WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Губкин Андрей Александрович Динитрозильные комплексы железа, S-нитрозотиолы и коэнзим Q как антиоксиданты в системах, моделирующих окислительный стресс Специальность 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова и в НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росздрава.

Научный консультант: доктор физико-математических наук, профессор Рууге Энно Куставич Научный консультант: кандидат химических наук Шумаев Константин Борисович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Петрусевич Юрий Михайлович доктор биологических наук Реутов Валентин Палладиевич

Ведущая организация: Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН

Защита диссертации состоится 21 ноября 2006 г. в « » часов на заседании диссертационного совета К 501.001.08 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адрессу: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, Физический факультет, аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан « » октября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 501.001.08 кандидат физико-математических наук Хомутов Г.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

В настоящее время одной из актуальных задач в медицинской биофизике, физиологии и медицинской химии является изучение короткоживущих активных соединений, выполняющих функцию регуляторов на различных уровнях организации живых организмов. К таким молекулам, в первую очередь, относятся оксид азота (NO) и активные формы кислорода. В последние годы появляется все больше данных о новых физиологических функциях оксида азота и его метаболитов. Наряду с сигнальной ролью NO, важной областью исследований является взаимодействие оксида азота с активными формами кислорода.

Возникающие в этих реакциях активные метаболиты азота – пероксинитрит, диоксид азота, NO2Cl и. др. являются важным компонентами иммунного ответа в организме человека и животных. С другой стороны, активные формы кислорода и азота участвуют в развитии патологий, связанных с окислительным стрессом, в том числе атеросклероза, ишемической болезни сердца, нейродегенеративных заболеваний, катаракты, рака, диабета. В тоже время, процессы взаимодействия активных форм кислорода с такими производными NO как S-нитрозотиолы (RSNO) и динитрозильные комплексы железа остаются мало изученным. Существенно, что сам оксид азота и S-нитрозотиолы в некоторых модельных системах проявляют антиоксидантные свойства. Предполагается, что одним из механизмов антиоксидантного действия NO является связывание свободных ионов железа в составе нитрозильных комплексов. При этом ингибируются реакции свободно-радикального окисления, катализируемые редокс-активными ионами железа. Перекисное окисление липидов ингибируется также благодаря взаимодействию NO с алкилпероксильными и алкоксильными радикалами. Оксид азота может защищать другие биологические молекулы от окислительной модификации, нитрозилируя гем и восстанавливая оксоферрилформы гемопротеидов.

Во многих работах в качестве возможных белков-переносчиков NO в кровотоке рассматриваются гемоглобин и альбумин. Цистеиновые остатки этих белков могут нитрозилироваться, в случае гемоглобина NO также связывается с железом гема. Показано, что при взаимодействии низкомолекулярных ДНКЖ с гемоглобином и альбумином образуются ассоциированные с этими белками динитрозильные комплексы железа. Они, так же как и низкомолекулярные ДНКЖ могут играть важную роль в условиях окислительного стресса.

Известно, что супероксид влияет на образование S-нитрозогемоглобина и стимулирует высвобождение NO из S-нитрозоальбумина. Редокс-реакции с участием гемоглобина играют важную роль в ходе окислительного стресса.

Установлено, что гемоглобин может стимулировать перекисное окисление белок-липидных комплексов. В ряде статей высказано предположение, что динитрозильные комплексы железа с белками могут участвовать в защите клеток от цитотоксического действия активных форм кислорода. Так как белковые динитрозильные комплексы ответственны за многие физиологические функции NO в организме человека, большое значение имеет изменение их концентрации под действием активных форм кислорода.

В условиях окислительного стресса происходит истощение большинства эндогенных антиоксидантов. В связи с этим, несомненно, актуальным является выяснение влияния производных оксида азота на концентрацию важнейшего липофильного антиоксиданта убихинона (коэнзима Q). Высокая эффективность коэнзима Q связана с тем, что он может регенерировать витамин Е (токоферол) и сам восстанавливается ферментами дыхательной цепи митохондрий или аскорбатом. Однако убихинон может также способствовать генерации супероксидного радикала.

Следовательно, взаимодействие убихинона с производными оксида азота может иметь неоднозначный характер.

Таким образом, реакции активных форм кислорода с содержащими ион нитрозония производными оксида азота (RSNO и динитрозильными комплексами железа) могут играть чрезвычайно важную роль как в нормальных условиях существования живого организма, так и в ходе патологических процессов возникающих в результате окислительного стресса. Исследование механизмов взаимодействия производных оксида азота и активных форм кислорода особо актуально, так как они могут определять баланс антиоксидантных и прооксидантных реакций в клетке, а также влиять на концентрацию оксида азота, который является универсальным регулятором многих метаболических путей и физиологических эффектов.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлось изучение физиологических роли взаимодействия активных форм кислорода с производными оксида азота, содержащими ион нитрозония, и влияния на эти процессы коэнзима Q (убихинона).

Исходя из поставленной в диссертационной работе цели, решались следующие задачи:

1. Изучить взаимодействие низкомолекулярных динитрозильных комплексов с активными формами кислорода и органическими гидропероксидами.

2. Исследовать особенности реакций ассоциированных с гемоглобином и альбумином динитрозильных комплексов с активными формами кислорода и пероксинитритом.

3. В системах, моделирующих окислительный стресс, исследовать влияние динитрозильных комплексов железа и S-нитрозоглутатиона на характеристики индуцированного железосодержащими белками перекисного окисления препаратов миокарда.

4. Изучить действие S-нитрозоглутатиона на окислительную деструкцию липофильных антиоксидантов: коэнзима Q и -каротина, а также взаимодействие в этих условиях коэнзима Q и Sнитрозоглутатиона.

Научная новизна диссертации.

1. Методом спектроскопии ЭПР изучены процессы взаимодействия низкомолекулярных и белковых динитрозильных комплексов с активными формами кислорода.

2. Впервые установлено, что различия кинетик деструкций ассоциированных с альбумином и гемоглобином динитрозильных комплексов под действием пероксида водорода, гидропероксида трет-бутила и пероксинитрита обусловлены гемовой группой.

3. При изучении взаимодействия различных типов динитрозильных комплексов с пероксидом водорода впервые показано, что входящее в состав этих комплексов железо не участвует в реакции Фентона.

4. Продемонстрировано антиоксидантное действие динитрозильных комплексов и S-нитрозоглутатиона при перекисном окислении митохондрий кардиомиоцитов, индуцированное миоглобином и ферритином в сочетании с гидропероксидом трет-бутила.

5. Впервые обнаружено защитное действие S-нитрозогутатиона в отношении убихинонов миокарда крысы в условиях моделирующих окислительный стресс.

6. Показано, что S-нитрозоглутатион и динитрозильные комплексы железа ингибируют окислительную деструкцию липофильного антиоксиданта -каротина под действием свободных радикалов трет-бутила.

Научно-практическая значимость исследования.

Представленные в диссертации экспериментальные данные проясняют механизмы взаимодействия динитрозильных комплексов железа с активными формами кислорода и могут быть использованы для лучшего понимания роли оксида азота и его производных в биологических системах. Процессы, изученные в данной работе, имеют большое значение для понимания механизмов действия фармакологических доноров оксида азота.

Апробация результатов исследования и публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах.

Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на XI и XII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам “Ломоносов-2004” и “Ломоносов-2005”, “Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии.” (Москва, 2005), IV международная научно-практическая конференция с международным участием “Активные формы кислорода, оксид азота антиоксиданты и здоровье человека” (Смоленск. 2005), III съезде биофизиков России (Воронеж 2004), XIV международной конференции и дискуссионном научном клубе “Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармокологии и экологии” (Ялта-Гурзуф, 2006).

Структура и объем диссертационной работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), методической части (глава 2), описания собственных результатов и их обсуждения (главы 3 – 7), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем работы составляет 111 страниц, включая 28 рисунков и графиков, 2 таблици и список литературы из 148 наименований.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, обоснована актуальность темы, сформулированны цели и задачи исследования, кратко изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

Первая глава содержит литературный обзор, посвященный активным формам кислорода, оксиду азота и его производным. Кратко изложены основные физико-химические свойства активных форм кислорода и азота.

Описаны их источники в биологических системах. Дана классификация NOсинтаз и представление о их функционировании, способах регуляции ферментативной активности. Кратко изложена работа дыхательной цепи митохондрий с упором на образование ею активных форм кислорода, прежде всего супероксида. Описана ксантиноксидоредуктаза, даны ее основные функции и регуляция. В разделе 1.3 кратко описано современное представление о взаимодействии активных форм кислорода и азота в клетке, рассказано о роли динитрозильных комплексов в этом взаимодействии.

Отдельный раздел посвящен пероксинитриту, как одному из наиболее важных продуктов взаимодействия активных форм кислорода и азота, описаны его цитотаксические свойства. Заканчивает главу раздел 1.4 о прооксидантных и антиоксидантных свойствах активных форм кислорода и азота, обобщаются данные о роли динитрозильных комплексов и Sнитрозоглутатиона. Целью обзора литературы было не только показать современное представление о разделе биофизики посвященном свободным радикалам кислорода и азота, но и показать место данной работы в этом разделе, обосновать актуальность поставленных в ней задач.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

Раздел 2.1 посвящен регистрации спектров ЭПР. Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре E-109Е фирмы Varian (США), при комнатной температуре (~25°C). Условия регистрации спектров ЭПР: СВЧ мощность 5 мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0,05 мТл для TIRON и СВЧ мощность 10 мВт, амплитуда ВЧ модуляции 0,4 мТл для ДНКЖ. Спектры феноксильного радикала пробукола регистрировали при СВЧ мощности 50 мВт. В экспериментах с генерацией О2•-, для постоянства газового состава образцы помещали в тонкостенный (толщина стенок 0,00254 мм) тефлоновый капилляр фирмы Norell, Inc. (США), а запись спектров проводили при непрерывной продувке воздухом. В остальных случаях образцы помешались в стеклянные капилляры. Для определения скорости генерации свободных радикалов кислорода митохондриями использовали спиновую ловушку TIRON. В остальных случаях для определения скорости генерации радикалов кислорода использовали спиновую ловушку DEPMPO. Регистрацию спектров спин-аддуктов DEPMPO проводили при тех же условиях что и для ДНКЖ: СВЧ мощность мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0,1 мТл. В разделе 2.описывается получение препаратов и работа с ними. В работе использовали восстановленный глутатион (Calbiochem, США), цистеин, гидропероксид трет-бутила (Merk, Германия), пероксид водорода, ДТПА, ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), DEPMPO (5-диэтоксифосфорил-5метил-1-пирролин N-оксид) (OXIS, США), TIRON (4,5 - диоксибензол - 1,3 - дисульфат натрия), супероксиддисмутазу, ксантиноксидазу, гемоглобин, метмиоглобин, гемин, пероксинитрит, диоксид калия (KO2), убихинон, ферритин и 2-тиобарбитуровую кислоту (Sigma, США) и некоторые другие.

S-нитрозоглутатион (GSNO) и динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) с глутатионом в диамагнитной димерной форме получали, смешивая 300 мМ NaNO2 и 200 мМ восстановленного глутатиона в кислой среде или растворы FeSO4 и глутатиона в молярном соотношении 1:2 сосуде Тунберга в атмосфере NO, соответственно. Препараты GSNO, ONOO- и ДНКЖ хранили при –20С. Концентрацию ДНКЖ определяли методом спектроскопии ЭПР.

Для генерации супероксида в разных экспериментах использовали систему ксантин-ксантиноксидаза или супероксид калия (КО2). При работе с ксантиноксидазай образец помещали в тонкостенный (толщина стенок 0,00254 мм) тефлоновый капилляр, как и при работе с митохондриями, а запись спектров проводили при непрерывной продувке воздухом.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»