WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Мы решили, что распад агрегатов и приобретение, супернатантом стимулирующей активности связаны между собой. Очевидно, что в супернатанте происходит накопление каких-то веществ, способствующих росту. Одним из простых объяснений может быть, что эти вещества являются продуктами распада части клеток в популяции. И действительно, с помощью метода проточной цитометрии (который позволяет оценить физиологическое состояние отдельных клеток, в данном случае по величине мембранного потенциала) мы получили данные, из которых видно (Рис. 12), что в лаг-фазе доля живых клеток представляет собой всего 20% от общего числа клеток в культуре, однако эта цифра значительно увеличивается, когда культура переходит к активному росту. Используя флуоресцентный краситель пропидиум иодид, проникающий в клетки с повреждённой мембраной, мы также подтвердили, что в агрегатах очень много таких клеток (Рис. 13).

Это даёт основу полагать, что повреждённые клетки являются источниками стимулирующих веществ.

Проанализировав супернатант с помощью биохимических методов, таких как диализ и ультрафильтрация мы обнаружили, что стимулирующие вещества являются низкомолекулярными и устойчивы к нагреванию. Дальнейший анализ супернатанта с помощью метода гель-фильтрации с последующей массспектроскопией получившихся фракций, показал, что стимулирующую активность имеют небольшие по массе вещества, доминирующим из которых является этил-гексановая кислота (Рис. 14). Поскольку мы работали с бедной синтетической средой, то источником этой кислоты могли быть только клетки. Но очевидно, что есть ещё какие-то низкомолекулярные вещества, пока не идентифицированные.

Подытоживая вышесказанное, мы сделали небольшое предварительное заключение. Клетки M. luteus и R. rhodochrous в лаг-фазе могут находиться длительное время в агрегатах в жизнеспособном состоянии - возможно, за счет использования питательных веществ образующихся вследствие лизиса части клеток («микро»криптический рост). Когда концентрация этих веществ становится достаточной для начала объёмного роста, культура переходит в фазу экспоненциального развития;

этот переход связан с постепенным распадом агрегатов.

Рис. 7. Агрегация клеток R. rhodochrous, растущих на жидкой среде Сатона Инокулят (a). Начало фазы логарифмического роста (в), Увеличенные агрегаты (с-e).

Стационарная фаза (f).

A( 1000) B( 100) C( 1000) D( 000) E( 000) F( 000) Рис. 8. Процентное содержание частиц различного размера в растущей культуре R.

rhodochrous (данные, полученные на дифракционном определителе размера частиц "Malvern 3600Ec").

Рис. 9. Численное распределение клеточных агрегатов различного размера и единичных клеток в культуре M.luteus, растущей на синтетической среде. По левой оси ординат отложена доля частиц разного размера в образце. 1 - средние агрегаты (5-50 мкм), 2 - мелкие агрегаты и одиночные клетки (0,5-5 мкм), 3 - крупные агрегаты (50-1000 мкм), 4 - ОД600 растущей культуры.

Рис. 10. Стимуляция роста R. rhodochrous и M. luteus растущих на бедных средах при интенсивном перемешивании супернатантами активных культур. 1-M. luteus на супернатанте (LMM); 2-R. rhodochrous на супернатанте (Сатон); 3-M. luteus на ЛММ; 4- R.

rhodochrous на Сатоне.

Рис. 11. Зависимость стимулирующей активности супернатанта M. luteus, полученного из разных фаз роста на синтетической среде (LMM) Рис. 12. Начальные стадии развития культуры M.luteus растущей на минимальной среде и процент жизнеспособных клеток в процессе роста культуры.

1- кривая роста культуры, 2 - увеличение процента жизнеспособных клеток в процессе роста культуры Рис. 13. Обнаружение повреждённых клеток в агрегатах R. rhodococcus в лаг-фазе Клеточные агрегаты в фазово-контрастном микроскопе Эти же агрегаты на флуоресцентном микроскопе с иодидом пропидия Рис. 14. Хроматограмма полученная с помощью хроматомассспектроскопии.

Роль белка Rpf в дезагрегации клеточных ассоциатов бактерии M. luteus.

И одним из важных моментов нашего исследования как раз процесс распада агрегатов и его механизмы. По-видимому, в нём должны участвовать ферменты, проявляющие литическую активность по отношению к клеточной стенке бактерий. Из литературных данных нам известно, что белок Rpf, ранее открытый и исследованный в нашей лаборатории, как фактор, стимулирующий активацию покоящихся клеток M. luteus имеет частичное структурное сходство с ферментом лизоцимом, известным как литический фермент клеточных бактериальных стенок. Как можно видеть из рисунка 15, у лизоцима имеются три альфа-спирали, которые также есть у консервативного домена Rpf с аналогичным пространственным расположением.

Исходя из этих данных, мы решили, что Rpf также может обладать литической активностью по отношению к клеточным стенкам, и таким образом принимать участие в дезагрегации клеточных ассоциатов. Для доказательства его лизоцимной активности мы использовали специфический субстрат МУФ-3-НАГ, применяемый для измерения активности лизоцима и являющийся очень грубым аналогом фрагмента клеточных стенок.

Как видно из рисунка 16, рекомбинантная форма Rpf действительно способна гидролизовать 1-4 связи в цепочке из трёх молекул N-ацетилглюкозамина. Конечно, удельная активность Rpf в 50 раз меньше, чем таковая у лизоцима. Для того, чтобы выяснить насколько данная активность близка к лизоцимовой, мы использовали мутантные белки M. luteus, в активных центрах которых заменены важные для катализа аминокислоты. Например, замена глутамата Е54, являющегося особенно важным в лизоциме, на глутамин приводила лишь к некоторому уменьшению активности. Замены E54 на аланин и особенно лизин вызывали значительно больший эффект подавления литической активности Rpf (Рис. 16). Были также исследованы и другие замены – например двух остатков цистеина, которые могли скреплять молекулу Rpf в виде дисульфидной связи. Замена С53 и С114 по отдельности приводила лишь к частичному подавлению активности, в тоже время их совместная замена приводила к практически полной инактивации Rpf (Рис. 16).

Эти данные позволили нам предположить, что, несмотря на сходство с лизоцимом, механизм действия Rpf, по-видимому, несколько иной. В любом случае действите Rpf приводит не к тотальному лизису всей клеточной стенки, а к расщеплению определённых связей, что делает пептидогликановый слой более рыхлым и позволяет проводить с ним различные модификации, которые в частности имеют место при распаде клеточных агрегатов.

Для того, чтобы выяснить как продукция Rpf коррелирует с распадом клеточных агрегатов мы отбирали супернатант из растущей культуры M. luteus и исследовали его с помощью иммуноблоттинга специфическими антителами к Rpf. Оказалось, что максимум Rpf образуется в фазе логарифмического роста (Рис. 17), а именно в этот момент происходит активный распад клеточных агрегатов.

На рисунке 18 представлены данные динамического светорассеивания и световой микроскопии культуры M. luteus, взятой из середины логарифмической фазы роста и обработанной Rpf в концентрации 10 мкг/мл. Видно, что до обработки культура представлена двумя популяциями агрегатов размерами несколько десятков и несколько сотен микрон, после обработки Rpf культура представлена в основном единичными клетками и маленькими агрегатами размером несколько микрон.

Дополнительное свидетельство о роли Rpf в дезагрегации было получено при исследовании мутанта M. luteus с инактивированным геном Rpf. Оказалось, что такой мутант растёт также как и дикий тип, однако, имеет сильно агрегированный фенотип (Рис.

19), причём агрегаты не распадаются даже в процессе роста культуры.

Эти данные, конечно, не объясняют в деталях механизма распада клеточных агрегатов, но являются подтверждением того, что Rpf участвует в процессе распада агрегатов и таким образом способствует активному росту клеток при переходе от лагфазы к фазе экспоненциального роста.

Рис. 15. Структура консервативного домена белка Rpf.

Лизоцим Консервативный Домен Rpf Рис. 16. Мурамидазная активность рекомбинантных белков Rpf.

Rpf(1), мутантные формы Rpf: E54Q(2), E54A(3), E54K(4), C53K+C114T(5), E54K+D48A(6); контрольбуфер(7).

400 420 440 460 480 Длина волны, нм Интенсивность флуоресценции Рис. 17. Секреторные формы Rpf в культуральной жидкости M.luteus.

Лаг- Фаза Фаза Метч фаза логарифмич стационар ики еского роста ного роста Рис. 18. Влияние белка Rpf на клеточные агрегаты M.luteus.

До обработки Rpf После инкубации с Rpf 2 часа, 250С Рис. 19. Клетки M. luteus мутантные по гену rpf (инактивация хромасомального гена) проявляют повышенную склонность к агрегации. 1-M. luteus дикий тип; 2-M. luteus мутант; 3-Rpf дикий тип; 4- Rpf мутант.

Обсуждения.

Клеточная агрегация у некоторых бактерий, является давно известным фактом.

Однако исследователи очень уделяли мало внимания этому явлению, особенно его биологическому смыслу.

В нашей работе мы показали значимость этого явления для выживания бактерий R.

rhodochrous и M. luteus в стрессовых условиях (неполноценная питательная среда, интенсивное перемешивание) Исходя из данных, полученных в нашей работе, мы предположили следующую гипотезу. В условиях неполноценных питательных сред клетки бактерий не могут расти автономно, очевидно, что для роста нужны некие вещества, которые отсутствуют в среде роста. По-видимому, в лаг-фазе клетки собираются в агрегаты, и дальнейшее развитие культуры происходит в пределах агрегатов, причём нежизнеспособные клетки лизируются и продукты этого лизиса являются питанием для оставшейся части клеток, и часть их попадает в среду культивирования. В этот период, обозначенный на рисунке римской цифрой два, видимого роста культуры практически не происходит, и клетки в основном находятся в агрегатах. Также в этот момент идёт незначительный синтез Rpf и его накопление в агрегатах и в среде. Увеличение концентрации питательных веществ в среде до определённого уровня приводит к тому, что она становится пригодной для автономного роста бактерий. В результате увеличения синтеза Rpf агрегаты начинают распадаться на отдельные клетки, и культура переходит в фазу экспоненциального роста (период, обозначенный на рисунке цифрой три). Однако если условия не позволяли клеткам образовать агрегаты в лаг-фазе или их образование было слишком слабым, то культура остаётся в периоде 2 довольно продолжительное время и затем погибает.

Конечно, эта схема является гипотетической, однако она достаточно хорошо объясняет экспериментальные данные, которые мы получили в этой работе.

Выводы.

1) Рост бактерий R. rhodochrous и M. luteus в в жидких средах сопровождается образованием клеточных агрегатов в лаг-фазе и их распадом в фазе экспоненциального роста.

2) Факторы, препятствующие образованию клеточных агрегатов в лаг-фазе вызывают остановку роста R. rhodochrous и M. luteus в неполноценной жидкой среде.

3) При росте бактерий на неполноценной среде происходит частичный лизис клеток и выход в культуральную жидкость низкомолекулярных веществ, способных стимулировать рост бактерий.

4) Секретируемый клетками M. luteus белок Rpf, проявляющий мурамидазную активность, участвует в диссоциации клеточных агрегатов.

5) Предложена новая стратегия роста и размножения бактерий в неполноценных питательных средах, включающая образование клеточных агрегатов на начальных стадиях развития и криптический рост.

Список публикаций.

Статьи 1) МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ.

Волошин С. А., Капрельянц А.С. // Биохимия. 2004. Т. 69. № 11. С. 1555–1564.

2) Роль межклеточных контактов для инициации роста и образования временнонекультивируемого состояния культурой Rhodococcus rhodochrous при развитии на бедных средах. С.А. Волошин, М.О. Шлеева, А.В. Сыроешкин, А.С. Капрельянц // Микробиология. 2005. Т. 74. № 4. С. 420–427.

3) ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ АГРЕГАЦИИ В КУЛЬТУРАХ MICROCOCCUS LUTEUS МЕТОДОМ ДИНАМИЧЕСКОГО СВЕТОРАССЕИВАНИЯ. Волошин С. А., Капрельянц А.С. // Прикладная Биохимия и Микробиология. 2005. № 6.Т. 44 с. 647651.

Тезисы 4) Роль межклеточных взаимодействий в развитии культуры Rhodococcus rhodochrous при росте в жидких питательных средах. Волошин С. А., Капрельянц А.С. 7-ая школа-конференция молодых учённых, 2003 Пущино.

5) CELL-CELL CONTACTS ARE ESSENTIAL FOR THE GROWTH OF BACTERIAL CULTURES UNDER POOR NUTRIENT CONDITIONS. S.A.Voloshin, A.S.Kaprelyants. 1-st congress of European Microbiologist, 2003, Liubliana.

6) КЛЕТОЧНАЯ АГРЕГАЦИЯ, КАК СТРАТЕГИЯ ВЫЖИВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ В СТРЕССОВЫХ УСЛОВИЯХ НА ПРИМЕРЕ БАКТЕРИИ MICROCOCCUS LUTEUS. Волошин С. А., Капрельянц А.

С. 8-ая школа-конференция молодых учённых, 2004, Пущино, C. 144.

7) Адаптация бактериальных популяций к неполноценным питательным средам, как пример «социального поведения» микроорганизмов. Волошин С. А., Капрельянц А. С. Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой, материалы второй региональной конференции молодых учённых. Cаратов, С.37-8) Белок Rpf участвует в ремоделинге клеточной стенки бактерии Micrococcus luteus. Волошин С.А., Дёмина Г.Р., Стеханова Т.Н., Дудик Т.В., Телков М.В., Мукамолова Г.В., Капрельянц А.С. 8-ая школа-конференция молодых учённых, 2005, Пущино. С.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»