WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

В ходе исследования образцы крови делили на 3 части, в каждый флакон добавляли ФГА до концентрации в среде 7 мкг/мл. После 24 ч. инкубации при 37°С, одну из проб подвергали -облучению в дозе 0,05 Гр. Через 5 часов после этого пробу, подвергшуюся воздействию дозы 0,05 Гр, и одну из не подвергавшихся этому воздействию проб облучали в дозе 1 Гр. Через часов от начала инкубации к пробам добавляли цитохалазин В до концентрации в среде 5-6 мкг/мл. Спустя 24 часа после добавления цитохалазина B клетки выделяли и фиксировали. Подсчитывали количество клеток с микроядрами на 1000 двуядерных клеток.

Наличие у человека АО или ПР определяли сравнивая уровни микроядер после облучения в дозе 1 Гр в пробе, предварительно облучённой в дозе 0,Гр, и в пробе, не подвергавшейся предварительному облучению.

Статистические методы Статистическая обработка материала осуществлялась с использованием программы Statistica 6.0, а так же встроенного пакета статистического анализа MS Excel 2003. Сопоставление величин оцениваемых параметров комет, частот апоптоза и средних уровней микроядер производилось с использованием критерия Уилкоксона-Манна (Лакин, 1990; Юнкеров, Григорьев, 2002). Для выявления корреляций вычислялся стандартный коэффициент корреляции (Лакин, 1990). Определяя наличие у обследованного человека АО или ПР с помощью микроядерного теста, частоты клеток с микроядрами сравнивали при помощи критерия Пирсона (Хи-квадрат) (Лакин, 1990; Юнкеров, Григорьев, 2002). Критерий Хи-квадрат использовался и при сопоставлении групп друг с другом по количеству случаев АО или ПР, а так же при сопоставлении методов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Адаптивный ответ у лиц, подвергшихся хроническому облучению Согласно полученным результатам среднее количество клеток с микроядрами после облучения лимфоцитов в дозе 1 Гр в группе подвергшихся хроническому облучению лиц было повышено, по сравнению с аналогичным показателем в контроле (табл. 1). Отличия от контроля по уровню микроядер отсутствуют при условии предварительного облучения клеток в дозе 0,05 Гр. При этом в группе облучённых людей не выявлено отличий между количествами клеток с микроядрами в пробе, облучённой в дозе 1 Гр, и пробе, подвергшейся такому же воздействию после Таблица Средние количества клеток с микроядрами (на 1000 клеток) при различных вариантах облучения лимфоцитов Исходный Облучение Группа Значение Облучение 1 Гр уровень 0,05Гр +1 Гр 164,13 ± 7,среднее 21,94 ± 2,85 165,63 ± 8,р*=0,Облучённые 11,64 30,38 32,max 48,00 224,00 217,N=min 7,00 118,00 114,медиана 21,5 161 168,141,20 ± 5,среднее 15,10 ± 3,06 157,50 ± 9,p**=0,Контроль 9,86 17,24 30,max 40,00 168,00 200,N=min 4,00 114,00 87,медиана 13 139,5 р* – достоверность отличия от контрольной группы p** - достоверность отличия от показателя с адаптирующим облучением предварительного облучения в дозе 0,05 Гр, тогда как в контроле предварительное облучение приводит к повышению количества клеток с микроядрами (табл. 1). Следовательно повышенная радиочувствительность лимфоцитов периферической крови у лиц, подвергшихся хроническому облучению сочетается с отсутствием у них изменений радиочувствительности клеток под воздействием дозы 0,05 Гр. Можно предполагать, что именно с такой разницей реакции на предварительное облучение и связано наблюдаемое в группе облучённых лиц при использовании микроядерного теста отсутствие случаев ПР (табл. 2).

В то же время, согласно результатам, полученным при использовании обоих вариантов метода ДНК-комет, частоты АО и ПР в группе облучённых лиц не отличаются от контрольных. Отличия от контроля по частотам данных реакций отсутствуют так же и в дозовых подгруппах (диапазоны доз на ККМ: 0,21 Гр - 0,7 Гр и 0,7 Гр – 1,42 Гр). Отличия по частотам реакций отсутствуют и при сравнении подгрупп друг с другом.

Таблица Реакции, выявленные с использованием микроядерного теста Контроль Облучённые N=10 N=Реакция абс. % абс. % АО 1 10,0 0 0,НДА 2 20,0 9 56,НДПР 3 30,0 7 43,0,ПР 4 40,0 p*=0,АО – адаптивный ответ; НДА – статистически недостоверный адаптивный ответ; НДПР – статистически недостоверное повышение радиочувствительности; ПР – повышение радиочувствительности;

p* – достоверность отличия от контрольной группы Апоптоз лимфоцитов у лиц, подвергшихся хроническому облучению Особенностью обследованной группы лиц, подвергшихся хроническому облучению, является сниженный по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе исходный уровень апоптоза по критерию ДР ДНК.

Сниженные уровни данного показателя отмечаются и после 24 ч. инкубации и непосредственно после облучения в дозе 1 Гр (рис. 2). Предположение о наличии угнетающего действия хронического облучения на способность клеток к гибели по механизму апоптоза было высказано рядом авторов, сообщавших об угнетении р53-зависимого апоптоза под влиянием хронического облучения (Takahashi, 2002; Enns, 2004; Миль и др., 2005; Xia et al., 2004).

Ещё одним возможным объяснением сниженного уровня апоптоза, выявленного с использованием метода ДНК-комет, может быть незавершённый характер апоптотической гибели части клеток, когда гибель клетки, начавшаяся как апоптоз, завершается гибелью по пути некроза, из-за истощения энергетических ресурсов (Тронов и др., 1998, 1999).

Без предварительного После предварительного облучения облучения в дозе 0,05 Гр 1 - исходный; p – достоверность 2 - 24 ч. отличия от уровня - облучённые инкубации; в контроле - контроль 3 - 1 Гр;

Рис. 2. Уровни апоптоза в группе облучённых лиц и в контроле по критерию ДР ДНК Отсутствие отличий между группами по частоте апоптоза, при использовании щелочного варианта метода комет может указывать на связь этих отличий с количеством комет, соответствующих терминальным стадиям апоптоза. Поскольку в случае использования щелочного варианта метода такие клетки могут выпадать из анализа.

Достоверных отличий уровня апоптоза в клетках, подвергшихся предварительному облучению в дозе 0,05 Гр, от уровня данного показателя в клетках, неподвергавшихся предварительному облучению, не было выявлено ни в группе облучённых лиц ни в контрольной группе.

При использовании щелочного варианта метода, как в группе облучённых лиц, так и в контроле, изменения частоты апоптоза, связанные с влиянием инкубации, выражены слабо, что может быть связано с уже упомянутым выше выпадением из анализа клеток, находящихся в терминальных стадиях апоптоза. Отличия между уровнями апоптоза в пробах, подвергнутых предварительному облучению, и аналогичных им пробах, не подвергавшихся такому воздействию, отсутствуют, так же как и при оценке апоптоза по количеству ДР.

Не было выявлено зависимостей частоты апоптоза от величин доз облучения ККМ или мягких тканей. При этом было показано понижение частоты апоптоза, выявленной непосредственно после облучения лимфоцитов в дозе 1 Гр, при понижении мощности дозы хронического облучения ККМ (коэффициент корреляции r = 0,45).

При использовании щелочного варианта метода в пробах, подвергшихся предварительному облучению в дозе 0,05 Гр, выявлены положительные корреляции количеств ОР и уровней апоптоза лимфоцитов на вторые сутки инкубации, а так же через 2 ч. (рис. 3) и 24 ч. (рис. 4) после облучения клеток в дозе 1 Гр от доз внешнего облучения ККМ и мягких тканей.

Зависимость от дозы внешнего Зависимость от дозы внешнего облучения ККМ облучения мягких тканей Рис. 3. Дозовые зависимости для уровня апоптоза через 2 ч. после облучения клеток в дозе 1 Гр Эти данные могут свидетельствовать о возможности модифицирующего действия предварительного облучения на уровень апоптоза. Вероятно, выраженность такого действия зависит от дозы хронического облучения ККМ и мягких тканей.

Зависимость от дозы внешнего Зависимость от дозы внешнего облучения ККМ облучения мягких тканей Рис. 4. Дозовые зависимости для уровня апоптоза через 24 ч. после облучения клеток в дозе 1 Гр Наблюдаемые закономерности указывают на возможность влияния дозы 0,05 Гр на апоптотическую гибель лимфоцитов после облучения в дозе 1 Гр.

Однако отсутствие достоверных отличий между уровнями апоптоза лимфоцитов, облучённых в дозе 0,05 Гр, от соответствующих уровней в неподвергавшихся предварительному воздействию клетках не даёт возможности говорить о таком влиянии, как о механизме формирования адаптивного ответа. Тем не менее, учитывая выявленное в данной работе снижение уровня апоптоза у лиц, подвергшихся хроническому облучению, нельзя исключить участия апоптотической гибели лимфоцитов в формировании наблюдаемых отличий между группой облучённых лиц и контролем по частоте ПР.

Связь фрагментации ДНК с репарацией и апоптозом.

Эффективность репарации ДР и ОР и её роль в формировании АО При анализе степени фрагментации ДНК, было показано, что исходное количество ДР, а так же уровни данного показателя после первых суток инкубации у подвергшихся хроническому облучению людей достоверно снижены по сравнению с аналогичными показателями в контроле, так же как это было отмечено и для частоты апоптоза (рис. 5).

Без предварительного После предварительного облучения облучения в дозе 0,05 Гр p – достоверность 1 - исходный;

отличия от уровня 2 - 24 ч.

- облучённые в контроле инкубации;

- контроль 3 - 1 Гр;

4 - 1 Гр – 2 ч.;

Рис. 5. Уровни ДР ДНК в группе облучённых лиц и в контроле Исходное количество ОР ДНК, не отличается от исходного уровня в контроле. Независимо от наличия предварительного воздействия на клетки в дозе 0,05 Гр, отличий от контроля по числу ОР не отмечается и в других исследованных точках. Эти результаты так же совпадают с данными, полученными при исследовании апоптоза.

Отмечено, что в обеих группах имеет место увеличение количества ДР в ходе 48 ч. инкубации, наблюдаемое и в отсутствие предварительного облучения лимфоцитов (рис. 6-а), и при наличии такого воздействия (рис. 6б). Сходство этих изменений с повышением уровня апоптоза указывает на то, что увеличение количества ДР может являться следствием гибели инкубируемых клеток по механизму апоптоза.

Корреляционные связи уровней ДР и ОР с величинами и мощностью доз хронического облучения ККМ и мягких тканей в большинстве случаев совпадают с зависимостями для частот апоптоза. В частности при А) В отсутствие предварительного облучения клеток Уровни апоптоза Уровни ДР ДНК Б) При условии предварительного облучения клеток в дозе 0,05 Гр Уровни апоптоза Уровни ДР ДНК 1 - исходный; 2 - 24 ч.инкубации; 3 - 1 Гр; 4 -1 Гр – 2 ч.; 5 - 48 ч.

инкубации; 6 -1 Гр –24ч.

- облучённые - контроль Рис. 6. Изменения уровней апоптоза и ДР ДНК (величины момента хвоста комет) в ходе инкубации лимфоцитов использовании щелочного варианта метода обнаружены такие же, как и для апоптоза, прямые зависимости от дозы хронического внешнего облучения для степени фрагментации ДНК через 2 ч. после облучения клеток в дозе 1 Гр (рис. 7) и через 24 ч. после облучения (рис. 8).

Зависимость от дозы внешнего Зависимость от дозы внешнего облучения ККМ облучения мягких тканей Рис. 7. Дозовые зависимости для уровня ОР ДНК через 2 ч. после облучения клеток в дозе 1 Гр Зависимость от дозы внешнего Зависимость от дозы внешнего облучения ККМ облучения мягких тканей Рис. 8. Дозовые зависимости для уровня ОР ДНК через 24 ч. после облучения клеток в дозе 1 Гр При этом, не было выявлено отличий между группами, а так же отличий обеих дозовых подгрупп друг от друга и от контроля по эффективности процессов репарации ДР и ОР, а так же отличий по чувствительности данных процессов к влиянию предварительного облучения в дозе 0,05 Гр.

Поскольку, как показали результаты исследования, величины момента хвоста, выявленные при использовании как нейтрального так и щелочного вариантов метода комет, после 24 ч. инкубации, непосредственно после облучения в дозе 1 Гр и 2 ч. спустя не отличаются друг от друга, как в группе облучённых так и в контрольной группе, независимо от наличия предварительного воздействия на клетки в дозе 0,05 Гр (рис. 5).

Отсутствие зависимости от дозы хронического облучения уровней ДР в различные периоды после воздействия на клетки дозы 1 Гр свидетельствует об отсутствии зависимости эффективности репарации ДР от дозы хронического облучения ККМ и мягких тканей. Сходство дозовых зависимостей, выявленных для уровней ОР, с таковыми для частот апоптоза, выявленного при использовании щелочного варианта метода не позволяет говорить о наличии связи между эффективностью репарации ОР и величиной дозы облучения ККМ или мягких тканей. Таким образом, существенного вклада процессов репарации одно- и двунитевых повреждений ДНК в формирование АО или ПР у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию на ККМ в диапазоне доз от 0,21 Гр до 1,42 Гр и мягких тканей (в диапазоне от 0,01 Гр до 0,14 Гр) выявлено не было.

ВЫВОДЫ 1. В отдалённые сроки, через 57-58 лет, после начала хронического воздействия излучения с низкой ЛПЭ в группе облучённых лиц (дозы облучения костного мозга от 0,21 Гр до 1,42 Гр) отмечается повышение среднего уровня микроядер после облучения клеток в дозе 1 Гр по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе. В условиях предварительного воздействия на клетки в дозе 0,05 Гр, уровень микроядер не отличался от контрольного.

2. В отдалённые сроки после начала хронического воздействия излучения с низкой ЛПЭ частота случаев повышения радиочувствительности, выявленных при помощи микроядерного теста после дополнительного облучения в дозах 0,05 Гр и 1 Гр, в группе облучённых лиц снижена по сравнению с контрольной.

3. Через 57-58 лет после начала хронического радиационного воздействия в группе облучённых лиц (дозы облучения костного мозга от 0,21 Гр до 1,Гр) уровень апоптоза лимфоцитов крови снижен по сравнению с аналогичным показателем в контроле. Снижение уровня апоптоза отмечается так же после 24 ч. инкубации лимфоцитов и непосредственно после облучения клеток в дозе 1 Гр. Данный эффект не зависел от факта предварительного облучения клеток в дозе 0,05 Гр.

4. Установлена линейная зависимость уровня апоптоза через 2 ч. и 24 ч.

после облучения в дозе 1 Гр лимфоцитов, подвергшихся предварительному воздействию в дозе 0,05 Гр, от дозы хронического облучения костного мозга и мягких тканей.

5. В отдалённые сроки после низкоинтенсивного радиационного воздействия эффективность репарации двунитевых и однонитевых разрывов ДНК у облучённых людей не отличалась от таковой в контрольной группе.

Эффективность репарации однонитевых и двунитевых разрывов не зависела от факта предварительного облучения клеток в дозе 0,05 Гр и дозы хронического облучения костного мозга и мягких тканей.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»