WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ЮШИНА Инна Алексеевна

РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ ХЕМОКИНОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТЕ

03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Белгород – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном  автономном образовательном учреждении высшего  профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" Минобрнауки РФ

Научный руководитель: Чурносов Михаил Иванович

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Полоников Алексей Валерьевич

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО "Курский государственный медицинский университет" Минздравсоцразвития РФ, профессор кафедры биологии, медицинской генетики и экологии 

Щипков Валерий Петрович

доктор медицинских наук, профессор, ФГБОУ ВПО "Российский университет дружбы народов» Минобрнауки РФ, и.о. заведующего кафедрой биологии и общей генетики

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО "Московский государственный медико-стоматологический университет" Минздравсоцразвития РФ

Защита диссертации состоится  «___» ___________ 2012 года в «____» часов на заседании совета по защите  диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАО  ВПО "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ  ВПО "Белгородский государственный национальный исследовательский университет"

Автореферат разослан  «____»____________2012 г.

Ученый секретарь совета по защите

диссертаций на соискание ученой

степени кандидата наук, на соискание

ученой степени доктора наук Д 212.015.13

доктор биологических наук                                                 В.И. Кочкаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы. Хронический гломерулонефрит (ХГН) является мультифакториальным прогрессирующим заболеванием почек в результате которого развивается длительный воспалительный процесс, текущий волнообразно, что приводит в итоге к склерозу, гиалинозу, запустеванию клубочков, развитию хронической почечной недостаточности. [Кутырина, 2002, Syrjanen et al., 2002; Картамышева и др., 2004]. Хроническая почечная недостаточность — острейшая социально-экономическая проблема. Важность проблемы хронической почечной недостаточности с медицинской, социальной и организационной точек зрения обусловлена высокой летальностью, инвалидизацией и сложностью технического обеспечения современных методов лечения этой патологии [Ермоленко, 2006]. В настоящее время в мире жизнь более 1 млн больных продолжается благодаря замещающей терапии и 2/3 из них проводят хронический гемодиализ. В развитых странах число больных, находящихся на хроническом гемодиализе, составляет 600-1100 на 1 млн населения. Необходимо отметить, что подавляющее число пациентов с данной патологией являются лицами трудоспособного возраста [Тареева, 2000; Rabelink, 2000].

       Хронический гломерулонефрит является генетически детерминированным иммуновоспалительным заболеванием [Шулутко, 2003], важное значение в развитии которого, как свидетельствуют данные литературы, играют хемокины [Vielhauer et al., 2004; Eis et al., 2004; Anders et al., 2010]. Хемокины это пептидные низкомолекулярные иммуномодуляторы обладающие свойствами хемоаттрактантов [Зак и др., 2006; Попова и др, 2006]. Они контролируют миграцию различных видов лейкоцитов, имеющих к ним рецепторы из кровяного русла в ткани, очаги воспаления, аутоиммунного процесса, участвуют в активации и дифференциации лейкоцитов, ангиогенезе, фиброгенезе [Schneider et al., 1999; Ukkonen et al., 2007; Chow et al., 2007; Nishioka et al., 2007].

       Исследованию молекулярно-генетических основ хронического гломерулонефрита посвящено значительное количество работ как зарубежных [Patrakka et al., 2002; Syrjanen et al., 2002; Kim 2003; Acharya et al., 2005; Zhu, 2005; Chin et al., 2005] так и отечественных [Камышова, 2004; Калиев и др, 2004; Петросян и др., 2006; Шестаков, 2006; Некипелова и др., 2006; Шарнова и др., 2007; Калмыкова, 2009; Литовкина, 2011] авторов. Однако, следует отметить, что значение генетических факторов хемокинов при формировании хронического гломерулонефрита к настоящему времени изучено не достаточно. Исследования роли полиморфных маркеров генов хемокинов в отношении хронического гломерулонефрита в нашей стране не проведены.

Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (государственный контракт №П384 «Разработка молекулярно-генетических основ мультифакториальной патологии человека (на модели генов цитокинов)»).

Цель исследования:

Изучить полиморфизмы генов хемокинов и рассмотреть их клиническое значение при хроническом гломерулонефрите.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

  1. Изучить распределение генетических полиморфизмов хемокинов (+1931А/Т MIP1, A/G I-TAC (rs4512021), -403A/G RANTES, C/G MCP1(rs2857657), -801G/A SDF1) у больных хроническим гломерулонефритом и в популяционном контроле.
  2. Исследовать особенности гуморального иммунитета у больных ХГН и определить роль молекулярно-генетических маркеров в его формировании.
  3. Проанализировать взаимосвязи генов-кандидатов с клиническим течением ХГН.
  4. Рассмотреть влияние генетических факторов на характер прогрессирования ХГН.
  5. Оценить ассоциации генетических полиморфизмов с эффективностью терапии ХГН.

Научная новизна. Впервые изучен генетический полиморфизм хемокинов – регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (-403A/G RANTES), моноцитарного хемоаттрактантного протеина 1 (C/G MCP1, rs2857657), макрофагального воспалительного протеина 1 (+1931А/Т MIP1), интерферон индуцибельного хемоаттрактанта Т-клеток (A/G I-TAC, rs4512021), фактора стромальных клеток (-801G/A SDF1) у больных хроническим гломерулонефритом русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья России.

Впервые определены генетические маркеры хемокинов, связанные с особенностями гуморального иммунитета у больных хроническим гломерулонефритом. Установлены молекулярно-генетические факторы неблагоприятного клинического течения хронического гломерулонефрита. Показаны связи генов-кандидатов с развитием терминальной стадии хронической почечной недостаточности. Выявлены ассоциации генетических полиморфизмов хемокинов с эффективностью лечения ХГН.

       Научно-практическое значение. Полученные результаты вносят вклад в расшифровку молекулярно-генетических механизмов формирования хронического гломерулонефрита. Для выявления пациентов группы риска с неблагоприятным прогнозом клинического течения хронического гломерулонефрита (непрерывно-рецидивирующее течение заболевания, высокий уровень артериального давления, сниженная клубочковая фильтрация и повышенный уровень креатинина) рекомендуется проведение молекулярно-генетического тестирования полиморфизмов моноцитарного хемоаттрактантного протеина 1 и интерферон-индуцибельного хемоаттрактанта Т-клеток. В качестве маркера развития терминальной

стадии хронической почечной недостаточности может использоваться A/G I-TAC (rs4512021). Для определения индивидуальной стратегии терапии хронического гломерулонефрита рекомендуется применять генетический маркер +1931А/Т MIP1. Результаты исследования используются в учебном процессе при преподавании медицинской генетики в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Положения, выносимые на защиту:

  1. Молекулярно-генетические маркеры хемокинов ассоциированы с клиническим течением хронического гломерулонефрита.
  2. Гены – кандидаты связаны с особенностями гуморального иммунитета при хроническом гломерулонефрите.
  3. Генетическими детерминантами терминальной стадии хронической почечной недостаточности являются G I-TAC и GG I-TAC (rs 4512021).
  4. Эффективность монотерапии цитостатиками зависит от генетического полиморфизма +1931 А/T MIP1.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: межрегиональной (с международным участием) научно – практической конференции « Социальная экология в изменяющейся России: проблемы и перспективы» (Белгород, 2007), VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке: Концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), XV Российском национальном конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 2008), 43-й Всероссийской научной конференции с международным участием студентов и молодых учёных «Актуальные проблемы теоретической, эспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень, 2009), 63-й итоговой научной конференции молодых учёных с международным участием (Ростов-на-Дону, 2009), IX Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых учёных по медицине (Тула, 2010), V Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2010), IV Международной научной конференции молодых учёных – медиков (Курск, 2010), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011)

Личный вклад автора. Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора: на этапах постановки цели и задач, разработки методов и их выполнения, проведения исследования, обработки, анализе и обобщения полученных результатов, апробации результатов исследования, подготовки публикаций по выполненной работе, написания и оформления рукописи.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 в журналах из списка ВАК. Получен патент на изобретение.





       Структура и объем диссертации. Диссертация  состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы, практические рекомендации и список литературы. Материалы диссертации изложены на 135 страницах машинописного текста и содержат 28 таблиц и 28 рисунков. Библиографический указатель содержит 212 наименование, из которых 144 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Медико-биологическая характеристика обследованных больных

Группу исследования составили 700 человек: 238 больных хроническим гломерулонефритом и 462 человека популяционного контроля. В нее включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющие родства между собой. Среди больных ХГН мужчин было 127 человек (53,4%), женщин – 111 (46,6%). В популяционной выборке  (n=462) распределение по полу было следующим: мужчины – 250 человек (54,1%), женщины – 212 (45,9%).  Средний возраст больных составил 39,58±14,58 лет (варьировал от 15 до 76 лет), в популяционной выборке – 42,20±6,28 лет (варьировал от 18 до 79 лет). (р>0,05).

Клинико-лабораторное обследование и формирование выборки больных проводилось на базе отделения нефрологии Белгородской областной клинической больницы. Среди 238 больных ХГН детально изучены клинические характеристики хронического гломерулонефрита в дебюте и течении заболевания, оценен характер прогрессирования ХГН и эффективность его терапии.

Всем больным ХГН и индивидуумам популяционного контроля проведено молекулярно-генетическое типирование полиморфных маркеров хемокинов: однонуклеотидные полиморфизмы регулятора активности нормальной экспрессии Т-клеток (-403G/A RANTES), фактора стимулятора роста предшественников - клеток (-801 G/A SDF1), моноцитарного хемоаттрактантного протеина 1 (C/G MCP1,rs2857657), интерферон индуцибельного -хемоаттрактанта Т- клеток (A/G I-TAC,rs4512021), макрофагального воспалительного протеина 1 (+1931A/T MIP1).

Генотипирование осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета.

Молекулярно-генетические методы

Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 4-5 мл, взятая из локтевой вены пробанда. Забор венозной крови производили в пробирки с консервантом, содержащим 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.0).

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществлялось методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew, 1984]. Анализ всех локусов (-403G/A RANTES, -801 G/A SDF1, C/G MCP1 (rs2857657), A/G I-TAC (rs4512021), +1931A/T MIP1) проводился методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК с использованием ДНК полимеразы Thermus aquatus производства «Силекс - М», олигонуклеотидных праймеров и зондов синтезированных фирмой «Синтол» (табл. 1). Генотипирование осуществлялось на амплификаторе  IQ5 (Bio-Rad) в режиме real time с использованием метода дискриминации аллелей (метод Tag Man зондов).

Таблица 1

Структура праймеров и зондов, использованных для генотипирования ДНК-маркеров методами ПЦР

Полимор-физм

Структура праймеров, зондов

Литература

-403 G/A RANTES

F: 5’- CTG AGT CAC TGA GTC TTC AAA GTT CC -3’

R: 5’- TCC AGA GGA CCC TCC TCA ATA A -3’

5’-FAM- AAA GGA GGT AAG ATC TGT AAT - RTQ1-3’

5’-ROX- AAA GGA GAT AAG ATC TGT AAT G - BHQ2-3’

[Yazdanpanah et.al., 2007]

A /G I-TAC (rs4512021)

F: 5’ – CAA AGA CCT AAG GGA ACT AGG TGA TAG – 3’

R: 5’ – GTG TCT TCC CAA TGT GTG TTC CT – 3’

5’-FAM- ATG ACT CTG GCT AGT C - RTQ1-3’

5’-ROX- AGC ATG ACT CCG GCT A - BHQ2-3’

[Prasad et.al., 2006]

C/G MCP1 (rs285765)

F: 5’- GTA TAG GCA GAA GCA CTG GGA TTT A -3’

R: 5’- CAG AAA AGA GTC ATG AGG AAA AAG CA -3’

5’-FAM- ATG AGC TCT TTG TCT TCT - RTQ1-3’

5’-ROX- ATG AGC TCT TTC TCT TCT - BHQ2-3’

[Jalilian et.al, 2008]

+1931 A/T MIP1

F: 5’- CAA GGG TTT TAA CAC CCT TAT GAA C -3’

R: 5’- CCA AGC AGG CCT ACA AGC TT -3’

5’-FAM- TTT CCT TAA CTG TGA AAC T - RTQ1-3’

5’-ROX- TTT CCT  TAA CAG TGA AAC T - BHQ2-3’

[Ardigo et. al., 2005]

-801 G/A SDF1

F: 5’- AGC TTT GGT CCT GAG AGT CC -3’

R: 5’- CAG TCA ACC TGG GCA AAG CC -3’

5’-FAM- TGG GAG CCG GGT CTG CCT CT - RTQ1-3’

5’-ROX- ACA TGG GAG CCA GGT CTG CCT CTT-BHQ2-3’

[Yazdanpanah et.al., 2007]

Статистические методы

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программного пакета «STATISTICA 6.0». Определение фенотипических и генных частот проводили стандартными методами [Животовский, 1983]. Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использовали критерий χ2  [Вейр, 1995].

Ассоциации молекулярно-генетических маркеров с формированием ХГН, а также с качественными признаками, характеризующими его клинические особенности оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2х2 с расчетом критерия 2 с поправкой Йетса на непрерывность и отношением шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (95%CI) [Schlesselman, 1982]. При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони, минимизирующей вероятность ложноположительных результатов (ошибки 1-го рода) [Реброва, 2006]. При изучении связей генетических полиморфизмов с клинически значимыми количественными признаками ХГН оценивали характер распределения исследуемых признаков с использованием критерия Шапиро-Уилка. При нормальном распределении признака для его описания использовали среднее арифметическое значение и ошибку среднего арифметического значения, а для сравнительного анализа – критерий Стьюдента. При несоответствии закону нормального распределения для описания признака применяли медиану (Me) и интерквартильный размах (Q25-Q75), а для сравнительного анализа – критерий Манна-Уитни [Реброва, 2006].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.Изучение роли полиморфных маркеров генов хемокинов в возникновении и клиническом течении хронического гломерулонефрита

При исследовании распределения частот генотипов среди больных ХГН и в популяционном контроле выявлено, что для всех рассматриваемых локусов выполняется равновесие Харди-Вайнберга (р>0,05). Уровень аллельного разнообразия по исследованным полиморфизмам варьировал от Н0=0,27 (для локуса  C/G MCP1 (rs2857657)) до Н0=0,49 (для локуса A/G I-TAC, rs4512021) в популяционной выборке и от Н0=0,27 (-801G/A SDF1) до Н0=0,46 (A/G I-TAC, rs4512021) среди больных ХГН.

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфных локусов хемокинов между больными ХГН и популяционным контролем не выявил достоверных отличий (табл. 2). Эти данные могут свидетельствовать о том, что рассмотренные нами хемокины не являются этиологическими факторами хронического гломерулонефрита, что полностью согласуется с современными представлениями о функциональной роли данных хемокинов. Являясь хемотаксическими факторами, контролируя миграцию различных видов лейкоцитов из кровяного русла в ткани [Зак и др.,2002, Попова, 2006], они играют важную роль в развитии воспалительных процессов и, следовательно, будут иметь важное значение не в этиологии, а в патогенезе хронического гломерулонефрита. Исследование ассоциаций генетических полиморфизмов хемокинов с клиническими признаками хронического гломерулонефрита, проведенное в настоящей работе, выявило важную роль молекулярно-генетических маркеров хемокинов в патогенезе ХГН.

Установлено, что полиморфный генетический маркер -403 G/A RANTES связан с развитием нефротического синдрома в дебюте ХГН: его распространенность у пациентов с этим синдромом составила 91,84%, что превышает данные популяционного контроля (82,12%, OR=2,45 95%СI 1,12-5,57, 2=5,24, p=0,02). Согласно литературным данным повышение продукции регулятора активности экспрессии и секреции Т-клеток (RANTES)  в почечных канальцах и мезенхимальных элементах почек обуславливает  активизацию миграции в воспаленные участки почек большого количества лейкоцитов, преимущественно моноцитов, макрофагов, которые секретируют широкий спектр провоспалительных цитокинов  [ Попова и др., 2006; Сhow et al., 2007; Prasad еt al., 2007].

Таблица 2

Распределение полиморфных маркеров генов хемокинов среди больных ХГН и в популяционном контроле (%)

Локусы

Аллели, генотипы

Больные ХГН

(n=238)

Контрольная группа (n=462)

ОR

(95% СI)

2, р

n

%

n

%

+1931А/Т MIP1

+1931T

125

27,78

246

27,27

0,97

(0,75-1,27)

2=0,02; p=0,90

+1931A

325

72,22

656

72,73

+1931TT

14

6,22

31

6,87

0,90

(0,45-1,79)

2=0,02; p=0,87

+1931AT

97

43,12

184

40,80

1,10

(0,79-1,54)

2=0,24; p=0,62

+1931AA

114

50,66

236

52,33

0,93

(0,67-1,30)

2=0,10 p=0,74

Ho (He)

0,43 (0,40)

0,41 (0,40)

A/G I-TAC

(rs4512021)

A

223

60,93

501

56,04

1,22

(0,95-1,59)

2=2,34; p=0,13

G

143

39,07

393

43,96

AA

69

37,70

142

31,77

1,30

(0,89-1,89)

2=1,79; p=0,18

AG

85

46,45

217

48,55

0,92

(0,64-1,31)

2=0,15; p=0,69

GG

29

15,85

88

19,69

0,77

(0,47-1,24)

2=1,02; p=0,31

Ho (He)

0,46 (0.47)

0,49 (0,49)

403G/A

RANTES

-403G

305

82,88

698

82,12

1,05(0,75-1,48)

2=0,05; p=0,81

-403A

63

17,12

152

17,88

-403GG

125

67,93

286

67,29

1,03

(0,68-1,50)

2=0,06; p=1,00

-403GA

55

29,89

126

29,65

1,01

(0,68-1,50)

2=0,01; p=1,00

-403AA

4

2,18

13

3,06

0,70

(0,19-2,36)

2=0,12 p=0,73

Ho (He)

0,30 (0,28)

0,30 (0,29)

C/G MCP-1 (rs2857657)

С

370

81,14

760

84,44

0,79

(0,58-1,08)

2=2,15; p=0,14

G

86

18,86

140

15,56

CC

152

66,67

320

71,11

0,81

(0,57-1,16)

2=1,21; p=0,27

CG

66

28,94

120

26,67

1,12

(0,77-1,62)

2=0,29; p=0,59

GG

10

4,39

10

2,22

2,00

(0,77-5,32)

2=1,77; p=0,18

Ho (He)

0,29 (0,30)

0,27 (0,26)

-801G/A

SDF1

-801G

375

82,96

759

82,86

1,01

(0,74-1,38)

2=0,00; p=1,00

-801 A

77

17,04

157

17,14

-801GG

157

69,47

313

68,34

1,05

(0,74-1,51)

2=0,45; p=0,83

-801GA

61

26,99

133

29,04

0,90

(0,62-1,31)

2=0,22; p=0,64

-801AA

8

3,54

12

2,62

1,36

(0,50-3,64)

2=0,19 p=0,68

Ho (He)

0,27 (0,28)

0,29 (0,30)

Примечание: H0 – наблюдаемая гетерозиготность; HE - ожидаемая гетерозиготность;

Выявлена ассоциация молекулярно-генетического маркера -801G/A SDF1 с развитием гематурического синдрома, а генетического полиморфизма A/G I-ТAC (rs 4512021) с возникновением тяжелой артериальной гипертензии в течении хронического гломерулонефрита. У больных с гематурической формой ХГН распространенность аллеля -801А SDF(27,78%) достоверно привышает аналогичный показатель контрольной группы (17,14%, OR=1,85 95%СI 1,04-3,30, 2=4,44, p=0,04). Среди пациентов с ХГН, имеющих тяжелую форму артериальной гипертензии (артериальное давление более 160/110 мм.рт.ст.), частота аллеля А I-ТAC (68,78%) является наибольшей по сравнению с популяционным контролем (56,04%, OR=1,65 95%СI 1,02-2,69 2=4,13, p=0,04).

С характером течения хронического гломерулонефрита и уровнем диастолического артериального давления связан полиморфный локус С/G MCP1 (rs 2857657). У пациентов с непрерывно - рецидивирующим течением ХГН частота аллеля G MCP1 (rs 2857657) равняется 24,69% и статистически достоверно превышает соответствующий показатель как среди больных ХГН с частотой обострения один раз в год и реже (16,54%, 2=3,77, p=0,05) так и среди  индивидуумов контрольной группы (15,56%, OR=1,78 95% CI 1,16-2,70, 2=7,50, p=0,007) (рис. 1).

Рис.1. Частота аллеля G MCP1 (rs 2857657) среди групп больных ХГН в зависимости от частоты обострения заболевания и в контрольной группе, %

Установлено, что у больных ХГН с генетическими маркерами GG и CG MCP1 уровень диастолического артериального давления (медиана составила 100,00 мм. рт.ст. нижний процентиль -80,0 мм.рт.ст., верхний процентиль– 110,00 мм. рт. ст.) был достоверно выше соответствующего показателя пациентов с генотипом CС MCP1 (медиана 100,00 мм. рт. ст., интерпроцентильный размах 70,0- 110,00 мм. рт. ст., р=0,01) (рис. 2).

Рис.2. Ассоциации генетического полиморфизма C/G MCP1 (rs 2857657) с уровнем диастолического артериального давления у больных хроническим гломерулонефритом

В основе выявленных ассоциаций генетического полиморфизма C/G MCP1 с клиническими особенностями хронического гломерулонефрита могут лежать следующие медико-биологические механизмы. Моноцитарный хемоаттрактантный протеин 1 (MCP1), секретируемый в больших количествах в тубулярных и мезенхимальных клетках почек в очаге поражения, является главным триггером, направляющим поток моноцитов /макрофагов и их адгезию в этот орган, которые затем активно продуцируют комплекс провоспалительных цитокинов, вызывающих в конечном итоге склероз гломерул и фиброз интерстициальной ткани [Stasikowska еt al., 2007; Zhang еt al., 2007; Anders et al., 2010].

2.Молекулярно-генетические маркеры и особенности гуморального иммунитета у больных ХГН

Сравнительное изучение показателей гуморального иммунитета у больных ХГН (n=164) и индивидуумов контрольной группы (n=62) выявило более высокие концентрации иммуноглобулина А и иммуноглобулина G у пациентов с хроническим гломерулонефритом (3,75±0,14г/л и 18,85±0,56г/л, соответственно) по сравнению с контрольной группой (2,98±0,15г/л и 12,42±0,73г/л, соответственно р<0,001). О значительных нарушениях в системе гуморального иммунитета при хроническом гломерулонефрите свидетельствуют и материалы работ [Syrjanen et al., 2002; Chin, 2005].

При анализе концентрации  иммуноглобулинов у больных ХГН, в зависимости от наличия и выраженности ХПН установлено что, во- первых, больные ХГН без ХПН отличаются от контрольной группы лишь по высокому содержанию IgG (20,28±0,85г/л против 12,42 ±0,74г/л в контроле, р< 0,001). Во - вторых, больные ХГН с ХПН существенно отличаются от контрольной группы по уровню рассмотренных иммуноглобулинов: концентрация IgA (3,96±0,18 г\л) и IgG (16,94 ±0,69г/л) выше, а содержание IgМ (2,43 ±0,11г/л) ниже, чем в контроле.

Выявлены связи генетических полиморфизмов +1931 A/T MIP1 и
-801G/A SDF1 с уровнем иммуноглобулинов у больных ХГН. У индивидуумов с генотипом +1931 ТТ MIP1 концентрация  иммуноглобулина G составила 22,02±2,02 г/л и была достоверно выше аналогичного показателя среди пациентов с генотипами +1931 AА и +1931 AT MIP1 (18,53±0,59 г/л, p=0,05).

Определены различия в характере ассоциаций молекулярно-генетических маркеров хемокинов с концентрациями иммуноглобулинов у больных с разной степенью активности процесса (стадии ремиссии и обострения) и у пациентов в зависимости от наличия ХПН. У больных с обострением хронического гломерулонефрита высокий уровень IgA (4,99±0,67 г/л) наблюдается у индивидуумов с генотипами – 801AA и - 801GA SDF1 по сравнению с пациентами с генотипом - 801 GG SDF1 (2,95±0,27 г/л, р=0,01). Выявлены связи генетического полиморфизма +1931А/Т MIP1 с концентрацией IgG в группе больных без ХПН: у индивидумов с генотипом +1931ТТ MIP1 концентрация иммуноглобулина G составила 25,58±1,62 г/л и была в 1,3 раза выше соответствующего показателя среди больных с генетическими маркёрами +1931АА и +1931АТ MIP1 (19,86±0,89 г/л, р=0,02).

3. Ассоциации генетических полиморфизмов хемокинов с характером прогрессирования ХГН

Проведен анализ ассоциаций молекулярно-генетических маркеров с показателями, характеризующими эффективность функционирования гломерулярного аппарата почек у больных ХГН - клубочковая фильтрация и уровень креатинина [Мосина и др., 2004]. Установлено, что пациенты с ХГН с генотипами АА и АG I-TAC (rs4512021) имеют значительно меньший показатель клубочковой фильтрации (медиана 74,0 мл/мин, нижний квартиль 14,0 мл/мин, верхний квартиль 104,0 мл/мин) (рис. 3) и более высокий уровень креатинина (медиана 119,0 мкмоль/л, нижний квартиль 94,4 мкмоль/л, верхний квартиль 541,0 мкмоль/л) по сравнению с индивидуумами с генотипом GG I-TAC (медиана 92,0 мл/мин, интерквартильный размах -74,0 - 108,0 мл/мин, р=0,05 и медиана 101,0 мкмоль/л, интерквартильный интервал – 87,0 – 181,0 мл/мин, р=0,05, соответственно).

Рис. 3. Ассоциации генетического полиморфизма A/G I - TAC (rs4512021) с показателем клубочковой фильтрации у больных ХГН

Различия в распределении аллелей и генотипов по локусу А/G I-TAC (rs4512021) определены нами и при сравнении больных достигших терминальной стадии хронической почечной недостаточности (ТХПН) (n=71) с популяционным контролем. Получено, что среди пациентов с ТХПН концентрация генотипа GG I-TAC (rs 4512021) составляет 5,08%, что практически в 4 раза меньше соответствующего показателя в контрольной группе (19,69%, OR=0,22, 95%CI 0,14-0,75, 2=6,57, p=0,01, pcor=0,03) (рис. 4). Аналогичной направленности данные получены и по частотам аллелей локуса A/G I-TAC: среди больных с ТХПН частота аллеля G I-TAC равняется 32,20%, тогда как в контрольной группе распространенность этого маркера составляет 43,96% (OR=0,61, 95CI% 1,08-2,54, 2=5,42, p=0,02). Следует отметить, что интерферон индуцибельный -хемоаттрактант Т-клеток (I-TAС) являясь хемотаксическим фактором для Т-лимфоцитов и активируя Th1СD4 Т-клетки, натуральные киллеры, моноциты в очаге поражения в организме (почки) [Cole et al., 1998], оказывает провоспалительное действие, обуславливая развитие значительных нарушений в гломерулярном аппарате и приводя к формированию терминальной стадии хронической почечной недостаточности [Тареева, 2000].

Рис. 4.  Распределение генотипа GG I-TAC (rs 4512021) среди больных хроническим гломерулонефритом с ТХПН и в популяционном контроле (%).

4. Гены-кандидаты и эффективность терапии хронического гломерулонефрита

Установлены ассоциации молекулярно-генетического маркера +1931 А/Т МIР1 с эффективностью терапии ХГН в группе пациентов получавших монотерапию цитостатиками (n=49) (рис. 5). Среди больных с отсутствием положительного эффекта от лечения цитостатиками (n=12) частота аллеля +1931Т МIР1 составила 8,33%, что более чем в 4 раза меньше аналогичного показателя у больных с положительным результатом от лечения цитостатиками (35,14%, 2 =5,13, р=0,02).

Рис. 5.  Частота аллеля +1931Т МIР1 среди больных ХГН, получавших монотерапию цитостатиками, с различной эффективностью лечения

ВЫВОДЫ

  1. Полиморфные генетические маркеры хемокинов +1931А/Т MIP1, A/G I-TAC (rs4512021), -403G/A RANTES, C/G MCP1(rs2857657), -801G/A SDF1 ассоциированы с клиническими характеристиками, уровнем иммуноглобулинов при хроническом гломерулонефрите, характером его прогрессирования и эффективностью терапии.
  2. Концентрации иммуноглобулинов классов A и G у больных ХГН в 1,3 -1,5 раза превышают показатели контрольной группы (р<0,001) и взаимосвязаны с развитием хронической почечной недостаточности. Маркером повышенного уровня IgG при хроническом гломерулонефрите является +1931ТТ MIP1, а высокие концентрации IgA в период обострения ассоциированы с - 801AA, - 801GА SDF1.
  3. Молекулярно-генетическим маркером непрерывно-рецидивирующего течения хронического гломерулонефрита служит G MCP1 (rs2857657), развитие нефротического синдрома в дебюте заболевания связано с -403G RANTES (OR=2,45), гематурический синдром в течении хронического гломерулонефрита маркирует аллель –801A SDF1(OR=1,86). Факторами риска формирования высокого уровня диастолического артериального давления являются GG и АG MCP1, развитие тяжёлой артериальной гипертензии связанно с A I-TAC (rs4512021).
  4. Сниженная клубочковая фильтрация и повышенный уровень креатинина ассоциированы с генотипами AA и АG I-TAC (rs4512021), а протективными факторами развития терминальной стадии хронической почечной недостаточности при хроническом гломерулонефрите являются G I-TAC(ОR=0,61) и GG I-TAC(ОR=0,22).
  5. Частота аллеля +1931Т MIP1 у пациентов, имеющих положительный эффект при монотерапии цитостатиками, составляет 35,14% и в 4,2 раза превышает распространенность этого маркера у больных с отсутствием эффекта от лечения (8,33%).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

  1. В нефрологических стационарах необходимо выявлять группы пациентов с неблагоприятным прогнозом течения хронического гломерулонефрита (непрерывно-рецидивирующее течение заболевания, высокий уровень артериального давления, сниженная клубочковая фильтрация, повышенный уровень креатинина) на основе молекулярно-генетического тестирования моноцитарного хемоаттрактантного протеина 1 (C/G в интроне 1 МСР1), интерферон  индуцибельного хемоаттрактанта Т-клеток (A/G I-TAC, rs4512021).
  2. При обследовании пациентов с хроническим гломерулонефритом в качестве маркера развития терминальной стадии хронической почечной недостаточности рекомендуется использовать генетический полиморфизм A/G I-TAC (rs4512021).
  3. Больным с хроническим гломерулонефритом, имеющим молекулярно-генетический маркер +1931Т MIP1, рекомендуется назначать монотерапию цитостатиками.

СПИСОК РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Юшина, И. А. Особенности гуморального иммунитета у больных хроническим гломерулонефритом / И. А. Юшина, М. И. Чурносов, Е. В. Некипелова // Социальная экология в изменяющейся России: проблемы и перспективы : материалы межрегион. (с междунар. участием) науч.-практ. конф., Белгород, 5-7 окт. 2007 г. : в 2 ч. / Рос. гуманит. науч. фонд, адм. Белгор. обл., БелГУ ; редкол.: В. В. Бахарев [и др.]. – Белгород, 2007. – Ч. 1. – С. 427-431.
  2. Некипелова, Е. В. Анализ гуморального иммунитета у больных хроническим гломерулонефритом / Е. В. Некипелова, М. И. Чурносов, И. А. Юшина // Вестник новых медицинских технологий. – Тула, 2007. – Т. XIV, № 4. – С. 112-114.
  3. Юшина, И. А. Анализ некоторых клинико-лабораторных показателей у больных хроническим гломерулонефритом / И. А. Юшина, М. И. Чурносов, Е. В. Некипелова // Здоровье и образование в XXI веке. Концепции болезней цивилизации : науч. тр. VIII междунар. конгр., Москва, 14-17 нояб. 2007 г. / РУДН, Сообщ. молодых врачей и организаторов здравоохранения, Проблем. комиссия «Хронобиология и хрономедицина» РАМН [и др.]. – М., 2007. – С. 716.
  4. Оценка роли генетических и иммунологических факторов в формировании хронической почечной недостаточности на фоне хронического гломерулонефрита / И. А. Юшина, Е. В. Калмыкова, Е. В. Некипелова [и др.] //Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». –2008. – № 2. – С. 117-125.
  5. Юшина, И. А. Особенности клинико-лабораторных показателей у больных хроническим гломерулонефритом в различных клинических группах / И. А. Юшина, М. И. Чурносов, Е. В. Некипелова // Человек и лекарство : XV рос. нац. конгр., Москва, 14-18 апр. 2008 г. : сб. материалов конгр. : тез. докл. / РАН, РАМН, Общерос. обществ. фонд «Здоровье человека». – М., 2008. – С. 376.
  6. Некоторые результаты молекулярно-генетического и иммунологического исследования больных с почечной патологией / И. А. Юшина, Е. В. Калмыкова, Е. В. Некипелова [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. – 2008. – № 6, вып. 6. – C. 55-65.
  7.        Молекулярно-генетические маркеры цитокинов: популяционная распространенность и связь с мультифакториальной патологией / Е. В. Калмыкова, Т. С. Тикунова, И. А. Юшина [и др.] // Вестник Российского университета дружбы народов. Сер. Медицина. – 2009. – № 4. – Р. 617-618.
  8. Юшина, И. А. Анализ клинико-лабораторных показателей в зависимости от клинических вариантов у больных ХГН / И. А. Юшина, Е. В. Некипелова, М. И. Чурносов // 63-я итоговая научная конференция молодых ученых Ростовского государственного медицинского университета с международным участием, посвященная 70-летию СНО (МНО), Ростов-на-Дону, 24 апр. 2009 г. : аннот. докл. и материалов дня науки РостГМУ / РостГМУ ; редкол.: А. А. Сависько [и др.]. – Ростов н/Д, 2009. – С. 81.
  9. Юшина, И. А. Сравнительный анализ некоторых гомеостатических функций почек у больных хроническим гломерулонефритом / И. А. Юшина, Е. В. Некипелова // Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации : материалы 43-й всерос. науч. конф. с междунар. участием студентов и молодых ученых / ТюмГМА ; гл. ред. И. В. Медведева, отв. за вып. И. Е. Задумина. – Тюмень, 2009. – С. 112.
  10. Юшина, И. А. Распределение генотипических полиморфных маркеров хемокина СХСL8 у больных хроническим гломерулонефритом / И. А. Юшина, Е. В. Некипелова, М. И. Чурносов // Материалы IV международной научной конференции молодых ученых-медиков, Курск, 25-26 февр. 2010 г. : в 3 т. / КГМУ, ВГМА, Центр.-Чернозем. центр РАМН [и др.] ; под ред. В. А. Лазаренко. – Курск, 2010. – Т. 3. – С. 443-445.
  11. Юшина, И. А. Материалы о распределении молекулярно-генетического полиморфизма +G/A 801SDF1 у больных хроническим гломерулонефритом / И. А. Юшина, Е. В. Некипелова, М. И. Чурносов // Медицинская генетика. – 2010. – Спец. вып. – С. 202. – (Материалы VI съезда Рос. о-ва мед. генетиков, Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г.).
  12. Юшина, И. А. Некоторые результаты молекулярно-генeтического исследования больных хроническим гломерулонефритом / И. А. Юшина // Вестник новых медицинских технологий. – Тула, 2010. – Т. 17, № 2 (прил.). – С. 134-135. – (IX всероссийская университетская научно-практическая конференция молодых ученых по медицине, Тула, 14 мая 2010 г. : сб. материалов / ТулГУ [и др.]).
  13. Эффективность терапии больных хроническим гломерулонефритом и полиморфизм гена MIP-1 / И. А. Юшина, Е. В. Некипелова, И. С. Полякова [и др.] // Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии : II всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Курск, 17-19 мая 2011 г. : сб. материалов / КГМУ, адм. Курской обл., Центр.-Чернозем. центр РАМН [и др.] ; отв. ред. В. П. Иванов. – Курск, 2011. – С. 379-380.

Патент на изобретение

  1. Способ дифференциальной диагностики форм хронического гломерулонефрита с хронической почечной недостаточностью и без почечной недостаточности : пат. 2364326 Рос. Федерация : МПК A61B5/00, G01N33/53 / М. И. Чурносов, Е. В. Некипелова, И. А. Юшина ; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Белгор. гос. ун-т». – № 2008124597/14 ; заявл. 16.06.2008 ; опубл. 20.08.2009.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.