WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     ||
|

Рис. 7. Зона контакта клитина и GFP. Электростатический потенциал поверхности показан для GFP (А) и клитина (Б). Поверхность окрашена в соответствии с зарядом аминокислотного остатка (отрицательный – красным, положительный – синим и нейтральный – белым цветами). Аминокислотные остатки зоны контакта показаны в виде цветных линий (синих – для клитина и пурпурных – для GFP).

Экспериментальное подтверждение структуры комплекса клитин-GFP Некоторые из аминокислотных остатков клитина, формирующих поверхность контакта с GFP, были заменены на аланин методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза (K11A, K13A, N15A, N109A, N188A). Также были получены мутанты клитина с укороченным N-концом (5А, 10V). Влияние мутаций на эффективность переноса энергии оценивали с помощью константы Ket, рассчитанной из биолюминесцентных спектров клитина и его мутантных форм в комплексе с GFP. Дополнительно мутанты клитина K11A, K13A, N188A и 5A использовали для ЯМР-титрования 2Н,15N-меченого GFP с целью оценить эффект мутации на аффинность белков в комплексе, которая оценивалась по степени возмущения кросс-пиков GFP. Все исследованные аминокислотные замены клитина снижали эффективность переноса энергии и аффинность белков друг к другу. Минимальный и максимальный эффекты показаны на примере мутантов N188A и K11A, соответственно (рис. 8). Интересно, что эффект от аминокислотных замен положительно заряженных K11 и K13 сопоставим с эффектом от делеции 8 остатков N-конца клитина.

Это может подтверждать значительный вклад электростатического взаимодействия в образование комплекса клитин-GFP.

Рис. 8. (А) Спектры биолюминесценции клитина (WT) и его мутантных форм (N188A, K11A) при титровании GFP. (Б) Возмущение химического сдвига аминокислотных остатков H,15N-меченого GFP при добавлении 2кратного молярного избытка клитина и его мутантных форм.

ВЫВОДЫ 1. Определены кинетические характеристики ферментативной реакции, катализируемой люциферазой из коралла Renilla muelleri, с целентеразином и целентеразин-связывающим белком (CBP). Показано, что использование CBP в качестве «субстрата» в два раза повышает эффективность работы люциферазы.

2. На основе кристаллических структур люциферазы Renilla и CBP, связанного с кальцием, рассчитана пространственная структура комплекса люцифераза-CBP-Ca2+, объясняющая высокую эффективность биолюминесцентной реакции с СВР в качестве «субстрата» люциферазы.

3. Впервые получены кристаллы и определена кристаллическая структура Са2+-регулируемого фотопротеина клитина из медузы Clytia gregaria с разрешением 1,9. Показано, что пространственная структура клитина высоко гомологична структуре фотопротеина обелина.

4. Впервые получены 13С,15N-меченый клитин и 2Н,13С,15N-меченый зеленый флуоресцентный белок (GFP) и проведено полное отнесение резонансов основных цепей в 1Н-15N HSQC ЯМР спектрах этих белков. С помощью ЯМР-титрования определены аминокислоты клитина и GFP, формирующие поверхность взаимодействия белков. Установлено, что основными аминокислотными остатками зоны контакта клитина являются остатки N-конца, -спирали D и С-конца белковой молекулы. Показано, что поверхность контакта GFP более дискретна и образована аминокислотами петель S3-S4, S6-S7 и S10-S11 верхушки «бочонка».

5. Используя кристаллические структуры клитина и GFP с учетом аминокислотных остатков поверхности взаимодействия, рассчитана пространственная структура комплекса клитин-GFP, отражающая взаимную ориентацию белков. Так как, KD комплекса клитин-GFP, оцененная из биолюминесцентных измерений, лежит в µМ диапазоне, а из данных ЯМР – в мМ диапазоне, сделан вывод, что структура комплекса клитин-GFP соответствует комплексу, предшествующему «возбужденному состоянию».

6. Получены мутанты клитина с заменами некоторых аминокислот, формирующих зону контакта. С помощью ЯМР и биолюминесцентных измерений показано, что замены уменьшают эффективность образования комплекса. Это является дополнительным подтверждением правильности рассчитанной структуры комплекса клитин-GFP.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1. Titushin, M.S. Coelenterazine-binding protein of Renilla muelleri: cDNA cloning, overexpression, and characterization as a substrate of luciferase / M.S.

Titushin, S.V. Markova, L.A. Frank, N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, J. Lee, E.S.

Vysotski // Photochem. Photobiol. Sci. – 2008. – V. 7 (2). – P. 189–196.

2. Titushin, M.S. Ca2+-dependent coelenterazine-binding protein of Renilla provides higher bioluminescence efficiency that free coelenterazine / M.S. Titushin, S.V. Markova, L.A. Frank, N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, J. Lee, E.S. Vysotski // Luminescence. – 2008. – V. 23 (2). – P. 95.

3. Титушин, М.С. Получение и некоторые биохимические свойства рекомбинантных белков биолюминесцентной системы коралла Renilla muelleri / М.С. Титушин // Материалы конференции молодых ученых КНЦ СО РАН.

– Красноярск: ИВМ СО РАН, 2007. – С. 41 – 44.

4. Титушин, М.С. Получение и некоторые биохимические свойства рекомбинантных белков биолюминесцентной системы коралла Renilla muelleri / М.С. Титушин // Материалы XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». – Новосибирск:

Новосибирский Государственный Университет, 2005. – С. 91–92.

Pages:     ||
|



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.