WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

2.10. Получение Rpf и его модификаций. Рекомбинантный белок из штамма E.coli LMG194, содержащий плазмиду Rpf-HisTag/pBAD/g111, был получен при выращивании клеток продуцента на RM среде (RM содержала (г/л): казаминовые кислоты – 20, Na2HPO– 6, KH2PO4 – 3, NaCl – 0,5, NH4Cl – 1; мл/л: 1М раствор тиамина – 0,1, 1М раствор MgCl– 1, pH 7,4) с добавлением 10 мл 20% раствора глюкозы и 1мл 10% раствора ампициллина при 370С на качалке при 150 об/мин. Индукцию проводили добавлением 0,01% Lарабинозы («ДиаМ», Россия), после того, как плотность культуры достигала 0,5-0,единиц оптической плотности (ОД 600). После 4-х часовой инкубации культуру центрифугировали) на бакетном роторе при 4000 об/мин, 15 минут. Клетки ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ NaH2PO4, 300 мM NaCl, pH 8,0, 10 мкг/мл РНКазы и 10 мкг/мл ДНКазы. Клеточную суспензию озвучивали на ультразвуке («Soniprep 150», Япония) три раза по 30 сек. и после центрифугирования (10000 об/мин, минут) супернатант разбавляли в 3 раза и наносили на аффинную колонку Ni-NTA агароза («Qiagen», Германия), уравновешенную буфером 50 мМ NaH2PO4, 300 мM NaCl, pH 8,0 (СБ). Колонку промыли последовательно 10 объемами СБ, 10 объемами СБ с мМ имидазола («Sigma», Германия), 2 объемами СБ с 20 мМ имидазола. Элюцию проводили 20 мМ tris-HCl pH 7,2, со 100 мМ гистидина («Sigma», Германия). Элюат диализовали против 20 мМ tris-HCl pH 7.2 в течение ночи при температуре 40С. Готовый препарат белка разводили равным объемом глицерина и хранили при –200С. Количество белка определяли спектрофотометрический.

С помощью сайт-направленного мутагенеза [12] были получены мутантные рекомбинантные белки по вышеприведенной схеме:

c заменой глютаминовой кислоты на глютамин (E54Q);

с заменой глютаминовой кислоты на аланин (E54A);

с заменой глютаминовой кислоты на лизин (E54K);

c одинарными и двойными заменами цистеина на лизин и цистеина на треонин (C53K, C114T и C53K+C114T) Рекомбинантные белки с аминокислотными заменами получали по той же схеме, что и не модифицированный Rpf.

Приготовление грубого препарата клеточных стенок M. luteus. Культуру M. luteus (Штамм NCIMB 13267) выращивали на богатой среде BrothE («Himedia», Индия) при 300С на качалке (200 об/мин) до оптической плотности (600 нм) равной 1,5 единицам. После этого клетки осаждали на центрифуге при 10000 g 15 минут. Полученный осадок промывали 0,9% раствором NaCl три раза. Промытый осадок ресуспендировали в 20 мл 4% раствора ДДС-Na и автоклавировали 20 минут при 1210С. Затем суспензию центрифугировали при 10000 g 15 минут. Осадок отмывали от ДДС-Na три раза 0,1% раствором Тритона Х-100, а затем три раза 10 мМ буфером трис-HCl pH 8,0. После этого суспензию высушивали на роторном испарителе до полного испарения влаги.

Высушенную суспензию хранили при –200С.

Измерение литической активности белка Rpf в отношении грубого препарата клеточных стенок M. luteus. Высушенный осадок клеток, обработанных ДДС-Na ресуспендировали в фосфатном буфере рН 7,0 и гомогенизировали полученную суспензию в стеклянном гомогенизаторе. Количество осадка брали такое, чтобы после гомогенизации оптическая плотность (600нм) получившейся суспензии была около 0,22 – 0,25 ед. Суспензию добавляли в 96-луночный планшет по 300 мкл в каждую лунку. В лунки добавляли белок Rpf до конечной концентрации 1 мкг/мл. Несколько лунок оставляли в качестве контрольных. После этого образцы инкубировали 2 часа при 300С и с перемешиванием 900 об/мин. Литическую активность Rpf смотрели по уменьшению оптической плотности суспензии обработанных клеток, которую измеряли на планшетном спектрофотометре Multiscan Ascent («Thermo labsistems», Финляндия) со встроенным шейкером и термостатом. Измерение проводили с интервалом 5 минут, в течение периода инкубирования.

Определение мурамидазной активности белков Rpf и его модификаций. Для определения мурамидазной активности рекомбинантного белка использовали субстрат 4methylumbelliferyl--d-N,N`,N``-triacetylchitotrioside (MUF-3-NAG) («Sigma», Германия).

Субстрат (конечная концентрация 8 мкМ) инкубировали с белком (конечная концентрация 1-10 мкг/мл) в присутствии 5 мМ МgSO4 в 50 мМ буфере лимонная кислота-цитрат натрия pH 6,0 в течение 3 часов при температуре 37oC. Интенсивность флюоресценции детектировали на спектрофлуориметре RF-5301PC («SHIMADZU», Япония) при длине волны возбуждения 360 нм и эмиссии 450 нм.

В третьей главе представлены собственные результаты.

Явление ингибирования роста культур Rhodococcus rhodochrous и Micrococcus luteus при развитии культур в неполноценных жидких средах при интенсивном перемешивании.

В результате наших работ были получены необычные результаты, заключающиеся в том, что рост культуры R. rhodochrous в жидкой неполноценной среде (среда Сатона) ингибировался интенсивным перемешиванием (Рис. 1). Данное явление имело место только на неполноценной среде. Одним из возможных объяснений данного явления могло быть избыточное количество кислорода, которое может иметь место при интенсивном перемешивании, хотя бактерия R. rhodochrous является облигатным аэробом и кислород не должен ингибировать её рост. Тем не менее, мы поставили эксперимент, в котором в неподвижную колбу стерильный воздух подавался принудительно. Как видно из рис. 1 в этом опыте наблюдался нормальный рост, что свидетельствует о том, что кислород не является причиной остановки роста. Аналогичное явление было нами обнаружено при исследовании роста другой ГЦ-богатой бактерии, M. luteus: при росте в жидкой неполноценной среде (минимальная среда с лактатом). Интенсивное перемешивание ингибировало рост (Рис. 2), в тоже время на богатой среде (МПБ) такого замечено не было. В данном случае надо учесть, что температура культивирования была 370С, что является оптимальным росте на полноценной среде, однако при снижении температуры до 300С рост культуры в жидкой неоптимальной среде становился менее чувствителен к перемешиванию. Надо заметить, что на агаризованных неполноценных средах, обе эти культуры росли хорошо и давали колонии. Исходя из этих данных, мы предположили, что интенсивное перемешивание препятствует образованию агрегатов и таким образом останавливает рост.

Наблюдение культуры R. rhodochrous в световой микроскоп обнаружили, что при оптимальных условиях роста в жидкой среде в начальных фазах роста клетки в большинстве своём находятся в агрегатах, в тоже время в условиях интенсивного перемешивания культура в основном представлена единичными клетками (Рис. 3). Эти визуальные наблюдения были подтверждены с помощью применения метода динамического светорассеивания, который позволяет оценивать состояние культуры при малых концентрациях клеток. На рисунке 4 представлены данные распределения частиц в культуре M. luteus при разных режимах культивирования. Видно, что при умеренном перемешивании и пониженной температуре культура представлена в основном довольно крупными агрегатами, в тоже время при повышенной температуре и интенсивном перемешивании культура представлена в основном единичными клетками и небольшими агрегатами.

Таким образом, интенсивное перемешивание сильно влияет на состояние этих культур при выращивании в жидкой среде и в тоже время ингибирует рост на неполноценных средах.

Однако отсутствие видимого роста не позволяет говорить о том, что реально происходит с культурой, погибают ли клетки или остаются жизнеспособными. Для ответа на этот вопрос мы использовали метод высева на плотные питательные среды. На рисунке 5 видно, что при росте в жидкой неполноценной среде и интенсивном перемешивании культура R. rhodochrous делает несколько генераций, после чего клетки прекращают делиться, однако остаются жизнеспособными длительное время. Добавление к среде культивирования небольших количеств дрожжевого экстракта (0,5%) полностью снимало ингибирующий эффект интенсивного перемешивания. Это ещё раз подтверждает, что ингибирование проявляется только на неполноценных средах. У нас также есть данные, что M. luteus ведёт себя также в аналогичных условиях.

Так как клетки R. rhodochrous оставались жизнеспособными после остановки деления, логично было бы предположить, что культура возобновит рост при снижении интенсивности перемешивания. Для того, что бы проверить это мы проделали эксперимент, в котором сначала скорость качалки была 250 об/мин, а через какое-то время уменьшена до 70 об/мин. Как видно из рисунка 6, действительно, при уменьшении интенсивности перемешивания культура начинала расти, и вырастала до плотностей характерных для данной среды. Исходя из вышеприведенных данных, мы сделали следующее предположение: Интенсивное перемешивание препятствует агрегации клеток R. rhodochrous и M. luteus, которая, по-видимому, необходима для инициации роста на неполноценных питательных средах.

Рис. 1. Зависимость роста культуры R. rhodochrous растущей на жидкой среде Сатона от интенсивности перемешивания. 1-МПБ; 2-среда Сатона, умеренное перемешивание; 3- среда Сатона, неподвижная колба; 4-среда Сатона, интенсивное перемешивание.

Рис. 2. Зависимость роста культуры Micrococcus luteus растущей на бедной синтетической среде (LMM) от интенсивности пермешивания 1-МПБ; 2-LMM, умеренное перемешивание; 3- LMM, интенсивное перемешивание.

Рис. 3. Степень агрегированности культуры R. rhodochrous растущей в нормальных условиях и в условиях диспергирования Нормальные Интенсивное условия перемешивание Рис. 4. Распределение клеток и клеточных агрегатов по размерам в культуре M.

luteus, растущей на минимальной среде в разных условиях 370С, 300С, 250 об/мин 200 об/мин Рис. 5. Изменение концентрации колониеобразующих единиц при росте культуры R.

rhodochrous в условиях нормального роста и при диспергировании клеточных агрегатов. 1-среда Сатона+ДЭ, умеренное перемешивание; 2-среда Сатона+ДЭ, интенсивное перемешивание; 3-среда Сатона, умеренное перемешивание; 4-среда Сатона, интенсивное перемешивание.

Рис. 6. Возобновление роста культуры R. rhodochrous в жидкой среде Сатона после уменьшения интенсивности перемешивания среды культивирования.

Клеточная агрегация на ранних стадиях развития бактериальных культур и её механизмы.

Нами было замечено, что чувствительность роста культур к перемешиванию характерна только для периода лаг-фазы, в фазе логарифмического роста перемешивание не ингибирует рост, а даже наоборот способствует ему. Мы исследовали, чем отличаются клетки в разных фазах с точки зрения образования межклеточных контактов. На рисунке 7 представлены фотографии, на которых показано состояние культуры R. rhodochrous в разных фазах при росте в условиях умеренного перемешивания. Как видно инокулят представляет собой единичные клетки. Однако в начале логарифмической фазы роста мы наблюдаем в культуре большое количество агрегатов, причём некоторые из них имеют специфические покровы. Агрегаты постепенно распадаются в процессе роста и в стационарной фазе культура представлена в основном единичными клетками.

Поскольку световая микроскопия не дает, во-первых, количественной оценки, а вовторых, не позволяет оценить состояние культуры при низких концентрациях клеток в лаг фазе, мы применили метод оценки размера частиц с помощью дифракции лазерного луча.

Из рисунка 8 видно, что культура действительно в конце лаг-фазы состоит в основном из агрегатов, в то время как к фазе стационарного роста агрегаты практически полностью распадаются на единичные клетки. Примерно такую же картину мы наблюдаем в случае с M. luteus растущем на минимальной среде (в данном опыте был применён метод динамического светорассеивания). Из рисунка 9 видно, что практически сразу после засева происходит уменьшение доли единичных клеток и довольно резкое возрастание доли клеточных агрегатов в культуре. Как только клетки переходят к активному росту, происходит обратный процесс, агрегаты постепенно диссоциируют, и в культуре возрастает доля единичных клеток.

Следует заметить, что на оптимальных средах поведение культур в целом напоминало таковое на неоптимальных. Однако, если на оптимальных средах время распада агрегатов было небольшим и в начале фазы логарифмического роста крупных агрегатов в культуре уже практически не было, то в случае неполноценной среды распад агрегатов растягивался на всю фазу логарифмического роста.

Так как чувствительность к перемешиванию проявляется только в лаг-фазе, а в фазе логарифмического роста такой чувствительности нет, то логично было предположить, что изменяется при этом сама среда, приобретая дополнительные свойства в процессе развития культуры. Для того чтобы проверить это мы поставили эксперимент, в котором вместо неполноценной питательной среды использовали супернатант взятый из фазы логарифмического роста (для каждой бактерии соответственно своя среда). Как видно из рисунка 10, никакого ингибирующего влияния перемешивания не наблюдается, и бактерии растут также как и на богатой среде. Мы решили посмотреть, из любой ли фазы развития супернатант проявляет стимулирующие свойства по отношению к растущим клеткам. Для этого мы проделали эксперимент, в котором взяли супернатант из фазы логарифмического роста и из поздней лаг-фазы. На рисунке 11 представлены три кривые роста M. luteus. Как видно, кривая роста в пермессивных условиях представлена тремя периодами: практически сразу после засева следует активный рост (период І), после которого наступает довольно длительный период «замедленного роста» (период ІІ), затем культура переходит в фазу экспоненциального роста (период ІІІ). Во время периода ІІ визуальный рост культуры практически не наблюдается и клетки собраны в агрегаты. Как показали наши эксперименты, супернатант, взятый из периода І или ІІ, не проявляет никаких стимулирующих свойств в непермессивных условиях, а супернатант взятый из периода ІІІ стимулировал рост клеток в непермесивнфых условияхю. Т.е. супернатант, взятый из этого периода, напоминает полноценную среду, а супернатант взятый из периода І или ІІ такими свойствами не обладает.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»