WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     |
|

На правах рукописи

Титушин Максим Сергеевич БЕЛОК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ СИСТЕМАХ КИШЕЧНОПОЛОСТНЫХ RENILLA MUELLERI И CLYTIA GREGARIA 03.00.02 – биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск – 2009

Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, г. Красноярск

Научный консультант:

Кандидат биологических наук Высоцкий Евгений Степанович

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук Овчинников Сергей Геннадьевич Кандидат биологических наук Межевикин Владислав Валентинович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт Биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится «_»_ 2009 г. в _ час. на заседании диссертационного совета Д 003.007.01 в Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д. 50, стр. 50.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН

Автореферат разослан «_»_ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Франк Л.А.

2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Классическими представителями целентеразинзависимых биолюминесцентных систем являются системы мягкого коралла Renilla и медузы Aequorea. Главный компонент биолюминесцентной системы Aequorea, Ca2+-регулируемый фотопротеин акворин, представляет собой комплекс из белка и нековалентно связанного 2-гидропероксицелентераизна.

Биолюминесценция возникает при добавлением ионов кальция, инициирующих реакцию декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина. В результате образуется молекула целентерамида в возбужденном состоянии и CO2.

Переход целентерамида в основное состояние сопровождается излучением кванта света. В биолюминесцентной системе Renilla функции фотопротеина как бы поделены между двумя белками: Ca2+-зависимый целентеразинсвязывающий белок (CBP) хранит субстрат и реагирует на ионы кальция, а люцифераза катализирует окисление целентеразина при участии кислорода.

Окисление целентеразина в активном центре люциферазы или фотопротеина сопровождается излучением в голубой области спектра, тогда как свечение медузы Aequorea и коралла Renilla является зеленым. Это обусловлено наличием зеленого флуоресцентного белка (GFP), который выступает в роли акцептора энергии возбужденного состояния продукта, целентерамида, и который, затем, излучает в зеленой области спектра. Поскольку такой безызлучательный перенос энергии наблюдается в сильно разбавленных растворах донорного и акцепторного белков, было сделано заключение, что перенос происходит с образованием белок-белкового комплекса. Однако достоверно образование комплекса было показано только для люциферазы и GFP из Renilla, но не для фотопротеина и GFP из Aequorea.

Впервые формирование комплекса в биолюминесцентной системе фотопротеинового типа было косвенно показано для клитина и GFP из медузы Clytia в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН. Однако в силу слабой природы взаимодействия клитина и GFP не удалось получить кристаллы комплекса, а следовательно, и определить его структуру. Пространственная структура комплекса представляет фундаментальный интерес, поскольку в рамках этого комплекса происходит безызлучательный перенос энергии, понимание механизма которого важно не только для биолюминесценции, но и для процессов фотосинтеза и дыхания. Другое направление исследований было связано с изучением биолюминесцентной системы морского коралла Renilla, в которой белок-белковое взаимодействие между люци феразой и GFP было продемонстрировано в работах американских ученых более 30 лет назад. Тогда же было высказано предположение, что все 3 белка системы Renilla: люцифераза, CBP и GFP – функционируют в комплексе, однако дальнейших исследований в этом направлении проведено не было.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось определение пространственных структур белок-белковых комплексов между Са2+регулируемым фотопротеином клитином и зелёным флуоресцентным белком (GFP), а также Са2+-регулируемым целентеразин-связывающим белком (CBP) и люциферазой, входящими в состав биолюминесцентных систем медузы Clytia gregaria и мягкого коралла Renilla muelleri, соответственно. Выполнение исследования требовало решения следующих задач:

1. Изучить биохимические и спектральные свойства CBP и кинетику биолюминесцентной реакции люциферазы Renilla с СВР в качестве «субстрата», а также, предполагая вид поверхности взаимодействия белков, рассчитать пространственную структуру комплекса при помощи программы стыковки («докинга») HADDOCK2.0.

2. Получить 13С,15N-меченые клитин и GFP для исследования методом ЯМР, провести отнесение резонансов в 1Н-15N HSQC спектрах клитина и GFP и на основе данных ЯМР-титрования определить аминокислотные остатки обоих белков, формирующие поверхность взаимодействия.

3. Учитывая данные об аминокислотных остатках поверхности взаимодействия, рассчитать пространственную структуру комплекса клитин-GFP в программе HADDOCK2.0, а также с помощью мутантов клитина, полученных олигонуклеотид-направленным мутагенезом, экспериментально подтвердить правильность рассчитанной структуры комплекса.

При решении поставленных задач получены результаты, которые выносятся на защиту:

1. Исходя из кинетических характеристик реакции люциферазы с СВР, спектральных свойств CBP, а также кристаллических структур люциферазы и CBP из Renilla muelleri рассчитана пространственная структуры комплекса люцифераза-CBP-Ca2+.

2. Методом ЯМР-титрования с использованием изотопно-меченых белков определены аминокислотные остатки поверхности взаимодействия клитина и GFP.

3. На основе данных о кристаллических структурах клитина и GFP и данных об аминокислотных остатках зоны контакта рассчитана пространственная структура комплекса клитин-GFP, правильность которой подтверждена экспериментально.

Научная новизна и практическая ценность работы. Все результаты, представленные в данной работе, получены впервые и имеют фундаментальный характер, так как добавляют новую информацию для понимания устройства и функционирования биолюминесцентных систем кишечнополостных, а также роли белок-белковых взаимодействий в этих процессах. Кроме того, комплекс клитин-GFP является хорошей модельной системой для исследования деталей молекулярного механизма индуктивно-резонансного переноса энергии в белковых структурах. Полученные результаты могут найти применение и в прикладных исследованиях. Так, использование CBP в качестве субстрата для люциферазы Renilla может повысить чувствительность биолюминесцентного анализа. В свою очередь, система клитин-GFP является новым перспективным кандидатом для использования в BRET системах, широко используемых для прижизненной визуализации белок-белковых взаимодействий в клетках и целых организмах. Данные о пространственной структуре комплекса клитин-GFP являются основой для возможной модификации белков в комплексе с целью повышения эффективности переноса энергии и, следовательно, чувствительности BRET анализа.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на Международной Конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2004); Конференции молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 2007); на Международном симпозиуме по Биолюминесценции и Хемилюминесценции (Шанхай, 2008); на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН и Национальной лаборатории биологических макромолекул Института биофизики Пекина (КНР).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы. Результаты структурных исследований включены в международные базы данных PDB и BMRB.

Структура и объем работы. Работа изложена на страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключение, выводы и список цитируемой литературы ( источников). Диссертационная работа проиллюстрирована рисунками, содержит таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клонирование и получение экспрессионных плазмид для клитина и GFP из Clytia gregaria и для люциферазы и CBP из Renilla muelleri было выполнено старшим научным сотрудником лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН Марковой С.В. Олигонуклеотид-направленный мутагенез клитина проводили методом ПЦР с использованием Quick-Change site-directed mutagenesis kit.

Трансформированные клетки E. coli (штаммы BL21-RIL и XL1-Blue) культивировали в LB-среде, содержащей ампициллин. Индукцию проводили добавлением ИПТГ. Для получения изотопно-меченых клитина и GFP трансформированные клетки выращивали в минимальной M9 среде, содержащей 15 NH4Cl и C-глюкозу. Для получения дейтерированного GFP минимальная среда готовилась на тяжёлой воде D2O.

Выделение и очистку рекомбинантных белков, их мутантных или изотопно-меченых форм проводили по схемам, разработанным в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН. Апо-клитин и апо-CBP выделяли из телец включений, проводили рефолдинг с субстратом целентеразином и очищали с помощью ионообменной хроматографией. Люциферазу и GFP выделяли из клеточного лизата металл-аффинной хроматографией за генетически пришитый полигистидиновый фрагмент, который затем удаляли инкубацией с TEV протеазой или энтерокиназой. Все белки дополнительно очищались при помощи гель-фильтрации.

Спектры поглощения белковых растворов регистрировали при помощи спектрофотометра UVIKON 943. Кинетику биолюминесцентной реакции люциферазы измеряли с использованием люминометра БЛМ 8802. Спектры биолюминесценции люциферазы и флуоресценции CBP измеряли на спектрофлуориметре AMINCO. Спектры биолюминесценции клитина и его мутантных форм в комплексе с GFP, а также кинетику люминесцентного сигнала измеряли с помощью планшетного спектрофлуориметра Varioskan. Все спектры корректировались на чувствительность ФЭУ к различным длинам волн, а также с учетом кинетики спада биолюминесцентного сигнала.

Поиск условий кристаллизации клитина выполняли с использованием 384 коммерческих растворов при помощи робота Mosquito и 96-луночного планшета методом сидячей капли. Дифракционные данные получали при облучении кристаллов длинной волны 1,54 рентгеновского излучения от трубки с вращающимся анодом Rigaku. Фазы рассчитывали в программе PHASER по методу «молекулярных замен» с использованием структуры обелина из Obelia geniculata (код в PDB банке 1JFO) в качестве модельной. Модель белка автоматически строили с помощью программы PHENIX. Расчет параметров модели и ее усовершенствование выполняли в программах MOLPROBITY и COOT.

Гетероядерные ЯМР спектры регистрировали на ЯМР спектрометрах Bruker DMX 600 и Bruker Advance 800 с рабочей частотой на протонах 15 МГц и 800 МГц, соответственно. Отнесение резонансов N и Н клитина 15 проводили на основании гетероядерных спектров N-HSQC, 3D H-15N-13C HNCA, HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCO, HN(CA)CO, HBHA(CBCA)NH и HBHA(CBCA)(CO)NH при температуре 293 K с использованием C,15Nмеченого клитина. Отнесение резонансов 15N и 1Н GFP проводили на основании гетероядерных спектров 3D HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCO и HN(CA)CO с использованием 2H,13C,15N-меченого GFP и спектра модифицированного 4D 13C,15N-NOESY, используя 13C,15N-меченый GFP, при температуре 310 K.

Аминокислотные остатки клитина и GFP, «затронутые» взаимодействием в рамках комплекса клитин-GFP, определяли в серии титрований Nмеченого клитина немеченым GFP или 2H,15N-меченого GFP немеченым клитином (или его мутантными формами). Полученные 15N-HSQC спектры сравнивали с исходными спектрами и рассчитывали величину возмущения химического сдвига для каждого резонанса.

Структуру комплекса клитин-GFP и люцифераза-CBP-Ca2+ рассчитывали с помощью программы «многозначной управляемой стыковки белков» HADDOCK2.0 на ядре CNS при использовании пространственных структур клитина (код в PDB банке 3KPX) и GFP (код в PDB банке 2HPW), люциферазы и CBP-Ca2+ (код в PDB банке 2HQ8) и ограничений по взаимодействующим аминокислотным остаткам. Метод последовательных приближений включал стадии жёсткой и гибкой стыковок и стадию уточнения структур в водном окружении. Результаты расчётов ранжировались в соответствии со значением свободной энергии связывания пространственных структур, которая включает термы Ван-дер-Ваальсовых и электростатических взаимодействий, десольватации, соответствия ограничениям по взаимодействующим аминокислотам и площади поверхности контакта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Доказательство существования комплекса Renilla люцифераза-CBP Целентеразин-связывающий белок (CBP) содержит в своём составе молекулу целентеразина, который становится доступным для окисления люциферазой после связывания Ca2+ с образованием продукта реакции – целентерамида. В спектре поглощения CBP имеется характерный белковый пик на 280 нм и пик, соответствующий поглощению молекулы целентеразина (нм). Связывание Ca2+ смещает максимум поглощения CBP в видимой области на 12 нм (432 нм). Однако этот спектр отличается от спектра поглощения свободного целентеразина в водном растворе (рис. 1А). Это позволяет сделать заключение, что целентеразин остаётся связанным с молекулой CBP после присоединения Ca2+, а изменения в спектре поглощения комплекса CBPСа2+ отражают конформационные перестройки в белковой молекуле. Такие перестройки, очевидно, делают целентеразин более доступным для окисления люциферазой, а следовательно, и для некаталитического окисления растворённым в воде кислородом. Некаталитическое окисление целентеразина идёт медленно, а образующийся целентерамид остаётся связанным с CBP, о чём свидетельствует слабая флуоресценция CBP (532 нм), возрастающая при добавлении Ca2+ (рис. 1Б). Известно, что флуоресцентными свойствами обладает молекула целентерамида в белковом, но не водном окружении. Для примера показана флуоресценция целентерамида в обелине после добавления ионов кальция (рис. 1Б).

Рис. 1. (А) Спектры поглощения CBP, CBP со связанным кальцием и свободного целентеразина (CE). (Б) Спектры флуоресценции обелина и CBP после добавления ионов кальция.

Биолюминесцентная реакция люциферазы in vitro может быть инициирована как добавлением целентеразина, так и раствора Са2+ в смесь люциферазы и CBP (схема рис. 2).

Рис. 2. Кинетические исследования биолюминесцентной реакции люциферазы при запуске реакции целентеразином или ионами Ca2+ в присутствии CBP.

Pages:     |
|



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.