WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Яруллина Любовь Георгиевна,

Официальные оппоненты:

Веселов Станислав Юрьевич,

доктор биологических наук, профессор,

ФГБОУ ВПО Башкирский государственный университет

Гаврилюк Инна Павловна,

доктор биологических наук, профессор,

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства имени Н.И. Вавилова

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Защита состоится «20» декабря 2012 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 212.013.11 при ФГБОУ ВПО Башкирский государственный университет по адресу: 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, д. 32, биологический факультет, ауд. 332.

Факс (347)273-67-78, e-mail: disbiobsu@mail.ru

Официальный сайт БашГУ: http://www.bsunet.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО Башкирский государственный университет.

Автореферат разослан «_____» ноября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.б.н.

М.Ю. Шарипова

Общая характеристика работы

Актуальность исследований. Одной из первоочередных задач современной биологии является выявление путей формирования устойчивости растений к патогенным микроорганизмам. Важную роль в регуляции взаимоотношений системы «растение – патоген» играют активные формы кислорода [Тарчевский, 2000; Ramputh et al., 2002]. Так резкое и многократное повышение уровня АФК (оксидативный взрыв) при инфицировании индуцирует в растениях каскад защитных реакций [Huckelhoven, Kogel, 2003; Bollwel, Daudi, 2009], а их низкая концентрация способствует росту патогенов [Narasimhan et al., 2001; Aver’yanov et al., 2007].

До недавнего времени считалось, что основным регулятором уровня АФК при инфицировании являются растения, а возможный вклад гриба в данный процесс даже не рассматривался. Однако, имеются данные об участии патогенных грибов в регуляции содержания АФК, как через продукцию Н2О2 [Аверьянов и др., 2007], так и через ее утилизацию [Zhang et al., 2004; Tanabe et al., 2009].

В настоящее время интенсивно исследуется сигнальная роль салициловой и жасмоновой кислот, индуцирующих продукцию АФК, в защите растений от патогенов [Allen, Tresini, 2000; Ладыженская, Проценко, 2002; Озерецковская и др., 2008; Шакирова и др., 2011]. Предполагается, что салицилатный сигналинг влияет на устойчивость растений к грибным патогенам с биотрофным типом питания, а жасмонатный - определяет развитие устойчивости к некротрофам. Относительно путей регуляции защитного ответа растений сигнальными молекулами при инфицировании возбудителями грибных болезней со смешанным (гемибиотрофным) типом питания сведения весьма противоречивы [Озерецковская, 2009; Максимов и др., 2011].

Возбудитель септориоза  Septoria nodorum Berk поражает мягкую пшеницу Triticum aestivum L. и другие виды злаков, что приводит к значительным потерям урожая. В связи с этим исследования роли про-/ антиоксидантной системы в формировании устойчивости к S. nodorum весьма актуальны. Они имеют большое теоретическое и практическое значение для защиты сельскохозяйственных растений.

Цель работы – выявить закономерности функционирования про-/антиоксидантной системы растений пшеницы при инфицировании возбудителем септориоза Septoria nodorum Berk и обработке сигнальными молекулами.

Задачи исследований:

- проанализировать изменения в содержании АФК, активности оксидоредуктаз в растительных тканях при инфицировании S. nodorum и обработке салициловой и жасмоновой кислотами;

- изучить экспрессионную активность генов пероксидазы и оксалатоксидазы, интенсивность накопления лигнина в растениях пшеницы при инфицировании различными по агрессивности штаммами гриба S. nodorum и обработке сигнальными молекулами;

- выявить роль грибной каталазы в регуляции уровня Н2О2 в растительных тканях и проявлении агрессивности патогена;

- провести сравнительную оценку транскрипционной активности генов оксалатоксидазы и пероксидазы в растениях пшеницы различной устойчивости при инфицировании возбудителем септориоза.

Научная новизна. Получены оригинальные экспериментальные данные об изменении экспрессии генов оксидоредуктаз в растениях пшеницы при инфицировании различными по агрессивности штаммами S. nodorum и воздействии сигнальных молекул. Выявлено, что салициловая и жасмоновая кислоты оказывают защитное действие на растения пшеницы при инфицировании S. nodorum, индуцируя в них генерацию супероксидного радикала и перекиси водорода. Получены новые данные о защитных свойствах сигнальных молекул против возбудителя септориоза, обусловленные активацией оксалатоксидазы, анионной пероксидазы, ингибиторов протеиназ и снижением активности каталазы. Впервые показано, что одним из факторов, обеспечивающих агрессивность и патогенность гриба S.nodorum, является высокая экспрессионная активность гена каталазы, участвующей в регуляции уровня Н2О2 в растительных тканях.

Практическая значимость работы. Выявлена связь устойчивости пшеницы к возбудителю септориоза с уровнем экспрессионной активности генов оксидоредуктаз в растениях. Результаты исследований детализируют представления о механизмах фитоиммунитета и могут быть использованы для разработки экологически безопасных средств защиты растений, новых методов ДНК-диагностики уровня устойчивости растений к грибным патогенам. Научные положения исследований рекомендуется использовать в качестве учебного материала по дисциплинам: физиология растений, биохимия, защита растений, фитопатология.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на 6-й межд. науч.-практ. конф. «Биологическая защита растений как основа экологического земледелия и фитосанитарной стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 2010), межд. конф. «Актуальные проблемы ботаники и экологии» (Ялта, 2010), 2-й и 3-й Всерос. школе-конф. по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика – наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012), 7-м съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011), межд. науч.-практ. конф. «Интегрированная защита растений: стратегия и тактика» (Минск, 2011), Всерос. конф. молодых учёных «Биология будущего: традиции и инновации» (Екатеринбург, 2012), 8-м межд. симпозиуме по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва, 2012).

Связь с научными программами. Работа поддержана грантами: АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» №2.1.1./5676; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК № 16.740.11.0061, ГК № П339); РФФИ_поволжье_а № 11-04-97037; ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (ГК № 16.512.11.2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 317 источников. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 таблицами и 31 рисунком.

Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н. Л.Г. Яруллиной, сотрудникам лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН, в которой проводились исследования: зав.лаб., д.б.н.. Максимову И.В., д.б.н. Трошиной Н.Б., к.б.н., Суриной О.Б., к.б.н. Бурхановой Г.Ф., к.б.н. Валееву А.Ш., асп. Ахатовой А.Р., асп. Касимовой Р.И. за неоценимую помощь при выполнении и обсуждении работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работы проводились на растениях мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) различных сортов (Омская 35, Омская 36, Башкирская 24, Башкирская 26, Симбирка, Казахстанская 10, Жница). Были использованы споры патогена – гемибиотрофного возбудителя септориоза (Septoria nodorum Berk.). Различные по агрессивности штаммы S. nodorum (высокоагрессивный штамм 9МН и низкоагрессивный штамм 4ВД) были получены из Института экспериментальной ботаники им. В.Ф. Купревича НАН Беларусии. СК и ЖК в соответствующих концентрациях (10-5 М и 10-7 М) использовали для предпосевной обработки семян пшеницы.

Для получения растворимой фракции белков растительный материал гомогенизировали в 0.01 М Na-фосфатном буфере (ФБ) рН 6.2 (1:10, г/мл). Активность пероксидазы и каталазы определяли по методу, описанному А.И. Ермаковым с соавторами [1987], а оксалатоксидазы по В. Dumas с соавторами [1995]. Активность протеиназ и их ингибиторов определяли спектрофотометрически по гидролизу хромогенного синтетического субстрата БАПНА [Erlanger et al., 1961] и по гидролизу желатина, активность амилаз – по гидролизу крахмала, иммобилизованных в геле агарозы [Шпирная и др., 2009]. Концентрацию О2- определяли с использованием 0.6 мМ нитротетразолия синего [Vaidyanathan et al, 2003]. Содержание Н2О2 определяли с использованием ксиленолового оранжевого [Bindschedler et al, 2001], локализацию Н2О2 определяли путем инфильтрации в растительные ткани диаминобензидина (ДАБ) [Caliskan, Cuming, 1998]. Для определения молекулярной массы и pI белков использовали метод двумерного электрофореза [Vincent et.al., 2006]. Накопление лигнина изучали по автофлуоресценции [Schafer et al., 2004; Плотникова, Штубей, 2009].

Для выделения РНК и ДНК использовали метод P. Chomczynski [1987]. Получение кДНК на основе мРНК проводили методом обратной транскрипции (от-ПЦР). После амплификации реакционную смесь фракционировали методом электрофореза с использованием прибора miniProtean 3 Cell («BioRad», США) согласно описанию Т. Маниатис и др. [1984]. Для определения размеров синтезированных ампликонов использовали маркерные ДНК GeneRuler TM 100 bp DNA Ladder («Fermentas», Латвия).

Эксперименты проводили в трехкратной биологической и четырехкратной аналитической повторностях. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерных программ Stat Soft (Statistica 6.0).

Результаты и их обсуждение

1. Анализ продукции АФК и активности оксидоредуктаз в растительных тканях при инфицировании S. nodorum и обработке СК и ЖК

Наблюдение за ростом возбудителя септориоза на эпидермисе листьев показало, что в контроле уже через 24 ч после инокуляции мицелий гриба густо покрывал поверхность листа (рис. 1 а, I). В вариантах опыта с применением СК, ЖК и их смеси прорастание спор было менее интенсивным (рис. 1 б, в, г, I). В листьях растений, предобработанных СК и ЖК, симптомы болезни были выражены слабее, чем в контроле (рис. 1 б, в, III).

Рис. 1. Влияние СК и ЖК и их смеси на интенсивность прорастания спор (I), генерацию Н2О2 в клетках мезофилла в зоне инфицирования (II) и развитие симптомов септориоза (III) в листьях пшеницы:

а – контроль,

б - обработка СК;

в - обработка ЖК,

г - обработка смесью СК+ЖК.

I, II, III – 24, 48 и 72 ч после инокуляции, соответственно

Образование АФК является одним из наиболее ранних ответов растительных клеток на контакт с патогеном, в результате чего индуцируются защитные реакции растения. Первым звеном в патоген-индуцируемой окислительной вспышке является активация связанной с клеточной мембраной НАДФН-оксидазы и генерация супероксидного радикала, который при участии супероксиддисмутазы преобразуется в Н2О2.

В наших исследованиях в ответ на инфицирование S. nodorum в листьях пшеницы наблюдалось повышение концентрации O•2 через 24 ч после инокуляции (табл. 1).

Таблица 1

Накопление супероксидного радикала O•2 и Н2О2 в листьях пшеницы сорта Башкирская 24 при инфицировании грибом S. nodorum и обработке салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислотами

Вариант

Время после инфицирования, ч

24

48

72

O•2, нМ/мг сырой массы

Контроль

73.0±3.7

81.1±3.2

62.0±3.9

S.nodorum

98.1±4.1

92.3±4.6

79.1±2.1

СК

99.2±3.7

88.1±6.1

74.2±2.4

СК+ S.nodorum

165.0±6.8

118.2±9.9

98.1±5.5

ЖК

89±3.7

124.3±5.8

96.3±3.9

ЖК+ S.nodorum

126.2±8.7

149.0±7.2

94.1±4.3

СК+ЖК

101±3.9

112±6.7

80,2±3.4

СК+ЖК+ S.nodorum

131±8.6

123±5.9

107,3±4.2

Н2О2, мкМ/мг сырой массы

Контроль

18.3 ±0.7

10.1± 0.6

7.2 ± 0.3

S.nodorum

22.7 ± 1.5

15.9 ±0.9

8.6 ± 0.2

СК

21.0 ± 1.3

14.1 ± 0.7

9.7 ± 0.3

СК + S.nodorum

38.8 ± 2.5

20.7 ±0.8

10.8 ± 0.5

ЖК

20.4 ±0.8

21.9±0,5

11,3± 0.2

ЖК + S.nodorum

29.2 ± 1.6

26.8±1.3

12.1± 0.4

СК+ЖК

24.3±1.4

28,3±1.7

15,2±0.7

СК+ЖК+ S.nodorum

30,1±1.7

34,3±1.2

21.3±0.9

В предобработанных СК и ЖК листьях синтез всех форм АФК усиливался. Цитологический анализ подтвердил, что в опытных вариантах количество Н2О2 – продуцирующих клеток было больше (рис. 1б, в, г, II), чем в контроле (рис. 1 а, II). Причем, при инфицировании под воздействием СК индуцируется более раннее повышение уровня АФК по сравнению с обработкой ЖК.

Изменение уровня АФК в растительных тканях происходит в результате многих метаболических процессов, в том числе изменения в активности про-/ антиоксидантных ферментов, таких как оксалатоксидаза, каталаза, пероксидаза. Так в ответ на инокуляцию листьев S. nodorum происходило повышение активности оксалатоксидазы (рис. 2 б, I). Обработка СК приводила к усилению активности оксалатоксидазы через 24 ч после инокуляции (рис. 2 г, I). Стимулирующее действие ЖК на активность фермента проявлялось на более поздних этапах взаимоотношений растительных клеток с грибом (рис. 2 I, е).

Рис. 2. Влияние салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот на активность оксалатоксидазы (I), каталазы (II) и пероксидазы (III) в листьях пшеницы при инфицировании S. nodorum:

а – контроль, б - инфицирование S. nodorum, в – обработка СК;

г - обработка СК + S. nodorum;

д – обработка ЖК, е – обработка ЖК + S. nodorum, ж - обработка смесью СК+ЖК, з - обработка смесью СК+ЖК + S. nodorum.

В инфицированных листьях постепенно возрастала активность каталазы (рис. 2, II) и пероксидазы (рис. 2, III), достигая максимального значения через 72 ч после инокуляции. СК оказывала ингибирующее действие на каталазную активность и модулирующее – на активность пероксидазы. Так, если в предобработанных СК здоровых растениях активность фермента была ниже, чем в контроле на всем протяжении опыта (рис. 2, III, в), то в предобработанных и инфицированных она плавно возрастала в ходе эксперимента (рис. 2, III, г).

Важной составляющей защитного ответа растений на действие патогенов, является образование соединений, подавляющих гидролитическую активность микроорганизмов [Домаш и др., 2008]. При поражении пшеницы S. nodorum происходило изменение уровня активности гидролитических ферментов и их ингибиторов. Повышение активности ингибиторов протеиназ в листьях было обусловлено усилением экспрессии гена EU 293132.1 (рис. 3). Предобработка ЖК способствовала более высокому уровню экспрессии гена ингибитора протеиназ в постинфекционный период, по сравнению с СК (рис. 3, 5, 6).

Рис.3. Экспрессия гена ингибитора протеиназ EU 293132.1 в листьях пшеницы при инфицировании S. nodorum:

1 – контроль; 2 – обработка СК;

3 – обработка ЖК; 4 – S. nodorum;

5 – обработка СК+ S. nodorum;

6 – обработка ЖК+ S. nodorum.

I – 24, II – 48, III – 72 ч после инокуляции, соответственно.

Здесь и далее цифрами над фотографиями гелей представлен уровень экспрессии гена в %.

Таким образом, обе сигнальные молекулы – СК и ЖК, оказывали пролонгированное защитное действие на растения пшеницы при инфицировании S. nodorum, усиливая в них генерацию супероксидного радикала и Н2О2. Защитное действие сигнальных молекул против возбудителя септориоза обусловлено активацией оксалатоксидазы, ингибиторов протеиназ и снижением активности каталазы.

2. Экспрессия генов пероксидазы и оксалатоксидазы, интенсивность накопления лигнина в растениях пшеницы при инфицировании различными по агрессивности штаммами гриба S. nodorum и обработке сигнальными молекулами

В естественных условиях популяция патогенов состоит из смеси различных штаммов, отличающихся степенью агрессивности. Одним из важных ферментов, который наряду с НАДФН-оксидазой, повышает уровень H2O2 в растениях при инфицировании, является оксалатоксидаза [Dumas et al., 1995]. Основная функция этого фермента - участие в деградации щавелевой кислоты, которая в патогенных системах является фактором вирулентности.

Рис. 4. Экспрессия гена оксалатоксидазы AJ556991.1 (А) и активность фермента (Б) в листьях пшеницы при инфицировании штаммами S. nodorum различной агрессивности.

1- контроль; 2- обработка СК; 3- обработка ЖК; 4- штамм 4ВД; 5- обработка СК+ штамм 4ВД; 6- обработка ЖК+ штамм 4ВД; 7- штамм 9 МН; 8- обработка СК+ штамм 9МН;

9- обработка ЖК+ штамм 9 МН. I – 24, II – 48, III – 72 ч после инокуляции, соответственно.

Результаты исследований показали, что при инфицировании высокоагрессивным штаммом уровень экспрессии гена оксалатоксидазы в растениях значительно ниже, чем при инфицировании низкоагрессивным штаммом (рис. 4 А), что напрямую отражается на активности фермента (рис. 4 Б). Интересно, что в предобработанных СК растениях но, особенно ЖК, экспрессия гена оксалатоксидазы повышается при инфицировании высокоагрессивным штаммом (рис. 4 - 8, 9).

Рис.5. Экспрессия гена пероксидазы TC 151917 (А) и активность фермента (Б) в листьях пшеницы при инфицировании штаммами S.nodorum различной агрессивности.

1- контроль; 2- обработка СК; 3- обработка ЖК; 4- штамм 4ВД; 5- обработка СК+ штамм 4ВД; 6- обработка ЖК+ штамм 4ВД; 7- штамм 9 МН; 8- обработка СК+ штамм 9МН;

9- обработка ЖК+ штамм 9 МН. I – 24, II – 48 ч после инокуляции, соответственно.

Важным ферментом, участвующим в регуляции содержания Н2О2 в растительных тканях является пероксидаза. Любопытно, в отличие от оксалатоксидазы, усиление экспрессии гена анионной пероксидазы происходило как при инфицировании низкоагрессивным, так и высокоагрессивном штаммом гриба (рис. 5 А). Вероятно, тотальная активность фермента в начальные фазы развития септориоза не зависит от степени агрессивности патогена (рис. 5 Б).

Эндогенная пероксидаза растений с использованием Н2О2 способна окислять фенольные соединения, что связано с укреплением клеточных стенок в результате лигнификации. В наших экспериментах в контрольных неинфицированных листьях слабая зеленая флуоресценция, характерная для отложений лигнина, наблюдалась в клеточной стенке ксилемы и замыкающих клеток устьиц. Развитие возбудителя септориоза сопровождалось появлением в зоне роста патогена интенсивной зеленой флуоресценции в устьичных клетках и в прилежащих к ним эпидермальных и мезофилльных клетках (рис. 6, I). При этом при инфицировании растений высокоагрессивным штаммом количество флуоресцирующих клеток в листьях оказалось меньше (рис. 6, II), чем в варианте с инфицированием листьев низкоагрессивным штаммом (рис. 6, II).

  К  СК ЖК

Рис. 6. Автофлуоресценция лигнина в листьях пшеницы при инфицировании штаммами S. nodorum различной агрессивности и обработке салициловой и жасмоновой кислотами, 48 ч после инокуляции. I – низкоагрессивный штамм; II – высокоагрессивный штамм.

В варианте опыта с предобработкой растений СК при использовании как низкоагрессивного, так и высокоагрессивного штаммов количество флуоресцирующих клеток возрастало, однако в варианте опыта с предобработкой растений ЖК этот параметр соответствовал уровню инфицированного контроля.

Таким образом, патосистема «пшеница – низкоагрессивный штамм S. nodorum» характеризуется более интенсивной лигнификацией клеточной стенки в сравнении с патосистемой «пшеница – высокоагрессивный штамм S. nodorum». Вероятно, метаболиты высокоагрессивного штамма возбудителя септориоза, негативно влияя на экспрессию гена оксалатоксидазы, снижают эффективность защитного ответа, в том числе за счет процессов лигнификации в растительных тканях.

3. Роль грибной каталазы в регуляции уровня Н2О2 в растительных тканях и проявлении агрессивности патогена S. nodorum

Возможным фактором агрессивности и вирулентности возбудителя септориоза считается способность к секреции внеклеточной каталазы, поскольку это расширяет возможности патогена к росту и развитию в растениях, в том числе при повышенных концентрациях перекиси водорода.

Инфицирование пшеницы S.nodorum сопровождалось повышением каталазной активности в листьях растений (рис. 7). Причем, уровень каталазной активности в растениях, инфицированных высокоагрессивным штаммом, был значительно выше, чем при инфицировании низкоагрессивным штаммом на всем протяжении опыта (рис. 7). Подобные результаты были получены нами при культивировании изученных штаммов гриба в жидкой питательной среде.

.

Рис. 7. Активность каталазы в листьях пшеницы при инфицировании различными штаммами S. nodorum:

1 - неинфицированные листья;

2 – низкоагрессивный штамм 4ВД;

3 – высокоагрессивный штамм 9МН.

Поскольку выявленная каталазная активность могла быть обусловлена не только факторами растения, но и гриба, были проведены эксперименты, позволившие оценить экспрессию одного из генов каталазы S.nodorum SNOG_03173 в тканях пшеницы. Как видно из рис. 8, при инфицировании растений пшеницы высокоагрессивным штаммом 9МН, усиленная экспрессия гена каталазы проявлялась уже к 6-му ч после инфицирования и поддерживалась на относительно высоком уровне на протяжении всего опыта (120 ч). В то же время, при заражении пшеницы низкоагрессивным штаммом 4ВД усиление экспрессии гена каталазы SNOG_03173.1. выявлялось только через 24 ч после инокуляции, и оно было значительно ниже (рис. 8).

Рис. 8. Экспрессия гена каталазы SNOG_03173.1. гриба S.nodorum в листьях пшеницы сорта Жница: 1 – контроль (неинфицированные растения);

2 – низкоагрессивный штамм 4ВД;

3 – высокоагрессивный штамм 9МН;

4 – амплификаты ДНК гриба S.nodorum.

Полученные данные свидетельствует о том, что степень экспрессионной активности гена SNOG_03173.1. и, соответственно, уровень активности фермента каталазы, разлагающего Н2О2, являются одним из важных факторов, обеспечивающих высокую агрессивность и патогенность гриба S.nodorum.

4. Связь устойчивости пшеницы к S. nodorum с постинфекционным уровнем экспрессии генов оксалатоксидазы и пероксидазы в растениях

Исследования проводились на пяти районированных сортах пшеницы, предположительно характеризующихся различной степенью устойчивости к септориозу. Визуальные наблюдения за ростом и развитием возбудителя септориоза на эпидермисе листьев исследуемых сортов пшеницы выявило различную степень развития патогена, и соответственно, различную степень поражаемости листьев пшеницы. На листьях пшеницы сорта Казахстанская 10 уже через 24 ч после инокуляции мицелий гриба густо покрывал поверхность листа. В вариантах опыта с применением листьев пшеницы сортов Омская 36, Симбирка, Башкирская 26 и особенно Омская 35 развитие гриба было менее интенсивным.

Размеры инфекционного пятна через 120 часов после инокуляции на листьях исследуемых сортов различались более чем в два раза (табл. 2). Таким образом, наибольшую устойчивость к возбудителю септориоза проявляли растения сорт Омская 35, наименьшую – Казахстанская 10, сорта пшеницы Омская 36, Симбирка, Башкирская 24 по степени инфицируемости листьев заняли промежуточное положение.

Таблица 2

Площадь инфекционного пятна и постинфекционный уровень экспрессии генов оксидоредуктаз (% к контролю) в листьях пшеницы различных сортов пшеницы

Cорта пшеницы с различной полевой устойчивостью

Площадь инфекционного пятна, мм2

Экспрессионная активность гена оксалатоксидазы AJ556991.1

Экспрессионная активность гена пероксидазы

TC151917

Омская 35

7,3 ± 0,3

227

200

Омская 36

9,1± 0,4

150

175

Симбирка

12,6±0,9

194

124

Башкирская 24

15,9 ±1,1

120

102

Казахстанская 10

19,6 ±1,3

120

101

Дальнейшие исследования по выявлению зависимости между размером инфекционного пятна и уровнем транскрипционной активности генов, кодирующих белки, которые принимают непосредственное участие в защитных реакциях растений (оксалатоксидаза, пероксидаза) показали, что уровень экспрессии генов защитных белков в целом снижается при увеличении размеров инфекционного пятна, т.е. более устойчивые сорта характеризуются и высокой экспрессионной активностью (табл. 2).

ВЫВОДЫ

1. Инфицирование пшеницы возбудителем септориоза S. nodorum  усиливает экспрессию генов оксидоредуктаз в растительных тканях,  и соответственно, повышает уровень активности кодируемых ферментов, что свидетельствует об их участии в формировании и реализации защитных реакций растений к патогену.

2. Сигнальные молекулы (салициловая и жасмоновая кислоты) оказывают защитное действие на растения пшеницы при инфицировании S. nodorum, индуцируя в них генерацию супероксидного радикала и перекиси водорода. Салициловая кислота вызывает более раннее индуцирующее действие на уровень АФК, чем жасмоновая кислота. Защитное действие сигнальных молекул против возбудителя септориоза обусловлено активацией оксалатоксидазы, анионной пероксидазы, ингибиторов протеиназ и снижением активности каталазы.

3. Патосистема «пшеница – низкоагрессивный штамм S. nodorum» характеризуется более интенсивной лигнификацией клеточной стенки по сравнению с патосистемой «пшеница – высокоагрессивный штамм S. nodorum». Повышенный синтез лигнина в зоне инфицирования обеспечивается высоким уровнем экспрессии генов оксалатоксидазы и анионной пероксидазы.

4. Впервые выявлена связь между степенью агрессивности гриба S. nodorum и уровнем активности внеклеточной каталазы патогена. Высокая экспрессионная активность гена каталазы и, соответственно, повышенный уровень активности фермента, участвующего в регуляции уровня Н2О2 в зоне инфицирования, является одним из биохимических факторов, обеспечивающих высокую агрессивность и патогенность штамма S.nodorum.

5. Выявлена связь устойчивости сортов пшеницы к возбудителю септориоза с уровнем экспрессии генов оксидоредуктаз в растениях: наименьшую поражаемость возбудителем септориоза проявляют сорта, характеризующиеся высоким уровнем экспрессии генов оксалатоксидазы и пероксидазы в инфицированных тканях.

Публикации по теме диссертации в изданиях,

рекомендованных ВАК РФ

  1. Яруллина Л.Г., Трошина Н.Б., Черепанова Е.А., Заикина Е.А., Максимов И.В. Салициловая и жасмоновая кислота в регуляции про-антиоксидантного статуса листьев пшеницы при инфицировании Septoria nodorum Berk.// Прикладная биохимия и микробиология. 2011, № 5. С. 602608.
  2. Заикина Е.А., Бурханова Г.Ф., Яруллина Л.Г. Сигнальная регуляция экспрессии оксидоредуктаз в системе «растение – грибной патоген» // Вестник Уральской медицинской академической науки, тематический выпуск по микробиологии, иммунологии и биотехнологии. № 4/1 (38). Екатеренбург, 2011. – С. 98-99.
  3. Ахатова А.Р., Яруллина Л.Г., Шпирная И.А., Заикина Е.А., Сурина О.Б., Ибрагимов Р.И. Активность гидролаз, их ингибиторов в тканях растений при заражении фитопатогенами и обработке индукторами устойчивости // Вестник Башкирск. ун-та. - 2012. - Т.18, №3. - С. 1278-1281.

Публикации в сборниках и материалах всероссийских

и международных конференций

  1. Бурханова Г.Ф., Яруллина Л.Г., Кузьмина О.И., Заикина Е.А., Максимов И.В. Анализ экспрессии генов защитных белков в растительных тканях при грибном патогенезе и обработке иммуностимуляторами // «Первые Международные Беккеровские чтения». Волгоград, 2010, ВГУ, С.31-33.
  2. Яруллина Л.Г., Бурханова Г.Ф., Заикина Е.А., Максимов И.В. Хитоолигосахариды и сигнальные молекулы в регуляции активности защитных белков растений // «Биологическая защита растений – основа стабилизации агроэкосистем» Краснодар, 2010, С. 634-636.
  3. Заикина Е.А., Бурханова Г.Ф., Яруллина Л.Г., Максимов И.В. Салициловая и жасмоновая кислоты в регуляции продукции АФК и экспрессии гена оксалатоксидазы в растениях пшеницы при инфицировании Septoria nodorum Berk // «Актуальные проблемы ботаники и экологии». Симферополь: ВД «Ариал», 2010, С. 353-355.
  4. Бурханова Г.Ф., Заикина Е.А., Яруллина Л.Г., Максимов И.В. Регуляция экспрессионной активности гена анионной пероксидазы пшеницы и картофеля сигнальными молекулами при инфицировании грибными патогенами // «Актуальные проблемы ботаники и экологии». Симферополь: ВД «Ариал», 2010, С. 335-336.
  5. Бурханова Г.Ф., Заикина Е.А., Касимова Р.И., Яруллина Л.Г. Индукция устойчивости растений к патогенным грибам элиситорами и сигнальными молекулами // «Биология будущего: Традиции и инновации». Екатеринбург: АМБ, 2010, С. 84-86.
  6. Яруллина Л.Г., Бурханова Г.Ф., Заикина Е.А. Регуляция экспрессионной активности гена оксалатоксидазы в растениях пшеницы при инфицировании SEPTORIA NODORUM BERK. // VII Съезд общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий», 2011, Нижний Новгород, С. 797-798.
  7. Яруллина Л.Г., Ибрагимов Р.И., Бурханова Г.Ф., Заикина Е.А., Марданшин И.С., Шпирная И.А.. Молекулярно-биохимические механизмы индуцированной устойчивости растений // «Интегрированная защита растений: стратегия и тактика». Минск, 2011. – С. 821-825.
  8. Заикина Е.А., Трошина Н.Б., Бурханова Г.Ф., Яруллина Л.Г. Влияние салициловой и жасмоновой кислот на экспрессионную активность гена оксалатоксидазы и развитие защитного ответа в листьях пшеницы при инфицировании различными по агрессивности штаммами Septoria nodorum BERK. // «Биомика – наука XXI века», Уфа, 2011, С. 38-40.
  9. Заикина Е.А., Бурханова Г.Ф., Яруллина Л.Г. Оценка уровня экспрессии генов оксидоредуктаз в листьях пшеницы при обработке сигнальными молекулами и инфицировании различными по агрессивности штаммами Septoria nodorum Berk. // Материалы II всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации» 15 октября 2012 г., Екатеринбург – С. 203-206.
  10. Ахатова А.Р., Заикина Е.А., Яруллина Л.Г. Влияние салициловой и жасмоновой кислот на уровень активности гидролаз и их ингибиторов в листьях пшеницы при инфицировании различными штаммами возбудителя септоиоза // Материалы II всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации» 15 октября 2012 г., Екатеринбург – С. 191-194.
  11. Яруллина Л.Г., Трошина Н.Б., Заикина Е.А., Сурина О.Б., Ахатова А.Р. Индуцированное накопление лигнина в системе «растение – грибной патоген» // Материалы докладов VIII международного симпозиума «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» Москва, 25 октября 2012 г.– С. 501-506.
  12. Заикина Е.А., Бурханова Г.Ф., Касимова Р.И., Ахатова А.Р., Яруллина Л.Г. Экспрессионная активность генов оксидоредуктаз в листьях пшеницы различной устойчивости при инфицировании Septoria nodorum // Материалы III Всероссийской школы-конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века».- Уфа: ИБГ УНЦ РАН, 2012г. – С. 42.

Список сокращений


АФК – активные формы кислорода

БАПНА – N, -бензоил -DL-аргинин -4- нитроанилид

ДАБ – диаминобензидин

ЖК – жасмоновая кислота

СК – салициловая кислота

НТС – нитротетразолий синий

ПЦР – полимеразно-цепная реакция

ФБ – Na-фосфатный буфер

pI – изоэлектрическая точка

Н2О2 – пероксид водорода

О2- – супероксиданион




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.