WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

15 Рис. 3. Фрагмент NH-H-15N срезов в трехмерном N-NOESY-HSQC (m=50 мс).

Стрелками показаны примеры последовательного отнесения по контактам ЯЭО между протонами соседних остатков. Выделенные контакты наиболее характерны для спиральной структуры.

Рис. 4. Вверху: одномерный Н ЯМР-спектр, интенсивные узкие сигналы относятся к 13 протонам липидных бицелл. Внизу: C-HSQC пептида в D2O, спектр “завернут” по С направлению для повышения разрешения.

В ходе отнесения сигналов в гетероядерных 13С-спектрах возник ряд трудностей:

1. уширение сигналов трансмембранной части пептида как из-за замедленного вращения белка в бицелле, так и из-за релаксации на протоны ацильных цепей липидов;

2. шум от узких интенсивных сигналов от протонов липидов перекрывает достаточно большую часть спектра (особенно в области метилов);

3. в случае перекрывания сигналов от остатков трансмембранной части и концевых подвижных участков, более широкие сигналы интересной нам трансмембранной части оказывались сопоставимы с шумом от узких сигналов экспонированных в воду подвижных остатков;

4. небольшая дисперсия сигналов, особенно среди остатков одного типа (например, большинство остатков Leu имеют похожие химические сдвиги протонов боковых цепей).

Наиболее простым решением этих проблем может стать использование липидов, дейтерированных по ацильным цепям, для мембранного окружения (делать полностью меченные липиды дорого и неэффективно). Это существенно снизит интенсивность кросспиков с протонов белка на липиды. Таким образом, сразу же уменьшится ширина линий в С-спектрах, за счет уменьшения релаксации на протоны липидов, и не будет зашумления от узких интенсивных сигналов мембранного окружения.

Отнесение остатков с ароматическими кольцами (Phe, Tyr, His) было сделано по спектрам 13С-HSQC и двумерным гомоядерным TOCSY и NOESY спектрам. Применение Н-ЯМР экспериментов было возможно благодаря тому, что область ароматики смещена в сильное поле относительно сильно перекрытой NH области. Таким образом, удалось однозначно определить химические сдвиги протонов имидозольного кольца His173 и боковой цепи Tyr182. Однако сигналы от ароматических колец трех остатков фенилаланинов оказались значительно перекрыты. Эти остатки располагаются последовательно друг за другом через три аминокислотных остатка и вполне могут быть сближены пространственно.

В итоге были отнесены все 1H, 15N и 13C атомы основной цепи, кроме NH Asn147, который находится на N-конце пептида (2-ой остаток) и из-за ускоренного обмена протона NH с водой уширен в 15N-ЯМР спектрах. Среди боковых цепей полное отнесение не было сделано для Leu170, который находится в сильно перекрытой области как 15N-, 13 1 15 так и С-ЯМР спектров. H, N и С химические сдвиги были депонированы в базу данных BMRB (http://www.mol.bmrb.ethz.edu) под идентификационным номером 7288.

Рис. 5. (1) HD – время полуобмена амидного протона на дейтерий растворителя.

обозначены остатки с 1/2 > 2 часов, - с 1< 1/2 < 2, для остальных остатков время полуобмена амидного протона на дейтерий было меньше часа. (2) Гомоядерные константы спин-спинового взаимодействия JHNCH: - КССВ < 5 Гц, - 5-6 Гц, – КССВ > 6 Гц. (3) Последовательные и среднего диапазона контакты ЯЭО, характеризующие вторичную структуру BNIP3 TM. Контакты обозначены как dAB(i,j) и соответствуют интенсивностям кросс-пиков ЯЭО между протонами A и В остатков i и j. N, и обозначают протоны NH, СН и СН соответственно. Более толстые линии соответствуют более интенсивным кросс-пикам в спектрах NNOESY-HSQC или 13С- NOESY-HSQC с m =60 мс.

Элементы вторичной структуры Без предварительных расчетов вторичную структуру белка можно определить исходя из анализа системы контактов ЯЭО (рис. 5), полученных из экспериментов NOESY, констант спин-спинового взаимодействия JHNCH и скоростей обмена амидных протонов с растворителем. Так, участки полипептидной цепи с малыми значениями КССВ (3JHNCH < 6 Гц), для которых наблюдаются интенсивные кросс-пики ЯЭО NH(i)/NH(i+1) и менее интенсивные CH(i)/HN(i+1), CH(i)/NH(i+3) и CH(i)/NH(i+4), представляют собой спирали.

Рис. 6. Сравнение химических сдвигов СН протонов BNIP3 TM с табличными значениями для соответствующих аминокислотных остатков в конформации “клубок”.

Рис. 7. Данные 15N релаксации. Значения T1, Т2, 15N{1H}NOE и R для каждого остатка BNIP3 TM.

Из карты d-связей (рис. 5) видно, что помимо трансмембранного сегмента, спиральная структура возможна и в концевых участках.

Отличия химических сдвигов каждого аминокислотного остатка от табличного значения для данного остатка в конформации «неупорядоченный клубок» также характеризуют тип вторичной структуры полипептидной цепи. Так называемый вторичный химический сдвиг, =белок-“клубок”, для СН протонов, как правило, имеет положительное значение для аминокислотного остатка в развернутом участке полипептидной цепи (-тяж) и отрицательное – в спиральной конформации. На рисунке представлены значения вторичного химического сдвига для трансмембранного домена BNIP3. Из рисунка следует, что пептид, за исключением N-концевой части (остатки 145158), имеет конформацию спирали. Положительные значения вторичного химического сдвига остатков трансмембранного региона можно объяснить особенностями их пространственного окружения. Так Val164 находится на N-конце трансмембранного домена, где вероятен изгиб спирали. Химический сдвиг сигнала СН Leu169 сильно сдвинут в слабое поле, это возможно если учесть, что он пространственно сближен с ароматическим остатком Phe165, находящимся через виток (4 аминокислотных остатка) спирали. Gly180 тоже имеет нетипичные химические сдвиги -протонов, вероятно, из-за того, что он входит в димеризационный мотив.

Изложенные выше предположения о вторичной структуре пептида полностью совпадают с данными, полученными из экспериментов по измерению скоростей обмена амидных протонов на дейтерий растворителя и оценки констант спин-спинового взаимодействия 3JHNCH (рис. 5).

Таблица 1. Количество пространственных ограничений, использовавшихся в расчете структуры.

Использованные ограничения На один мономер Всего ограничений Всего ЯЭО контактов 585 Нетривиальные ЯЭО 304 Внутриостаточные 101 Последовательные (|i-j|=1) 131 Среднего диапазона (1<|i-j|<4) 70 Дальнего диапазона (|i-j|>4) 2 Водородные связи 19 114*Межмономерные ЯЭО 14 Ограничения на двугранные углы 91, 76 1 15 Данные N релаксации также позволяют сделать предположения о вторичной 15 структуре BNIP3 TM. Значения N{1H} NOE, N T1 и Т2 довольно сильно зависят от расположения остатка в аминокислотной последовательности (рис. 7). Так участку Leu166-Gly184 соответствуют наибольшие положительные значения N{1H} NOE, что говорит о его ограниченной подвижности. Таким образом, можно предположить, что именно этот участок является стабильной трансмембранной -спиралью. К концам этой спирали примыкают более подвижные участки (остатки 159-165 и 185-187), которые, судя по всему, находятся на границе бицелла-вода. С другой стороны, отрицательные значения N{1H} NOE для участков Arg146-Ser158 и Thr188-Ser190 говорят о свободной подвижности и, следовательно, их экспонировании в раствор. По полученным данным для димера BNIP3 TM было рассчитано время вращательной корреляции R, которое составило примерно 18 нс. Этому значению R соответствует эффективная масса комплекса белок-бицелла ~ 50 кДа, что составляет сумму масс димера белка (~ 10 кДа) и бицеллы ДМФХ/ДГФХ, состоящей из 80 молекул липидов (~ 40 кДа). Это говорит о практически отсутствующей подвижности BNIP3 TM внутри бицеллы, что, как уже не раз упоминалось, является одной из причин значительного уширения сигналов от остатков трансмембранного региона.

Расчет пространственной структуры Расчет пространственной структуры BNIP3 TM по данным ЯМР-спектроскопии включал в себя 4 этапа: (1) анализ локальной структуры с помощью модулей программы CYANA, (2) расчет пространственной структуры мономера белка и отбор ЯЭО контактов в спектрах «гомодимера», нарушающихся в мономере, (3) поиск межмономерных контактов и (4) окончательный расчет пространственной структуры димера.

Рис. 8. Примеры срезов из спектров «гетеродимера» с межмономерными ЯЭО контактами и кросс-пиками на протоны липидного окружения (* - на протоны ацильных цепей, ** -на протоны головок липидов).

Локальная структура BNIP3 TM была получена на основании контактов ЯЭО из спектра N-NOESY-HSQC (m=60 мс) и ограничений на торсионные углы, и 1, которые рассчитывались при анализе пространственной структуры с учетом стерически разрешенных величин двугранных углов, констант спин-спинового взаимодействия 3 JHNCH и JNCH, а также результатов программы TALOS. На этом этапе было сделано стереоспецифическое отнесение Н-протонов. Предварительное стереоотнесение делалось при помощи модуля HABAS программы CYANA на основании уже имеющихся ограничений на двугранные углы и внутриостаточных ЯЭО контактов. Далее было рассчитано 100 пространственных структур, из которых для дальнейшего анализа выбиралось 10 с наилучшей целевой функцией. Полученные структуры подавались на вход модуля GLOMSA для поиска новых пар стереоконформеров боковых цепей. Затем цикл повторялся.

Для расчета пространственной структуры мономера были добавлены пространственные ограничения на ЯЭО контакты из С-спектров. После нескольких итераций расчетов и анализа полученных структур были введены ограничения на водородные связи. Ряд ограничений на межпротонные расстояния на предполагаемом интерфейсе димеризации нарушался во всех расчетах, что говорит о наличии как внутри-, так и межмономерной составляющей в соответствующих кросс-пиках. Такие контакты были убраны из внутримономерных ограничений и добавлены в межмономерные с приблизительно оцененным расстоянием и большей погрешностью.

Наличие в ЯМР-спектрах только одного набора кросс-пиков и отсутствие в трансмембранном регионе дальних контактов (между протонами удаленных более на чем на 4 остатка в аминокислотной последовательности) позволяют сделать вывод, что димер BNIP3 TM параллелен и симметричен. Поэтому для расчета пространственной структуры димера к С-концу аминокислотной последовательности одного мономера была добавлена такая же последовательность, связанная с первой цепью из 165 подвижных псевдоостатков. Аминокислотные остатки второго мономера получили порядковые номера i+200, для них были продублированы все ограничения на межпротонные расстояния (из ЯЭО контактов), водородные связи и двугранные углы. Ограничения на межмономерные контакты также были взяты в двойном объеме для симметричности димера.

Рис. 9. Стереоизображение 20 лучших ЯМР структур BNIP3 Ile156-Ser190, совмещенных по тяжелым атомам основной цепи трансмембранного домена (Leu166-Gly184).

Как говорилось ранее, ограничения на межмономерные контакты были получены напрямую из ЯМР-экспериментов с «гетеродимером». Так как в эксперименте были использованы немеченые липиды, то в спектрах присутствовали интенсивные кросс-пики на протоны ацильных цепей ДМФХ и ДГФХ (рис. 8). В результате, для расчета пришлось выбирать отдельно стоящие сигналы, которые можно было бы однозначно отнести, и правильно оценить объем соответствующих кросс-пиков. Таким образом, было задано по 14 ограничений для каждого мономера в силу симметрии. Более полно димеризационный интерфейс был исследован после расчета пространственной структуры димера и минимизации конформационной энергии.

Окончательный расчет пространственной структуры BNIP3 TM проводился с учетом всех полученных ранее данных (табл. 1). Из 200 рассчитанных структур было взято 20 (10%) с наилучшей целевой функцией (рис. 9). Анализ результатов был проведен в программе MOLMOL. Пространственная структура трансмембранного домена BNIP3, как и предполагалось, представляет собой стабильную -спираль на участке Leu166Gly184. Введенные в расчет межмономерные контакты не изменяют конформацию мономера. Трансмембранные -спирали пересекаются под углом = – 40 (правая закрутка) и образуют параллельный симметричный димер. Расстояние между -спиралями составило d = 6.3.

Минимизация конформационной энергии экспериментальной структуры Среда, моделирующая мембрану, позволяет исследовать гидрофобные белки с трансмембранными доменами, методом спектроскопии ЯМР, но вместе с тем имеет собственные недостатки, так как влияет на качество спектров. Кроме того, мы не можем получить точных данных о взаимодействии белка с липидным окружением. Несмотря на большое количество ЯЭО контактов между протонами белка и липидов, по полученным данным можно только судить о том, какая из групп липида пространственно сближена с тем или иным остатком белка (рис. 8). Из-за идентичности всех молекул ДМФХ и ДГФХ спектроскопия ЯМР позволяет получить только косвенные данные о взаимодействии белка и бицеллы: боковые цепи каких остатков белка экспонированы в липидное окружение. Поэтому полученные методом спектроскопии ЯМР-структуры были подвергнуты минимизации конформационной энергии методом молекулярной динамики (МД) в явно заданном бислое ДМФХ с наложением всех экспериментальных ограничений. Моделирование позволило адаптировать структуру к мембранному окружению, при этом ее качество (распределение двугранных углов боковых цепей, конформация основной цепи) улучшилось, а геометрия взаимодействия ТМ фрагментов существенно не изменилась (табл. 2). Более того, расчет 5нс молекулярно-динамической траектории без ЯМР-ограничений не привел ни к изменению структуры димера, ни к «выходу» молекулы из пространства экспериментальных ограничений.

Таблица 2. Сравнение наборов структур до и после МД-релаксации.

Среднеквадратическое отклонение (RMSD) рассчитано для участка со стабильной спиралью (Leu166-Gly184).

Экспериментальные После МД RMSD () BNIP3 TM (остатки166-184) тяжелые атомы основной цепи 0.60+0.19 0.93+0.все тяжелые атомы 1.10+0.18 1.50+0.Расстояние между спиралями d () 6.1±0.4 6.3±0.Угол между спиралями (град.) -39±1.5 -40±2. Всего было получено 16 пространственных структур, минимизированных по конформационной энергии методом МД. Так как методы спектроскопии ЯМР не позволили определить таутомерную форму имидозольного кольца His173, расчеты проводились для двух конформаций с незаряженным имидазольным кольцом (12 структур для BNIP3 с протонированным N His173 и 4 структуры – с N). Кроме того, была рассчитана 5нс молекулярно-динамическая траектория для BNIP3 TM с положительно заряженным His173. Использованные ЯМР- ограничения и атомные координаты структур димера BNIP3 TM были депонированы базу данных PDB (Protein Data Bank) под идентификационным номером 2J5D.

Рис. 10. Пространственная структура трансмембранного домена BNIP3: (а) - белок изображен в явно заданном бислое ДМФХ, (б) – указаны основные участки структуры.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»