WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Пероксинитрит получали, смешивая охлажденные растворы 1 М NaNO2 и М Н2О2 в 0,3 М H2SO4, после чего быстро добавляли равный объём 1,4 М NaOН. Разделы 2.3 и 2.4 посвящены описанию получения изолированных митохондрий и определению их функциональной активности. Митохондрии выделяли из сердец крыс. Методика выделения митохондрий была стандартной. Животных усыпляли, используя 20% раствор уретана (1,8 мг/кг массы животного), который вводился в брюшную полость. Затем быстро извлекали сердце и помещали в охлажденную (4С) среду выделения. Cостав среды выделения: 300 мM сахароза, 10 мM HEPES (N-2гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновая кислота), 0,5 мM EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота); рН 7.4. Измельченную ткань переносили в гомогенизатор (стекло-тефлон), добавляли 25-30 мл среды выделения в соответствии с соотношением 1:8 и гомогенизировали 2-минуты до превращения суспензии в гомогенную. Осаждение митохондрий производили в два этапа на центрифуге К-24 (ГДР). Полученный осадок митохондрий суспендировали в 150 мл БСА. Далее помещали в маленькую пробирку и хранили во льду или замораживая при –20°С. Концентрация белка в митохондриальной суспензии, определенная по биуретовому методу, составляла 30-35 мг/мл. Раздел 2.5 посвящен описанию инициирования перекисного окисления митохондрий и методу определения МДА.

Свободнорадикальное окисление митохондрий индуцировали добавлением 400 мкМ гидропероксида трет-бутила и 100 мкМ метмиоглобина. В ряде экспериментов вместо метмиоглобина или совместно с ним добавляли ферритин (2,5 мг/мл). Образцы объемом в 1 мл инкубировались в течение часов при 37°С после чего в них определялось содержание малонового диальдегида (МДА). Для этого к 0,5 мл инкубационной смеси, содержащей препарат митохондрий, добавляли 1,5 мл 1%-ной фосфорной кислоты, 10-М ЭДТА, 10-5 М ВНТ и 1 мл 0,5%-ного раствора 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК), после чего инкубировали 45 мин при 100°С. После охлаждения смеси, комплекс МДА с ТБК экстрагировали н-бутанолом. В бутанольной фазе регистрировали спектр поглощения в области 515-550 нм. Концентрацию МДА рассчитывали по оптической плотности комплексов МДА-ТБК при 532 нм ( = 1,56. 105 М-1 см-1) [92]. Все оптические измерения проводили на спектрофотометрах Hitachi 557 (Япония) и Beckman Coulter 650 (США). При исследовании взаимодействия ДНКЖ с супероксидным радикалом (О2•–), последний генерировали добавлением к реакционной смеси свежеприготовленного раствора супероксида калия (КО2) в диметилсульфоксиде или использовали систему ксантин-ксантиноксидаза для ферментативной генерации О2•–.

В третьей и последующих главах представлены непосредственно результаты исследований. Третья глава посвящена взаимодействию низкомолекулярных динитрозильных комплексов с активными формами кислорода и гидропероксидами. В данной работе факт генерации супероксидных радикалов митохондриями устанавливали при помощи спиновой ловушки TIRON. При инкубации митохондрий в присутствии субстратов дыхательной цепи не происходит существенного образования супероксида. При добавлении антимицина появляется сигнал аддукта спиновой ловушки с супероксидным радикалом. На рис.1 показана деструкция ДНКЖ при их инкубации с митохондриями из сердечной мышцы крыс в присутствии сукцината в качестве субстрата и антимицина А.

Рис.1. Деструкция динитрозильных комплексов с глутатионовыми лигандами при генерации супероксида митохондриями из сердца крысы.

1 – инкубационная среда + 0,2 мМ ДНКЖ + 1 мкг/мл антимицина А + мМ сукцината;

2 - то же что и (1) + СОД (ед/мл) + каталаза (400 ед/мл).

0 4 8 12 Время, мин В случае добавления в систему супероксиддисмутазы и каталазы, не происходило столь значительного падения сигнала, т.е. деструкцию динитрозильных комплексов вызывает именно супероксид, генерируемый дыхательной цепью митохондрий.

Значительное падение сигнала динитрозильных комплексов говорит о Сигнал ЭПР, отн.

ед.

высокой скорости реакции между ними и супероксидным радикалом.

Антиоксидантное действие ДНКЖ оценивали по ингибированию образования в системе гемин/H2O2 феноксильного радикала пробукола. Последний является синтетическим антиоксидантом близким по структуре и механизму действия к токоферолу. Из рис.2 видно, что ДНКЖ как с глутатионовыми так и с цистеиновыми лигандами (спектры 2 и 3), в молярных соотношениях, сравнимых с H2O2 и гемином, более чем на 70% ингибируют образование радикала пробукола. Динитрозильные комплексы с фосфатными лигандами были несколько менее эффективны (~50% ингибирования) (рис.2, спектр 4).

Рис.2. Влияние динитрозильных g=2,комплексов с различными лигандами на образование радикала пробукола. Реакционная смесь содержала:

изопропанол/K,Na-фосфатный буфер, 1,5 мМ пробукола и 0,мМ гемина.

1 - cпектр ЭПР феноксильного радикала пробукола образовавшегося после добавления в реакционную среду 2 мМ Н2О2;

2 - то же что и (1) + 0,5 мМ ДНКЖ, содержащих цистеин;

3 - то же что и (1) + 0,5 мМ ДНКЖ, содержащих глутатион;

4 - то же что и (1) + 0,5 мМ 324 325 326 327 328 ДНКЖ с фосфат-анионом в Магнитное поле, мТл качестве лиганда.

Таким образом, можно предположить, что тиольные лиганды наряду с другими компонентами динитрозильных комплексов, такими как NO+ и ионы железа, вносят свой вклад в снижение концентрации радикала пробукола.

Образование феноксильного радикала может происходить при одноэлектронном окислении пробукола оксоферрилформой гемина или гидроксильным радикалом (рис.2). Представляется вероятным, что эти активные окислители, образуются при взаимодействии гемина с H2O2.

Четвертая глава посвящена ферритину и миоглобину, их участию в развитии окислительного стресса. В литературе появляется все больше данных о связи метаболизма ферритина, активных форм кислорода и NO. Так, ферритин может участвовать в образовании нитрозильных комплексов железа.

Синтез самого ферритина регулируется оксидом азота, а проходящая с участием ферритина, микросомальная продукция активных форм кислорода, ингибируется донорами NO. В то же время, возможное влияние миоглобина и ферритина на окислительную модификацию митохондрий изучено недостаточно. В данной работе было исследовано свободнорадикальное окисление митохондрий, индуцированное сочетанием гидропероксида третбутила с метмиоглобином или их комбинацией с ферритином. На рис.представлены результаты изучения влияния S-нитрозоглутатиона (GSNO), GSH и ДНКЖ на образование вторичных продуктов перекисного окисления (МДА) в препарате митохондрий из миокарда крысы.

Рис.3. Накопление МДА.

1 - препарат митохондрий (0,5 мг белка/мл), Na,K-фосфатный буфер и 1,400 мкМ гидропероксида трет-бутила;

2 – то же, что и (1) плюс 100 мкМ метмиоглобина;

1,3 - то же, что и (2) плюс 100 мкМ GSNO;

4 - то же, что и (2) плюс 200 мкМ 0,GSH;

5 - то же, что и (2) плюс 100 мкМ GSNO и 200 мкМ GSH;

6 - то же, что и (2) плюс 50 мкМ 0,ДНКЖ.

В серии параллельных экспериментов в среду инкубации добавляли 2,0,мкг/мл ферритина (заштрихованные 1 2 3 4 5 столбики).

Образование МДА наиболее эффективно подавлялось под действием ДНКЖ (рис.3 столбец 6), а также при сочетанном действии GSNO и GSH (рис.3 столбец 5). Следует отметить, что в последнем случае возможно формирование ДНКЖ при взаимодействии МДА, мк M GSNO, GSH и ионов железа, содержащихся в реакционной среде. Накопление МДА при окислении мембран митохондрий индуцированном гидропероксидом трет-бутила в сочетании с метмиоглобином и ферритином было достоверно выше, чем в присутствии гидропероксида трет-бутила и миоглобина (рис.3 столбец 2).

На рис.4 представлены кинетики деструкции ДНКЖ при ферментативной генерации O2.- в системе ксантин - ксантиноксидаза.

Рис.4. Кинетики деструкции ДНКЖ в условиях ферментативной генерации супероксид-анион радикала.

Реакционная среда содержала:

1 - 100 мМ Na,K-фосфатного буфера pH 7,4, 0,2 мМ 1 мМ ксантина, 0,2 ед./мл ксантиноксидазы, 120 мкМ ДНКЖ;

2 - то что и (1) плюс 100 мкМ метмиоглобина.

400 В присутствии 0 10 20 30 метмиоглобина скорость Время, мин распада ДНКЖ резко возрастает (рис.4 кривая 2), однако, этот эффект почти полностью снимается каталазой. Полученные результаты указывают на то, что снижение ЭПР-детектируемой концентрации ДНКЖ происходит как под действием O2.-, так и гидроксильного радикала, возникающего в условиях эксперимента в реакции между Н2О2 и метмиоглобином.

Высокая антиоксидантная активность ДНКЖ, позволяет заключить, что при взаимодействии этого комплекса NO с O2.-, по-видимому, не происходит образования пероксинитрита.

Сигнал ЭПР, отн.

ед.

Пятая глава посвящена взаимодействию белковых динитрозильных комплексов с активными формами кислорода. В разделе 5.1 описано исследование взаимодействия белковых ДНКЖ с супероксидом, ферментативно генерируемым в системе ксантин-ксантиноксидаза. На рис.и 6 представлены кинетики гибели альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ, соответственно, под действием супероксида.

350 200 300 048 12 0 2 4 6 8 10 Время, мин. Время, мин.

Кинетика деструкции альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ в условиях ферментативной генерации супероксида.

Рис.5. Рис.6.

(1) – Na-фосфатный буфер, (1) – Na-фосфатный буфер, альбуминовые ДНКЖ (560µМ), ДТПА гемоглобиновые ДНКЖ (540µМ), (1,6мМ), ксантин (3,5мМ), ДТПА (1,6мМ), ксантин (3,5мМ), ксантиноксидоредуктаза (0,6 ксантиноксидоредуктазу (0,6 ед./мл);

ед./мл); (2) - (1) + СОД (100 ед./мл);

(2) - (1) + СОД (25 ед./мл); (3) - (1) + СОД (400 ед./мл);

(3) - (1) + СОД (400 ед./мл); (4) - (2) + каталаза (600 ед./мл);

(4) - кинетика гибели (5) - кинетика спонтанной альбуминовых ДНКЖ в реакционной деструкции гемоглобиновых ДНКЖ в среде без ксантина. Концентрация реакционной среде без ксантина.

альбумина 16,5 мг/мл.

Представляется вероятным, что разница в кинетиках гибели альбуминовых и гемоглобиновых динитрозильных комплексах связана с Сигнал ЭПР, отн.

ед.

Сигнал ЭПР, отн.

ед.

взаимодействием гема с пероксидом водорода, в результате которого возникают активные интермедиаты, способные внести свой вклад в деструкцию гемоглобиновых ДНКЖ. При взаимодействии пероксида водорода с гемом образуется феррилгемоглобин, являющийся сильнейшим окислителем. В данных условиях динитрозильные комплексы оказываются способными эффективно восстанавливать феррилгемоглобин, фактически выступая в роли антиоксидантов. Это может иметь большое значение для тканей с высоким содержанием гемопротеидов, находящихся в условиях окислительного стресса.

В разделе 5.2 описано взаимодействие динитрозильных комплексов с пероксидом водорода и гидропероксидом трет-бутила. В присутствии пероксидов наблюдалось существенное снижение концентрации ДНКЖ.

Было показано, что гидропероксид трет-бутила более эффективно разрушает гемоглобиновые ДНКЖ. Это можно объяснить возникновением активных интермедиаторов при взаимодействии гема с пероксидом водорода и гидропероксидом трет-бутила. Такими интермедиатами являются оксоферрилгемоглобин, протеиновые радикалы гемоглобина и алкилперекисные радикалы.

В разделе 5.3 описано исследование образования димеров субъединиц гемоглобина, образующихся вследствие возникновения дисульфидной связи между цистеинами -93 и димеризации тирозиновых свободных радикалов в результате окислительной модификации. В ходе вызванной пероксидом водорода деструкции гемоглобиновых ДНКЖ можно было бы ожидать окисление цистеиновых -93, входящих в состав динитрозильных комплексов, и образования дисульфидной связи. Однако, связанные с гемоглобином ДНКЖ в концентрациях, эквимолярных пероксиду водорода, почти полностью ингибируют димеризацию субъединиц, т.е. в случае с гемоглобиновыми ДНКЖ не происходит окисления цистеинов молекулы гемоглобина. Причем взаимодействие этих ДНКЖ с пероксидом водорода не приводит к генерации свободных радикалов в реакции Фентоновского типа и возникновению дисульфидных связей, т.е. железо, входящее в состав динитрозильных комплексов, само по себе, не вызывает разложение перосида водорода.

Таким образом, гемоглобиновые ДНКЖ действуют как антиоксиданты, защищая белок, с которым они связаны, от окислительной модификации.

Стоит отметить, что образование белковых ДНКЖ носит обратимый характер и не нарушает функциональной активности белка. Антиоксидантное действие ДНКЖ, показанное в этом эксперименте, не носит специфический характер по отношению к гемоглобину и также может реализовываться в случае других белков. В разделе 5.4 описано исследование взаимодействия альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ с пероксинитритом. В результате диффузионно-контролируемой реакции супероксида с оксидом азота образуется один из наиболее мощных биологических окислителей - пероксинитрит. Невысокие концентрации оксида азота и супероксида компенсируются высокой константой скорости реакции. Представляется вероятным, что пероксинитрит может вызывать окислительную деструкцию белковых ДНКЖ, как в физиологических условиях, так и в модельных системах.

Рис.7. Деструкция альбуминовых ДНКЖ под действием различных концентраций пероксинитрита в Na-фосфатном буфере (0,2 М, pH 7,4), содержащем ДТПА (1,6 мМ).

Концентрация альбумина 16,мг/мл. Концентрация альбуминовых ДНКЖ (560 µМ).

0,0 0,2 0,4 0,6 0,На рис.7 и 8 представлены [O N O O ], мМ кривые зависимости деструкции альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ от концентрации пероксинитрита.

Сигнал ЭПР, отн.

ед.

Рис.8. Деструкция гемоглобиновых ДНКЖ под действием различных концентраций пероксинитрита в Naфосфатном буфере (0,2 М, pH 7,4), содержащем ДТПА (1,6 мМ).

Концентрация гемоглобина 16,3 мг/мл (288 µМ). Концентрация гемоглобиновых ДНКЖ (540 µМ).

Хорошо видно, что альбуминовые ДНКЖ почти на порядок более 0 1 2 3 4 5 [ONOO-], мМ чувствительны к действию пероксинитрита, чем ДНКЖ, ассоциированные с гемоглобином. Этот факт может быть связан как с большей доступностью альбуминовых ДНКЖ, так и с возможным взаимодействием пероксинитрита с гемом этих белковых молекул. Интересно, что перелом в концентрационной зависимости деструкции гемоглобиновых ДНКЖ соответствует молярному соотношению гем/ONOO-, равному 2. Это косвенно подтверждает предположение, что именно геммы -субъединиц гемоглобина частично нейтрализуют пероксинитрит.

Шестая глава посвящена описанию взаимодействия оксофферилмиоглобина с динитрозильными комплексами. Известно, что в деструктивных процессах, развивающихся в ходе окислительного стресса, определенную роль играют миоглобин, гемоглобин и другие гемопротеиды.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»