WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

В процессе МД наблюдается общая тенденция изменения структуры мономеров BNIP3 TM, определяемая взаимодействием с мембраной. N-концевая область BNIP3 ТМ (остатки 146-158), богатая полярными и заряженными остатками, интенсивно взаимодействует с полярными головками липидов и водой. Этот участок неупорядочен – более 90% МД-траектории не образуется каких-либо элементов вторичной структуры (рис. 10), что подтверждается данными 15N-релаксации: малыми значениями 15N{1H} NOE и локального R (рис. 8). Для них также характерны большие отличия в различных моделях структуры димера. Все эти данные (отсутствие вторичной структуры, большое разнообразие конформаций) указывают на неспецифический характер взаимодействий этого участка с окружением. В то же время, конформация этого участка стабилизируется взаимодействием с мембраной – значения RMSF (среднеквадратичная флуктуация атомов) по остаткам не превышают 1.5.

Следующая часть (остатки 159-165) состоит в основном из гидрофобных остатков, за исключением Glu160 и Lys163. Вторичная структура на этом участке полипептидной цепи представляет собой -спираль в более 80% МД траектории. Эта амфифильная спираль находится на интерфейсе липид-вода (рис. 10). Стабильность данного участка белка выше, чем в случае остатков Arg146-Ser158, а конформационная гетерогенность в этом случае существенно меньше. Несколько большее значение RMSD при выравнивании по атомам основной цепи трансмембранного региона указывает на подвижность этих спиралей как целого относительно мембранного ядра. Данные N-релаксации и МД подтверждают существование N-концевой спирали, более подвижной чем трансмембранная -спираль. Значение N{1H} NOE и локального R на данном участке (рис. 8) непостоянно, зависимость имеет вид ступеней (особенно заметных на графике для Т1). Это говорит о нестабильности данного участка: спираль Ala159-Phe165 может «расплетаться» частично (на один виток Ala159-Phe161 – первая ступень) или полностью, так как конформация -спирали энергетически не выгодна богатому на гидрофобные остатки участку в водном окружении. Вторичная структура остатков Ala159-Pheстабилизируется за счет нескольких межостаточных контактов: взаимодействие заряженных боковых цепей Glu160 и Lys163 и стэкинговое взаимодействие ароматических колец остатков Phe157, Phe161 и Phe165. Влияние боковой цепи Phe157, находящегося дальше всех от трансмембранного региона, слабее всего (участвует только в течении 30% МД-траектории). Взаимодействие ароматических колец Phe161 и Pheболее сильное: наблюдаются не только внутри-, но и межмономерные контакты. Во всех случаях боковые цепи остатков фенилаланина расположены так, что экранируют трансмембранную часть белка от молекул воды.

Следующий участок полипептидной цепи Leu166-Gly184 представляет собой трансмембранную -спираль. На этом участке наблюдается наименьшая конформационная гетерогенность и наибольшие значения N{1H} NOE и локального R (Рис. 8). Примыкающие к нему Arg185-Leu187 находятся на интерфейсе липид-вода и, как и подобный N-концевой участок, образуют нестабильную подвижную -спираль.

Длинные заряженные боковые цепи Arg185 и Arg186 взаимодействуют с полярными головками молекул липидов и надежно закрепляют белок в бицелле. Кроме того, в каждом мономере образуется по паре водородных связей между ароматическим кольцом Tyr182 и гуанидиновыми группами Arg186. С-концевой участок Thr188-Ser190 экспонирован в воду, его структура не упорядочена.

Димеризационный интерфейс BNIP3 TM Сразу заметим, что область межмономерных контактов весьма стабильна, она одинакова во всех полученных структурах и не меняется в течение молекулярнодинамической траектории. На N-конце спирали взаимодействуют только боковыми цепями гидрофобных остатков фенилаланина, как говорилось ранее, ароматические кольца которых участвуют в стэкинг-взаимодействии. Скорее всего этот участок функционально важен. Далее взаимодействие между спиралями осуществляется за счет остатков, образующих на поверхности молекулы довольно протяженный гидрофильный участок. На С-конце трансмембранного домена упаковка спиралей наиболее плотная, за счет остатков с небольшими боковыми цепями, расположенных через виток -спирали, и составляющих двойной «гликофориновый» мотив A176ХХХG180ХХХG184. Межмономерные контакты, наблюдаемые во всех структурах, включают в себя следующие остатки: Phe165, Leu169, Ser172, His173, Ala176, Ile177, Gly180, Ile181, Ile183, Gly184 и Arg185. Интересно, что недавно методом направленного мутагенеза было установлено, что остатки His173, Ala176 и Gly180 необходимы для гомодимеризации BNIP3 (E.S.Sulistijo et al.).

В ходе работы было получено большое количество N-HSQC спектров при различных условиях: температура и рН. Во многих из них можно наблюдать минорную компоненту для сигналов амидных групп остатков Leu169, Ser172 и Ala176. Анализ ЯМРспектров при различных температурах (30-55С) позволяет утверждать, что в районе димеризационного интерфейса наблюдается медленный конформационный обмен. При основных условиях эксперимента (pH 5,0, 40C) скорость обмена не превышает 20 Гц и вклад минорной составляющей незначителен (~ 10%). Такой обмен может быть связан с небольшой подвижностью мономеров друг относительно друга или медленными локальными конформационными изменениями.

Присутствие внутри трансмембранного региона такого остатка как His173 не может не вызывать интерес. Обычно эксперименты проводились при рН 5,0 и то, что при нем имидозольное кольцо гистидина не заряжено, говорит о сильном смещении рК этого остатка. Проведенный нами ряд экспериментов позволил установить, что значение рК(His173) < 3,5. Понизить рН далее не позволяют особенности бицелл. Низкое значение рК гистидина может служить косвенным признаком того, что его имидозольное кольцо участвует в образовании водородной связи. Из анализа полученных пространственных структур можно сделать вывод, что боковые цепи Ser172 и His173, а также карбонильные группы основной цепи Ser168 и Leu169 (химический сдвиг C сильно смещен в слабое поле) образуют сложную сеть водородных связей, включающую оба мономера (рис. 11).

Рис. 11. Возможные конформации узла Ser172-His173.

Анализ молекулярно-динамических траекторий показал, что полученным методом ЯМР-спектроскопии пространственным ограничениям может соответствовать несколько конформаций узла Ser172-His173, зависящих главным образом от таутомерной формы имидозольного кольца гистидина. В спектрах ЯМР, как правило, сигналы от любого из протонов Н1 или Н2 сильно уширены и их невозможно увидеть. Таким образом, сделать однозначный выбор между как возможными конформациями, так и таутомерными формами His173 невозможно. Для случая His173 (протонирован N2 имидозольного кольца) возможны два способа упаковки -спиралей. В первом случае (рис. 11 а) имидозольные кольца гистидина находятся в стэкинге, расстояние между ними примерно 3,5-4,0. При таком расположении колец возможен, наблюдаемый нами, сдвиг сигналов Н His173 в сильное поле. Эта конформация стабилизируется межмономерными водородными связями O(Ser172) –NH2(His173’). Кроме того, в разных структурах OНгруппа Ser172 образует водородную связь с СО-группой Ser168 или Leu169. 10 из энергетически минимизированных МД структур относятся к этой категории. В других двух структурах имидозольные кольца гистидина раздвинуты на ~ 8, а между ними помещены боковые цепи серинов (рис. 11 б). В этом случае образуются три межмономерные водородные связи: OН(Ser172)–О(Ser172’), О(Ser172)–NH2(His173’) и N1(His173)–OН(Ser172’). На первый взгляд кажется, что такая конформация асимметрична, что должно в свою очередь найти отражение в ЯМР-спектрах. Но если проанализировать всю молекулярно-динамическую траекторию, то можно заметить частые переключения в образовании водородных связей между разными мономерами.

Такой конформационный обмен может привести к усреднению химических сдвигов сигналов и объемов кросс-пиков в ЯМР-спектрах. Заметим еще раз, что на протяжении всех молекулярно-динамических траекторий полученные экспериментально пространственные ограничения не нарушались.

Для пространственных структур с His173 (таутомерная форма имидозольного кольца с протонированным N1) получено 4 молекулярно-динамических траектории. Во всех структурах наблюдается стэкинг имидозольных колец (рис. 11 в). Стабилизация взаимодействия происходит за счет внутримономерной водородной связи OН(Ser172) – N2(His173) и межмономерной – NH1(His173)–CO(Leu169’). Подобная конформационная гетерогенность может объяснять наличие минорной компоненты у сигналов амидных групп остатков Leu169 и Ser172 в 15N-HSQC спектрах.

Для оценки влияния роли заряда боковой цепи His173 на структуру димера и свойства мембраны был проведен расчет молекулярно-динамической траектории с заряженным остатком His173 в одном из мономеров. Расчет проводили из равновесной структуры с протонированным атомом азота N2. На первом этапе (3 нс) для адаптации системы к новому зарядовому состоянию фиксировалось положение атомов основных цепей BNIP3. Далее следовал длительный расчет МД (5 нс). Результаты моделирования показали, что заряд не оказывает существенного влияния на общую упаковку липидов бислоя – значительного перераспределения положения липидов не происходит. Однако в этом случае существенно возрастает доступность остатков Ser172 и His173 для молекул воды. Если в случае незаряженного гистидина эти остатки взаимодействовали с водой 23% времени МД-траетории, то при появлении заряда время взаимодействия с водой для этих остатков возрастает до 90 %. Взаимное расположение мономеров сохраняется.

Существенные изменения происходят только в структуре узла His-Ser (рис. 11 в). В этом случае боковая цепь Ser172 выходит из области взаимодействия. Кольцо заряженного гистидина располагается параллельно осям спирали и образует водородные связи с боковой цепью незаряженного His173 и молекулами воды. Таким образом, в этом случае образуется цепочка водородных связей, в которую вовлечены несколько молекул воды и остатки His173.

Взаимодействие BNIP3 TM с водой Эксперименты по измерению скорости обмена амидных протонов на дейтерий показали, что не все остатки трансмембранного сегмента недоступны воде. На рисунке 12 б наглядно показано, что в N-концевую часть вплоть до His173 между мономерами может проникать вода. Разница между скоростями обмена у остатков, расположенных на интерфейсе димеризации и экспонированных в липидное окружение, значительна. Так время полуобмена амидного протона на дейтерий у His173 ~ 2 часа, а у Leu171 > часов. В спектре ROESY также присутствует интенсивный кросс-пик на частоте воды и протонов имидозольного кольца гистидина Н2 и Н1. То есть участок белка, состоящий из гидрофильных остатков Ser168, Ser172 и His173, может не только участвовать в образовании внутри- и межмономерных водородных связей, но и взаимодействовать с молекулами воды. Из анализа молекулярно-динамических траекторий можно установить, что боковая цепь Ser168 взаимодействует с водой примерно 50% всего времени, а боковые цепи Ser172 и His173 – только 2-3%, в основном в переходных состояниях.

Конформационная гетерогенность, о которой говорилось выше, вполне может соответствовать образованию недолго живущих водородных связей этих остатков с молекулами воды. Заметим, что на С-конце димера подобная ситуация не наблюдается, там межмономерное взаимодействие более плотное.

Таким образом, встраивание гомодимера BNIP3 в мембрану приводит к существенному увеличению проникновения воды в липидный бислой: примерно на от атомов фосфора заряженных головок липидов, в то время как в бислой ДМФХ вода может проникать всего на 4-5. Совокупность экспериментальных данных и результатов МД позволяет утверждать, что подобное проникновение молекул воды вглубь мембраны – уникальное свойство трансмембранного домена BNIP3.

Рис. 12. (а) Минимизированная по конформационной энергии методом МД структура BNIP3 TM. Желтым обозначены атомы фосфора полярных головок липида, красным и белым – молекулы воды, проникающие в липидный бислой. (б) Пространственная структура BNIP3 TM, на которой цветом показана доступность каждого остатка молекулам растворителя. Цвет зависит от времени полуобмена амидного протона соответствующего остатка на дейтерий.

Связь структурно-динамических свойств трансмембранного домена BNIP3 и проапоптотической функции белка В данной работе с высоким разрешением установлена пространственная структура трансмембранного домена апоптозного белка BNIP3 в мембранном окружении и охарактеризована его внутримолекулярная динамика. Совокупность всех полученных экспериментальных (ЯМР) и расчетных данных (молекулярная динамика) позволила на основе обзора литературы предложить механизм биологического действия белка BNIP3 на молекулярном уровне.

Известно, что присутствие в трансмембранном домене остатка His характерно для ионных каналов, особенно протонных. Уникальная структура димера трансмембранного домена BNIP3, способствующая проникновению молекул воды вглубь липидного бислоя, и высокая плотность переключающихся водородных связей на интерфейсе димеризации вокруг узла Ser-His указывают на то, что BNIP3 TM может образовывать протонный канал во внешней мембране митохондрии. Это вполне согласуется с известными на сегодняшний день данными о белке BNIP3, который активируется при сильном ацидозе (понижении рН, вследствии накопления молочной кислоты – продукта гликолиза), вызванном гипоксией клетки, и встраивается во внешнюю мембрану митохондрии. По нашему мнению, предполагаемый протонный канал понижает pH в митохондриальном межмембранном пространстве и уменьшает электрохимический потенциалов на внешней мембране митохондрии. Это должно приводить к гиперполяризации внутренней мембраны митохондрии, открытию РТ (permeability transition) пор, изменению потоков метаболитов, дестабилизации работы и пространственной организации митохондрии, что в свою очередь инициирует апоптозо-некрозный каскад событий в клетке.

ВЫВОДЫ 1. На основе методов гетероядерной спектроскопии ЯМР и молекулярной динамики разработан комплексный подход для исследования структурно-динамических свойств трансмембранных доменов белков.

2. Методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения определена пространственная структура и описана внутримолекулярная динамики трансмембранного домена проапоптозного белка BNIP3 в комплексе с липидной бицеллой ДМФХ/ДГФХ.

Показано, что белок образует параллельный симметричный димер. Прямыми методами спектроскопии ЯМР исследован интерфейс димеризации.

3. Методом молекулярной динамики проверена стабильность полученной структуры в явно заданном липидном бислое ДМФХ, уточнена пространственная структура, исследовано взаимодействие белка с липидным окружением и молекулами растворителя.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»