WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном

На правах рукописи

образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет»

Научный консультант: доктор химических наук

, профессор Гармонов Сергей Юрьевич

Официальные оппоненты: Плетенева Татьяна Вадимовна доктор химических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», г. Москва, НГУЕН Чунг Зунг зав. кафедрой фармацевтической и токсикологической химии Егорова Светлана Николаевна доктор фармацевтических наук, профессор, Биофармацевтический анализ месалазина и ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», сульфаниламидов для оценки фенотипа зав. кафедрой фармации ФПК и ППС ацетилирования организма человека

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия Российской Федерации

Защита состоится «14» сентября 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.07 при ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» по адресу: 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, д.68, зал заседаний Ученого совета, А-330.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке кандидата химических наук ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет».

Автореферат разослан «27» июня 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Нугуманова Гульнара Наиловна Казань – 203

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

из организма человека для косвенного установления фенотипа ацетилирова ния.



Актуальность темы. Разработка методов анализа лекарственных веществ Для достижения поставленых целей решались следующие задачи:

(ЛВ) в биологических объектах для фармакокинетических исследований играет - изучение условий хроматографического разделения и режимов элюироважную роль в оценке биоэквивалентности, обеспечении безопасности, эффек- вания, расчет и оценка параметров пригодности хроматографической системы тивности и персонализации применения лекарственных средств (ЛС). при разработке методик определения месалазина, сульфаметаксазола и сульДля ЛВ, содержащих аминные функциональные группы, биотрансформа- фадиметоксина в моче и слюне;

ция осуществляется главным образом путем реакций N-ацетилирования, и у - выявление факторов, обеспечивающих чувствительность и избирательчеловека сформированы фенотипы быстрого и медленного метаболизма, раз- ность спектрофотометрических определений месалазина, сульфаметаксазола и личающиеся генетически детерминированной активностью N-ацетилтрансфе- сульфадиметоксина в моче и слюне в виде окрашенных производных с 7-хлорразы (NAT) гепатоцитов. При этом активность NAT является одним из важных 4,6-динитробензофуроксаном (ХБФО);

факторов, определяющим индивидуальные колебания концентрации ЛВ в ор- - оценка влияния компонентов анализируемой матрицы на регистрируеганизме пациентов, и, в конечном итоге, их ответ на многие ЛС, применяемые мый в условиях ВЭЖХ и спектрофотометрии аналитический сигнал, определепри ряде социально значимых заболеваний (инфекционных, сердечно- ние метрологических характеристик разработанных способов для подтверждесосудистой системы, органов дыхания, печени). ния их соответствия требованиям, принятым для фармацевтического анализа;

Наиболее часто фенотипирование NAT производится с помощью фарма- - проведение расчета и оценки фармакокинетических параметров тесткокинетических исследований выведения с мочой изониазида и сульфанила- препаратов ацетилирования у здоровых добровольцев, разработка способов мидов спектрофотометрическим методом с применением хромогенных реаген- установления активности NАТ при экскреции месалазина, сульфаметаксазола тов (карбонильные соединения, диазотирование с последующим азосочетанием и сульфадиметоксина с мочой и слюной;

и др.), однако существенными недостатками этих методик являются низкая - установление фармакокинетических параметров тест-препаратов окислечувствительность определений, малоизбирательность из-за сложного состава ния и ацетилирования у больных хроническим вирусным гепатитом В.

анализируемой матрицы, многостадийность и длительность. В тоже время Научная новизна работы:

оценка активности NAT методом высокоэффективной жидкостной хромато- - установлены условия хроматографического разделения месалазина, графии (ВЭЖХ) при определении кофеина в моче, гидразидов кислот и суль- сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в условиях обращено-фазной ВЭЖХ, фаниламидов в крови имеет ограничения по клиническому применению этого а также выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности теста у некоторых категорий больных. биофармацевтического анализа этих лекарственных веществ в биологических Перспективным направлением развития фармацевтической химии является жидкостях организма человека;

разработка неинвазивных подходов по биофармацевтическому анализу для - найдены и обоснованы рабочие условия высокочувствительного и избиустановления фармакокинетических параметров новых тест-препаратов ацети- рательного определения месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина лирования в моче и слюне. Это обуславливает необходимость создания изби- в моче и слюне методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектрированирательных, чувствительных, высокопроизводительных и доступных для кли- ем, оптимизированы способы их пробоподготовки при высокопроизводительнической практики методов количественного определения ЛВ в биологических ных аналитических определениях тест-препаратов процессов ацетилирования;

жидкостях. Этим требованиям удовлетворяют методы ВЭЖХ и спектрофото- - впервые показана возможность количественного определения месалазиметрии при использовании высокоизбирательных аналитических реагентов. на, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне спектрофотометПрименение комплекса этих методов позволяет решать сложные задачи, воз- рическим методом на основе реакции с 7-хлор- 4,6-динитробензофураксаном;

никающие при проведении фармакокинетических исследований, а также раз- - разработаны способы косвенного определения активности Nрабатывать алгоритмы персонализации фармакотерапии и оценивать влияние ацетилтрансферазы на основе оценки фармакокинетических параметров месаЛВ на активность ферментативных систем метаболизма. лазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина при их экскреции с мочой, Цель работы состояла в разработке методов хроматографического и спек- сульфадиметоксина в слюне с применением ВЭЖХ и спектрофотометрии и трофотометрического определения месалазина и сульфаниламидов в биологи- обосновано их использование для персонализации фармакотерапии;

ческих жидкостях, оценке фармакокинетических параметров при их выведении 5 - комплексом методов биофармацевтического анализа изучена фармакоки- Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертанетика тест-препаратов ацетилирования и окисления при хроническом вирус- ции были доложены и обсуждены на XVII, XVIII Российских национальных ном гепатите В. конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2010, 2011), 65 и 66-ой ВсероссийПрактическая значимость. Разработан комплекс методик спектрофото- ской конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2010, 2011), III метрического и хроматографического определения содержания месалазина, Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне. На их основе пред- (Краснодар, 2009), ХV Всероссийской научно-практической конференции ложены диагностические подходы для оценки индивидуальной активности «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2010), VII Съезде медицинских генеметаболической системы ацетилирования организма человека, которые могут тиков (Ростов на Дону, 2010), Всероссийской конференции "Аналитическая быть рекомендованы как лабораторные тесты при персонализированном при- хроматография и капиллярный электрофорез" (Краснодар, 2010), III региоменении лекарственных средств. нальной научно-практической конференции с международным участием «СинВнедрение результатов. Результаты исследования внедрены во Всерос- тез и перспективы использования биологически активных соединений» (Касийском Центре молекулярной диагностики и лечения Министерства здраво- зань, 2011), ХIХ Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Москва) и в град, 2011), III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезучебный процесс ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский ням (Москва, 2011).

технологический университет» в дисциплинах «Контроль качества лекарст- Публикации: Основные результаты диссертационной работы опубликовенных препаратов» и «Основы токсикологии». ваны в 17 печатных изданиях, включая 5 статей в рецензируемых изданиях, На защиту выносится: рекомендуемых для размещения материалов диссертаций, 1 статью в междуна- результаты исследования хроматографического разделения месалазина, родном журнале и 11 тезисов докладов.

сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в условиях обращено-фазной ВЭЖХ; Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзо- результаты изучения влияния состава и рН подвижной фазы, условий ра литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исэлюирования, данных по оценке пригодности предложенных хроматографиче- следований, их обсуждения, выводов, заключения, списка литературы, вклюских систем и свойств ЛВ на выбор условий избирательного и чувствительного чающего 261 источник. Работа изложена на 183 страницах машинописного детектирования месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина при их текста, иллюстрирована 38 рисунками и 30 таблицами.





анализе в моче и слюне; Личный вклад автора в опубликованных в соавторстве работах состоит в - обоснование и подбор оптимальных условий чувствительного и избира- выборе и обосновании методик эксперимента, непосредственном его проведетельного спектрофотометрического определения месалазина, сульфаметокса- нии, в участии во всей процедуре анализа и обобщении полученных эксперизола и сульфадиметоксина в виде производных с 7-хлор-4,6- ментальных результатов, расчете фармакокинетических параметров, установдинитробензофуроксаном в слюне и моче, способов пробоподготовки при ко- лении закономерностей и формулировке выводов.

личественных определениях этих тест-препаратов; Благодарности. Автор работы выражает глубокую благодарность к.х.н.

- результаты исследования метрологических характеристик разработанных Шитовой Н.С. за научные консультации и помощь в фармакокинетических способов определения, полученные путем обработки экспериментального ма- исследованиях и статистической обработке их результатов; д.х.н., профессору териала, подтверждающие их соответствие требованиям, принятым для био- Юсуповой Л.М. за синтез 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана, использованнофармацевтических методов анализа; го в работе; к.х.н. Салахову И.А и провизору-аналитику Хуснутдиновой А.Р. за - результаты расчета и анализа фармакокинетических данных месалазина, помощь в проведении хроматографических исследований.

сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в биологических жидкостях и опти- мизации критериев фенотипирования для экспрессной и точной оценки инди- видуальной активности ферментных систем; СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

- способы определения индивидуальной активности N-ацетилтрансферазы, осВ первой главе описан химизм метаболических процессов ацетилированованных на биофармацевтическом анализе фармакокинетических параметров мения; ферментные системы, участвующие в биотрансформации ксенобиотиков и салазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина;

биофармацевтические подходы по оценки их активности; современные методы - данные по фармакокинетике тест-препаратов ацетилирования и окислеколичественного определения ЛВ в биологических жидкостях человека, а такния при хроническом вирусном гепатите В.

же связь скорости ацетилирования с различными заболеваниями.

7 Во второй главе дано описание объектов, методов и средств исследования ЛВ в биологических жидкостях, схем и методик проведения экспериментов и расчета фармакокинетических параметров, способов статистической обработки результатов.

При выполнении работы были использованы следующие лекарственные средства: субстанция 5-аминосалициловой кислоты («Alfa Aesar», Germany), месалазин (таблетки по 0,4 г, «Сан Фармасьютикал Индастриз Лтд», Индия), субстанция сульфаметоксазола («Sigma-Aldrich», Switzerland), субстанция сульфадиметоксина («Sigma-Aldrich», Switzerland), сульфадиметоксин (таблетки по 0,5 г, OAO «Биосинтез», Россия), изониазид (таблетки по 0,3 г, «Акрихии», Россия)), субстанция антипирина («Sigma-Aldrich», Germany).

В работе использована система жидкостной хроматографии SHIMADZU (Япония) с программным обеспечением LC Solutin. Для контроля pH мобильной Рис. 1. Схема метаболизма месалазина и его пролекарств фазы использовали pH-метр фирмы Hanna (Румыния). В предварительных испыв организме человека таниях для определения спектров анализируемых веществ использовался сканирующий спектрофотометр SPECORD 40 фирмы AnalitykJena (Германия). Спектрофотометрические измерения также проводили на спектрофотометре СФ-26.

Биофармацевтический анализ мочи и слюны здоровых добровольцев и больных проводился при участии зав. каф. инфекционных болезней КГМУ, д.м.н., профессора Фазылова В.Х. и д.м.н., доцента Кравченко И.Э.

Фармакокинетическая и статистическая обработка результатов проводилась при использовании компьютерных программ Statistika 6, Excel, M-IND и Mathcad 11.

В третей главе приведены результаты разработки методов определения , нм , нм тест-препаратов ацетилирования: сульфаметоксазола и месалазина в моче, Рис. 2. Спектр поглощения сульфади- Рис. 3. Спектр поглощения сульсульфадиметоксина в моче и слюне методом ВЭЖХ и спектрофотометрии.

метоксина (5 мкг/мл) в смеси ацето- фаметоксазола (10 мкг/мл) в смеМесалазин (5-аминосалициловая кислота) и сульфаниламиды (сульфаменитрил - 0,5 % раствор ортофосфор- си ацетонитрил - 0,02 М раствор таксазол и сульфадиметоксин) были использованы в качестве тест-препаратов ной кислоты (15:85 об. %). гидрофосфата натрия pH=6,2 (3:ацетилирования в связи с их широким применением как антибактериальных об. %).

средств, обладающих оптимальной фармакокинетикой (быстрая всасываемость в желудочно-кишечном тракте, создание широкого диапазона концентраций в Рис. 4. Спектр поглощения месабиологических жидкостях), а также потенциальной возможностью оценки гелазина (10 мкг/мл) в смеси ацетонетической детерминированности процессов их метаболизма в моче и слюне.

нитрил - 0,05 % водный раствор Месалазин является активным метаболитом при биотрансформации ряда ЛС трифторуксусной кислоты (10:(cульфасалазин, олсалазин, балсалазид) (рис. 1), что определяет необходимость % об).

, нм персонализации их применения путем оценки фенотипа ацетилирования.

В качестве универсального метода определения тест-препаратов в биоло- гических жидкостях использована ВЭЖХ. Выбранные длины волн позволили Для определения месалазина использовали бинарную ПФ, состоящую из определить каждое из исследуемых соединений на длине волны максимально- смеси ацетонитрила и раствора трифторуксусной кислоты. Этот элюент позвого поглощения или близкой к ней (рис. 2-4). При аналитических длинах волн в ляет хроматографировать 5-аминосалициловую и 4-аминосалициловую (внутусловиях ВЭЖХ также наблюдалось поглощение биогенных компонентов ренний стандарт) кислоты в виде симметричных пиков на обращено-фазном слюны и мочи неустановленной природы в УФ-области спектра (рис. 5-7). сорбенте C16, что объясняется, по видимому, более резким изменением селек9 тивности колонки вследствие модификации силанольных активных центров (Pecosphere C-8 и C18, XTerra RP-18, CYANO) с использованием той же ПФ поверхности. При этом использовали изократическое элюирование, которое разделения достичь не удалось.

является более экономичным и поэтому более предпочтительным при опреде- Правильность ВЭЖХ определений ЛВ в моче и слюне была оценена с ислении одного соединения. пользованием метода «введено-найдено», что демонстрирует отсутствие мешающего влияния компонентов мочи на результаты определений (табл. 1).

Рис. 5. Хроматограммы: месалазин (1) и 4-аминосалициловая кислота (2). I – стандартные растворы. II - в моче человека. ПФ: ацетонитрил - 0,05 % раствор Рис. 7. Хроматограммы: сульфаметоксазола (1) и внутреннего стандарта трифторуксусной кислоты (10:90, об. %), скорость потока 1 мл/мин. Discovery антипирина (2). I - стандартные растворы, II - в моче человека. ПФ: ацетонитRP Amide C16 150 4,6 мм, 40С, =300 нм. Содержание аналитов 10 мкг/мл.

рил - 0,02 М гидрофосфат натрия, pH=6,2 (3:97, об.%), 1 мл/мин. Discovery RP Amide C16 150 4,6 мм, 40 С, =269 нм. Концентрация всех аналитов мкг/мл Таблица 1. Результаты определения сульфадиметоксина, сульфаметоксазола и месалазина в биологических жидкостях методом ВЭЖХ (n=6), p=0,Лекарственные Объект Введено, Найдено, RSD вещества анализа мкг/мл мкг/мл 0,50 0,49±0,02 0,2,00 2,01±0,06 0,Моча 5,00 5,02±0,07 0,Рис. 6. Хроматограммы сульфадиметоксина: I – стандартный раствор, II - в 10,00 9,98±0,07 0,моче человека. ПФ: ацетонитрил - 0,5 % раствор фосфорной кислоты (15:85, Сульфадиметоксин 0,25 0,25±0,01 0,об. %). Discovery RP Amide C16 150 4,6 мм, 40 С, =270 нм, скорость потока Слюна 0,50 0,50±0,01 0,1 мл/мин. Концентрация 5 мкг/мл.

2,00 1,98±0,09 0,Была исследована возможность использования фосфорной кислоты и бу- 5,00 5,03±0,11 0,ферных растворов на ее основе в качестве элюентов при определении сульфа1,00 0,98±0,06 0,ниламидов в биологических жидкостях. В этом случае отсутствует поглощение 5,00 4,96±0,07 0,Сульфаметоксазол Моча компонентов ПФ в области коротких длин волн, что позволяет повысить чув10,00 10,10±0,08 0,ствительность определений. При использовании ПФ ацетонитрил - 0,5 % фос15,00 14,96±0,09 0,форная кислота (15:85, об. %), ацетонитрил - 0,02 М гидрофосфат натрия 1,00 1,1±0,06 0,pH=6,2 (3:97, об. %) на колонке Discovery RP Amide C16 пики ЛВ хорошо раз5,00 4,92±0,12 0,Месалазин Моча деляются с компонентами мочи. На других обращенно-фазных колонках 10,00 10,10±0,11 0,15,00 14,92±0,10 0,11 Количественное определение ЛВ проводилось методом внешнего стандар- В фармацевтическом анализе одним из подходов улучшения аналитичета по площади пика для сульфадиметоксина и внутреннего стандарта для ских свойств ЛВ при спектрофотометрических определениях является получесульфаметоксазола и месалазина. В интервале 0,1 мкг/мл - 20 мкг/мл линейные ние их производных. Сравнительное сопоставление существующих подходов градуировочные зависимости аналитического сигнала от содержания иссле- позволило выявить перспективу использования реакций ЛВ, содержащих дуемых ЛВ записываются следующим образом: аминные функциональные группы с хлординитрозамещенными бенз-2,1,3для сульфадиметоксина S (mAU*s)=1,504Cx (мкг/мл) (R2 = 0,9999, n = 15, оксадиазола. Среди них - 7-хлор-4,6-динитробензофуроксан (ХБФО), обла% RSD=0,68); дающий высокой реакционной способностью и контрастностью полос поглодля сульфаметоксазола S(mAU*s) = 0,775CX (мкг/мл) (R2 = 0,9999, n = 15, щения с ариламинами. ХБФО был использован в работе для определения меса% RSD=1,63); лазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне. Было устадля месалазина S(mAU*s) = 2,119CX (мкг/мл) – 5,285 (R2 = 0,9999, n = 15, новлено, что исследованные ЛВ образуют азот-углерод связанные, интенсивно % RSD=1,54). окрашенные продукты аналитических реакций Оценка ключевых показателей валидационных параметров предложенных условий разделения выявила перспективу их использования для определения сульфадиметоксина, сульфаметоксазола и месалазина в биологических жидкостях (табл. 2).

Таблица 2. Результаты валидации методик определения лекарственных веществ в моче и слюне методом ВЭЖХ Сульфа- СульфаПараметры Критерии Месалазин диметоксин метоксазол Rs1,5 Rs=2,0 Rs=1,8 Rs=1,Пригодность N не менее хроматографи- 2000 т.т. N=3000 т.т. N=2842 т.т. N=2780 т.т.

ческой системы Симметрия Максимумы поглощения производных ЛВ находятся в интервале 480-5пика: 0,8 – 2,0 1,39 1,34 1,нм, при этом их положение и интенсивность определяются природой раствоСпецифичность Полное разделение пиков рителя и рН среды (рис. 8,9). Было установлено, что добавки органических Линейность R2 не менее R2=0,9999 R2=0,9999 R2=0,9999 растворителей при проведении реакции влияют на устойчивость продуктов и калибровки 0,9интенсивность их полос поглощения, что может быть связано с обеспечением Интервал оптимальной растворимости продуктов реакции и степени ее завершения.

определяемых - 0,1-20 0,1-20 0,1-20 Была изучена возможность определения тест-препаратов в биологических содержаний, жидкостях. Как пример, на рис. 10 представлены спектры поглощения раствомкг/мл ров реагента, его смеси с образцом мочи и продукта аналитической реакции с Метод «введесульфадиметоксином. Из представленных спектрально-аналитических данных Правильность но-найдено» %RSD=2,25 %RSD=2,25 %RSD=3,видно, что в условиях анализа при = 490-500 нм влияние реагента и мочи на %RSDполосы поглощения продукта реакции весьма незначительно. Его можно полПредел ностью исключить, включив эти компоненты в состав раствора сравнения при обнаружения, - 0,03 0,03 0,спектрофотометрическом детектировании, а также возможно использование мкг/ мл трихлоруксусной кислоты для удаления мешающих компонентов в моче.

Метод Метод Метод Таким образом, такое изменение пробоподготовки позволяет проводить Воспроизводи- внешнего внутреннего внутреннего избирательные и чувствительные спектрофотометрические определения суль%RSDмость стандарта, стандарта, стандарта, фаниламидов и месалазина в биологических жидкостях.

%RSD=0,68 %RSD=1,63 %RSD=1,13 Рис. 12. Устойчивость продукта 7-хлор- Рис. 13. Влияние концентрации Рис. 8. Спектры поглощения 4,6- Рис. 9. Спектры поглощения 4,64,6-динитробензофуроксана (1,5·10-4М) с реагента на аналитический сигнал динитробензофуроксановых производ- динитробензофуроксановых промесалазином в смеси ДМСО-вода (5:95 при проведении реакции с месаланых сульфадиметоксина (4.10-5 М): 1 - изводных месалазина (3.10-5 М): зином (3·10-5М) в смеси диметилоб.) во времени, =500 нм, pH=6,8, l=1 см этанол-вода (50:50, об.%); 2 – то же - в воде; 2 - этанол-вода (30:70, об.

сульфоксид-вода (5:95 об. %), (30:70, об. %); 3 - ацетонитрил-вода %), 3 - ацетонитрил-вода (30:70, =500 нм, pH=6,8, l=1 см (30:70, об.%); 4 - диметилсульфоксид- об.%), 4 - диметилсульфоксидвода (5:95, об.%); 5 – этанол-вода (5:95, вода (30:70, об. %), 5 – то же Правильность спектрофотометрических определений сульфадиметоксина, об.%); 6 -в воде, pH=6,8, l=1 см (5:95, об. %), pH=6,8, l=1 см сульфаметоксазола и масалазина в биологических жидкостях была оценена методом «введено – найдено». Полученные данные показывают, что при выбранных условиях детектирования компоненты мочи и слюны не оказывают мешающего влияния на спектрофотометрические определения аналитов (табл.

3).

Оценка ключевых показателей валидационных параметров предложенных условий спектрофотометрического анализа выявила перспективу их использования для определения сульфадиметоксина, сульфаметоксазола и месалазина в биологических жидкостях (табл. 4).

Рис. 10. Спектры поглощения: 1 - Рис. 11. Зависимость оптической плотХБФО (1,5·10-4 М) в ацетонитриле, 2 - ности от рН при проведении реакции Таблица 3 Результаты определения лекарственных веществ в биологичекомпоненты мочи и ХБФО (1,5·10- 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана ских жидкостях методом «введено-найдено» (n=5, р=0,95) М) в присутствии трихлоруксусной (1,5·10-4М) и сульфаметоксазола (3·10-Лекарственные Объект Введено, Найдено, кислоты (10-2М), 3 - динитробензо- М) в воде, =490 нм, l=1 см RSD вещества анализа мкг/мл мкг/мл фуроксановое производное сульфа3,12 3,04±0,10 0,метоксазола (3·10-5 М) в воде, pH=6, Моча 6,24 6,12±0,19 0,8, l=1 см 9,36 9,27±0,17 0,Сульфадиметоксин Для выбора оптимальных условий определений изучено влияние кислот- 4,68 4,64±0,15 0,ности реакционной среды, концентрации реагента и устойчивости производ- Слюна 7,80 7,82±0,10 0,ных во времени. Как видно, наиболее полное образование производного и мак10,92 10,95±0,10 0,симальная интенсивность светопоглощения наблюдается в интервале pH 6-1,28 1,27±0,07 0,при двух и более кратном избытке реагента (рис. 11-13). Светопоглощение 2,56 2,36±0,09 0,Сульфаметоксазол Моча аналитической смеси повышается первые 3 мин. В течение дальнейших трех 5,12 5,10±0,12 0,часов величина оптической плотности сохраняется на одном уровне, что де7,68 7,72±0,07 0,монстрирует устойчивость производных во времени.

0,32 0,35±0,02 0,0,77 0,81±0,03 0,Месалазин Моча 1,53 1,50±0,04 0,4,6 4,62±0,07 0,15 Таблица 4. Результаты валидации методик спектрофотометрического определения лекарственных веществ в моче и слюне Сульфади- СульфамеПараметры Критерии Месалазин метоксин токсазол Контрастность Не менее полос поглоще- 90 80 70 Рис. 14. Фармакокинетические кривые Рис. 15. Фармакокинетические ния, нм кумулятивной экскреции сульфадиме- кривые кумулятивной экскреции Стабильность,час - 3 3 токсина с мочой после перорального сульфаметоксазола с мочой после Правильность %RSD 6 %RSD = 3,04 %RSD = 2,84 %RSD = 2,однократного приема в дозе 0,5 г: 1- перорального приема в дозе 0,4 г:

R2 = 0,999 R2 = 0,995 R2 = 0,9быстрый фенотип; 2- медленный фено- 1-быстрый фенотип; 2- медленный Линейность и R2 не менее А=0,1594Сх А = 0,08Сх А = 0,147Сх тип ацетилирования фенотип ацетилирования калибровочная 0,990 (мкг/мл) + (мкг/мл) + (мкг/мл) + кривая 0,0012 0,034 0,00Были рассчитаны фармакокинетические параметры кумулятивного вывеИнтервал опредения сульфадиметоксина, сульфаметоксазола и месалазина с мочой. Для быделяемых содер- - 0,32 – 4,6 0,312 – 9,36 0,512 –5,стрых ацетиляторов характерны более низкие значения площади под фармакожаний, мкг/мл кинетической кривой, времени полувыведения ЛВ и более высокие значения Предел обнаруконстанты элиминации, объема распределения, чем для медленных ацетилято- 0,1 0,09 0,жения, мкг/мл ров (табл. 5-7). Разница в периоде полувыведения и количестве выводимого 103 2,4.104 2,5.104 3,8.1, л. мол-1. см-препарата для пациентов одной и той же группы объясняется, по-видимому, вариациями функционального состояния желудочно-кишечного тракта и друПолученные результаты позволяют сделать вывод о значительных прегими факторами среды.

имуществах разработанных методик определения тест-препаратов в биожидкоНа рис. 17 представлено содержание сульфадиметоксина в слюне. Устастях перед другими, уже известными из литературы. Это связано, прежде всеновление фенотипа ацетилирования возможно путем анализа почасовых проб го, с быстротой, точностью, прецезионностью анализа и возможностью его слюны через 24 час после приема тест-препарата. Полученные кинетические широкого клинического использования.

данные по моче и слюне коррелируют между собой.

С помощью комплекса разработанных методик обследованы здоровые добровольцы и оценено их распределение на медленный и быстрый фенотипы.

По нашим данным соотношение ацетиляторных фенотипов у здоровых добровольцев составляет 55% медленных и 45% быстрых ацетиляторов, что согласуется со сведениями из литературы. По этим результатам рассчитаны фармакокинетические параметры (табл. 5-7). Контрольное определение фенотипа ацетилирования у здоровых добровольцев проводилось с помощью тест-препарата изониазида.

Полученные данные позволяют использовать в качестве критерия для фенотипирования ацетилирования указанные параметры, из которых наиболее Рис. 16. Фармакокинетические кривые Рис. 17. Уровень содержания сульудобным является оценка фракции дозы тест-препарата.

кумулятивной экскреции месалазина с фадиметоксина в слюне после пероФармакокинетические кривые кумулятивной экскреции ЛВ с мочой примочой в разовой дозе 800 мг в виде рального однократного приема в ведены на рис. 14-16. Как видно, установление количества ЛВ позволяет сулекарственной формы месакола: 1 - дозе 500 мг. 1 - быстрый фенотип, 2-.

дить о фенотипе ацетилирования обследуемых. При этом уровень выводимого быстрый фенотип; 2-медленный фе- медленный фенотип ацетилирования ЛВ для быстрых и медленных ацетиляторов различается более чем в два раза.

нотип ацетилирования 17 Таблица 5. Фармакокинетические параметры экскреции сульфадиметокси- В четвертой главе описаны взаимоcвязи скорости окисления и ацетилирона с мочой (доза 0,5 г) у здоровых добровольцев (Mean±SD) вания тест-препаратов метаболизма при хроническом вирусном гепатите В (ХВГВ). По имеющимся литературным данным соотношение фенотипов в разФенотип ацетилирования Параметр P* ных этнических группах отличается, поэтому при формировании группы приБыстрый Медленный давалось значение ее однородности, которую составляли лица европейской Число добровольцев 20 популяции, проживающие в Республике Татарстан. При этом быстрое ацетиАктивность NАТ (фракция лирование является преобладающим (67 %), что свидетельствует об предрас4,20,7 9,91,8 P<0,0дозы изониазида, %) положенности лиц с быстрым фенотипом к ХВГВ и согласуется с литературP<0,AUC, мкгч/мл 242505060 5437672ными данными (рис. 18, табл. 8).

Kel, ч-1 P<0,0,1300,014 0,070 0,0Vd, мл P>0,205 66 146Фракция дозы сульфадиме6,40,7 13,31,4 P<0,0токсина за 24 часа, % Таблица 6. Фармакокинетические параметры экскреции сульфаметоксазола с мочой (доза 0,4г) у здоровых добровольцев (Mean±SD) Фенотип ацетилирования Параметр P* Быстрый Медленный Число добровольцев 20 Активность NАТ (фрак- Рис. 18. Соотношение фенотипов ацети- Рис. 19. Соотношение фенотипов окис3,90,4 9,10,8 P<0,0ция дозы изониазида, %) лирования: 1 - больные ХВГВ (n=24), 2 - ления: 1 - больные ХВГВ (n=24), 2- здоздоровые добровольцы (n=110) ровые добровольцы (n=40) P<0,AUC, мкгч/мл 131041772 4221773Kel, ч-1 P<0,0,360,03 0,19 0,Больные ХВГВ по активности цитохромов P450 распределяются на две T1/2, ч P<0,2,010,21 5,000,фенотипические группы (рис. 19): средний (37%) и медленный фенотип окисVd, мл P>0,84 24 94ления (63%) в сравнении со здоровыми, которые распределяются тримодально:

Фракция дозы сульфаме4,40,7 9,42,4 P<0,05 быстрый (21%), средний (43%) и медленный фенотип (36%). У больных ХВГВ токсазола за 8 часов, % с увеличением длительности и прогрессирования заболевания замедляется элиминация тест-препарата окисления антипирина. Активность NАТ у больТаблица 7. Фармакокинетические параметры экскреции месалазина с ных ХВГВ в группах медленных и средних фенотипов окисления не имеет стамочой (доза 0,8г) у здоровых добровольцев (Mean±SD) тистически значимых различий.

Фенотип ацетилирования Параметр P Таблица 8. Фармакокинетические параметры тест-препарата Быстрый Медленный ацетилирования изониазида у больных ХВГВ (p<0,001) Число добровольцев 18 Активность NАТ (фракция Фармакокинетические Быстрое ацетили- Медленное аце3,10,2 9,41,4 P<0,0дозы изониазида, %) параметры рование (n=16) тилирование(n=8) P<0,0AUC, мкгч/мл 121233941 2947777Площадь под фармакокинетиче244902300 91500132Kel, ч-1 P<0,00,5500,063 0,401 0,0ской кривой (AUC), мкгч/мл T1/2, ч P<0,01,300,10 1,730,090 Константа элиминации, ч-0,45380,0140 0,23610,0Vd, мл P<0,129 42 7115 Время полувыведения (T1/2), ч 1,370,68 4,880,Фракция дозы месалазина Объем распределения, мл 90,726,2 33,73,1,60,5 3,70,9 P<0,0за 10 часов, % 19 достигают 0,03 мкг/мл при диапазоне определяемых содержаний от 0,1 до У больных ХВГВ не наблюдается быстрый фенотип окисления (табл. 9), мкг/мл.

что возможно, обусловлено уменьшением количества соответствующих суб3. Установлены рабочие условия спектрофотометрического определения стратов и нарушением баланса между способностью медленных окислителей месалазина и сульфаниламидов в моче и слюне в виде окрашенных производбыстро ацетилировать вещества, а быстрых окислителей медленно их ацетилиных с 7-хлор-4,6-динитробензофуроксаном ( 490-500 нм) с пределами обнаровать. Для оптимизации эффективности применения противовирусных и геружения 0,09; 0,1; 0,16; мкг/мл для сульфадиметоксина, месалазина и сульфапатопротекторных ЛС, подвергающихся ацетилированию и окислению, рекометоксазола соответственно. Выявлены факторы регулирования избирательномендуется определение фенотипов ацетилирования и окисления у больных сти, чувствительности и экономичности определений лекарственных веществ в ХВГВ.

биологических жидкотях подбором состава среды, устойчивости во времени, а также направленным изменением спектральных характеристик производных Таблица 9. Фармакокинетические параметры антипирина у больных ХВГВ определяемых веществ.

по оценке его содержания в слюне (per os в дозе 0,6 г) (Mean±SD) (p<0,05) 4. Разработаны методики биофармацевтического анализа активности Nацетилтрансферазы на основе оценки фармакокинетических параметров месаСредний фе- Медленный Фармакокинетический параметр, лазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина при их экскреции с мочой и нотип окис- фенотип окисразмерность сульфадиметоксина в слюне методами ВЭЖХ и спектрофотометрии, обосноления (n=9) ления (n=15) вано их использование для персонализации фармакотерапии.

Константа скорости элиминации, час-1 0,332±0,021 0,154±0,5. Методами биофармацевтического анализа изучена фармакокинетика Константа скорости накопления препарата 0,556±0,036 0,542±0,0тест-препаратов ацетилирования и окисления при хроническом вирусном гепав крови, час-тите В. При этом преобладает быстрый фенотип ацетилирования (67%) и по Объем распределения, л 68,3±2,8 45,0±1,фенотипу окисления происходит перераспределение на средний (37%) и медМаксимальная концентрация препарата в 4,74±0,6 9,04±0,88 ленный (63%) типы. Установлена прогностическая значимость этих биофармаслюне, мкг/мл цевтических тестов для коррекции применения лекарственных средств при Период полуэлиминации препарата, час 3,15±0,33 7,23±0,вирусном гепатите В.

Клиренс, мл/час 20128±2100 4522±7Площадь под кривой «концентрацияПубликации в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, 36±3 109±время» (AUC), мкгчас/мл рекомендованных для размещения материалов диссертаций:

* Примечание: P – статистический уровень значимости различий между показателями быстрого и медленного фенотипов ацетилирования; Mean – 1. Гармонов, С.Ю. Спектрофотометрическое определение 5средняя величина; SD – среднеквадратичное отклонение.

аминосалициловой кислоты в моче для оценки ее экскреции из организма человека / C.Ю. Гармонов, Нгуен Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов, Л.М. Юсупова, Н.С. Шитова, Р.Н. Исмаилова, В.Ф. Сопин// Вестник Казанского технолоВЫВОДЫ гического университета.-2010. - №10. - С. 57- 63.

1. Обоснованы и установлены условия чувствительного и избирательного 2. Гармонов, С.Ю. Индукционное влияние ксимедона на активность микопределения месалазина и сульфаметоксазола в моче, сульфадиметоксина в росомальных оксидаз печени человека / C.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, А.В.

моче и слюне методом обращенно-фазной ВЭЖХ со спектрофотометрическим Жарехина, В.И. Погорельцев, Нгуен Чунг Зунг, Т.А. Киселева, И.Е. Зыкова, детектрированием. Выявлено влияние состава подвижных фаз, их рН, содерИ.Э. Кравченко // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической жания в них неводного компонента, режимов элюирования на разделение лехимии. - 2010. - №4. - С. 34-38.

карственных веществ.

3. Гармонов, С.Ю. Методы оценки и регуляция активности генетически 2. Валидационные параметры при определении месалазина и сульфаметокдетерминированных метаболических ферментных систем организма человека / сазола в моче, сульфадиметоксина в моче и слюне соответствует современным С.Ю. Гармонов, И.Э. Кравченко, Нгуен Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов, В.Х.

требованиям к пригодности хроматографической системы. Определение харакФазылов // Биомедицина. - 2010. - №3. - С. 39-41.

теризуются высокой селективностью (более 1,2), разрешением (более 1,5) и симметрией пиков (менее 1,5). Пределы детектирования исследуемых веществ 21 4. Гармонов, С.Ю. Установление фенотипа ацетилирования на основе Л.М. Юсупова, В.Ф. Сопин, С.Ю. Гармонов // Тезисы докладов ХIХ Менделеспектрофотометрического определения сульфадиметоксина в моче / C.Ю. Гар- евского съезда по общей и прикладной химии.- Волгоград, 2011.- С.376.

монов, Нгуен Чунг Зунг, Л.М. Юсупова, Р.Н. Исмаилова, В.Ф. Сопин // Вест- 9. Гармонов, С.Ю. Спектрофотометрическое определение месалазина в ник Казанского технологического университета.-2011.- №19. С.18-24. моче и изучение его экскреции из организма человека / С.Ю. Гармонов, Нгуен 5. Гармонов, С.Ю. Спектрофотометрическое определение месалазина в Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов, Г.А. Абдурахимова // Сборник научных трумоче как тест для оценки фенотипа ацетилирования организма человека / С.Ю. дов: “Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукГармонов, Нгуен Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов, Л.М. Юсупова, Н.С. Шито- ции”. – Пятигорск, 2011.- Вып. 66.-С. 375.

ва, Р.Н. Исмаилова, В.Ф. Сопин // Химико-фармацевтический журнал. – 2011. – 10. Гармонов, С.Ю. Персонализированный прием ксимедона в качестве Т. 45.- №12.-С. 48-51. индуктора системы микросомальных оксидаз / С.Ю. Гармонов, И.Э. Кравчен ко, Нгуен Чунг Зунг // Материалы XVIII Российского национального конгресСтатьи и материалы конференций: са "Человек и лекарство". - Москва, 2011.-С.502.

11. Гармонов, С.Ю. Оценка активности метаболических ферментных сис1. Nguyen Trung Dung. Determination of mesalazine in human urine by HPLC / тем у больных стрептококковыми ангинами с целью персонализации лечения / Nguyen Trung Dung, S.Yu. Garmonov // Viet Nam Journal of Science and С.Ю. Гармонов, Нгуен Чунг Зунг, А.В. Жарехина, И.Э. Кравченко // МатериаTechnology.-2011.-V.49.-№.3A.-P.259-265.

лы III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. – 2. Гармонов, С.Ю. Методы биофармацевтического анализа метаболичеМосква, 2011. Том. 9 – прилож. 1.-C.188.

ских ферментных систем организма человека / С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, 12. Нгуен Чунг Зунг. Лекарственный препарат месалазин как тест-маркер А.В. Жарехина, Нгуен Чунг Зунг, Т.А. Киселева // Материалы III Всероссийдля оценки фенотипа ацетилирования организма человека / Нгуен Чунг Зунг, ской конференции с межд. участием "Аналитика России".- Краснодар, 2009.- Г.А. Абдурахимова, А.Р. Акбирова, Р.Т. Рыспаева, Л.М. Юсупова, С.Ю. ГарС.384.

монов // Тезисы докладов III региональной научно-практической конференции 3. Гармонов, С.Ю. Индукционное влияние ксимедона на активность микс международным участием «Синтез и перспективы использования биологичеросомальных оксидаз печени человека / С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, А.В.

ски активных соединений». Казань: КГМУ, 2011. С. 64-65.

Жарехина, Нгуен Чунг Зунг // Тезисы докл. 65-ой Всероссийской конференции по фармации и фармакологии. - Пятигорск, 2010.- С.44. Салахов, И.А. Унифицированные подходы к контролю качества лекарСоискатель ственных средств методом ВЭЖХ / И.А. Салахов, Г.Р. Нурисламова, Нгуен Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов, Э.А. Иртуганова, C.Ю. Гармонов // Материалы Всероссийской конференции "Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез". - Краснодар, 2010.-С.159.

5. Гармонов, С.Ю. Методы диагностики групп риска пациентов при исНгуен Чунг Зунг пользовании маркеров ацетилирования и окисления / С.Ю. Гармонов, Н.С.

Шитова, Нгуен Чунг Зунг, Т.А. Киселева, В.Ф. Сопин // Тезисы докладов XVII Рос. нац. конгресса "Человек и лекарство". - Москва, 2010.-С.75.

6. Киселева, Т.А. Фармакогенетический анализ метаболических ферментных систем организма человека / Т.А.Киселева, Нгуен Чунг Зунг // Тезисы докладов XV юбилейной Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые в медицине".- Казань, 2010.-С.234.

7. Нгуен Чунг Зунг. Оценка и регуляция активности генетически детерминированных метаболических ферментных систем организма человека / Нгуен Чунг Зунг, Т.А. Киселева, Н.С. Шитова, А.В. Жарехина, С.Ю. Гармонов // Материалы VII Съезда медицинских генетиков.-Ростов на Дону, 2010.-С396.

8. Нгуен Чунг Зунг. Хроматографическое и спектрофотометрическое определение месалазина в моче человека / Нгуен Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов,






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.