WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синтез амидной связи является важной задачей в практике органической и фармацевтической химии. Однако существующие химические способы синтеза амидной связи не соответствуют требованиям «зеленой» химии и имеют ряд недостатков – как правило, они проводятся с использованием органических растворителей, включают стадии предварительной активации реагентов и не обладают достаточной регио- и стереоселективностью. Сокращение использования экологически опасных растворителей является принципиально важной проблемой, так как растворители вносят наибольший вклад в образование отходов фармацевтической промышленности1, которые, по оценкам экспертов, могут на 1-2 порядка превышать количество синтезируемого целевого продукта2.

Использование ферментов как катализаторов синтеза амидной связи в водной среде могло бы решить большую часть из перечисленных проблем. В связи с этим изучение кинетических и термодинамических закономерностей ферментативного ацилирования аминосоединений в водной среде представляет собой актуальную научную и практическую задачу.

Цель и задачи исследования. Задачей настоящего исследования явилось изучение термодинамики и кинетики реакций синтеза амидной связи, катализируемого пенициллинацилазами (ПА) из E.coli и A.faecalis в водной среде, с целью выявления факторов, определяющих эффективность ферментативных реакций.

Научная новизна и практическая значимость работы. Обнаружена линейная корреляция свободной энергии образования амидной связи в водной среде с кислотностью аминогруппы аминокомпонента. Впервые показано, что только время достижения максимального выхода является кинетически контролируемым параметром, в то время как сама величина максимального выхода определяется величиной константы равновесия реакции ферментативного ацильного переноса в водной среде, которую можно рассчитать из термодинамических данных для соответствующих реакций прямой конденсации. Показано, что эффективный ферментативный синтез амидов в водной среде может быть проведен в результате прямой конденсации карбоновой кислоты и аминосоединения, выявлены факторы, определяющие эффективность процесса, проведена оптимизация препаративного ацилирования аминосоединений.

Апробация работы. Результаты были доложены на международных конференциях: «Ломоносов-2004», «Biocatalysis-2005», «Advanced science in organic chemistry» (2006), «Biotechnology-2007», «Biocatalysis in non-convential media» (2008), «BioTrans-2009».

Публикации. По теме работы опубликованы 2 статьи в рецензируемых журналах, 8 тезисов докладов международных конференций.

J.S. Carey, D. Laffan, C. Thomson, M.T. Williams, Org. Biomol. Chem., 2006, 4, 2337–23 R.A. Sheldon, Green Chemistry, 2007, 9, 1273–12 Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 138 ссылок.

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, включает рисунка, 14 таблиц.

Результаты работы Термодинамика образования амидной связи В реакции образования амидной связи участвуют карбоксильная и аминогруппы, что определяет сильную зависимость константы равновесия реакции от pH среды. Для упрощения систематизации рассчитывают константы равновесия для реакции незаряженных форм кислоты и аминосоединения. При этом изменение энергии Гиббса при произвольных условиях можно представить в виде суммы трёх величин: термодинамической (или pH-независимой), относящейся к реакции незаряженных форм реагентов, pH-зависимой, учитывающей ионизацию реагентов, и составляющей, связанной с ионной силой среды. Этот подход позволяет рассчитывать pH-профиль энергии Гиббса реакции образования амидной связи.

В простейшем случае, когда субстраты не имеют других функциональных групп (Рис. 1), реакция нейтральных форм – это взаимодействие протонированной карбоксильной группы карбоновой кислоты с депротонированной аминогруппой аминосоединения. В данном случае энергию Гиббса, и каждую из ее составляющих можно представить следующим образом.

fS fHNu ' o KC KT 110 pH pKSH 110 pKHNu pH fP o o o' GC' GT Gion Go' f O KT O + R NHNH OH KHNu+ R KSH + R NHO O Рис. 1. Реакция нейтральных форм реагентов и ионизационные равновесия.

Соответствующие составляющие энергии Гиббса рассчитываются на основе соответствующих компонент равновесной константы по формуле:

G RT ln(K) pH-профиль энергии Гиббса реакции конденсации фенилуксусной кислоты и фенилглицинола имеет характерный параболический вид (Рис. 2А).

Cнижение концентрации протонированной формы фенилуксусной кислоты приводит к неблагоприятным для конденсации значениям в щелочной области, а в кислой области условия для синтеза неблагоприятны из-за снижения концентрации непротонированного аминосоединения. Рассчитанный pHпрофиль совпадает с экспериментально полученными данными, что свидетельствует об адекватности рассматриваемой модели.

А Б 0 2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 pH pH Рис. 2. (А) pH-профиль реакции конденсации фенилуксусной кислоты и L-фенилглицинола.

Равновесие достигалось при помощи катализатора - ПА из E.coli – при проведении реакций в кислой и нейтральной области pH (pH<7.5) и ПА из A.faecalis при проведении реакций в щелочной области (pH>7.5), (Б) pH-профиль реакции конденсации фенилуксусной кислоты с глицином. Сплошная линия соответствует модели, в которой реакционоспособной является аминокислота в нейтральной либо в анионной форме. Пунктирная линия соответствует модели, в которой реакционоспособными являются как нейтральная, так и анионная формы.

Эту модель можно расширить для более сложного случая с участием полифункциональных соединений, например, для синтеза N-ацильных производных аминокислот (рис. 3).

В данном случае формула для ионной составляющей энергии Гиббса существенно усложняется за счёт увеличения числа форм аминосоединения, но форма pH-профиля сохраняет параболический вид (рис. 2Б):

Kbase Kacid 0 KPH [H KSH [H ] Kbase Kacid [H ] 0' Gion R T ln KPH [H ] o' o' c c G ( kДж/моль ) G ( kДж/моль ) O O OH R O O O NH R KT + H2N O K±base O K0acid O O R KSH R + H3N O KPH R OH O O H2N OH K±acid O O NH K0base R + H3N OH Рис. 3. Ионизационные равновесия для реакции конденсации фенилуксусной кислоты с глицином (R=CH2) и 3-аминобензойной кислотой (R=Ar).

Зависимость потенциала Гиббса от природы аминосоединения в реакции образования амидной связи в фенилацетильных производных Для исследования влияния природы аминокомпонента на величину свободной энергии образования амидной связи исследовали реакции синтеза/гидролиза N-ацильных производных широкого круга аминосоединений (рис. 4).

Рис. 4. Реакция прямой конденсации фенилуксусной кислоты с различными аминосоединениями.

В качестве субстратов были выбраны фенилуксусная кислота и аминосоединения, сильно различающиеся по своей структуре и основности аминогруппы (значения pK аминогрупп варьируются в интервале от 1,0 до 10,5).

Для понимания каким образом и в какой степени природа аминосоединения определяет суммарную величину свободной энергии образования амидной связи, рассмотрим каждую из трех составляющих по отдельности (рис. 5).

Рис. 5. Зависимость свободной энергии Гиббса синтеза амидов от основности аминосоединений. Значения сводобной энергии приведены в соответствии с номером соединения на рис. 4.

1. Термодинамическая (или pH-независимая) составляющая свободной o энергии GT, которая соответствует реакции нейтральных форм компонентов.

Полученные результаты демонстрируют линейную корреляцию между значениями изменения свободной энергии реакции образования амидной связи из “нейтральных” форм реагентов и основностью аминогрупп (рис. 5). Следует отметить, что стерический и так называемый альфа-эффект заместителей практически не проявляется – в данную зависимость попадают как метоксиамин, анилины, амины, аминоспирты, аминокислоты, так и данные ранних работ по ядрам бета-лактамных антибиотиков. Величина термодинамического потенциала Гиббса меняется в пределах от ~0 до -кДж/моль.

o 2. Ионная (или pH-зависимая) составляющая Gio'n, которая отражает влияние ионизации функциональных групп компонентов на равновесие.

Эта величина принимает минимальное значение при pH равной полусумме значений pK карбоксильной и аминогруппы. В случаях, когда pKSH>>pKHNu+, o величина Gio'n равно нулю. Как правило, pKSH<

3. Третья составляющая свободной энергии Go', характеризующая отклонение экспериментальных условий от идеальных, достигает всего нескольких единиц кДж/моль для низких значений ионной силы (на графике не отражена).

Согласно вышесказанному, увеличение основности аминогруппы o приводит, с одной стороны, к линейному уменьшению GT, благоприятствуя o синтезу, и, с другой стороны, к экспоненциальному росту Gio'n, что, в конечном o счете, определяет увеличение суммарного потенциала Гиббса GC'. Очевидно, большая разница в величинах pK карбоксильной и аминогруппы делают прямую конденсацию неблагоприятной для высокоосновных аминосоединений.

Обнаруженная закономерность позволяет количественно предсказать термодинамику гидролиза/синтеза фенилацетамидов (Рис.5). Равновесие o сдвинуто в сторону образования амидной связи ( GC' <0) для реакции конденсации фенилуксусной кислоты и аминосоединений со значением pK в o интервале 1,5-8,5, а наименьшее значение GC'=-6.3 kДж/моль достигается для аминов с pK 4,5.

Использование реакции прямой конденсации в биотехнологии.

Эффективное и стереоселективное ацилирование 1-фенилэтиламина в водной среде без активации ацильного донора Стереоселективное ферментативное ацилирование представляет большой интерес для органического синтеза и фармацевтической химиия, и является важнейшей стадией разделения рацематов аминосоединений. Следует отметить, что первичные амины являются высокоосновными соединениями, и условия их эффективного ацилирования могут быть достигнуты лишь в щелочной водной среде (pH около 10) или в безводной органической среде, где большинство ферментов малоактивны и нестабильны. Однако при проведении ферментативных реакций в органических растворителях приходится использовать активированные ацильные доноры, которые способны спонтанно и нестереоизбирательно ацилировать реакционноспособные аминогруппы, что снижает энантиомерную чистоту продукта. Вышеперечисленные недостатки можно обойти при проведении ферментативного ацилирования аминов в водной среде методом прямой конденсации карбоновой кислоты и амина. В данном случае термодинамически благоприятные условия конденсации достигаются в нейтральной реакционной среде (при pH 6–8), где большинство ферментов являются высокоактивными и стабильными. В этих условиях оба исходных субстрата хорошо растворимы и стабильны, что позволяет создать высококонцентрированные растворы компонентов и обеспечить выгодные термодинамические условия для ферментативного ацилирования амина.

Движущей силой реакции, обеспечивающей высокую производительность процесса, является смещение равновесия в сторону синтеза за счет выпадения в осадок малорастворимого в воде целевого продукта. При проведении прямой конденсации не требуется активация ацильного донора, что упрощает и удешевляет процесс ферментативного ацилирования амина. Широкая субстратная специфичность и стереоселективность пенициллинацилаз позволяет провести эффективное ацилирование аминов методом прямой конденсации. Синтез продукта ацилирования N-фенилацетил-(R)фенилэтиламина протекает достаточно быстро вплоть до достижения степени превращения 30–35 % от исходных концентраций реагентов (рис. 6А). Затем реакция замедляется, что обусловлено приближением к термодинамическому равновесию. Анализ энантиомерной чистоты целевого продукта на разных степенях конверсии показал высокую стереоселективность ацилирования (рис. 6Б). Энантиомерный избыток целевого продукта составил 98 и 96% при степени конверсии 30 и 40%, соответственно. По завершении реакции целевой продукт, N-фенилацетил-(R)-фенилэтиламин, в виде осадка легко выделяется из реакционной смеси. Выход N-фенилацетил-(R)-фенилэтиламина по активному энантиомеру амина составил 80%, энантиомерный избыток – 95%.

Рис. 6. Синтез энантиомерно чистого N-фенилацетил-(R)-фенилэтиламина методом стереоселективной прямой конденсации фенилуксусной кислоты и рацемата (±)-фенилэтиламина в водной среде, катализируемой пенициллинацилазой из Alcaligenes faecalis:

(А) – интегральная кинетика образования продукта синтеза, (Б) – энантиомерный избыток целевого продукта при разных степенях конверсии.

Эффективное и стереоселективное ацилирование эфиров аминокислот в водной среде без активации ацильного донора Ацилирование путем прямой конденсации, катализируемой пенициллинацилазами в водной среде, может быть использовано для получения фенилацетильных производных сложных эфиров аминокислот. Исследование показало, что чрезвычайно важным для повышения производительности ферментативного ацилирования является повышение концентрации реагентов.

Выход продукта ацилирования увеличивается при увеличении количества исходных реагентов в реакционной смеси (рис. 7). Для достижения наибольшей производительности синтеза необходимо перевести реакцию в гетерогенный режим с выпадением целевого продукта в осадок. Зависимость скорости синтеза от соотношения вода/реагенты проходит через максимум, который соответствует максимально концентрированной, но ещё гетерогенной системе (рис. 8). При переходе к «твердофазной» системе скорость синтеза падает.

Рис. 7. Зависимость степени ацилирования этилового эфира фенилаланина (PheOEt) фенилуксусной кислотой (Phac) и ее галогензамещенными производными от концентрации исходных субстратов при их эквимолярном соотношении (слева) и от логарифма концентрации (справа).

Рис. 8. Зависимость скоростей ферментативного ацилирования PheOEt и TyrOEt фенилуксусной кислотой (Phac) от соотношения вода/реагенты (200C, pH 6.0, эквимолярные соотношения реагентов).

Благоприятным с практической точки зрения свойством синтеза в гетерогенных системах является то, что продукт, выпавший в осадок, можно Степень превращения Степень превращения V, мкмоль/час легко отделить и проводить синтез многократно, добавляя новые порции реагентов, тем самым достигая максимально эффективного использования фермента и субстратов. Важными факторами оптимизации при этом, наряду с концентрацией реагентов, являются температура, структура ацильного донора и условия проведения ферментативного ацилирования, изменение которых влияет как на скорость реакции, так и на растворимость целевого продукта.

Пример влияния температуры на растворимость этилового эфира Nфенилацетилфенилаланина приведен в табл. 1.

Таблица 1. Растворимость этилового эфира N-фенилацетилфенилаланина при различных температурах.

Т, 0С Растворимость, М 5 0.00015 0.00020 0.00025 0.000130 0.0001Одним из способов повышения выхода при ацилировании аминосоединений в водной среде является увеличение гидрофобности ацилирующего агента, например, применение в качестве ацилирующего агента галогензамещённых производных фенилуксусной кислоты. Растворимость продуктов ацилирования весьма сильно зависит от природы заместителя и варьируется от 1 мМ до 50 мкМ (табл. 2), что существенным образом влияет на эффективность ацилирования. Чем менее растворим продукт ацилирования, тем при более низких концентрациях исходных субстратов удается достичь высоких значений его выхода (см. рис. 7).

Таблица 2. Растворимость продукта ацилирования при использовании замещенных фенилуксусных кислот (250C, pH 6).

Продукт ацилирования Растворимость, мМ N-PhacPheOEt N-3-F-Phac-PheOEt 0.N-3-Cl-Phac-PheOEt 0.N-3-Br- Phac-PheOEt 0.N-2,6-diCl- Phac-PheOEt 0.По реакционной способности ацилирующие агенты располагаются следующим образом (табл. 3): фенилуксусная кислота > 3- фторфенилуксусная кислота > 4-бромфенилуксусная кислота > 3-хлорфенилуксусная кислота > 2, 6дихлорфенилуксусная кислота.

Дополнительные возможности увеличения эффективности ферментативного ацилирования аминосоединений в водной среде связаны с использованием систем с высокой высаливающей способностью. Так, при синтезе N-фенилацетильных производных этилового эфира фенилаланина можно уменьшить растворимость целевого продукта за счёт применения высаливающих агентов в соответствии с рядом Гофмейстера.

Таблица 3. Скорости ферментативного ацилирования PheOEt замещенными фенилуксусными кислотами.

Ацилирующий агент V0, ммоль/час Phac 3-F-Phac 4-Br-Phac 0.3-Cl-Phac 0.2-Br-Phac 0.2,6-diCl-Phac 0.В системах с высокой высаливающей способностью удается провести эффективное ацилирование не только сложных эфиров, но и свободных аминокислот. Примеры влияния сульфата аммония на растворимость и равновесные концентрации компонентов реакции показывают, что при высоких концентрациях соли растворимость продуктов ацилирования меньше их термодинамической равновесной концентрации и реакция переходит в гетерогенный режим, при этом растворимость исходных соединений меняется незначительно. В таких условиях можно достичь достаточно высоких степеней превращения. Следует отметить, что нативный фермент весьма быстро инактивируется в таких системах и синтез в солевых средах требует применения стабилизированных препаратов иммобилизованного фермента.

Обобщая полученные результаты можно сделать вывод о том, что ферментативное ацилирование путем прямой конденсации представляет большой интерес, так как является достаточно технологичным. Это связано с простотой проведения синтеза, легкостью выделения продуктов и высокими степенями конверсии.

Ферментативное ацилирование аминосоединений с использованием активированных ацильных доноров.

Термодинамика реакций ацильного переноса Реакция ферментативного ацильного переноса на нуклеофил (3) может быть рассмотрена с точки зрения термодинамики как сумма двух реакций – реакции гидролиза ацильного донора (1) и реакции прямой конденсации неактивированного ацильного донора и нуклеофила (2).

RCOX + H2O RCOOH + X (1) RCOOH + Nu RCONu + H2O (2) RCOX + Nu RCONu + X (3) 0 0 GC '(1 2) GC '(1) GC '(2) 110 pKa{Nu} pH 0 0 GC '(1 2) GC (1) GC (2) R T ln pKa{NH4 110 } pH Основываясь на этом можно, исходя из константы равновесия, а также текущих концентраций ацильного донора, продукта Х и нуклеофила Nu, рассчитать равновесную концентрацию продукта в реакционной смеси при проведении реакции ферментативного ацильного переноса в различные моменты времени. Рассмотрим пример реакции ацильного переноса на амид треонина с использованием фенилацетамида в качестве ацильного донора.

Результаты расчёта равновесной концентрации продукта и кинетическая кривая накопления продукта представлены на рис. 9.

Рис. 9. Роль термодинамики в протекании ферментативного ацильного переноса.

Кривая 1: Термодинамически достижимая концентрация продукта ацильного переноса, рассчитанная исходя из константы равновесия реакции и концентраций исходных субстратов (ацильного донора и нуклеофила) в реакционной смеси в каждый момент времени. Кривая 2: Экспериментальная кинетическая кривая накопления продукта ацильного переноса в реакционной смеси в реакции ацилирования амида треонина, катализируемой пенициллинацилазой. Экспериментальные условия: начальные концентрации фенилацетамида и треонинамида 0.025 М, pH 8, 25oC, 2 мкМ ПА из A.f.

Как следует из графика, экспериментальная кинетическая кривая накопления продукта ацильного переноса возрастает лишь до момента пересечения к расчётной кривой равновесной концентрации этого продукта.

Тем самым опровергается широко распространённое представление об ацильном переносе, как о реакции, которая «даёт возможность ‘поймать’ промежуточный момент, в котором продукта переноса в системе присутствует больше, чем ‘позволено’ по термодинамике, т.е. максимум эффективности имеет кинетическую природу». Как видно из графика – концентрация продукта до достижения максимума ни в одной точке не превышает равновесные значения, рассчитанные исходя из константы равновесия реакции ацильного переноса. Характерный вид кинетической кривой накопления продукта с максимумом и последующим снижением концентрации продукта объясняется тем, что фермент катализирует не только реакцию ацильного переноса на нуклеофил, но и реакцию гидролиза ацильного донора, а также образовавшегося продукта ацильного переноса.

Видно, что максимально достижимый выход продукта ферментативного ацильного переноса определяется термодинамикой реакции ацильного переноса. При этом кинетика самой реакции может быть представлена как последовательная смена нескольких режимов протекания. На начальном этапе реакционная система находится в неравновесных условиях (максимальная концентрация субстратов, отсутствие продуктов), благоприятствующих протеканию ацильного переноса. Естественно, на начальном этапе происходит наиболее быстрый синтез продукта ацильного переноса (начальный участок кривой 2). По мере расходования исходных реагентов накопление продукта ацильного переноса замедляется, падает и значение потенциально достижимых с точки зрения термодинамики концентраций продукта ацильного переноса (резко ниспадающий участок кривой 1). В точке пересечения двух кривых достигается максимальный выход продукта ацильного переноса, а далее, пройдя эту точку, реакционная система попадает в другую неравновесную область, где равновесие смещено уже в сторону расходования продукта ацильного переноса. Это расходование продукта ацильного переноса может протекать как гидролиз продукта (реакция 2 в обратном направлении) и как реакция синтеза ацильного донора с последующим его гидролизом (реакция 3 в обратном направлении, а затем реакция 1). Реакционная система будет стремиться к достижению равновесия по всем трём реакциям (1, 2 и 3 – причём в этой тройке только любые две реакции являются независимыми). Максимум кинетической кривой накопления продукта ацильного переноса обусловлен не только скоростями ацильного переноса на нуклеофил, а также скоростями гидролиза ацильного донора и образующегося продукта, но и термодинамикой реакции 3 – реакции ацильного переноса. Кроме того, снижение скорости накопления продукта ацильного переноса при приближении к точке максимума является следствием приближения к положению равновесия в реакции ацильного переноса.

Кинетические схемы ферментативного ацильного переноса Предложенные ранее кинетические модели ферментативного ацильного переноса, катализируемого ПА в водной среде, включали неравновесные стадии, а именно: стадию образования ацилфермента и его гидролиза в случае «минимальной» кинетической схемы и, помимо перечисленных, - стадию гидролиза тройного ацилфермент-нуклеофильного комплекса в случае полной схемы, учитывающей образование тройного комплекса ацилферментнуклеофил (схема 1).

KS kkE + S ES EA E + P+ PN kKN EAN k-kKP EP E + P Схема 1. Кинетическая схема ферментативного ацильного переноса от ацильного донора на нуклеофил с образованием комплекса ацилфермент-нуклеофил. E – фермент, S – ацильный донор; нуклеофил N; ES, EP – комплекс фермента с субстратом и продуктом синтеза; EA – ацилфермент, EAN – комплекс ацилфермент-нуклеофил; P1 – продукт, выделяющийся при образовании ацилфермента; P2 – продукт гидролиза ацилфермента, Pпродукт синтеза. Смысл констант вытекает из приведенной схемы. С помощью прописных букв K обозначены константы равновесия соответствующих стадий в форме констант диссоциации; с помощью строчных k – кинетические константы.

Поскольку уравнение Холдена, связывающее значения термодинамической и кинетических констант реакции, может быть применено только к равновесной части схемы, при определении взаимосвязи между термодинамическими и кинетическими параметрами ферментативного ацильного переноса необходимо дополнить схему, предусмотреть обратимость стадий образования и гидролиза ацилфермента (включить соответствующие стадии k-2 и k-3) и придать общей кинетической схеме полностью равновесный вид. В полной кинетической схеме ферментативного ацильного переноса (схема 2) за ацилфермент конкурируют три нуклеофила – продукт P1, представляющий собой уходящую группу ацильного донора, вода и добавленный нуклеофил N.

Полностью обратимая кинетическая схема 2, позволяет найти связь кинетических параметров реакции с термодинамическими константами ацильного переноса и гидролиза ацильного донора.

Для того, чтобы оценить как введение новых стадий и ограничений, накладываемых термодинамикой, отразится на кинетической схеме, перед разбором наиболее сложной равновесной схемы (схема 2) рассмотрим в порядке усложнения несколько упрощённых частных случаев ферментативного ацильного переноса. В качестве исходной рассмотрим ситуацию, когда ацильный перенос не осложнён стадией гидролиза – идеальный случай ферментативного ацильного переноса (схема 3). Подобный вариант протекания ферментативного ацильного переноса возможен, например, в неводных растворителях при использовании липазы в качестве катализатора.

kk1 kk2 kEP2 E+PE+S ES P1+EA EAPk-k-1 k-k-2 k-+N k-4 kEAN k-5 kEP k-6 kE+P Схема 2. Полная кинетическая схема ферментативного ацильного переноса. E – фермент, S – ацильный донор, ацильный остаток которого переносится на нуклеофил N;

ES, EP, EP2 – комплексы фермента с субстратом, продуктом ацильного переноса и продуктом гидролиза, соответственно; EA – ацилфермент, EAN – комплекс ацилферментнуклеофил; EAP1 – комплекс ацилфермент-первый продукт превращения ацильного донора, выделяющийся при образовании ацилфермента, P1 – первый продукт превращения ацильного донора, выделяющийся при образовании ацилфермента; P2 – продукт гидролиза ацилфермента, P - продукт ацильного переноса на нуклеофил N(продукт синтеза).

kk1 k4 kk2 kE+S ES EAN EP E+P P1+EA+N EAPk-k-1 k-4 k-k-2 k-Схема 3. Кинетическая схема ферментативного ацильного переноса, не осложненного гидролизом ацилфермента. E – фермент, S - ацильный донор, ацильный остаток которого переносится на нуклеофил N; ES, EP – комплексы фермента с субстратом и продуктом ацильного переноса, EA – ацилфермент, EAN – комплекс ацилфермент-нуклеофил; EAP1 – комплекс ацилфермент-первый продукт превращения ацильного донора, выделяющийся при образовании ацилфермента, P1 – первый продукт превращения ацильного донора, выделяющийся при образовании ацилфермента, P-продукт ацильного переноса на нуклеофил N (продукт синтеза).

Рассмотрим представленные кинетические схемы в порядке усложнения.

При этом задачей рассмотрения будет сравнение новых схем (2 и 3) и ранее предложенной кинетической схемы 1 для выяснения вопроса о том, насколько добавление равновесных стадий и учет термодинамических параметров ацильного переноса меняет существующие представления о параметрах и путях управления эффективностью ацильного переноса (ранее такими параметрами являлись сочетания кинетических констант, обозначаемые , и )3.

Наиболее простым случаем ферментативного ацильного переноса является реакция без гидролиза (схема 3). В этом виде реакция с точки зрения формальной кинетики похожа на хорошо известную реакцию прямой конденсации. Для иллюстрации последнего утверждения сравним схему реакции прямой конденсации и ацильного переноса без гидролиза (схемы 4 и 3, соответственно) и вытекающие из них кинетические уравнения.

kkk3 k4 kE+P2 EP2 EAN EP E+P EA+N k-3 k-k-k-k-Схема 4. Кинетическая «равновесная» схема реакции ферментативной прямой конденсации. E – фермент, P2-ацильный (неактивированный) донор, используемый для ацилирования нуклеофила N; EP2, EP – комплексы фермента с ацильным донором P2 и продуктом ацилирования Р, соответственно, EA – ацилфермент, EAN – комплекс ацилфермент-нуклеофил.

Схемы реакции ферментативного ацильного переноса и прямой конденсации отличаются только стадиями, предшествующими образованию ацилфермента. Применение в качестве ацильного донора неактивированной кислоты в прямой конденсации приводит к тому, что вода является для этой реакции не только растворителем, но и уходящим нуклеофилом, что приводит к возникновению единственного отличия от схемы 3 – там не предусмотрена стадия связывания воды в центре связывания нуклеофила.

Рассмотрим взаимосвязь кинетических констант данных реакций с константами равновесия. Для этого запишем уравнения Холдена:

k1 k2 k3 k4 k5kKat k1 k2 k3 k4 k5k6 (для схемы 3) (4) k1 k2 k3 k4 kKdc (для схемы 4) (5) k1 k2 k3 k4 kСравнение уравнений показывает, что значительно более низкое значение константы равновесия прямой конденсации связано с более низким значением константы скорости образования ацилфермента из кислоты по сравнению с активированным ацильным донором.

Если выделить параметры эффективности по аналогии с тем, как делалось ранее для неравновесных кинетических схем, то в приложении к данным Youshko M.I., Chilov G.G., Shcherbakova T.A., Svedas V.K., Biochim. Biophys. Acta: Proteins & Proteomics, 2002, 1599, 134-1 системам параметры эффективности и выражение для константы равновесия для схемы 3 будут выглядеть следующим образом:

k1 k5 k ; (6) k1 k2 kk3 k4 k ; (7) k2 k3 k Kat ; (8) При этом параметр ранее связывали с относительной реакционной способностью нуклеофила N по отношению к воде, а в нашем случае, в связи с введением обратной стадии ресинтеза донора в схеме 3, этот параметр отражает относительную реакционную способность нуклеофила N по отношению к «уходящему» нуклеофилу P1. Параметр ранее интерпретировали как сравнительную реакционоспособность фермента при гидролизе двух субстратов – ацильного донора S и синтезируемого продукта P. При рассмотрении равновесной схемы без дополнительных ограничений этот параметр принимает более сложный вид.

Анализ равновесной кинетической модели активированного ацильного переноса с равновесным гидролизом ацилфермента (схема 2) Согласно соотношению Холдена кинетические константы реакции в прямом и обратном направлении однозначно связаны с величиной константы равновесия реакции. Запишем выражения для констант равновесия ферментативного ацильного переноса (Kat), прямой конденсации (Kdc) и гидролиза донора (Khd):

S+NP1+P (9) k1 k2 k3 k4 k5 kKat (10) k1 k2 k3 k4 k5 kP2+NP (11) k8 k7 k4 k5 kKdc (12) k8 k7 k4 k5 kSP1+P2 (13) k1 k2 k3 k7 kKhd (14) k1 k2 k3 k7 kПоскольку из приведённых констант лишь две являются независимыми – ограничимся рассмотрением констант равновесия ацильного переноса и гидролиза ацильного донора. С учётом выражений для кинетических параметров, ранее использованных для описания ферментативного ацильного переноса в соответствии со схемой 1, вышеприведённые уравнения будут иметь следующий вид:

Kat (15) F Для выяснения того, какие сочетания констант оказываются ключевыми для схемы 2, был проведен анализ системы дифференциальных уравнений, описывающих поведение системы, представленной на схеме 2 в предположении о стационарности реакций по ацилферменту. Проведенный кинетический анализ показал, что наряду с параметрами и важными параметрами, определяющими поведение системы, являются константы равновесия прямой конденсации и гидролиза донора. При начальных условиях t=0, S=S0, N=N0, P1=P2=P=0, и малых степенях превращения схемы неразличимы по параметру соотношения начальных скоростей синтеза и гидролиза S/H:

(16) В целом поведение реакции, протекающей в соответствии с равновесной схемой 2, является более сложным, чем представлялось ранее. Тем не менее, основные выводы из проведённого кинетического анализа состоят в том, что, также как и в рамках предыдущей схемы 1, увеличение параметра нуклеофильности приводит к повышению эффективности протекания синтеза по отношению к гидролизу.

Для проверки справедливости проведенного кинетического анализа и роли соотношения (15) было проведено сравнение синтеза ампициллина с использованием двух ацильных доноров – амида D-фенилглицина и дипептида D-фенилглицилглицина. Ввиду значительного вклада энергии ионизации в случае реакции гидролиза пептидной связи в сравнении с амидной связью, гидролиз пептидов является термодинамически более выгодным. Это приводит к более глубокому смещению равновесия в реакциях ацильного переноса с использованием дипептида в качестве ацильного донора, что количественно выражается в увеличении значения константы равновесия процесса и, соответственно, кинетических параметров и выхода целевого продукта (табл. 4).

Таблица 4. Сравнение кинетических и термодинамических параметров для реакции ферментативного синтеза ампициллина из амида D-фенилглицина и D-фенилглицилглицина при одинаковых условиях – pH 6.5, 25oC.

Выход, Донор Kat F % DPGNH2 4.3 5.2 56 - DPGGly 21.2 0.11 120 45.4 Ранее предполагалось, что основными факторами, определяющими эффективность реакции ферментативного ацильного переноса, являются кинетические параметры и , при этом выход продукта прямо пропорционален величине и обратно пропорционален величине .

Проведенный нами термодинамический и кинетический анализ реакций ферментативного ацильного переноса показал, что параметры и не являются независимыми и напрямую связаны с константой равновесия реакции ацильного переноса.

Сравнение ферментативного ацилирования путем прямой конденсации и путем ацильного переноса Рассмотренные методы ферментативного ацилирования аминосоединений в водной среде (метод прямой конденсации и метод ферментативного ацилирования аминов с использованием активированных ацильных доноров) лишены недостатков ферментативных реакций, проводимых в среде органических растворителей, и пригодны как для биокаталитического синтеза их N-ацильных производных, так и для биокаталитического получения энантиомерно чистых соединений в мягких условиях из доступных реагентов.

Для выяснения перспектив препаративного использования необходимо сравнение обоих методов. Каждый подход имеет сильные и слабые стороны.

При использовании активированных ацильных доноров достигается более высокая скорость и глубина ацилирования, а также энантиомерная чистота целевого продукта. Однако при этом необходимо использовать более дорогие ацильные доноры и проводить процесс в щелочной среде, где фермент является менее стабильным. Принципиальным достоинством метода прямой конденсации является возможность использования дешевых ацильных доноров и проведения реакции в более мягких условиях, где большинство ферментов, в т.ч. и использованные нами ферменты семейства пенициллинацилаз, являются более активными и стабильными. В конечном счете, все эти факторы и определят экономику биокаталитической технологии в каждом конкретном случае. Можно ожидать, что оба подхода - стереоселективное ферментативное ацилирование аминосоединений методом прямой конденсации и ферментативный ацильный перенос в водной среде станут компонентами интегральной биокаталитической технологии получения энантиомерно чистых аминосоединений и их производных.

Основные результаты и выводы 1. Определены термодинамические параметры реакции ацилирования широкого круга аминосоединений, обладающих различными параметрами основности, различными ацильными донорами в водной среде. Обнаружена линейная зависимость термодинамической энергии Гиббса от pK аминосоединений.

2. Показано, что термодинамика реакции ацильного переноса определяет максимальный выход продукта в реакциях ферментативного ацилирования аминосоединений в водной среде активированными ацильными донорами.

3. Проведён анализ способов повышения выхода в реакциях прямой конденсации карбоновых кислот и аминосоединений в водной среде, изучены возможности увеличения выхода путем подбора ацильного донора, изменения условий проведения реакции (температуры, присутствия высаливающих агентов).

4. Проведен ферментативный синтез N-ацилированных аминокислот и их сложных эфиров. Показано, что наиболее высокий выход целевого продукта достигается в гетерогенных высококонцентрированных системах. Найдено оптимальное соотношение вода/реагенты, при котором скорость биокаталитического синтеза максимальна, а выход целевого продукта близок к количественному.

5. Показано, что ферментативное ацилирование аминосоединений в водной среде можно проводить в технологическом режиме с циклическом добавлением реагентов и отделением целевых продуктов, что позволяет максимально эффективно использовать фермент и минимизировать расход исходных субстратов.

Список публикаций 1. D.T.Guranda, G.A.Ushakov, P.G.Yolkin, V.K.Svedas Thermodynamics of phenylacetamides synthesis: Linear free energy relationship with pk of amine, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2012, №1-2, 48-53.

2. Гуранда Д.Ф., Ушаков Г.А., Швядас В.К. Эффективное и стереоселективное ацилирование 1-фенилэтиламина в водной среде без активации ацильного донора, катализируемое пенициллинацилазой, Acta Naturae, 2009, 3, 52-54.

3. Кudryavtsev P.A., Guranda D.T., Ushakov G.A., Panin N.V., Bibin A.V., Godina A.F., vedas V.K. Biocatalytic resolution of amino compounds by using penicillinacylase in aqueous medium. Abstracts Int. Conf.

“Biotechnology-2007”. Moscow, 2007, p. 60.

4. Guranda D.T., Kudryavtsev P.A., Ushakov G.A., Panin N.V., Bibin A.V., Sidorova A.V., vedas V.K. Biocatalytic resolution of amino compounds by using penicillinacylase in aqueous medium. Int. Symp. Advanced Science in Organic Chemistry. Sudak, Crimea, Ukraine. 2006, C-043.

5. Guranda D.T., Ushakov G.A., Yolkin P.G., Kudryavtsev P.A.

Thermodynamics of phenylacetamides synthesis/hydrolysis: linear correlation between the Gibbs energy and pK of amine. Abstracts Int. Conf. “Biocatalysis2005”. St. Petersburg, 2005, p. 42.

6. Буданова Ю.А., Химюк А.Я., Ушаков Г.А., Гуранда Д.Т. Введение и снятие N-защитных групп в пептидном синтезе пенициллинацилазой.

Материалы XI Межд. конф. “Ломоносов-2004”, Москва, 2004, 8-9 с.

7. Юшко М.И., Гуранда Д.Ф., Чилов Г.Г., Ямскова О.В., Ушаков Г.А., Суплатов Д.А., Кудрявцев П.А., Емельянов И.И., Саранская О.В.,Швядас В.К. Разработка методов энантиоселективного биокаталитического ацилирования в водной среде как основы экологически безопасной технологии получения хиральных аминосоединений. Материалы итоговой конференции ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России за 2007-2012 годы», Москва, 2007, стр. 16-17.

8. vedas V., Ushakov G., Sedlyarov V., Guranda D. Biocatalytic acylation of amino compounds in aqueous medium: optimization based on thermodynamic studies. Abstracts Int. Symp. “BioTrans”. Bern, Switzerland. 2009, p.324.

9. Ushakov G.A., Tukhtubaeva N.E., Guranda D.T. Enzymatic synthesis of olygopeptides in aqueous medium. Abstracts Int. Conf. “Biocatalysis in noncinvential media”. Moscow, 2008, p.36.

10. Guranda D., Ushakov G., Panin N., Godina A, Sedlyarov V., vedas V.

Penicillin-acylase catalyzed reactions in aqueous medium: from kinetic and thermodynamic analysis to practical applications for stereoselective synthesis and resolutions. Abstracts of the Int. Conf. “Biocatalysis in non-convential media”. Moscow, 2008, p.32.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.