WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Целенаправленное изменение каталитических свойств ферментов, дизайн новых ингибиторов ферментов и условий проведения ферментативных реакций представляют собой важные и сложные задачи как с точки зрения фундаментальной, так и прикладной наук

и. Сегодня очевидно, что решение проблем такого уровня сложности не может быть основано на чрезвычайно трудоемких эмпирических подходах и требует рационального использования достижений современной теоретической химии, которые становятся все более доступными с развитием высокоприозводительных вычислительных методов. Таким образом, рациональный дизайн ферментов с заданными свойствами, создание новых лекарственных препаратов, оптимизация биотехнологий представляют собой комплексное наукоемкое направление, чрезвычайно актуальное в настоящее время.

Цели и задачи исследования В настоящей работе была поставлена задача исследовать возможности применения методов теоретической химии в сочетании с экспериментальными данными для решения задач биокатализа и биотехнологии. Необходимо было изучить механизм реакций, катализируемых D-аминопептидазой из Ochrobactrum anthropi (DAP) и апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазой человека 1 (APE1), использовать эти знания для получения ферментного препарата с измененной субстратной специфичностью, а также поиска новых ингибиторов. Наряду с использованием методов теоретической химии для дизайна каталитических свойств фермента и его ингибиторов была предпринята попытка in silico подбора наилучшего растворителя для проведения биокаталитических реакций, протекающих в нетрадиционных (органических) средах.

Научная новизна работы В результате выполнения работы предложен согласованный механизм действия APE1 с описанием и распределением ролей аминокислотных остатков активного центра в каталитическом механизме. Установлен основной принцип механизма действия ферментов семейства пенициллин-связывающих белков, в том числе D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi, который заключается в формировании необычной конфигурации каталитической триады. При помощи методов теоретической химии предсказаны мутантные варианты DAP с расширенной субстратной специфичностью. Мутантные формы фермента получены и протестированы, показана их каталитическая активность по отношению к производным D-лейцина и D-фенилаланина. Выявлен аминокислотный остаток, определяющий высокую стереоселективность действия D-аминопептидазы.

3 Разработан и валидирован алгоритм выбора среды проведения биокаталитических реакции, выход в которых ограничен термодинамическим равновесием в растворе.

Практическая значимость работы С использованием методов теоретической химии создана мутантная форма D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi с расширенной субстратной специфичностью. Сформированное представление о механизме действия APE1 позволило провести эффективный виртуальный скрининг новых ингибиторов фермента – лидерных соединений на пути создания лекарственных средств для онкологических заболеваний. Выявленный механизм действия D-аминопептидазы важен для понимания особенностей механизма действия других ферментов семейства пенициллин-связывающих белков, в частности, транспептидаз, ответственных за синтез клеточной стенки бактерий, и бета-лактамаз, обеспечивающих резистентность бактерий к действию бета-лактамных антибиотиков, при поиске более эффективных бета-лактамных антибиотиков. Разработанный алгоритм оптимизации условий проведения биокаталитических реакций (выбора наилучшего растворителя) позволяет проводить оптимизацию среды проведения биокаталитических превращений с целью увеличения выхода целевого продукта.

Апробация работы Основные положения и результаты работы были представлены на следующих международных научных конференциях, посвященных биокатализу и биотрансформациям: «Биокатализ в нетрадиционных средах» (2008 г., Москва, Россия), «Биокат 2010» (2010 г., Гамбург, Германия), «Ломоносов-2010», (2010 г., Москва), «Биотранс 2011» (2011 г., Джиардини Наксос, Италия).

Публикации По материалам диссертации подготовлены и опубликованы 3 статьи в рецензируемых научных журналах, 4 тезисов докладов международных конференций.

Структура и объем работы Диссертация состоит из следующих разделов: «Список сокращений», «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Основные результаты и выводы», «Список использованной литературы». Объем диссертации составляет 92 страницы машинописного текста и включает 33 рисунка, 8 таблиц и 101 библиографическую ссылку.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека Молекулярное моделирование ионизационных состояний остатков активного центра По результатам расчета ионизационных состояний остатков активного центра установлено, что в условиях оптимума протекания реакции гидролиза фосфоэфирной связи (pH 7-8) остаток His309 находится в протонированной форме (расчетное значение pKa равное 8,6 совпадает со значением pK2 экспериментально определенного pH-профиля активности фермента), а остаток Asp210 – в депротонированной (расчетное значение pKa равное 6,2 близко к значению pK1 pHпрофиля активности фермента 6,6). Таким образом, можно заключить, что функцию общего основания при катализе выполняет депротонированный отрицательно заряженный остаток Asp210, в то время как положительно заряженный в условиях оптимума реакции остаток His309 участвует в связывании отрицательно заряженной фосфатной группы субстрата и стабилизации переходного состояния.

Связывание субстрата в активном центре фермента Стартовая сольватированная модель фермент-субстратного комплекса APEбыла создана на основе кристаллографических структур 1DE8 и 1DE9 из банка данных PDB. Оптимизация позиций атомов модели (прежде всего, координат добавленных атомов водорода) была проведена путем двухстадийной минимизации энергии системы. На первой стадии проводили молекулярно-механическую минимизацию с целью удаления наибольших напряжений в системе. На второй стадии осуществляли более тонкую настройку структуры активного центра при помощи гибридной КМ/ММ минимизации энергии с использованием гамильтониана RM1. Стабильность полученной структуры была подтверждена в результате молекулярно-динамической симуляции продолжительностью 1000 пс.

Анализ полученной модели показывает, что связывание субстрата в активном центре апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы сопровождается образованием большого количества связей и взаимодействий различной природы. Среди них следует выделить гидрофобные взаимодействия дезоксирибозы AP-сайта в гидрофобном кармане, образованном остатками Leu282, Phe266 и Trp280. Свободная гидроксильная группа дезоксирибозы AP-сайта также образует водородную связь с карбонильной группой основной цепи Ala230. Фосфатная группа, расположенная на 3’-конце AP-сайта, удерживается положительным зарядом остатка Arg177. Атакуемая фосфатная группа электростатически взаимодействует с ионом магния и образует водородные связи с боковыми радикалами остатков Asn174, Asn212 и His309.

Гидроксильная группа остатка Tyr171 направлена в сторону 5’-атома кислорода уходящей группы.

Ориентация атакующей молекулы воды обеспечивается взаимодействием с общим основанием Asp210, карбонильной группой остатка Asn212 и боковым радикалом остатка His309. Реакционноспособная конформация карбоксильной группы общего основания Asp210 в ферменте поддерживается взаимодействием бокового радикала с аминогруппой основной цепи остатка Asn212 (Рис. 1).

Рис. 1. Активный центр в модели фермент-субстратного комплекса APE1-ДНК. Стрелка указывает направление нуклеофильной атаки.

Каталитическое расщепление фосфодиэфирной связи: атака активированной молекулы воды Ориентированная и поляризованная под действием зарядов остатков Asp210, His309 и иона металла молекула воды способна атаковать фосфатную группу субстрата, одновременно передавая протон общему основанию – остатку Asp210.

Образующийся в результате атаки интермедиат в виде тригональной бипирамиды стабилизирован следующими взаимодействиями в активном центре фермента: атомы кислорода в «вершинах» бипирамиды участвуют в образовании водородных связей с боковыми радикалами остатков His309 и Tyr171; плоскость треугольника в «основании» бипирамиды расположена между остатками Asn174, Asn212 и ионом магния (Рис. 2).

Данные по мутагенезу Tyr171, приведенные в литературе, указывают на критическую роль этого остатка в механизме действия APE1, однако, в отличие от ранее сделанных предположений, мы предполагаем другую роль Tyr171 в катализе.

Близкое расположение положительных зарядов иона магния и остатка Arg156 должно способствовать облегченному отрыву протона от гидроксильной группы Tyr171, поэтому мы рассматриваем данный остаток в качестве потенциального донора протона для уходящей группы, являющейся сильным основанием. Менее значительное влияние мутаций по положению 171 на связывание субстрата по сравнению с падением каталитической активности объясняется слабо выраженным взаимодействием остатка с субстратом на ранних стадиях реакции, предшествующих каталитическому акту, что полностью согласуется со сделанным предположением. В ходе каталитического превращения, по-видимому, происходит сближение уходящей группы с боковым радикалом остатка Tyr171, что обеспечивает дополнительную стабилизацию интермедиата реакции, и передача протона на уходящую группу становится возможной.

При дальнейшем протекании реакции менее стабилизированная, находящаяся в плоскости основания и направленная в сторону остатка Asn212 связь P-O– превращается в двойную P=O. Одновременно с этим разрывается связь P-O, направленная к остатку Tyr171, и уходящая группа забирает протон у гидроксильной группы тирозина, оставляя оксианион, стабилизированный окружением, а именно близкорасположенными положительными зарядами остатков Arg156 и иона магния (Рис. 2). Восстановление каталитически активного состояния активного центра (депротонирование общего основания Asp210 и протонирование остатка Tyr171) происходит в результате взаимодействия с молекулами воды из внешней среды.

Рис. 2.

Схематичное изображение строения и превращения интермедиата в виде тригональной бипирамиды в реакции гидролиза, катализируемой APE1.

Анализ связывания субстрата и поиск механизмозависимых ингибиторов В связывании субстрата и стабилизации переходного состояния в ходе реакции участвует множество зарядов и полярных групп, характер этих взаимодействий и ионогенное состояние аминокислотных остатков активного центра определяют требования к структуре соединений, способных связываться в активном центре APE1.

При конструировании эффективных ингибиторов фермента следует реализовать, по крайней мере, наиболее важные взаимодействия. Существование гидрофобного участка связывания наряду с множеством полярных и различно заряженных групп осложняет поиск низкомолекулярных соединений подходящей структуры.

Аминокислоты являются тем классом природных соединений, в структуре которых одновременно имеются заместители различной природы, способные осуществить гидрофобные, электростатические взаимодействия, выступить донором или акцептором водородных связей. Для выяснения особенностей взаимодействия фермента с потенциальными ингибиторами такого строения было проведено молекулярное моделирование связывания различных аминокислот (в том числе 6-гидрокси-ДОФА) и их производных в активном центре APE1 с учетом ионизации как самого потенциального ингибитора, так и аминокислотных остатков активного центра фермента.

Анализ результатов молекулярного моделирования показывает, что наличие карбоксильной группы позволяет выбранным соединениям связываться с ионом металла и остатком His309, в то время как гидрофобный заместитель, например фенильный радикал, может располагаться в гидрофобном кармане связывания дезоксирибозы (Рис. 3). Введение гидроксильных заместителей в фенильный радикал может приводить к образованию дополнительных водородных связей с полярными остатками активного центра фермента. Кроме того, одним из возможных факторов, определяющих эффективность ингибирования, является связывание ингибитора с заряженным остатком общего основания Asp210.

В настоящее время продолжаются поиски эффективных ингибиторов апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека, основанные на уточненных данных по участию остатков активного центра фермента в каталитическом процессе.

Рис. 3. Расположение субстрата (А) и потенциального ингибитора (Б) в активном центре полноатомной модели APE1. Желтым цветом показаны остатки гидрофобного кармана: Phe266, Trp280 и Leu282.

Механизм действия D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi Анализ структуры D-аминопептидазы. Молекулярное моделирование ионизационных состояний остатков активного центра Визуальный анализ структуры D-аминопептидазы (PDB ID 1EI5) выявляет пару близкорасположенных остатков Tyr153 и Lys65 в окружении каталитического остатка Ser62 с примерно равным расстоянием от нуклеофильного атома O серина. При расчете ионизационных свойств аминокислотных остатков активного центра D-аминопептидазы было обнаружено значительно более низкое значение pKa остатка Lys65, равное 7.8, по сравнению с обычными значениями pKa остатков лизина в белках (10-11). Следует отметить также довольно высокое значение pKa, найденное для остатка Tyr153, равное 11.8.

Атомы азота и кислорода трех указанных остатков образуют почти равносторонний треугольник в пространстве активного центра (Рис. 4). Такое их расположение создает особую конфигурацию каталитической триады, в которой протон гидроксильной группы серина направлен внутрь треугольника и поделен между всеми тремя атомами. Возможность подобной организации триады обусловлена весьма необычными свойствами аминокислотного остатка Lys65, способного акцептировать протон в нейтральной и слабощелочной среде, обеспечивая высокую реакционную способность остатка Ser62.

Рис. 4. Стереоизображение активного центра D-аминопептидазы, показывающее структурную организацию каталитической триады. Выделены остатки Ser62, Lys65, Tyr153, Asn155, His287 и Asp225.

Экспериментальное изучение pH-профиля активности DAP Экспериментальные данные хорошо согласуются с результатами молекулярного моделирования и предполагаемой ролью остатка Lys65 в функционировании каталитической триады. Исследование показало, что pH-профиль каталитической активности D-аминопептидазы имеет стандартную колоколообразную форму со значениями pK1 и pK2 равными 7.4 и 8.8 соответственно (Рис. 5). Значение 7.4 на основании результатов молекулярного моделирования ионизационных свойств было отнесено к остатку Lys65.

Рис. 5. pH-профиль каталитической активности D-аминопептидазы. Расчетная кривая построена по уравнению v = v0/(1+[H+]/K1+K2/[H+]) со значениями v0, pK1 и pK2 равными 0.53, 7.4 и 8.8, соответственно.

Описание механизма действия D-аминопептидазы Как и в случае других сериновых гидролаз, реакция, катализируемая D-аминопептидазой, протекает по трехстадийной схеме через стадии образования промежуточного ковалентного ацилфермента и последующего его гидролиза (или переноса ацильной части на внешний нуклеофил в реакциях ацильного переноса).

Особенности организации каталитической триады фермента и низкое значение pKa остатка Lys65, по-видимому, обуславливает следующую роль этого остатка в механизме реакций, катализируемых D-аминопептидазой:

Незаряженный в условиях pH-оптимума ферментативной реакции остаток Lys65, действуя в качестве общего основания при атаке O атома Ser62 по карбонильной группе субстрата, принимает протон с атакующей OH-группы при образовании тетраэдрического интермедиата на стадии ацилирования.

С разрушением тетраэдрического интермедиата и образованием ацилфермента уходящая группа принимает близко расположенный и образующий с ней водородную связь протон гидроксильной группы остатка Tyr153, значение pKa которого понижается за счет близко расположенного положительного заряда остатка Lys65. Одновременно с этим получившийся нестабилизированный оксианион, будучи более сильным основанием, депротонирует остаток лизина.

Процесс деацилирования каталитического остатка серина фермента протекает посредством активации молекулы воды (или другого внешнего нуклеофила) при совместном действии двух остатков Lys65 и Tyr153 и передачи протона «по цепочке» от нуклеофила к остатку Tyr153, а от остатка Tyr153 к Lys65 с образованием второго тетраэдрического интермедиата.

Одновременно с разрушением второго тетраэдрического интермедиата и последующим отрывом ацильной части субстрата (выделением второго продукта реакции) образующийся оксианион Ser62 депротонирует остаток Lys65, и фермент приходит к первоначальному состоянию.

Следует отметить, что за время каталитического акта не происходит как таковой передачи протона. Он остается поделенным между остатками «каталитического треугольника». Именно это, на наш взгляд, и обеспечивает высокую активность D-аминопептидазы и других ферментов класса пенициллинсвязывающих белков, для которых величины каталитических констант достигают тысяч сек-1.

Указанный механизм действия D-аминопептидазы хорошо согласуется с экспериментальными данными по мутагенезу, показавшими важность пары остатков Lys65 и Ser62 для осуществления катализа, а также с результатами и выводами, полученными в расчетных работах, где утверждается главенствующая роль консервативного остатка Tyr153 на стадии деацилирования. Предложенный механизм может быть распространен и на родственный D-аминопептидазе фермент амидазу D-аминокислот из Ochrobactrum anthropi (DAA), расчет ионизационных свойств остатков активного центра которого показывает, что величина pKa консервативного остатка Lys63 (аналогичного Lys65 в D-аминопептидазе) также сильно понижено и равно 6.3. Падение активности фермента, связанное с протонированием общего основания при значениях pH ниже pKa, соответствует pH-профилю активности DAA, представленному в литературных источниках.

Дизайн субстратной специфичности D-аминопептидазы Биоинформатический анализ семейства белков, гомологичных D-аминопептидазе, молекулярное моделирование мутантных форм Для сбора и анализа данных по семейству пенициллин-связывающих белков, включающего D-аминопептидазы, D-амидазы аминокислот, щелочные D-пептидазы и бета-лактамазы классов A и C, был проведен поиск гомологов D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi по первичной и третичной структуре в банках данных белковых последовательностей UniProt и белковых структур PDB. Полученная в результате выборка из 734 гомологов по первичной структуре и 24 гомологов по третичной структуре была профильтрована и наиболее информативные последовательности отобраны для проведения множественного выравнивания по первичной и третичной структуре. Выравнивание трехмерных структур показало, что область активного центра D-аминопептидазы обладает достоверным сходством с D-амидазами аминокислот, щелочными D-пептидазами и бета-лактамазами как на уровне аминокислотной последовательности, так и на уровне пространственной организации.

Определение групп-специфичных позиций в активных центрах пенициллинсвязывающих белков проводилось с использованием программного обеспечения ZEBRA, ранее разработанного в нашей лаборатории. Следующие позиции в структуре D-аминопептидазы были определены как групп-специфичные: W114, W222, A226, C61, L291, I220, T196, D225 (Рис. 6, нумерация по структуре 1EI5, остатки приведены в порядке уменьшения степени специфичности).

Рис. 6.

Выбранные для дизайна D-аминопептидазы группспецифичные позиции, варьирование которых обуславливает изменение функциональных свойств в семействе пенициллинсвязывающих белков.

По каждой из позиций был составлен список рекомендуемых замен на аминокислотные остатки, наиболее часто встречающиеся в группах по специфичности. В соответствии со списком замен была сформирована библиотека структур мутантных форм D-аминопептидазы, всего 1981 структура. С учетом числа подготовленных лигандов (38 штук), количество пар «фермент-субстрат» для проведения докинга достигло 75278.

Виртуальный скрининг библиотеки мутантных ферментов, обоснование выбора позиций и замен для экспериментального получения Из-за значительного количества возможных мутантных вариантов по группспецифичным позициям для экспериментального получения и исследования свойств было решено рекомендовать мутантные формы D-аминопептидазы, содержащие не более трех замен. Основными мутациями явились замены пары остатков триптофана – 222 и 114, характеризующихся наибольшей степенью специфичности при биоинформатическом анализе ферментов семейства и перекрывающих значительный объем активного центра фермента в области связывания ацильной части субстрата.

По результатам скрининга библиотеки мутантов, способных превращать ароматические субстраты, такие как амиды D-His, D-Phe и D-Tyr, высокую оценку получала замена W222H. Предпочтение остатка гистидина в позиции 222 может быть объяснено образованием стекингового взаимодействия бокового радикала гистидина с ароматическим кольцом субстрата. Для разветвленных алифатических субстратов мутация W222H также была предпочтительной наряду с W222V и W222T. Для остальных субстратов замена W222H также находилась среди лучших результатов скрининга. Таким образом, мутация W222H была отобрана, как наиболее эффективная с точки зрения расширения субстратной специфичности D-аминопептидазы.

Наиболее высоко оцененные по результатам скрининга мутанты с расширенной специфичностью либо не содержали замены по позиции 114, либо содержали замену W114L. Для гарантированного увеличения объема кармана субстратной специфичности было принято решение осуществить замену по позиции 114.

Поскольку в структуре нативной D-аминопептидазы (DAP д.т.) боковой радикал остатка W114 участвует в образовании водородной связи с остатком D225, нарушение которой могло повлиять на активность или стабильность фермента, для тестирования была выбрана пара замен по 114 положению на рекомендованный лейцин и гистидин, напоминающий по своей структуре остаток триптофана. В последнем случае (замена W114H) сохраняется взаимодействие боковых радикалов остатков в позициях 114 и 225, тогда как в первом появляется возможность для дополнительных гидрофобных взаимодействий в активном центре фермента, что важно для субстратов с разветвленным алифатическим радикалом.

По результатам молекулярного моделирования предполагалось, что замена W222H будет приводить к улучшению связывания ароматических субстратов за счет образования стекингового взаимодействия развернутого бокового радикала остатка гистидина и фенильного кольца субстрата. Однако для обеспечения соответствующего разворота необходимо провести сопутствующую мутацию остатка в положении 220. Замена I220T, предсказанная в результате виртуального скрининга, способствует развороту кольца гистидина за счет образования дополнительной водородной связи между боковыми радикалами остатков T220 и H222 (Рис. 7).

Дополнительно была протестирована возможность простого укорачивания бокового радикала Ile220 до Val (мутация I220V) без введения дополнительной водородной связи с сохранением гидрофобного остатка по положению 220, также способствующего развороту кольца гистидина.

Для уменьшения числа рекомендованных мутантов было решено объединить мутации, вводящие гидрофобные остатки в активный центр D-аминопептидазы.

Рис. 7.

Моделирование взаимодействия ароматических колец субстрата и бокового радикала остатка His 222.

Дополнительно выделен остаток T220.

Таким образом, для препаративного получения были выбраны следующие мутантные варианты D-аминопептидазы: одиночный W222H (DAP1), двойной W222H/W114L (DAP2), тройные W222H/W114L/I220V (DAP3V) с высокой гидрофобностью и W222H/W114H/I220T (DAP3T) с низкой гидрофобностью сайта связывания субстрата. Прогнозируемое расширение пространства кармана субстратной специфичности после введения трех мутаций показано на Рис. 8.

Рис. 8. Иллюстрация поверхности кармана субстратной специфичности D-аминопептидазы до (слева) и после введения мутаций (справа).

Результаты скрининга показывают, что одиночный мутант Trp222His способен успешно связывать субстраты D-MetNH2, D-CysNH2, D-LeuNH2, D-IleNH2, а также D-AsnNH2. Двойной мутант W222H/W222L способен связывать D-MetNH2, D-IleNH2, L-beta-PheNH2, D-ValNH2, D-HisNH2 и D-CysNH2. Наиболее эффективным предполагался тройной мутант по трем обнаруженным группспецифичным позициям Trp222His, Trp114Leu, Ile220Val, способный по результатам проведенного in silico исследования связывать и гидролизовать D-PheNH2, D-IleNH2, D-CysNH2, D-ValNH2, D-AlaNH2 и L--PheNH2.

Экспериментальное исследование субстратной специфичности полученных мутантных форм D-аминопептидазы По результатам спектрофотометрических исследований концентрация активных центров составила около 10-5 M для всех полученных образцов мутантных вариантов D-аминопептидазы. Экспериментальные значения кинетических констант, определенные в ходе исследования субстратной специфичности мутантных вариантов фермента приведены в Таблице 1.

Все исследованные мутанты D-аминопептидазы обладали активностью по отношению к специфическому субстрату фермента дикого типа – пара-нитроанилиду D-аланина. Активность в отношении более объемного субстрата – пара-нитроанилида D-лейцина, проявлял только тройной мутант DAP3T. Рассчитанные значения KM и kcat в данной паре «фермент-субстрат» составили, соответственно, 2,2 мМ и 22 сек-1. Оба тройных мутанта DAP3V и DAP3T были активны в отношении D-фенилаланинамида, однако ни один из исследуемых мутантных ферментов не был способен гидролизовать L-фенилаланинамид. Таким образом, введенные мутации позволили существенно расширить субстратную специфичность фермента и сохранить его высокую стереоспецифичность.

Таблица 1. Экспериментальные значения кинетических параметров гидролиза субстратов мутантными D-аминопептидазами с расширенной субстратной специфичностью.

D-Ala-pNA D-Leu-pNA D-Phe-NH kcat/KM, kcat/KM, kcat/KM, kcat, сек-1 KM, mМ kcat, сек-1 KM, mМ М-1сек-1 М-1сек-1 М-1мин-DAP д.т. 620 0.6 1.0106 – – – – DAP3V 560 3.6 1.65105 – – – DAP3T 220 6.9 3.2104 22 2.2 1.0104 Кинетические эксперименты по гидролизу хромогенного субстрата D-Ala-pNA в присутствии необратимого ингибитора сериновых протеаз фенилметилсульфонилфторида (PMSF) показали связывание этого ингибитора в активном центре тройного мутанта DAP3T (Рис. 9). В остальных случаях влияние PMSF на кинетику реакции гидролиза специфичного цветного субстрата обнаружено не было.

Рис. 9. Интегральные кривые накопления продукта гидролиза пара-нитроанилида D-аланина мутантной формой D-аминопептидазы DAP3T в отсутствие (синий) и при наличии (красный) PSMF в реакционной смеси.

Таким образом, в результате рационального дизайна фермента с использованием методов теоретической химии удалось получить мутантные варианты D-аминопептидазы с расширенной субстратной специфичностью, наиболее удачным из которых является тройной мутант DAP3T, содержащий замены W222H/W114H/I220T.

Разработка метода виртуального скрининга наилучшего растворителя для проведения биокаталитических реакций Описание алгоритма Рассмотрим стандартную равновесную реакцию:

aA bB cC dD, для которой термодинамическая константа равновесия, основанная на активностях, c d aC aD будет равна: Kth (1). Данное значение не зависит от состава среды (включая a b aA aB природу растворителя). Константа Kth также может быть определена как Kth Kx K (2), где Kx – отношение мольных долей реагентов в точке равновесия, c d C D а K равно: K (3). Если имеется действительная предсказательная модель a b A B для оценки коэффициентов активности для интересующей системы, становится возможным рассчитать значение Kth при любом заданном составе смеси. Ранее было показано, что метод COSMO-RS дает хорошие результаты при расчете реакционных систем ферментативных реакций, используемых в данной работе. При известном значении Kth для данной реакции можно предсказать значение Kx, а значит и выход реакции при практически любых условиях, влияющих на коэффициенты активности.

Если целью расчета является предсказание точки равновесия реакции ab initio, то есть без каких-либо экспериментальных данных, необходимы сложные полные вычисления энергий Гиббса стабильных состояний реагентов и продуктов.

Разработанный алгоритм не является ab initio методом и основан на использовании экспериментально определенного значения Kth интересующей реакции. Это значение может быть рассчитано при помощи COSMO-RS из результатов измерений концентраций в точке равновесия для всех соединений при одном единственном составе реакционной смеси. Далее, используя полученное значение Kth, разработанный метод позволяет предсказать состояние равновесия в практически любых смесях, включая любой растворитель известной структуры и в системах без стороннего растворителя (с учетом того, что реакционная смесь гомогенная и находится в жидком состоянии, и когда, например, растворителем является вещество, вступающее в реакцию).

Метод представляет собой минимизацию энергии Гиббса и может быть описан следующими шагами:

1. Предварительная DFT-оптимизация структур, применение диэлектрического потенциала COSMO для каждого соединения реакционной смеси и растворителя-кандидата, включая анализ конформеров.

2. Расчет референсного значения Kth реакции из экспериментальных данных в точке равновесия в единственных условиях с использованием COSMO-RS для определения коэффициентов активности.

3. Начальная оценка концентраций субстратов и продуктов и, следовательно, значения Kx.

4. Расчет значения K средствами COSMOtherm.

5. Расчет текущего значения Kth и сравнение его с референсным значением, предварительно рассчитанным на шаге 2.

6. Изменение концентраций субстратов и продуктов в ту или иную сторону в зависимости от результатов, полученных на предыдущем шаге, расчет нового значения Kx.

7. Повторение шагов 4-6 до достижения порога сходимости значения Kth (выбирается пользователем, обычно составляет 5%).

Блок-схема алгоритма представлена на Рис. 10.

Рис. 10.

Блок-схема разработанного Расчет Ввод коэффициентов алгоритма.

данных активности в cosmotherm Да Порог равен Расчет значения нулю? Kth Нет Расчет направления Сошлось или Нет смещения порог равен 0? «равновесия» Да Изменение Вывод концентраций, результата расчет Kx Референсное значение Kth также может быть получено с использованием разработанной программы. При указании нулевого значения порога сходимости программа производит расчет значение коэффициентов активности компонентов с указанными значениями концентраций и выводит в качестве результата искомое значение термодинамической константы, которое и используется при дальнейших расчетах.

Шаг 6 представляет собой простую линейную интерполяцию концентрации между текущим и одним из предыдущих значений методом деления отрезка пополам.

Полученное значение концентрации используется на следующей итерации расчета.

Направление интерполяции в сторону увеличения или уменьшения концентрации выбирается в зависимости от соотношения «текущего» и референсного значений Kth, при этом в качестве «предыдущих» сохраняются те значения концентраций, отрезок образованный которыми новое значение делит пополам (Рис. 11).

Алгоритм реализован на языке программирования Perl. Среднее время выполнения программы составляет 5 минут, за которое алгоритм совершает 6-итераций приближения. Это позволяет проводить выбор наилучшего растворителя для реакции в течение нескольких часов даже с учетом необходимой DFTоптимизации структур реагентов. Для работы алгоритма требуются предварительно установленные в системе интерпретатор языка Perl версии 5.8.3 и выше и пакет программ COSMOtherm версии 2.1 и выше.

Рис. 11. Схема выбора нового значения концентрации на шаге 6 разработанного алгоритма.

Валидация разработанного метода виртуального скрининга растворителя Для оценки точности предсказаний с использованием разработанного алгоритма были использованы результаты экспериментальных исследований двух реакций, катализируемых липазами в органических средах: 1) эстерификация додекановой-1 (лауриновой) кислоты ментолом; 2) эстерификация лауриновой кислоты додеканолом-1. Ранее было показано, что COSMO-RS обеспечивает достаточную точность в расчетах коэффициентов активностей для данных систем.

Результаты расчетов и экспериментальные данные литературных источников обобщены в Таблицах 2 и 3. Наилучшее значение Kx с точки зрения выхода реакции выделено полужирным шрифтом. По результатам исследования видно, что хотя не всегда удается точно предсказать значение константы Kx, для выбора оптимального растворителя реакции зачастую достаточно результатов одного экспериментального исследования положения равновесия. Особую важность в этом случае приобретает точность полученных экспериментальных данных. Вычисления имеют некоторую тенденцию завышать по сравнению с остальными значение рассчитываемой константы для растворителя, предоставляющего референсное значение Kth. Это может быть связано с тем, что в этом случае итеративное приближение не проводится, так как в качестве входных данных задаются экспериментально полученные равновесные значения концентраций. Данный эффект может быть минимизирован при помощи уменьшения задаваемого порога сходимости, что приводит к увеличению числа итераций и более длительному расчету, а также чревато возможным достижением в процессе вычислений значения машинной точности чисел, при котором не будет обеспечен выход из бесконечного цикла.

Некоторая неопределенность в выборе наилучшего растворителя в случае со второй реакционной системой (Таблица 3) связана с относительно малым влиянием растворителя на выход в данной реакции (коэффициент вариации экспериментальных значений log Kx для четырех лучших растворителей менее 10%).

Исходный текст программы, реализующий разработанный алгоритм, приведен в приложениях к основному тексту диссертации.

Заключение Выполнение диссертационной работы позволило получить важный опыт применения методов теоретической химии в сочетании с экспериментальными данными для решения задач биокатализа и биотехнологии. Изучение механизмов действия D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi (DAP) и апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазой человека 1 (APE1) дало возможность использовать эти знания для получения ферментного препарата с измененной субстратной специфичностью, а также поиска новых ингибиторов. Наряду с использованием методов теоретической химии для дизайна каталитических свойств фермента и его ингибиторов был получен ценный опыт in silico подбора наилучшего растворителя для проведения биокаталитических реакций, протекающих в органических средах. В целом выполненная работа показала плодотворность сочетания методов теоретической химии и экспериментального исследования при решении научных и прикладных задач.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ Предложен согласованный механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека, показано, что общим основанием при катализе является остаток Asp210, а донором протона для уходящей группы – остаток Tyr171.

Установлены основные принципы механизма действия ферментов семейства пенициллин-связывающих белков и показано, что в случае D-аминопептидазы и амидазы D-аминокислот из Ochrobactrum anthropi общим основанием при катализе является остаток Lys65(63) с необычно низким значением pKa.

При помощи методов теоретической химии предсказаны мутантные варианты D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi, обладающие расширенной субстратной специфичностью; изменение каталитических свойств мутантных ферментов подтверждено экспериментально.

На основе метода COSMO-RS разработан и реализован алгоритм виртуального скрининга растворителя, позволяющий провести выбор оптимальной среды для проведения биокаталитического превращения и достичь максимального выхода целевого продукта.

Таблица 2. Экспериментальные и предсказанные значения log Kx для реакции эстерификации лауриновой кислоты ментолом.

Растворитель Экспериментальное Референсное Предсказанное значение log Kx для растворителя в эксперименте значение log Kx значение log Kth Гептан Циклогексан 224-ТМП Толуол Ацетонитрил 2-Метилбутанол-Гептан 1.26 2.08 1.26 1.40 0.90 1.03 1.39 1.Циклогексан 1.41 2.24 1.02 1.41 0.87 1.02 1.38 1.224-ТМП* 1.23 2.04 1.03 1.40 1.23 1.03 1.39 1.Толуол 1.02 2.07 0.88 1.27 0.79 1.02 1.23 1.Ацетонитрил 0.52 2.04 0.45 0.64 0.43 0.43 0.52 0.2-Метилбутанол-2 0.63 2.04 0.53 0.66 0.47 0.52 0.46 0.Таблица 3. Экспериментальные и предсказанные значения log Kx для реакции эстерификации лауриновой кислоты додеканолом-1.

Растворитель Экспериментальное Референсное Предсказанное значение log Kx для растворителя в эксперименте значение log Kx значение log Kth Гексан Гептан Циклогексан 224-ТМП Толуол Гексан 1.63 2.18 1.63 1.46 1.42 1.46 1.Гептан 1.55 2.19 1.60 1.55 1.59 1.61 1.Циклогексан 1.38 2.00 1.42 1.44 1.38 1.43 1.224-ТМП 1.39 2.00 1.37 1.38 1.35 1.39 1.Толуол 1.18 2.05 1.66 1.68 1.64 0.88 1.*224-ТМП = 2,2,4-триметилпентан СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. И.Г. Халиуллин, Д.А. Суплатов, Д.Н. Шалаева, М. Оцука, Я. Асано, В.К. Швядас, «Биоинформатический анализ и молекулярное моделирование участия Lys65 в каталитической триаде D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi», Acta Naturae, 2010, т. 2, № 5, с. 70–74.

2. P. Braiuca, I. Khaliullin, V. Svedas, L. Knapic, M. Fermeglia, P. J. Halling, and L. Gardossi, “BESSICC, a COSMO-RS based tool for in silico solvent screening of biocatalysed reactions,” Biotechnology and Bioengineering, 2012, vol. 109, no. 7, pp. 1864–1868.

3. И.Г. Халиуллин, Д.К. Нилов, И.В. Шаповалова, В.К. Швядас, «Построение механистической полноатомной модели апуриновой / апиримидиновой эндонуклеазы человека APE1 для виртуального скрининга новых ингибиторов», Acta Naturae, 2012, т. 4, № 13, с. 83–89.

4. I. Khaliullin, V. vedas, P. Braiuca, L. Gardossi, “In silico solvent selection for biocatalysed reactions by COSMO-RS method,” 2nd International Conference “Biocatalysis in Non-Conventional media”, Moscow, Russia, June 12-15, 2008.

5. I. Khaliullin, D. Suplatov, V. vedas, Y. Asano, M. Otsuka, D. Shalaeva, “The Role of Lys65 Residue in the Catalytic Triad of D-aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi Revealed by Bioinformatic Analysis and Molecular Modeling,” Proc. 5th Internat. Congress on Biocatalysis Biocat2010, Hamburg, Germany, August 29 – September 2, 2010, p. 196.

6. Shalaeva D.N., Suplatov D.A., Khaliullin I.G., vedas V.K., “Bioinformatics insight into structural determinants of D-aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi substrate specificity to amino acid derivatives,” Международная конференция «Ломоносов-2010», 2010, Москва.

7. I. Khaliullin, K. Tokunan, M. Himi, D. Suplatov, D. Shalaeva, Y. Asano, V. vedas, “Bioinformatic analysis and molecular modeling to predict mutations widening substrate specificity of D-aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi,” Book of Abstracts, 10th International Symposium on biocatalysis, BioTrans-2011, Giardini Naxos, Italy, October 2-6, 2011, p. 149.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.