения 20 биохимических тестов. Результаты учитывали, заполняли бланки с кодами цифрового профиля, идентификацию проводили по кодам или идентификационной таблице.

3.4.2. Количественный и видовой состав бактерий в микробиоценозах кишечника птиц с синдромом желудочно-кишечных болезней

При исследовании количественного учета бактерий в микробиоценозах кишечника цыплят с синдромом желудочно-кишечных болезней были выявлены существенные отличия количественного и видового состава микрофлоры кишечника от нормы. Количество эшерихий при исследовании проб feces от суточных цыплят составляло – 3,73±0,18; проб от цыплят в возрасте 3 сут. –  5,54±0,17; проб от цыплят в возрасте 5 сут. –  7,50±0,21. Количество Salmonella enteritidis при исследовании проб feces от суточных цыплят составляло – 2,02±0,12; проб от цыплят в возрасте 3 сут. –  3,41±0,11; проб от цыплят в возрасте 5 сут. –  4,09±0,17. Количество Salmonella typhimurium при исследовании проб feces от суточных цыплят составляло – 1,77±0,45; проб от цыплят в возрасте 3 сут. –  2,74±0,31; проб от цыплят в возрасте 5 сут. –  3,79±0,31. Количество лактобактерий в зависимости от возраста цыплят составило: 1 сут. – 3,17±0,24; 3 сут. – 3,81±0,12; 5 сут. – 4,13±0,17. Количество бифидобактерий составило: 1 сут. – 0; 3 сут. – 4,11±0,13; 5 сут. – 5,42±0,26.

3.5. Результаты выделения энтеробактерий из патологического материала птиц с синдромом желудочно-кишечных болезней

При исследовании 50 проб патологического материа­ла и 50 проб feces птиц отряда Куриные мясной породы «Брама», яичной породы «Русская белая», мясо-яичной породы «Московская белая»; отряда Гусиные породы «Холмогорская»; отряда Перепела «Японская порода», а так же синантропных птиц отряда Голубиные в возрасте от 1 до 15 суток установлено, что при желудочно-кишечных болезнях доминировали культуры микроорганизмов, отнесенные к видам: Escherichia coli – 41,2 %; Salmonella typhimurium – 12,8 %; Salmonella enteritidis – 10,7 %; Staphylococcus aureus – 11,8 %; Enterococcus faecalis – 10,7 %; Proteus vulgaris – 7,9 %; Enterococcus faecium – 4,9 % (табл. 6).

При серологической идентификации 24 культур сальмонелл, выделенных из патологического материала и feces птиц 11 изолятов (45,8 %) были отнесены к Salmonella enteritidis, 13 изолятов (54,2 %) к Salmonella typhimurium. В результате серологической идентификации культур сальмонелл, выделенных при бактериологическом исследовании патологического материала и feces птиц породы «Брама», 3 изолята (23,2 %) были отнесены к Salmonella typhimurium, 2 изолята (18,2 %) к Salmonella enteritidis; породы «Русская белая» 3 изолята (23,2 %) были отнесены к Salmonella typhimurium, 2 изолята (18,2 %) к Salmonella enteritidis; породы «Московская белая» 2 изолята (15,2 %) были отнесены к Salmonella typhimurium, 3 изолята (27,2 %) к Salmonella enteritidis; «Холмогорской» породы 2 изолята (15,2 %) были отнесены к Salmonella typhimurium, 2 изолята (18,2 %) к Salmonella enteritidis; «Японская порода» 3 изолята (23,2 %) были отнесены к Salmonella typhimurium, 2 изолята (18,2 %) к Salmonella enteritidis  (табл. 7).

Таблица 6

Видовой состав патогенных и условно-патогенных бактерий, выделенных из патологического материала птиц

Вид бактерий

Соотношение видов бактерий

Количество выделенных культур микроорганизмов

Сердце

Печень

Легкие

Селезенка

Трубчатая кость

Feces

Абс.

%

Абс.

%

Абс.

%

Абс.

%

Абс.

%

Абс.

%

Абс.

%

Escherichia

coli

42

41,2

9

21,4

10

23,8

3

7,2

1

2,4

1

2,4

18

42,8

Salmonella

enteritidis

11

10,7

-

-

6

54,6

-

-

-

-

-

-

5

45,4

Salmonella

typhimurium

13

12,8

-

-

9

69,2

-

-

-

-

-

-

4

30,8

Proteus

vulgaris

8

7,9

1

12,5

1

12,5

3

37,5

-

-

-

-

3

37,5

Enterococcus

faecalis

11

10,7

2

18,2

5

45,5

-

-

-

-

-

-

4

36,3

Enterococcus

faecium

5

4,9

1

20

2

40

-

-

-

-

-

-

2

40,0

Staphylococcus

aureus

12

11,8

2

16,6

2

16,6

2

16,6

1

8,3

3

33,6

2

16,6

Всего

102

100

Общее количество

изолятов, выделенных

из органов

15

14,8

35

34,5

8

8,1

2

2,1

4

3,1

38

37,4

Таблица 7

Результаты серологической идентификации

микроорганизмов рода Salmonella

Порода птицы

Количество выделенных штаммов, %

Salmonella typhimurium

Salmonella enteritidis

Отряд Куриные:

Мясная порода «Брама»

23,2

18,2

Яичная порода

«Русская белая»

23,2

18,2

Мясо-яичная порода «Московская белая»

15,2

27,2

Отряд Гусиные:

«Холмогорская порода»

15,2

18,2

Отряд Перепела:

«Японская порода»

23,2

18,2

3.6. Определение серогрупповой принадлежности

и адгезивных антигенов E.coli

Серогрупповую принадлежность культур E.coli определяли в реакции агглютинации антигена с диагностическими О-коли сыворотками. При определении серогрупповой принадлежности эшерихий агглютинирующими поливалентными и моновалентными сыворотками было идентифицировано 28 изолятов (66,6 %). Среди изолятов, реагирующих с поливалентной сывороткой «группы №1», обнаружены серогруппы О2, О1, О15, О78.  К серогруппе О2 отнесены 9 изолятов (32,14 %), к О1 – 6 (21,43 %), к О15 – 7 (25,0 %), к О78 – 6 (21,43 %). 

При серологической идентификации культур эшерихий, выделенных при бактериологическом исследовании патологического материала и feces сельскохозяйственной птицы породы «Русская белая», 4 изолята (44,5 %) были отнесены к серогруппе О2, 2 изолята (33,3 %)  к серогруппе О1; породы «Московская белая» 2  изолята (22,2 %) были отнесены к серогруппе О2,  2 изолята (28,6 %) к серогруппе О15, 2  изолята (33,3 %) к серогруппе О78; «Холмогорской» породы 2 изолята (28,6 %) были отнесены к серогруппе О15.

При серологической идентификации изолятов эшерихий, выделенных от синантропных птиц семейства «Голубиные», установлено, что к серогруппе О2 отнесено 3 изолята (33,3 %); к серогруппе О1 – 4 изолята (66,7 %); к серогруппе О15 – 3 изолята (42,9 %); к серогруппе О78 – 4 изолята (66,7 %). Из 42 изолятов E. coli 33,4 % не удалось типировать набором стандартных «О-коли сывороток».

Для определения адгезивных антигенов эшерихий использовали агглютинирующие сыворотки К88, К99, 987Р, F41 и А20 в реакции агглютинации (РА) на стекле. Микроорганизмы культивировали на скошенном МПА или агаре Хоттингера для выявления антигенов К88, 987Р, A20 и на среде Минка – для обнаружения антигенов К99, F41. Реакцию учитывали в течение одной минуты при легком покачивании стекла при температуре 18-28 С. Контролем служила испытуемая культура, смешанная с каплей физиологического раствора (pH 7,2-7,4) и с каплей кроличьей сыворотки, разведенной 1:10 (для  исключения  самоагглютинации).  Положительная реакция характеризовалась склеиванием бактериальных клеток в зерна или хлопья различной величины и полным или частичным просветлением сыворотки при отсутствии агглютинации в контроле. Реакцию учитывали сначала с комплексной сывороткой и в случае положительной реакции исследовали культуры, выращенные на МПА или среде Хоттингера, с сыворотками К88, 987Р и А20, а культуры со среды Минка – с К99 и F41.

При определении адгезивных антигенов изолятов E. coli, выделенных из feces и патологического материала сельскохозяйственной и синантропной птицы, установлено, что из 9 изолятов, отнесенных к серогруппе О2, адгезивными свойствами обладали 4 изолята (О2:K99 – 1, O2:987P – 1, O2:F41 – 1, O2:A20 – 1); из 6 изолятов, отнесенных к серогруппе О1, адгезивными свойствами обладали 3 изолята (O1:A20 – 3); из 7 изолятов, отнесенных к серогруппе О15, адгезивными свойствами обладали 4 изолята (О15:K99 – 1, O15:A20 – 3); из 6 изолятов, отнесенных к серогруппе О78, адгезивными свойствами обладали 4 изолята (O78:K88 – 2, O78:A20 – 2) (табл. 8).

Таблица 8

Результаты оценки адгезивных антигенов E. coli

Вид микроорганизмов

(источник выделения, количество изолятов)

Адгезивная сыворотка (кол-во и % положительных результатов)

Комп-лекс

K88

K99

987P

F41

A20

  1. E.coli О1 (feces птиц)

4

2 (50,0)

-

-

-

-

-

-

-

-

2 (50,0)

  1. E.coli О2 (feces птиц)

6

3 (50,0)

-

-

1 (33,3)

1 (33,3)

-

-

1 (33,3)

  1. E.coli О15  (feces птиц)

4

2 (50,0)

-

-

-

-

-

-

-

-

2 (50,0)

  1. E.coli О78 (feces птиц)

3

3 (100,0)

1 (33,3)

-

-

-

2 (66,7)

  1. E.coli О1 (патматериал птиц)

2

1 (50,0)

-

-

-

-

-

-

-

-

1 (50,0)

  1. E.coli О2 (патматериал птиц)

3

1 (33,3)

-

-

-

-

-

-

1 (33,3)

-

-

  1. E.coli О15 (патматериал птиц)

3

2 (66,6)

-

-

1 (33,3)

-

-

-

-

1 (33,3)

  1. E.coli О78 (патматериал птиц)

3

1 (33,3)

1 (33,3)

-

-

-

-

-

-

-

-

Всего:

28

15 (53,6)

2 (13,3)

2 (13,3)

1 (6,66)

1 (6,66)

9 (60,0)

При определении гемолитической активности изолятов E.coli учитывали степень образования на 5%-м кровяном агаре зон просветления среды. Установлено, что характерной -гемолитической активностью обладали 8,0 % изученных изолятов E. coli.

 

3.7. Результаты изучения свойств энтеробактерий,

доминирующих при желудочно-кишечных болезнях птиц

3.7.1. Изучение антагонистической активности

При исследовании межвидового антагонизма использовали  общепринятые методы исследования: перпендикулярных штрихов; агаровых блочков, находящихся в центре мембранного фильтра, а также с  использованием мембранных фильтров. Суть методики состоит в способности биологически активных веществ, продуцируемых микробами-антагонистами, диффундировать через мембранные фильтры в слой питательной среды. Культуру изучаемого микроорганизма в количестве 0,5 мкл и концентрации 107–108 кл/мл наносили в виде капли в центр мембранного фильтра, помещенного на поверхность плотной питательной среды, и культивировали при оптимальных для данного микроорганизма условиях. Затем мембранные фильтры удаляли с поверхности плотной питательной среды, и на то же место помещали новые мембранные фильтры, на поверхность которых наносили взвесь исследуемых тест-штаммов патогенных бактерий в той же концентрации. Контролем служил рост культур, не подвергшихся воздействию БАВ. После воздействия биологически активных веществ на поверхностях мембранных фильтров выявляли рост культуры бактерий в виде пятна различной плотности и величины. Для определения антагонистической активности микроорганизмов применение мембранных фильтров позволяет проводить количественную оценку степени ингибирования штамма-антагониста, с применением хромогенных сред представляется возможным определять антагонистическую активность микроорганизмов, относящихся к разным систематическим группам. Кроме того, на одной чашке Петри можно проводить исследования антагонистической активности 3-4 штаммов-антагонистов к 9-24 тест-культурам.

При изучении антагонистической активности микрорганизмов установлено, что изученные культуры микроорганизмов  E. coli угнетали рост S. typhimurium с зоной задержки роста 1,4±0,1 мм; S. enteritidis – 1,6±0,1 мм; C. freundii – 1,5±0,2 мм; P. mirabilis – 0,6±0,1 мм; K. pneumonia – 1,3±0,1 мм (табл. 9).

Таблица 9

Результаты изучения антагонистической активности бактерий

Вид микроорганизма

Зона задержки роста, мм

1

2

3

M±m

t

td

Salmonella typhimurium

1,4

1,3

1,5

1,4±0,1

24,249

1,65

Salmonella enteritidis

1,6

1,5

1,7

1,6±0,1

27,713

1,85

Citrobacter freundii

1,3

1,5

1,7

1,5±0,2

12,99

2,0

Proteus mirabilis

0,7

0,5

0,6

0,6±0,1

10,392

0,85

Klebsiella pneumonia

1,2

1,4

1,3

1,3±0,1

22,517

1,55

  Примечание: t - доверительный коэффициент;  td – коэффициент достоверности различий средних величин

3.7.2. Изучение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам изучали методами серийных разведений, диффузии в агар, а также с использованием микробиологического анализатора «MicroTax». Бактериальную суспензию из 18-часовой культуры  готовили  в  3-5 мл изотонического раствора  0,9%-ного NaCl по оптическому стандарту мутности "McFarland" 0,5. Подготовленную бактериальную суспензию в количестве 10 мкл переносили в 10 мл среды "Isosensitest". Из среды "Isosensitest" в определенные лунки планшета вносили по 100 мкл бактериальной суспензии, планшет инкубировали в термостате 18-24 ч при 35-37 C. Затем производили учет результатов на микробиологическом анализаторе "MicroTax Rider".

Антибиотикорезистентность микроорганизмов определяли с помощью методик: «Оценка критической дозы ("Break-point")», «Оценка минимальной ингибирующей концентрации ("МИК")». При отсутствии роста в минимальной и максимальной концентрациях антибиотика микроорганизмы считали чувствительными к препарату. При наличии роста при минимальной концентрации антибиотика чувствительность микроорганизма к препарату являлась промежуточной. Если рост наблюдался при минимальной и максимальной концентрациях антибиотика, микроорганизмы считали устойчивыми к препарату. Минимальной ингибирующей концентрацией считали минимальную концентрацию антибиотика, которая ингибирует рост микроорганизмов.

При изучении чувствительности к антибиотикам из 42 изученных изолятов  E. coli 9 (21,4 %) были чувствительны к антибиотикам группы цефалоспоринов (цефазолин, цефатоксим); 8 (19,1%) – группы фторхинолонов (офлоксацин, ципрофлоксацин); 7 (16,7 %) – группы аминогликозидов (канамицин, амикацин); 9 (21,4 %) были устойчивы к антибиотикам группы макролидов (эритромицин, олеандомицин); 9 (21,4 %) – к группе природных пенициллинов (оксациллин). Из 24 изолятов сальмонелл  6 (25,0 %) были чувствительны к антибиотикам группы цефалоспоринов (цефазолин, цефатоксим); 5 (20,8 %) – группы фторхинолонов (офлоксацин, ципрофлоксацин); 3 (12,5 %) – группы аминогликозидов (канамицин, амикацин); 6 (25,0 %) – были устойчивы к антибиотикам группы макролидов (эритромицин, олеандомицин); 4 (16,7 %) – группы природных пенициллинов (оксациллин) (табл. 10).

Таблица 10

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам

Антибактериальный препарат

Чувствительность микроорганизма

Escherichia coli

Salmonella enteritidis

Salmonella typhimurium

I*

II*

I*

II*

I*

II*

Цефазолин

10,5

-

18,2

-

7,7

-

Цефатоксим

10,9

-

18,2

-

7,7

-

Офлоксацин

8,3

-

9,1

-

15,4

-

Ципрофлоксацин

10,8

-

9,1

-

7,7

-

Канамицин

7,8

-

9,1

-

-

-

Амикацин

8,9

-

9,1

-

7,7

-

Эритромицин

-

16,3

-

9,1

-

15,4

Олеандомицин

-

5,1

-

18,2

-

7,7

Оксациллин

-

21,4

-

-

-

7,7

Примечание: I* – % чувствительных микроорганизмов; II* – % устойчивых микроорганизмов

3.7.3. Изучение чувствительности микроорганизмов 

к дезинфицирующим средствам

При оценке чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему средству «Дезант» (1,6,3,8-диметано-1,3,6,8-тетраазациклодекан),  наряду с общепринятым методом диффузии в агар, нами были апробированы «Дип-слайды», предназначенные для бактериологического исследования поверхностей. При исследовании полимерную пластину слайда, покрытую плотной питательной средой, плотно прижимали к поверхности, а затем помещали в контейнер и культивировали при 37 °С 18-24 ч.  Дезинфекция признавалась удовлетвори­тельной, если зона задержки роста микроорганизмов вокруг лунок с дезинфицирующим препаратом составляла более 10 мм, во всех исследованных смывах и «Дип-слайдах» отсутствовал рост микроорганизмов S.typhimurium, S.enteritidis, E. coli. Применение «Дип-слайдов» «Oxoid», покрытых агаризированой средой и предназначенных для контроля качества дезинфекции поверхностей, позволяла выявлять уровень контаминации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae (табл. 11).

Таблица 11

Результаты изучения чувствительности микроорганизмов

к дезинфицирующему препарату «Дезант»

Вид микроорганизмов, № штамма

(источник выделения)

Метод исследования

Диффузия в агар

(зона задержки роста, мм)

Дип-слайды «Oxoid» (степень контаминации)

Концентрация препарата, %

2,0

2,5

3,0

2,0

2,5

3,0

S.typhimurium №5715 (референтный штамм)

13,70±2,31

15,20±1,76

16,90±2,33

++

-

-

S.typhimurium

(feces птицы)

14,30±1,83

15,00±2,30

16,20±1,89

++

-

-

S.typhimurium

(п/м)

13,90±2,17

14,80±3,10

15,70±2,44

++

-

-

S.enteritidis №204 (референтный штамм)

14,20±2,55

15,10±1,78

16,20±1,34

++

-

-

S.enteritidis

(feces птицы)

14,40±2,11

15,70±1,74

16,80±1,85

-

-

-

S.enteritidis

(патматериал птицы)

15,40±1,88

16,50±2,03

17,30±1,36

-

-

-

E.coli О115 №580

(референтный штамм)

15,70±1,19

16,40±1,84

17,80±1,86

++

-

-

E.coli О1

(feces птицы)

15,20±2,43

16,50±2,32

17,80±2,11

-

-

-

E.coli О2

(feces птицы)

16,90±2,62

17,40±1,24

18,30±1,55

-

-

-

E.coli О15

(feces птицы)

15,70±2,31

16,20±1,57

17,40±1,65

-

-

-

E.coli О78

(feces птицы)

14,70±1,77

15,70±2,21

16,80±2,32

++

-

-

Примечание: «-», «++» отсутствие контаминации, слабая контаминация соответственно

На основании результатов исследований установлено, что при желудочно-кишечных болезнях птицы в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта доминируют  культуры микроорганизмов, отнесенные к видам: Escherichia coli – 41,2 %; Salmonella typhimurium – 12,8 %; Salmonella enteritidis – 10,7 %. Этиологическая структура сальмонеллеза представлена видами: S. typhimurium (54,2 %); S. enteritidis (45,8 %); эшерихиоза, серогруппами – О2 (32,14 %), О15 (25,0 %), О1 (21,43 %), О78 (21,43 %), соответственно. При определении адгезивных антигенов установлено, что из 9 изолятов E. coli, отнесенных к серогруппе О2, адгезивными свойствами обладали 4 изолята (K99, 987P, F41, A20); из 7 изолятов, отнесенных к серогруппе О15, – 4 изолята (K99, A20); из 6 изолятов, отнесенных к серогруппе О1, – 3 изолята (A20); из 6 изолятов, отнесенных к серогруппе О78, – 4 изолята (K88, A20).

ВЫВОДЫ

1. На основе сравнительной оценки и подбора эффективных дифференциально-диагностических питательных сред и тест-систем из патологического материала и feces при желудочно-кишечных болезнях птиц выделено и идентифицировано 102 культуры микроорганизмов, отнесенных к видам: Escherichia coli – 41,2 %; Salmonella typhimurium – 12,8 %; Salmonella enteritidis – 10,7 %; Staphylococcus aureus – 11,8 %; Enterococcus faecalis – 10,7 %; Proteus vulgaris – 7,9 %; Enterococcus faecium – 4,9 %.

2. При серологической идентификации 24 изолятов микроорганизмов рода Salmonella, выделенных из патологического материала и feces птицы, 11 изолятов (45,8 %) были отнесены к Salmonella enteritidis, 13 (54,2 %) –  Salmonella typhimurium.

3. При определении серогрупповой принадлежности 42 изолятов E. coli, выделенных из патологического материала и feces, к серогруппе О2 отнесены 9 изолятов (32,14 %), О15 – 7 (25,0 %), О1 – 6 (21,43 %),  О78 – 6 (21,43 %), 33,4 %  изолятов не удалось типировать стандартным набором «О-коли сывороток».

4. При определении адгезивных антигенов микроорганизмов, выделенных из feces и патологического материала птиц, из 9 изолятов E. coli серогруппы О2 адгезивными свойствами обладали 4 культуры микроорганизмов: О2:K99 – 1, O2:987P – 1, O2:F41 – 1, O2:A20 – 1; из 7 изолятов серогруппы О15 – 4 изолята: О15:K99 – 1, O15:A20 – 3; из 6 изолятов серогруппы О1 - 3 культуры: O1:A20 – 3; из 6 изолятов серогруппы О78 – 4 изолята: O78:K88 – 2, O78:A20 – 2.

5. Установлено, что использование сред «Rambach agar», «XLT-4 agar», «Cromocult Coliform agar» позволяет с высокой специфичностью и в ускоренные сроки проводить индикацию и идентификацию сальмонелл и эшерихий.

6. Установлено, что применение иммунохроматографической тест-системы «Singlepath ® Salmonella» позволяет в течение 24 ч с учетом обогащения при первоначальной концентрации в исследуемом образце от 100 бактериальных клеток проводить индикацию микроорганизмов рода Salmonella.

7. Установлено, что из 42 изолятов E. coli 9 (21,4 %) были чувствительными к антибиотикам группы цефалоспоринов (цефазолин, цефатоксим); 8  (19,1 %) – группы фторхинолонов (офлоксацин, ципрофлоксацин); 7 (16,7 %) – группы аминогликозидов (канамицин, амикацин); 9 (21,4 %) – были устойчивы к антибиотикам группы макролидов (эритромицин, олеандомицин); 9 (21,4 %) –  группы природных пенициллинов (оксациллин).

8. Установлено, что из 24 изолятов  микроорганизмов рода  Salmonella 6 (25,0 %) были чувствительны к антибиотикам группы цефалоспоринов (цефазолин, цефатоксим); 5 (20,8 %) – группы фторхинолонов (офлоксацин, ципрофлоксацин); 3 (12,5 %) – группы аминогликозидов (канамицин, амикацин); 6 (25,0 %) – были устойчивы к антибиотикам группы макролидов (эритромицин, олеандомицин); 4 (16,7 %) –  группы природных пенициллинов (оксациллин)

9. Применение «Дип-слайдов» «Oxoid», покрытых агаризированой средой и предназначенных для контроля качества дезинфекции поверхностей, позволяет выявлять уровень контаминации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

  1. Использование сред «Rambach agar», «XLT-4 agar», «Cromocult Coliform agar»  при бактериологической диагностике сальмонеллеза и эшерихиоза позволяет при первичной идентификации дифференцировать колонии сальмонелл и эшерихий от таксономически сходных видов энтеробактерий.
  2. Для использования в научно-исследовательских учреждениях разработаны и изданы «Методические рекомендации по определению антагонистической активности микроорганизмов», утвержденные секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 8 от 22 июня 2010 года).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

  1. Плитов И.С. Сравнительная характеристика питательных сред для количественно-качественного учета энтеробактерий при дисбактериозе кишечника птиц  // Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания : Материалы Международной научной конференции студентов и молодых ученых. – М. : МГУПБ, 2009. – С. 287-288.
  2. Плитов И.С. Определение чувствительности энтеробактерий к антибиотикам и дезинфицирующим средствам // Ветеринария. – 2010. – № 12. – С. 42–45.
  3. Шурахова. Ю.Н. Этиологическая структура бактериальных болезней птиц по данным отчетов ветлабораторий Российской Фе­дерации за 2009 год // Ю.Н. Шурахова, И.С. Плитов, M.B. Калмыков, О.Н. Виткова // VI международный ветеринарный конгресс по пти­цеводству. – М., 2010. – С. 102-103.
  4. Ленченко Е.М. Сравнительная характеристика дифференциально-диагностических питательных сред для индикации возбудителей сальмонеллеза птиц // Е.М. Ленченко, И.С. Плитов // Аграрная наука. – 2011. – №3. – С. 26-28.
  5. Плитов И.С. Антагонистическая активность микроорганизмов при эшерихиозе птиц // Ветеринария. – 2011. – № 9. – С. 30-32.
  6. Плитов И.С. Индикация патогенных бактерий, циркулирующих в птицеводческих хозяйствах // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. – 2011. – №1 (5). – С. 63-65.

Подписано в печать 26.04.2012. Усл. печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ

МГУПП, 109316, Москва, ул. Талалихина, 33.

ООО «Франтера». 109316, Москва, ул. Талал ихина, 33.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.