WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |
на правах рукописи УДК 577.322.5 Пустовалова Юлия Евгеньевна ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ ТРАНСМЕМБРАННОГО ДОМЕНА ПРОАПОПТОЗНОГО БЕЛКА BNIP3 МЕТОДОМ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР 03.00.02 –Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2006 1 Диссертация выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, на кафедре физико-химической биологии и биотехнологии МФТИ (ГУ).

Арсеньев Александр Сергеевич Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, Заседателев Александр Сергеевич профессор доктор химических наук, профессор Сергеев Николай Михайлович Институт теоретической и Ведущая организация:

экспериментальной биофизики РАН (г. Пущино МО) Защита состоится “ 20 ” декабря 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (ГУ) по адресу:

141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9., тел.: (495) 40857-00, 408-56-27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физикотехнического института (ГУ).

Автореферат разослан “ 17 ” ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Брагин В.Е.

К 212.156.03 к.ф.-м.н., доцент 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Уникальные свойства мембранных белков во многом определяют пространственная структура и функциональная подвижность их трансмембранных доменов. Одним из часто встречающихся в мембранных доменах белков структурным элементом является -спираль. Существует множество функциональных классов мембранных белков (ионные каналы, рецепторы и т.д.), для которых предполагается структурная организация в виде «пучков», состоящих из -спиральных сегментов, а функционирование непосредственно обеспечивается взаимодействиями между ними.

Более того, для многих мембранных белков необходимым условием функционирования является их димеризация (или олигомеризация). В связи с этим большой интерес представляет понимание механизмов межмолекулярных взаимодействий в гетерогенной среде, которой является липидный бислой биологической мембраны. В данной работе исследована довольно простая, но вместе с тем широко распространенная в природе, модель – гомодимер трансмембранных -спиралей.

Помимо этого, интерес представляет и сам объект исследования – белок BNIP3.

Этот белок относится к группе “BH3-only” семейства белков-медиаторов апоптоза BCL-2.

Как и все представители “BH3-only” BNIP3 вызывает митахондрия-опосредованный апоптоз с высокой избирательностью к сигналу смерти. BNIP3 экспрессируется и накапливается в клетках при гипоксии, а активируется при понижении внутриклеточного рН во время ацидоза, вызванного переходом клетки на гликолиз вследствие нехватки кислорода. Наиболее изученный случай подобного действия BNIP3 наблюдается при инфаркте миокарда в тканях сердца. Кроме того, интересен механизм действия BNIP3 на молекулярном уровне, так как он достаточно специфичен. Несмотря на принадлежность к семейству BCL-2, этот белок вызывает каспазо-независимый апоптоз, иногда с признаками некроза. Также показано (E.S. Sulistijo et al.), что трансмембранный домен BNIP3 необходим для проапоптозной активности белка.

Цель и задачи исследования Целью данной диссертационной работы является определение структурнодинамических свойств трансмембранного домена (ТМ) проапоптозного белка BNIP3, а также изучение их связи с биологической функцией BNIP3.

Методы исследования В работе использовался комплексный подход, сочетающий в себе экспериментальный метод (спектроскопия ЯМР высокого разрешения) и теоретический – метод молекулярной динамики. Это позволило обойти ряд существенных ограничений, накладываемых гидрофобной природой объекта на экспериментальные методы.

В качестве объекта исследования был выбран фрагмент (остатки 146-190) человеческого белка BNIP3, включающий в себя трансмембранный домен (остатки 164184).

Научная новизна и практическая значимость работы На сегодняшний день опубликована только одна пространственная структура высокого разрешения димера трансмембранных -спиралей (трансмембранный домен белка гликофорин А, 1998). В представленной работе методом гетероядерной спектроскопии ЯМР исследован трансмембранный домен белка BNIP3 в комплексе с бицеллой ДМФХ/ДГФХ. Показано, что BNIP3 ТМ представляет собой параллельный симметричный димер. Прямыми методами исследован димеризационный интерфейс.

Разработана методика МД-релаксации полученных методом спектроскопии ЯМР пространственных структур трансмембранных сегментов. Она позволяет обойти ряд экспериментальных ограничений, накладываемых мембранной природой объекта исследования. Методом МД рассчитывается молекулярно-динамическая траектория для полученной экспериментально ЯМР-структуры трансмембранного домена, которая помещается в явно заданный липидный бислой (ДМФХ), при этом на протяжении всего расчета на протоны белка накладываются экспериментальные пространственные ограничения. Такой комплексный подход позволяет достоверно описать пространственную структуру и структурно-динамические характеристики трансмембранных белков в липидном окружении.

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях посвященных спектроскопии ЯМР (Санкт Петербург, и Gttingen, Германия, 2006); VIII международном семинаре по магнитному резонансу (Ростов-на-Дону, 2006); VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006); научных семинарах лаборатории структурной биологии ИБХ РАН (Москва, 2003 - 2006).

Публикации Основные результаты диссертации изложены в 5 тезисах докладов, представленных на российских и международных научных конференциях.

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, трех глав, включая литературный обзор, заключения и выводов. Общий объем работы составляет 91 страницу текста, включая рисунок, 7 таблиц и список литературы, содержащий 101 наименование.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение Во введении обоснована необходимость и актуальность определения пространственной структуры трансмембранного домена (ТМ) BNIP3. Кратко изложены имеющиеся на сегодняшний день сведения о функции белка.

Глава 1. Обзор литературы В первой главе (литературном обзоре) изложены основные сведения об объекте исследования и других белках семейства BCL-2. Освещены проблемы изучения мембранных белков методом спектроскопии ЯМР, проведено сравнение наиболее распространенных сред, моделирующих мембранное окружение.

Глава 2. Материалы и методы Во второй главе приведены сведения об использованном в работе оборудовании, веществах, методах получения и обработки ЯМР-спектров, а также условиях, при которых проводились теоретические расчеты методом молекулярной динамики.

Объект исследования – фрагмент BNIP3, включающий в себя трансмембранный домен, как немеченый, так и 15N-, 15N-13C-меченый, был получен и любезно предоставлен сотрудниками лаборатории инженерии белка института биоорганической химии им. М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Я.С. Ермолюком, М.В. Гончарук, Е.Н. Ткач). Также был получен BNIP3 TM селективно 15N-меченный по азотам амидных групп лейцинов.

Все ЯМР-эксперименты проводились на спектрометре Varian Unity 600 с рабочей частотой на протонах 600 МГц. В качестве среды, моделирующей мембранное окружение, использовали билипидные мицеллы (бицеллы), состоящие из димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ) и дигексаноилфосфатидилхолина (ДГФХ) (q=[ДМФХ]/[ДГФХ]=0,25; CL=5%; [BNIP3 TM]/[ДМФХ+ДГФХ]=1/40) в 20мМ ацетатном буфере при рН 5,0 и 40°C.

Отнесение сигналов проводилось на основании гетероядерных спектров 15N-HSQC, 15 N-NOESY-HSQC, HNCA, HCCH-TOCSY, C-HSQC; для расчета структуры использовались 15N- и 13C-NOESY-HSQC спектры.

Для изучения динамических характеристик BNIP3 TM были измерены параметры N-релаксации из ЯМР-экспериментов T1-15N-HSQC, T2-15N-HSQC и NOE-15N-HSQC.

Межмономерные контакты были получены из ЯМР-спектров гетеродимера (эквимолярная смесь немеченого и 15N-13C-меченого образца) 2D 15N/13C-F1-filt./F3-separ.NOESY-HSQC и 3D 13C-F1-filt./F3-separ.-NOESY-HSQC.

Доступность трансмембранного домена растворителю и взаимодействие с молекулами воды исследовались с помощью экспериментов по измерению скорости обмена амидного протона на дейтерий растворителя (ряд спектров N-HSQC) и двумерным протонным спектрам ROESY и NOESY.

Константы спин-спинового взаимодействия гомоядерная JHNCH и гетероядерная 3 JNCH оценивались по гетероядерным N-спектрам HNHA и HNHB. Если подобным образом константу измерить не удавалось, ограничение на соответствующий двугранный угол рассчитывалось исходя из анализа химических сдвигов N, С, Н и C атомов в программе TALOS.

Расчет пространственной структуры трансмембранного домена BNIP3 проводился в программе CYANA 1.01 с использованием ряда стандартных модулей, таких как CALIBA, HABAS, GLOMSA.

Энергетическая минимизация экспериментальных ЯМР-структур проводилась в группе молекулярного моделирования лаборатории структурной биологии ИБХ РАН П.Е. Волынским в программе GROMACS 3.2.1. Всего было получено 19 молекулярнодинамических траекторий с разными стартовыми экспериментальными структурами.

Глава 3. Результаты и обсуждение Гидрофобная природа трансмембранного домена BNIP3 накладывает на возможные методики его исследования ряд ограничений. Необходимость использования липидных бицелл (в нашем случае немеченых) приводит к увеличению размера объекта и, следовательно, к уширению линий. Таким образом, даже для такого небольшого объекта (45 аминокислотных остатков) не представляется возможным использовать методы двумерной 1Н-ЯМР спектроскопии. Использование гетероядерных методик и повышение размерности спектра позволяют увеличить разрешение и разделить индивидуальные сигналы протонов в соответствии с химическими сдвигами ковалентно связанных с ними гетероядер. При этом одновременно получают важную дополнительную информацию о 15 системе в виде химических сдвигов ядер N и С. Поскольку гетероядерная спектроскопия ЯМР использует большие КССВ (90-130 Гц) на этапах передачи когерентности, она гораздо менее чувствительна к увеличению ширины линий, обусловленному размером объекта, чем методы, опирающиеся на малые гомоядерные КССВ.

Отнесение сигналов в спектрах ЯМР TM BNIPОтнесение сигналов для пептида BNIP3 ТМ в комплексе с липидной бицеллой было проведено с использованием спектров HSQC, NOESY и HCCH-TOCSY. Сначала в спектре 15N-HSQC были идентифицированы все возможные кросс-пики 15NН/15N (рис. 1), соответствующие сигналам от NH- и NH2-групп пептида. Затем на основе полученных химических сдвигов ядер азота и ковалентно связанных с ними протонов в спектрах HNCA и 15N-NOESY-HSQC были сделаны срезы HN-C-N и HN-H-N соответственно. Для данного объекта не удалось получить приемлемых спектров N-ТОСSY-HSQC из-за замедленной подвижности белка в липидном окружении. Поэтому не представляется возможным отнесение сигналов по стандартной методике. В данном случае мы начали работу с последовательного отнесения сигналов амидных протонов и азотов-15 к определенному положению остатков в первичной структуре. Для начала из анализа 15 спектров N-HSQC, N-NOESY-HSQC и HNHA был сделан вывод о возможном разделении всех спиновых систем протонов на остатки соответствующие трансмембранному региону и концевым участкам. Остаткам трансмембранного сегмента соответствуют более широкие (менее интенсивные) сигналы, которые можно легко 15 отличить уже в N-HSQC (рис. 1). Далее были идентифицированы кросс-пики NH/15N пяти остатков глицина, у которых химический сдвиг 15N значительно меньше (< 112 м.д.), чем у остальных остатков. Таким образом, однозначно выделили внемебранные остатки глицина Gly154 и Gly155, далее в спектре HNCA нашли цепочку контактов С(i-1)-HN(i)C(i). На рисунке 2 показан участок с последовательным отнесением срезов спектра HNCA. Подобная тактика не только позволила сделать почти полностью последовательное отнесение сигналов, но и определить химические сдвиги сигналов ядер C, которые имеют характерную зависимость от типа остатка, что помогло в отнесении неоднозначных сигналов. В трансмембранной области сигналы оказались значительно уширены, поэтому сделать описанным выше способом отнесение участка Phe165-Hisне удалось.

Рис. 1. Спектр 15N-HSQC. Красным выделены остатки трансмембранного домена.

Последовательное отнесение сложного участка (остатки 165-175) было продолжено на основании предположения об -спиральной структуре трансмембранного домена BNIP3. На рисунке 3 показано, что таким образом можно проследить цепочку связей dNN(i,i+1) по интенсивным кросс-пикам в N-NOESY-HSQC спектре. Далее использовалась стандартная методика для отнесения сигналов протонов в NOESY спектре на основании соответствия спиновой системы определенному типу аминокислотного остатка. Сразу же удалось отнести сигналы от боковых цепей остатков внемембранной части пептида с характерными рисунком кросс-пиков и химическими сдвигами. К таким остаткам относятся Thr, Val, Ser, Ile, Ala, Phe и Gly.

Отнести сигналы остатков трансмембранного домена, кроме Val164 и Phe165, на этом этапе не удалось. Помимо того, что сигналы остатков трансмембранного домена сильно уширены, в нем присутствует несколько наборов остатков одного типа (в основном Leu) сближенных как в первичной, так и во вторичной структуре (расположенных через виток спирали). Для уточнения неоднозначного отнесения участков с несколькими сближенными остатками лейцина использовался спектр NNOESY-HSQC для образца селективно 15N-меченного по -амино группам лейцинов.

Рис. 2. Фрагмент NH-13C-15N срезов в трехмерном спектре HNCA. Стрелками показаны характерные контакты на С предыдущего остатка.

Полное отнесение боковых цепей BNIP3 TM проводилось по спектрам HCCHTOCSY с временем смешивания m=23 мс и 13C-NOESY-HSQC 60 мс в D2O и 13C-NOESYHSQC 100 мс в Н2О. Срезы H-H-(C) делались для всех существующих в спектре CHSQC кросс-пиков (рис. 4). После этого удалялись срезы, соответствующие сигналам от атомов липидного окружения (определялись по Н спектрам, исходя из их интенсивности), и зашумленные сигналом от воды. Оставшиеся срезы автоматически сравнивались в программе XEASY. Таким образом, в спектре HCCH-TOCSY находились срезы соответствующие одному и тому же остатку. Если значение химического сдвига С было определено заранее по HNCA спектру, остаток относился однозначно. Оставшиеся остатки (участок Phe165-His173, сигналы которого были уширены в спектре HNCA) относились после с учетом стандартной методики отнесения и анализа значений химических сдвигов 13С.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»