WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     ||
|

(А) Зависимость люминесцентного сигнала от концентрации целентеразина и CBP. (Б) Кинетика люминесцентного сигнала в реакции с целентеразином и CBP. (В) Определение Km и Vmax из графика Лайнувера-Берга. (Г) Спектры биолюминесценции с целентеразином и СВР.

Кинетические исследования показали, что интенсивность свечения люциферазы в реакции с CBP в несколько раз выше, чем с целентеразином во всём диапазоне концентраций субстрата (рис. 2А). Из графика ЛайнувераБерга (рис. 2В) определены кинетические параметры реакции (Km, Vmax) и показано, что люцифераза совершает в 6 раз большее число оборотов с CBP, чем со свободным целентеразином (Vmax(CE) = 1080 отн.ед., Vmax(CBP) = отн.ед. при одинаковых концентрациях люциферазы). Общая эффективность работы люциферазы, оценённая из kcat/Km, в реакции с CBP в 2,5 раза выше, чем с целентеразином (kcat(CBP)/Km(CBP) = 136 мкМ-1с-1, kcat(CE)/Km(CE) = 57 мкМc-1). Квантовый выход реакции при использовании CBP в качестве «субстрата» также в 2 раза выше, чем со свободным целентеразином (рис. 2Б). Спектры биолюминесценции с СВР и свободным целентеразином практически идентичны, что свидетельствует об общем молекулярном механизме окисления целентеразина в активном центре люциферазы (рис. 2Г).

Полученные данные позволили сделать заключение, что протекание биолюминесцентной реакции требует образования короткоживущего белокбелкового комплекса между люциферазой и CBP, в рамках которого происходит доставка целентеразина в активный центр люциферазы. Увеличение квантового выхода реакции с CBP, вероятно, может быть объяснено ослаблением колебательной релаксации возбужденного состояния целентерамида в более жёстком белковом окружении.

Пространственная структура комплекса Renilla люцифераза-CBP Пространственные кристаллические структуры CBP из Renilla muelleri в Ca2+-свободном и Ca2+-связанном состояниях были определены научным сотрудником лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН Степанюк Г.А. Пространственная структура CBP имеет вид глобулы, подобной глобуле фотопротеинов (рис. 3А). Примечательно, что конформационные перестройки в молекуле CBP в ответ на связывание Ca2+ приводят к образованию отверстия на поверхности белковой глобулы, которое открывается непосредственно в целентеразин-связывающую полость белка (рис. 3Б). Поскольку, как было показано, целентеразин остаётся в CBP при связывании Ca2+, представляется наиболее вероятным, что его доставка в активный центр люциферазы осуществляется непосредственно через образующееся отверстие.

Пространственная структура люциферазы из Renilla muelleri была получена в результате компьютерного моделирования в программе SWISSMODEL с использованием кристаллической структуры люциферазы из Renilla reniformis в качестве первичной модели. В силу высокой гомологии аминокислотных последовательностей данных люцифераз Renilla (98 %) пространственные структуры люциферазы из Renilla muelleri (модель) и люциферазы из Renilla reniformis практически идентичны (среднеквадратичное отклонение RMSD 1,0 ).

Моделирование пространственной структуры комплекса люциферазаCBP-Ca2+ проводили с помощью программы стыковки («докинга») HADDOCK2.0 и первичных структур люциферазы и CBP-Ca2+. Аминокислотные остатки, окружающие активный центр люциферазы и отверстие на поверхности CBP, составили условия ограничения стыковки (остатки D158, E161, K173, E183, S188 люциферазы и Q67, V74, E80, S88, E96, Q103 CBP).

Рассчитанные структуры ранжировали в соответствии со свободной энергией связывания. Для более чем 60% структур среднеквадратичное отклонение координат (RMSD) от структуры с наименьшей свободной энергией связывания составило 7.5.

Пространственная структура комплекса с наименьшей свободной энергией связывания представлена на рис. 3В. Зона контакта люциферазы и CBP сформирована в равной степени остатками заряженных и нейтральных аминокислот, которые образуют относительно небольшое число водородных связей и гидрофобных контактов. Площадь поверхности контакта составляет порядка 1800 2, что является средним значением для известных белокбелковых комплексов. Поверхность CBP имеет участки с преобладающим положительным зарядом (R9, K91, K93, K97, K209) и преобладающим отрицательным зарядом (D66, E95, E96), которые комплементарны соответствующим участкам поверхности люциферазы, сформированным остатками D158, E160, E161, D162 и K4, K189, K193, K282 (рис. 3В). Перечисленные особенности являются характерными для слабых белок-белковых взаимодействий. Отверстие, открывающееся в субстрат-связывающую полость CBP, располагается напротив активного центра люциферазы. Образующийся белковый «карман» вполне вероятно может экранировать возбуждённое состояние целентерамида и тем самым обеспечивать наблюдаемое повышение квантового выхода реакции.

Рис. 3. Изображение поверхности белковой глобулы CBP в целентеразин- (А) и Са2+-связанной (Б) формах. Стрелка показывает «отверстие» на поверхности CBP, образующееся в результате связывания Ca2+. (В) Пространственная структура комплекса люцифераза-CBP-Ca2+, рассчитанная в программе стыковки HADDOCK2.0. Электростатический потенциал поверхности показан для CBP с кальцием (верхняя молекула) и люциферазы (нижняя молекула).

Стрелками отмечены участки комплементарности электростатических потенциалов поверхностей (синий цвет соответствует положительному заряду, красный – отрицательному).

Поверхность взаимодействия клитина и GFP из Clytia gregaria, определённая методом ЯМР-титрования В присутствии мкМ концентраций GFP спектр биолюминесценции клитина (max = 470 нм) становится практически идентичен спектру флуоресценции GFP (max = 500 нм) (рис. 4). Очевидность безызлучательного переноса энергии в данной системе следует из сохранения квантового выхода реакции. Сближение хромофоров на расстояние не менее 100 (необходимое условие для индуктивно-резонансного переноса энергии) при мкМ концентрациях белков представляется возможным лишь в рамках белок-белкового комплекса. Несмотря на то, что исходя из биолюминесцентного анализа KD комплекса клитин-GFP лежит в мкМ диапазоне (10-6 М), из существующих на сегодняшний день методов (гель-фильтрация, аналитическое ультрацентрифугирование, плазмонный резонанс, ЯМР) образование комплекса удалось показать только методом ЯМР (чувствительность 10-2 М). В ходе работы также не удалось получить кристаллы комплекса клитин-GFP, хотя по отдельности клитин и GFP образовывали кристаллы, которые были использованы для определения их пространственных кристаллических структур с высоким разрешением (1,9 для клитина и 1,55 для GFP).

Рис. 4. Спектры биолюминесценции клитина (0,057 мкМ) при разных концентрациях GFP (0 – 4,24 мкМ). Чёрным цветом показан спектр флуоресценции GFP.

Клитин представляет собой компактную белковую глобулу (Mr 22,кДа), сформированную 8-ю -спиралями (А – H), и имеет 3 Са2+связывающих петли (I, III, IV) (рис. 5А). Структура клитина высоко гомологична структуре фотопротеина обелина (RMSD 0.66 ); целентеразинсвязывающие полости обоих белков сформированы идентичными аминокислотными остатками. N-конец клитина (T2 – A9) не структурирован, поэтому для него отсутствуют данные электронной плотности.

Кристаллическая структура GFP была определена научным сотрудником Института биофизики СО РАН Степанюк Г.А. Пространственная структура GFP (Mr мономера 26,6 кДа) имеет вид «бочонка», сформированного 11ю -слоями (S1 – S11) (рис. 5Г). В центре «бочонка» расположен хромофор – результат автокаталитической циклизации аминокислот S68, Y69 и G70.

Уникальная структура «бочонка» эффективно изолирует хромофор от внешней среды, обеспечивая высокий квантовый выход флуоресценции GFP. В растворе GFP образует гомодимер (Mr 53,2 кДа), что подтверждено данными гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования.

Для проведения ЯМР экспериментов были получены образцы клитина 13 15 2 и GFP, меченые изотопами C и N. Для образца Н,15N- и H,13C,15Nмеченого GFP были подобраны условия обратимой денатурации белка с целью замены способных к обмену атомов 2Н N-H групп на атомы 1Н. Основой для определения аминокислотных остатков клитина и GFP, формирующих зону контакта, послужили двумерные спектры HSQC (гетероядерный одно1 квантовый перенос когерентности), полученные на ядрах H и N. Каждый кросс-пик (резонанс) такого спектра соответствует N-Н группе основной цепи белка и боковых радикалов аминокислот Asn, Gln, Trp, His и Arg. Образование белкового комплекса меняет локальное электронное окружение аминокислот поверхности взаимодействия, что отражается в изменении химического сдвига соответствующих кросс-пиков в HSQC спектре.

1 Последовательное отнесение Н и N химических сдвигов основной цепи клитина и GFP проводили, как описано в материалах и методах. Отнесение осложнялось относительно большими размерами белковых молекул (клитин 22,4 кДа и димер GFP 53,2 кДа). Проблему уширения линий ЯМР сигналов GFP по причине быстрой релаксации решали с использованием образца ренатурированного Н,13С,15N-меченого GFP. На основе значений химических сдвигов атомов 1HN, 1H, 1H, 15N, 13CO, 13C, 13C было проведено отнесение 95% резонансов клитина и GFP.

1 15 Сравнение Н-15N HSQC спектров изолированного N-клитина и Nклитина в смеси с немеченым GFP позволило определить кросс-пики, которые испытывают возмущение химического сдвига в результате комплексообразования, и соотнести их с конкретными аминокислотными остатками белка (рис. 5Б). Аналогично определяли «возмущенные» аминокислотные остатки GFP (рис. 5Д). Величину возмущения химического сдвига (ВХС) рассчитывали поформуле:

Рис. 5. Определение методом ЯМР-титрования аминокислотных остатков поверхности взаимодействия клитина и GFP. На пространственных структурах клитина (А) и GFP (Г) «возмущенные» остатки показаны в виде цветных линий и обозначены цветом на поверхности белка. (Б, Д) участки H-15N HSQC спектров, полученные наложением спектров 15N-меченого клитина (Б, чёрный цвет) и 2H,15N-меченого GFP (Д, чёрный цвет) при добавлении немеченых GFP (Б, синий) и клитина (Д, пурпурный). (В, Д) Возмущение химического сдвига (ВХС) аминокислотных остатков клитина (В) и GFP (Е) при титровании немеченым GFP и клитином, соответственно. Порог в 1 и 2 среднеквадратичных отклонения показан серым и синим (пурпурным) цветами.

ВХС = sqrt(H2 + 0.2N2) (1), где N и H – изменение величины химического сдвига 15N и 1Н, выраженной в миллионных долях (м.д.).

Параметр «возмущённые» присваивался аминокислотным остаткам, для которых значение ВХС превышало среднее возмущение всех остатков на величину среднеквадратичного отклонения (рис. 5В,Д), а также остаткам со значительным уменьшением интенсивности кросс-пиков.

Возмущение химических сдвигов (и интенсивности сигналов) затрагивает 23 остатка клитина, большинство которых формирует равномерную поверхность на пространственной структуре клитина (рис. 5А). Определенная таким образом поверхность взаимодействия клитина с GFP включает аминокислотные остатки участков N-конца (А9 – E17), -спирали D (K100 – N109) и C-концевого сегмента (G180 – Y193), которые в молекуле клитина пространственно сближены. Возмущение некоторых остатков (L103, L105, G180, T184, L192, Y193), не доступных растворителю, можно объяснить близостью их пространственного расположения к остаткам поверхности взаимодействия.

Возмущение химических сдвигов затрагивает 25 остатков GFP, которые входят с состав петли S3-S4 и следующей за ней короткой -спирали (D55 – S65), протяженной петли S6-S7 (K132 – H149) и петли S10-S11 (G– D218). Поверхность взаимодействия GFP с клитином выглядит боле дискретной (рис. 5Г), поскольку для ряда остатков, находящихся в «зоне возмущения» не удалось провести отнесение, либо разделить сигналы в силу высокой степени перекрытия (P57, S133, N134, I137, R141, Y144, P147, P148, A150, K168, D171, V172, G174, P212, D215). Интересно возмущение остатков GFP, не доступных растворителю (V58, T60, A61, T62, I63, S65, F85б S146, H149), которые как бы соединяют поверхность контакта с хромофором GFP, либо образуют водородные связи с хромофором (S146, H149). Вероятно, связывание клитина может приводить к минорным конформационным перестройкам центральной оси GFP, несущей хромофор.

Пространственная структура комплекса Clytia клитин-GFP Поверхности взаимодействия с клитином мономеров GFP в димере расположены таким образом, что молекула клитина не может занять оба сайта связывания одновременно. Поэтому 1 мономер GFP способен связать мономер клитина, а в растворе вполне вероятен тетрамерный симметричный комплекс (2 молекулы клитина : 1 молекула димера GFP). Для упрощения расчетов модели пространственной структуры комплекса в программе HADDOCK2.0 в качестве исходной бралась структура мономера GFP. Более 40 % рассчитанных структур составляют кластер с наименьшим значением свободной энергии связывания; среднеквадратичное отклонение (RMSD) координат структур в «лучшем» кластере не превышает 4.

Пространственная структура комплекса с наименьшей свободной энергией связывания представлена на рис. 6. Выражена комплементарность формы поверхностей белков: -спираль D клитина занимает «желоб» на вершине «бочонка» GFP, сформированного петлями S6-S7 и S10-S11. Хромофоры белков в комплексе сближены на расстояние (45 ), которое является более чем достаточным для обеспечения эффективного индуктивно-резонансного переноса энергии.

Рис. 6. Стереоизображение пространственной структуры комплекса клитин-GFP.

Указано расстояние между хромофорами (45 ). Отмечены элементы вторичной структуры, формирующие зону контакта (N-конец и спираль D клитина; петли S6-S7 и S10-S11 GFP).

Зона контакта белков (площадь 1900 2) характеризуется выраженной комплементарностью электростатических потенциалов поверхностей клитина и GFP (рис. 7): положительный заряд сосредоточен на участке поверхности клитина (K11, K13, K100, K104), а отрицательный – на поверхности GFP (D211, D213, D214, D215, E216). Другой участок взаимодействия сформирован аминокислотными остатками подвижного N-конца клитина (T2, D3, T4, A5, S6, K7, Y8, A9, V10) и участка петли S6-S7 GFP (S133, N134, L138, G139, M140, R141). Более высокая вариабельность контактов в этом участке отражает конформационную подвижность N-конца клитина. В целом, природа контактов поверхности взаимодействия клитина и GFP характерна для слабо взаимодействующих белков, что хорошо соотносится с данными ЯМРтитрования (KD комплекса 10-2 – 10-3 М). Однако в биолюминесцентных экс периментах высокоэффективный перенос энергии происходит при мкМ концентрациях белков. Этот факт позволяет сделать предположение, что существует два типа комплексов клитин-GFP: «возбужденный» комплекс, в рамках которого аффинность белков увеличивается на несколько порядков, и «невозбужденный» комплекс с низкой аффинностью, который, фактически, определяется с помощью ЯМР-титрования.

Pages:     ||
|



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.