WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

УДК 615.099

МИРОНОВ Николай Николаевич

ВОЗМОЖНОСТИ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ

ХРОМАТОГРАФИИ СЫВОРОТКИ КРОВИ В ДИАГНОСТИКЕ

И ОЦЕНКЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ

ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА

14. 01. 04 – внутренние болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Нижний Новгород – 2012

Работа выполнена в Институте Федеральной службы безопасности Российской

  Федерации (г. Нижний Новгород)

Научный руководитель: 

доктор медицинских наук, профессор Алексеева Ольга Поликарповна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,  профессор Стронгин Леонид Григорьевич

Нижегородская государственная медицинская академия (г. Нижний  Новгород)

доктор медицинских наук, профессор  Шептулин Аркадий Александрович 1 Московский государственный медицинский университет им.И.М.Сеченова (г. Москва)      

Ведущее учреждение:

3 Центральный военный клинический госпиталь им.А.А.Вишневского  МО РФ (г.Москва)

Зашита диссертации состоится « 29__ » __марта_____2012 г.

в _13_____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.061.02 при

государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования « Нижегородская Государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения российской Федерации по адресу: 603005 г. Нижний Новгород, пл. Минина 10/1

  С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке  Нижегородской государственной медицинской академии по адресу: г. Нижний Новгород, ул. Медицинская, 4

Автореферат разослан « ____ » ____________2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат медицинских наук  Ю.А.Орлова

 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Воспалительные заболевания кишечника (язвенный колит и болезнь Крона) характеризуются наличием воспалительно-деструктивных процессов в кишечнике, рецидивирующим течением, и представляют собой одну из наиболее серьезных и нерешенных проблем в современной гастроэнтерологии и колопроктологии (Белоусова Е.А., 2002,2009; Халиф И.Л., 2008;  Парфенов А.И.,2009; Loftus E.V.Jr., 2004; Stange E.F. et all., 2006; Travis S.P.L. et all., 2006; Kappelman M.D. et al., 2008).

Если по уровню заболеваемости они значительно уступают другим гастроэнтерологическим заболеваниям, то по тяжести течения, частоте осложнений и летальности занимают одно из ведущих мест в структуре болезней желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), особенно в России. Это связано с поздней диагностикой заболеваний: диагноз язвенного колита  лишь в 25% случаев устанавливается в течение первого года болезни, в остальных случаях – на протяжении 2 – 12 лет от начала первых симптомов болезни, опасные для жизни осложнения развиваются в 29% случаев. При установлении диагноза болезни Крона в период до 3 лет от начала симптомов болезни частота осложнений составляет 55%, при более поздней диагностике – 100%.

Постоянный интерес к воспалительным заболеваниям кишечника обусловлен прежде всего тем, что, несмотря на многолетнюю историю изучения, этиология их остается неизвестной. При этом во всем мире отмечается тенденция прогрессирования воспалительных заболеваний кишечника, особенно язвенного колита  среди лиц старше 60 лет и болезни Крона в детском возрасте (Мазанкова Л.Н. и соавт., 2005; Белоусова Е.А., 2006, 2011; Алексеева О.П. и соавт., 2008; Longobardi T., 2003; Marshall J.K., Hilsden R.J., 2003; Loftus E.V.Jr., 2004; Kappelman M.D. et al., 2008).

Отдельно следует отметь существенные трудности в диагностике воспалительных заболеваний кишечника, особенно, болезни Крона, и сложности дифференциальной диагностики язвенного колита и болезни Крона. В клинической практике считается, что до 17 % случаев, болезнь Крона не может быть дифференцирована от язвенного колита (Халиф И.Л., Лоранская И.Д., 2004; Yantiss R K., 2006).

Вопросы скрининговой диагностики воспалительных заболеваний кишечника до настоящего времени вообще серьезно не рассматривались в клинической практике.

Одним из важнейших перспективных подходов к изучению патогенеза воспалительных заболеваний кишечника является установление их генетической, инфекционной, иммунологической и иной гетерогенности. При этом набор предрасполагающих факторов, отдельных клинических признаков, лабораторных показателей (биохимических и иммунологических), характерных для язвенного колита и болезни Крона, являются отражением уникального нарушения гомеостаза внутренней среды организма, прежде всего крови, которые могут выть положены в основу диагностики этих заболеваний.

Все это предполагает необходимость постоянного поиска новых диагностических маркеров язвенного колита и болезни Крона, особенно в направлении создания скрининговых технологий. 

Современные разработки в области высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в направлении сочетания хроматографического анализа и компьютерного статистического поиска оптимальных конечных оценок на основе теории распознавания образов (Насонов С.В., 2007) позволили создать новую уникальную технологию построения и анализа жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови, направленную на формирование исходных данных для диагностики патологических процессов в организме. 

На основании изложенного была выбрана цель данной работы, состоящая в изучении возможности применения высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови для разработки скрининговой диагностики и оценки результатов лечения воспалительных заболеваний кишечника.

Для достижения указанной цели было необходимо решить следующие основные задачи:

1. Изучить возможность использования технологии построения и анализа жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови для разработки скрининговой диагностики язвенного колита и болезни Крона.

2. Оценить возможность проведения дифференциальной диагностики между язвенным колитом и болезнью Крона при помощи технологии построения и анализа жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови.

3. Провести оценку эффективности лечения язвенного колита и болезни Крона с использованием технологии построения и анализа жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови.

Положения, выносимые на защиту:

1. Технология построения и анализа жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови может быть использована для скрининговой диагностики и дифференциальной диагностики язвенного колита и болезни Крона.

2. Оценка эффективности лечения язвенного колита и болезни Крона может быть выполнена с использованием технологии построения и анализа жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови.

Научная новизна работы заключается в установлении новых закономерностей в изменении спектральных свойств сыворотки крови при язвенном колите и болезни Крона по сравнению со здоровыми пациентами.

Впервые изучена динамика восстановления количественных параметров жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови у пациентов с язвенным колитом и болезнью Крона на фоне лечения.

Впервые показана перспективная возможность использования жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови для изучения механизмов формирования неэффективности лекарственной терапии воспалительных заболеваний кишечника.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований разработана методика скрининговой диагностики, дифференциальной диагностики и оценки эффективности лечения язвенного колита и болезни Крона на основе технологии построения и анализа жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови.

Создана по типу «обучающей выборки» специальная и постоянно пополняемая база данных жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови больных язвенным колитом и болезнью Крона, которая предназначена для скрининговой диагностики этих заболеваний, а также для уточнения элементов дифференциальной диагностики между язвенным колитом и болезнью Крона.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуждены в ходе Второй Межрегиональной гастроэнтерологической научно-практической конференции Приволжского федерального округа РФ «Неинфекционные заболевания кишечника: от научных достижений к стандартам терапии» (10 апреля 2008 года, г. Нижний Новгород),  Всероссийской конференции гастроэнтерологов с международным участием и VII конференции (съезда) гастроэнтерологов Южного федерального округа РФ «Актуальные проблемы гастроэнтерологии» (29-30 апреля 2008 года, г. Железноводск), 14 Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 6-8 октября 2008 года), на межкафедральном заседании кафедр внутренних болезней Института ФСБ РФ (г. Нижний Новгород) и кафедры госпитальной терапии Нижегородской государственной медицинской академии (12 января 2012).

Реализация результатов исследования. Основные научные положения и выводы нашли отражение в педагогическом процессе и научной работе на кафедре внутренних болезней Института ФСБ РФ и кафедре госпитальной терапии им. В.Г.Вогралика ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ».

Результаты исследования внедрены в клиническую практику гастроэнтерологического центра Приволжского федерального округа РФ на базе ГБУЗ Нижегородской области «Нижегородская областная клиническая больница им. Н.А.Семашко».

Публикации. По теме диссертации опубликованы 3 статьи в рецензируемых журналах и 7  работ в других изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Объем работы – 112 страниц машинописного текста. Иллюстративная часть включает 10 рисунков и 24 таблицы. Список литературы включает 206 наименований, из которых 60 работы на русском языке и 146 на иностранном.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования.

Всего в исследованиях участвовали 75 человек, из которых 46 человек (26 мужчин и 20 женщин в возрасте от 20 до 68 лет) составили группу больных язвенным колитом. 15 пациентов (11 мужчин и 4 женщины в возрасте от 21 до 56 лет) страдали болезнью Крона. Больные язвенным колитом и болезнью Крона проходили амбулаторное обследование и лечение на базе гастроэнтерологического центра Приволжского федерального округа РФ при Государственном бюджетном учреждении здравоохранения Нижегородской области «Нижегородская областная клиническая больница им. Н.А.Семашко» в период с 2005 по 2010 годы. В контрольную группу вошли 14 практически здоровых людей-добровольцев (5 мужчин и 9 женщин) в возрасте от 23 до 54 лет.

Больные язвенным колитом имели давность заболевания от 1 до 15 лет, большинство больных (40%) – от 1 до 5 лет. Диагноз у всех больных верифицирован эндоскопически и морфологически. В исследование не включались больные с тяжелой сопутствующей патологией. Среди сопутствующих заболеваний наиболее частыми были анемия, хронический гастрит, хронический панкреатит вне обострения, контролируемая артериальная гипертензия.

Тяжесть язвенного колита оценивалась по количественному критерию PGA. Составляющими данного критерия являются индекс клинической активности Mayo, определяемый по результатам колоноскопии, показатели частоты стула и наличия в нем крови.

В исследование были включены только больные с умеренной (средней) степенью тяжести заболевания (PGA = 2) с поражением толстой кишки на расстоянии более 15 см от анального отверстия (для исключения изолированного проктита) с целью формирования максимально возможной однородной группы для последующего выполнения спектрометрического анализа сыворотки крови. Частота стула в сутки варьировала от 1-2 раз больше нормы у 20 больных (43.5%) и до 3-4 раз больше нормы – у 26 больных (56.5%). Степень ректальных кровотечений соответствовала 1 (примесь крови в кале в большей части дефекаций) у 32 больных (69.6%) и 2 (явная кровь в кале в большей части дефекаций) – у 14 больных (30.4%). Системные проявления болезни в виде субфебрильной температуры отмечались у 6 больных (13.0%) и артралгии – у 8 больных (17.4%).

По протяженности поражения толстой кишки выявлена локализация воспалительного процесса: проктосигмоидит – у 21 больного (45.6%), левосторонний колит – у 20 лиц (43.5%) и тотальное поражение – у 5 больных (10.9%).

В выборку с болезнью Крона включались пациенты с диагнозом, подтвержденным при помощи рентгенологического и/или эндоскопического и морфологического методов.

В проведенном исследовании участвовали 29 пациентов, которые были разделены на 2 группы. В контрольную группу вошли 14 практически здоровых людей-добровольцев в возрасте от 23 до 54 лет.

Исследуемую группу составили 15 пациентов (11 мужчин и 4 женщины в возрасте от 21 до 56 лет) с болезнью Крона.

Степень тяжести заболевания оценивалась по стандартному международному индексу активности болезни Крона (CDAI) и составляла не менее 150 единиц, что соответствует стадии обострения заболевания. Величина данного индекса составляла у больных от 235 до 310 единиц (среднее значение 268.1 ± 5.6) до назначения лечения.

В исследование не включались больные с сопутствующей патологией в стадии декомпенсации или обострения.

В группе пациентов с язвенным колитом выполнялись следующие методы обследования не позднее 7 дней до назначения лечения и на следующий день после прекращения:

лабораторные методы, включающие общий анализ крови и мочи, определение уровня глюкозы в крови, креатинина, АЛТ, АСТ, гамма-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, билирубина, альбумин, СОЭ, выявление в кале Clostridium difficile, бактериальных патогенов и яиц паразитов по общепринятым методам диагностики;

колоноскопия с оценкой индекса Mayo, теста ранимости слизистой и биопсией из слизистой оболочки проводилась при помощи аппарата OLYMPUS CV-70; 

выполнялась оценка степени активности язвенного колита болезни врачом (показатель PGA);

проводился забор крови и подготовка проб сыворотки крови для жидкостно-хроматографического исследования.

Показатель PGА, как критерий тяжести язвенного колита и оценки эффективности лечения, определялся с использованием индекса клинической активности Mayo, рассчитанного по системе баллов, которая включает непосредственную визуальную оценку состояния слизистой оболочки при эндоскопии, оценку частоты стула и ректальных кровотечений за предыдущие 3 дня со слов пациента.

Для лечения язвенного колита применялся препарат месалазин группы 5-АСА в стабильных дозах для каждого больного 4.8 грамма в сутки в течение 6 недель.

В группе пациентов с болезнью Крона выполнялись следующие методы обследования до и после курса лечения:

лабораторные методы, включающие анализ крови (гематокрит, гемоглобин, эритроциты, лейкоциты и лейкоцитарная формула, тромбоциты); биохимические исследования (уровень глюкозы в крови, креатинин сыворотки, мочевина, АсАТ, АлАТ, гамма-глутамилтрансфераза, щелочная фосфатаза, общий билирубин и его фракции, альбумин, СОЭ, C-реактивный белок); общий анализ мочи;

забор крови и подготовка проб сыворотки крови для жидкостно-хроматографического исследования.

Лечение пациентов с болезнью Крона проводилось преднизолоном по стандартной схеме в соответствии с Международным консенсусом по лечению болезни Крона средней тяжести (Travis S.P.L. et all., 2006). Начальная доза преднизолона составляла 40 мг в сутки, а затем проводилось снижение дозы на 10 мг каждые две недели до уровня 20 мг в сутки, и далее доза снижалась на 5 мг каждую неделю до 5 мг. Общая продолжительность лечения составила 8 недель. В качестве дополнительной терапии использовались  препараты 5-АСА (месалазин) по 4.8 г в сутки.

В данной работе в качестве исследуемого субстрата была использована сыворотка крови. Забор крови проводился натощак из вены в количестве 5-10 мл. Полученная сыворотка (не менее 2 мл) высушивалась при 25С в течение 48 часов до состояния сухой корочки и перемалывалась до состояния гомогенного порошка. Далее бралась навеска порошкообразной сыворотки в количестве 40 мг и в течение 45 минут проводилась экстракция 200 мкл субстрата 85% метанолом. После осаждения крупно- и среднемолекулярных белков проводилось центрифугирование смеси при ускорении 12G с последующим отбором надосадочной жидкости. Полученный таким образом экстракт сыворотки крови подвергался жидкостно-хроматографическому исследованию. При необходимости пробы сыворотки крови анализировались повторно 2-3 раза.

При анализе использовалась стандартная методика исследования на хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «Эконова», Новосибирск).

Хроматограмма подвергалась математической обработке с идентификацией наиболее значимых пиков и вычислением их площадей.

Полученные отношения площадей представляют собой безразмерные относительные пропорции количеств веществ в смеси и наиболее полно характеризуют её биохимический состав. Эти соотношения являлись параметрами, подлежащими дальнейшей многоуровневой статистической обработке.

Планирование исследований и оценка полученных результатов выполнялись при помощи одномерного и многомерного статистического анализа.

Одномерный статистический анализ включал определение средних значений показателей, величин их варьирования (среднего квадратического отклонения, стандартной ошибки и коэффициента вариации), а также оценку достоверности их различия при помощи параметрического t-критерия Стьюдента для связанных выборок (Урбах В.Ю., 1975; Лакин Г.Ф., 1990) и непараметрического критерия U-Вилкоксона-Манна-Уитни (Гублер Е.В.,  Генкин А.А., 1973; Гублер Е.В., 1978). Основанием применения методов параметрической статистики для обработки исходных данных было принято соответствие распределения выборки исследуемого показателя нормальному закону (Плохинский Н.А., 1970; Лакин Г.Ф., 1990).

Изменения количественных соотношений веществ у больных язвенным колитом и болезнь Крона, регистрируемые при высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови, служили параметрами для формирования диагностического критерия – многомерного статистического отклика, получившего название «спектрометрического образа болезни».

Статистическая обработка хроматограмм сыворотки крови проводилась на совмещенной с хроматографом ПЭВМ на базе микропроцессора Pentium-IV. 

Для статистической оценки полученных распределений ВЭЖХ-параметров в образах болезней использовались методы многомерного статистического анализа диалоговой системы STADIA 4.52 (копия 1102), реализованной в специальной компьютерной программе, предназначенной для обработки массива хроматограмм на основе многоуровневого кластерного анализа с формированием трехмерного образа нормы или патологического состояния (Насонов С.В., 2007).

Методом кластерного анализа проводилась предварительная оценка однородности исследуемых распределений ВЭЖХ-параметров для каждых двух дифференцируемых образов болезней. После этого использовался метод дискриминантного анализа, основанный на определении канонических направлений в исходном пространстве признаков (ВЭЖХ-параметров), удовлетворяющих критерию максимального отношения дисперсии распределений ВЭЖХ-параметров между образами к дисперсии внутри образов. Уровень значимости вычисленных линейных дискриминантных функций Фишера оценивался по критерию хи-квадрат для трех степеней свободы и доверительной вероятности не менее 95%. Конечным результатом методики являлся спектральный образ, расположенный в фиксированной точке трехмерного пространства координат. Совокупность спектральных образов разных пациентов составляло диагностическое облако патологического состояния.

По своей сути сочетание жидкостной хроматографии и многоуровневой статистической компьютерной обработки полученных спектров является комплексной уникальной технологией фиксации жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови в трехмерном пространстве.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для достижения цели и решения задач данной работы были спланированы и выполнены исследования, направленные на доказательство возможности применения технологии построения и анализа жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови для диагностики, дифференциальной диагностики и оценки эффективности лечения язвенного колита и болезни Крона. Были подобраны сопоставимые по возрасту, полу, точности клинического диагноза и тяжести заболевания три группы пациентов. В первую группу вошли 46 больных язвенным колитом, во вторую группу – 15 пациентов с болезнью Крона, и третью группу составили 14 практически здоровых людей-добровольцев.

Задача оценки возможности применения технологии построения и анализа жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови для скрининговой диагностики язвенного и болезни Крона решалась путем статистического сравнения облаков спектральных образов здоровых пациентов и больных язвенным колитом и болезнью Крона.

Полученные результаты разделения спектральных образов в группах здоровых пациентов и больных язвенным колитом (рис. 1) показывают значительную степень разделения спектральных образов в группах здоровых пациентов и больных язвенным колитом с высоким уровнем вероятности по критерию хи-квадрат. 

Разграничение спектральных образов здоровых людей и пациентов с болезнью Крона,  представленные на рис. 2, достигло высокой степени вероятности по критерию хи-квадрат (99.78).

Рис. 1. Жидкостно-хроматографические спектральные образы сыворотки крови контрольной группы (светлый тон ядер) и больных язвенным колитом (темный тон ядер).

Координаты: Х=А(W1210)/А(T4240), Y=А(X1210)/А(T4240),

Z=А(B1220)/А(M2250).

Следует понимать, что такая высокая точность разделения спектральных образов для скрининговой диагностики была достигнута по причине строгого отбора пациентов с точно установленными диагнозами язвенного колита и болезни Крона в исследуемых группах пациентов, которые по своей сути рассматриваются в статистическом анализе как «обучающие выборки» для последующих экспертных оценок. 

Рис. 2. Жидкостно-хроматографические спектральные образы сыворотки крови здоровых людей (темный тон ядер) и пациентов с болезнью Крона (светлый тон ядер). 

  Координаты: Х=А(W1200)/А(T3220), Y=А(X1210)/А(Х5250), 

Z=А(Т5220)/А(В1230).

Задача дифференциальной диагностики язвенного и болезни Крона решалась путем статистического сравнения соответствующих облаков спектральных образов групп больных язвенным колитом и болезнью Крона. Полученные в результате выполненных исследований данные статистического анализа,  также показывают полное разграничение облаков спектральных образов, представленных на рис. 3, в группах с уровнем вероятности по критерию хи-квадрат 99.81.

Исследование возможности использования технологии фиксации жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови для оценки эффективности лечения язвенного колита средней тяжести на примере применения препарата 5-АСА (месалазином) в дозе 4.8 грамма в сутки в течение 6 недель с промежуточной оценкой эффективности терапии  по индексу PGA была проведена на группе из 46 больных язвенным колитом.

Рис. 3. Жидкостно-хроматографические спектральные образы сыворотки крови групп больных язвенным колитом (темный тон ядер) и болезнью Крона (светлый тон ядер)

  Координаты: Х=А(Х5210)/А(T4240), Y=А(Т4220)/А(Р2280),

Z=А(B1230)/А(Т4240)

Все больные язвенным колитом (n=46) имели среднюю степень тяжести (активности) болезни с индексом PGA=2. PGA как суммарный показатель оценивался с учетом индекса дефекации, индекса ректальных кровотечений и колоноскопического индекса Mayo. Полный клинический ответ (индекс PGA=0) после лечения зарегистрирован у 9 больных язвенным колитом (19.6%). Частичный клинический ответ с индексом PGA=1 наблюдался у большинства больных (73.9%). Отсутствие клинического ответа на лечение (PGA=2) было выявлено только у 3 пациентов.

Статистический анализ построенных спектральных образов (рис.4) показал удовлетворительную диагностическую точность (72.8%) разграничения групп больных язвенным колитом до и после лечения с уровнем вероятности 96.02%. Относительно невысокий уровень разграничения спектральных образов сыворотки крови до и после лечения больных язвенным колитом объясняется соответствующим, среднего уровня, терапевтическим эффектом 5-АСА препаратами.

Рис. 4.  Жидкостно-хроматографические спектральные образы сыворотки крови в группах больных язвенным колитом до лечения (светлый тон ядер) и после лечения (темный тон ядер) месалазином.

Координаты: Х=А(W1200)/А(X5200), Y=А(W1200)/А(B1220),

Z=А(W2200)/А(B0210).

Для поиска возможных механизмов формирования неполного ответа на лечение была выполнена попытка построения спектральных образов сыворотки крови группах больных язвенным колитом с полным ответом на лечение, у которых индекс PGA = 0 (n = 9), и неполным ответом на лечение с индексом PGA > 0 (n = 37). В эту группу были объединены больные с частичным ответом на лечение (PGA = 1) и без ответа на лечение (PGA = 2). Построенные спектральные образы показаны на рис. 5.

Рис. 5. Жидкостно-хроматографические спектральные образы сыворотки крови в группах больных язвенным колитом с полным (PGA=0) ответом на лечение (темный тон ядер) и неполным (PGA>0) ответом на лечение (светлый тон ядер) 

  Координаты: Х=А(W4230)/А(X2250), Y=А(X1220)/А(T4250),

Z=А(B1230)/А(T2250)

Из данного рисунка видно, что достигнуто выраженное различие между группами больных язвенным колитом с полным ответом на лечение и объединенной группой больных с частичным ответом и без ответа на лечение. Статистический анализ построенных спектральных образов показывает достоверное разграничение между группами больных язвенным колитом с полным ответом на лечение и с частичным ответом или без ответа на лечение месалазином с уровнем вероятности 96.03%.

На основании полученных результатов появляется возможность перспективного применения высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови для изучения механизмов развития неэффективности лекарственной терапии.

Оценка эффективности лечения болезни Крона проводилась в соответствии с Международными рекомендациями по снижению величины CDAI. Положительным ответом на лечение считали снижение данного показателя на 100 и более баллов после рекомендованной для больных средней тяжести терапии преднизолоном, начиная с 40 мг со снижение дозы до 5 мг в течение 8 недель в сочетании с месалазином по 4.8 г в сутки (Travis S.P.L. et all., 2006).

Оценка эффективности лечения болезни Крона проведена на группе из 15 больных со средней степенью активности болезни Крона с CDAI от 235 до 310 единиц (среднее значение 268.1 ± 5.6 ( 255.5 280.7) для Р = 0.05, коэффициент вариации V = 8.5%) в исходном состоянии до начала лечения.

На период окончания лечения величина CDAI колебалась от 14 до 137 единиц (среднее значение 81.4 ± 7.9 (64.4 98.4) для Р = 0.05, коэффициент вариации V = 37.8%). В среднем снижение CDAI после лечения составило 173.7 балла. С точки зрения математической статистики показатель CDAI после лечения отклоняется от нормального распределения. Большая величина коэффициента вариации объясняется индивидуальными различиями пациентов с болезнью Крона в отклике на проводимое лечение.

Среднюю величину различий или количественных изменений показателя CDAI можно установить по t-критерию Стьюдента для связанных выборок. При помощи данного критерия показано, что средняя величина достоверного (Р < 0.01) уменьшения CDAI у пациентов с болезнью Крона после курса лечения составила CDAI = 186.6 ± 7.6 (170.4 203.0) для Р = 0.05.

Применение технологии фиксации жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови (рис. 6) показывает практически полное расхождение спектральных образов у пациентов с болезнью Крона до лечения и на момент окончания лечения преднизолоном в сочетании с месалазином, что подтверждает эффективность назначенной терапии.

Рис. 6. Жидкостно-хроматографические спектральные образы сыворотки крови у пациентов с болезнью Крона до лечения (светлый тон ядер) и после лечения (темный тон ядер) преднизолоном в сочетании месалазином

  Координаты: Х=А(F1210)/А(J1240), Y=А(J1210)/А(T4240),

Z=А(W2210)/А(X1210)

Статистический анализ построенных спектральных образов показывает высокую степень разграничения пациентов с болезнью Крона до и после лечения с уровнем вероятности 99.5%, что можно объяснить высоким терапевтическим эффектом кортикостероидов при средней тяжести болезни Крона.

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований доказана возможность использования высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови с построением спектральных образов нормы и патологии для разработки скрининговой диагностики язвенного колита и болезни Крона на основе статистически достоверного с высоким уровнем вероятности разделения спектральных образов в группах больных и здоровых лиц.

2. Установлена возможность проведения дифференциальной диагностики между язвенным колитом и болезнью Крона с высокой вероятностью разграничения хроматографических спектральных образов этих болезней, полученных на основе использования метода высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки. 

3. Доказана возможность применения технологии построения и анализа жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови для оценки эффективности терапии на примере лечения язвенного колита высокими дозами месалазина и болезни Крона преднизолоном в сочетании с месалазином по критерию восстановления спектральных образов этих болезней на фоне лекарственной терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ  РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Технологию построения и анализа жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови рекомендуется применять в практической деятельности врачей общей практики, терапевтов, гастроэнтерологов амбулаторного и госпитального звена для скрининговой диагностики при подозрении на воспалительные заболевания кишечника, дифференциальной диагностики между язвенным колитом и болезнью Крона при затруднении в обследования тяжелых пациентов, и для оценки эффективности лечения этих заболеваний во избежание инвазивных и дорогостоящих методов исследования.

2. Созданную базу данных жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови больных язвенным колитом и болезнью Крона рекомендуется расширять по мере накопления диагностической информации, и использовать для дальнейших разработок способов количественной оценки тяжести язвенного колита и болезни Крона на основе технологии построения и анализа жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО

ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Миронов, Н.Н. Новый способ лабораторной диагностики болезни Крона по сыворотке крови / Н.Н.Миронов, С.В.Насонов, О.П.Алексеева  // Ремедиум Приволжье. Специальный выпуск для врачей.: Актуальные вопросы гастроэнтерологии – 2007. -  С.68-69.

2. Миронов, Н.Н. Возможности диагностики болезни  Крона в стадии обострения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки  крови / Н.Н.Миронов, С.В.Насонов, О.П.Алексеева, С.В.Криштопенко  // Саратовский научно-медицинский журнал. -  2008.- Т.4. -  №2. -  С.82-85.

3. Миронов, Н.Н. Возможности диагностики язвенного колита и оценки эффективности его лечения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки  крови / Н.Н.Миронов, С,В.Насонов, О.П.Алексеева  // Медицинский альманах. – 2008. - № 2(2). - С. 38-41.

4. Алексеева, О.П. Эпидемиологические показатели и особенности диагностики воспалительных заболеваний кишечника в Нижегородской области / О.П.Алексеева, С.В.Криштопенко, Н.Н.Миронов // Материалы восьмой Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием и красноярской краевой гастроэнтерологической конференции «Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения»; Красноярск, 17—18 апреля 2008 г. / Под ред. д.м.н., проф. В. В. Цуканова, д.м.н., проф. А. Б. Салминой. — Красноярск, 2008. – С. 388-389.

5. Алексеева, О.П. Возможности диагностики язвенного колита с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки  крови / О.П.Алексеева, Н.Н.Миронов, С.В.Криштопенко, С.В.Насонов // Гастроэнтерология юга России ( ежегодное научно-практическое издание). - Ростов-на-Дону., 2008. - С.44-48.

6. Миронов, Н.Н. Возможности диагностики воспалительных заболеваний кишечника в стадии обострения с использованием высоко-эффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови / Н.Н.Миронов, О.П.Алексеева, С.В.Криштопенко // Материалы 14 Российской Гастроэнтерологической Недели. - Российский журнал Гастроэнтерологии, гепатологии, Колопроктологии. – Приложение № 32.- 2008. – Т.18.- №5. – С.694.

7. Алексеева, О.П. Возможности дифференциальной диагностики язвенного колита и болезни Крона с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови / О.П.Алексеева, Н.Н.Миронов, С.В.Криштопенко, Е.Н.Колодей // Медицинский альманах. - 2010.- №1(10).- С. 82-85.

8. Колодей, Е.Н. Возможности использования высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови в дифференциальной диагностике воспалительных заболеваний кишечника (язвенный колит, болезнь Крона) и синдрома раздраженного кишечника / Е.Н.Колодей, Н.Н.Миронов, О.П.Алексеева, А.А.Игнатьев // Медицинский альманах. -  2011, №2 (15).- С.36-39.

9. Колодей, Е.Н. Возможности использования высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) сыворотки крови в дифференциальной диагностике воспалительных заболеваний кишечника и синдрома раздраженного кишечника / Е.Н.Колодей, Н.Н.Миронов, О.П.Алексеева, А.А.Игнатьев // Материалы 17 Российской Гастроэнтерологической Недели. - Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии.- Приложение № 38.  – 2011. – Т.21.- №5.- С. 171.

10. Колодей, Е.Н. Дифференциальная диагностика воспалительных заболеваний кишечника  (язвенный колит, болезнь Крона) и синдрома раздраженного кишечника с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови / Е.Н.Колодей, Н.Н.Миронов, О.П.Алексеева, А.А.Игнатьев // Материалы 13-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург – Гастро-2011» .- Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. – 2011. - №2-3. – С. М40.

СПИСОК  СОКРАЩЕНИЙ  И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

БК – болезнь Крона

АЛТ – аланиновая трансаминаза

АСТ – аспарагиновая трансаминаза 

ВЗК – воспалительные заболевания кишечника

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография

ГЭРБ – гастро-эзофагеальная рефлюксная болезнь

ЖКТ – желудочно-кишечный тракт

ИЛ – интерлейкины

мг – миллиграмм

МК ВЭЖХ – микроколоночная ВЭЖХ

ПЭВМ – персональная электронно-вычислительная машина

ЯК – язвенный колит

5-АСА - 5-аминосалициловая кислота

CDAI (Crohn’s disease activity index) – индекс активности болезни Крона

MAYO – показатель тяжести язвенного колита

PGA (Physician’s Global Assessment) – показатель (индекс) активности (тяжести) язвенного колита

– среднее значение показателя

γ – уровень надежности

Р – вероятность ошибки (нулевой гипотезы)

Sx – среднее квадратическое отклонение

– ошибка среднего

t – значение критерия Стьюдента

V – коэффициент вариации






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.