WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Волошин Сергей Александрович ЗНАЧЕНИЕ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ У БАКТЕРИЙ MICROCOCCUS LUTEUS И RHODOCOCCUS RHODOCHROUS ДЛЯ ИНИЦИАЦИИ РОСТА.

Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в лаборатории «Биохимии стрессов микроорганизмов» Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Капрельянц Арсений Сумбатович Официальные оппоненты Доктор биологических наук, профессор Воробьёва Лена Ивановна кандидат биологических наук Шевелёв Алексей Борисович Ведущая организация Институт биохимии и физиологии Микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г.Пущино

Защита состоится «13» декабря 2005 г.в 13 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по принуждению учёной степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомится в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан« » 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В современной микробиологии уже давно ведутся споры о роли межклеточных взаимодействий при росте различных видов микроорганизмов. Особенно важным представляется этот вопрос в отношении прокариотических организмов, популяции которых до недавнего времени считали простым набором клеток, которые растут независимо друг от друга. Однако в два последних десятилетия появилось много фактов, свидетельствующих о сложной организации микробных культур. В настоящее время известно довольно много бактериальных факторов роста, цитокинов и сигнальных молекул, которые участвуют в таких процессах, как споруляция, конъюгация, биолюминесценция, вирулентность и т.д. Сделан большой прогресс в исследовании такого явления как кворум-сенсинг, имеющий большое значение в развитии микробных популяций, в том числе и патогенных бактерий. Но, несмотря на значительные успехи в области химических факторов коммуникации и роста микроорганизмов остаётся много вопросов, связанных с физическими контактами между бактериальными клетками и образования бактериями специфических скоплений. Хорошо известно на сегодняшний день, что некоторые бактерии образуют в процессе роста сложные структуры (например, плодовые теля миксобактерий или стрептомицетов), однако кроме этого ещё довольно большое число видов бактерий имеет склонность к агрегации при росте в жидких средах и значение такого явления остаётся не совсем изученным.

На сегодняшний день одними из самых исследованных бактериальных ассоциатов являются биоплёнки и бактериальные маты. Бактериальные маты являются сложными многовидовыми и многослойными ассоциатами, характерными для различных местообитаний на земле и играют большую роль в экстремальных экосистемах.

Биоплёнки часто образуются в естественной среде обитания на границе раздела двух фаз и могут состоять всего из одного вида. В настоящее время изучены процессы образования биоплёнок, значение биоплёнок для медицины и экологии.

Однако, несмотря на активное исследование матов и биоплёнок, исследователи уделяют мало внимания агрегации бактерий в жидкой фазе, которая может иметь большое значение в биотехнологии. Очень мало исследованы механизмы этой агрегации и её роль в развитии бактериальной популяции в различных условиях окружающей среды.

Цели и задачи исследования.

Цель работы состояла в поиске ответа на вопрос: какое значение для развития популяции имеет агрегация ряда бактерий на жидких средах И если имеет, то, при каких условиях, и какие механизмы могут быть ответственны за это явление.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать, как влияют различные факторы, приводящие к изменению степени агрегированности клеток (интенсивность перемешивания, температура) на рост бактерий R. rhodochrous и M. luteus на разных средах.

2. Проследить, как изменяется степень агрегации бактерий при росте в жидких средах. И как агрегация зависит от состава среды.

3. Выяснить, как связаны инициация роста бактерий и агрегация и влияние на это химических факторов секретируемых клетками 4. Исследовать какие механизмы лежат в основе диссоциации клеточных агрегатов.

Изучить возможное участие белка Rpf в этом процессе.

Научная новизна.

1. Впервые показана роль клеточной агрегации для роста бактерий R. rhodochrous и M. luteus в жидких неполноценных питательных средах, причём отсутствие условий для образования ассоциатов приводит к резкому замедлению или даже полной остановке роста.

2. Впервые приведены доказательства, что в процессе роста на бедных средах в бактериальных агрегатах происходит локальное деление клеток в лаг-фазе, причём более жизнеспособные клетки используют продукты лизиса менее жизнеспособных клеток, наподобие криптического роста у стационарных культур.

3. Впервые приведены убедительные доказательства того, что белок Rpf обладает ферментативной активностью в отношении клеточной стенки бактерии M. luteus и таким образом играет большую роль в процессе диссоциации клеточных агрегатов и инициации активного роста культуры.

Научно-практическое значение.

Полученные в результате работы данные могут иметь большое значение в биотехнологических процессах для оптимизации сред и условий культивирования бактерий для получения тех или иных биологически активных соединений, а также для создания эффективных биологических плёнок для очистки загрязнённых вод.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы докладывались на итоговых научных конференциях: «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2003), The 1-st Congress of European microbiologist (Slovenia, Liubliana, 2003), «Горизонты физикохимической биологии» (Пущино, 2004), «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004), «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2005) Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, в числе которых 3 статьи в российских научных журналах.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на страницах. Список цитируемой литературы включает наименований. Иллюстративный материал содержит рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы. Основная актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

Первая глава содержит обзор литературы, посвящённый различным аспектам межклеточного взаимодействия у бактерий. Рассматриваются химические факторы коммуникации, колониальная организация бактериальных культур и биоплёнки, также рассматривается связь между межклеточным взаимодействием и «социальным поведением» микроорганизмов. Отдельное внимание уделено клеточной стенке и ферментам, связанным с её реорганизацией, показана большая роль клеточной стенки в коммуникации между клетками в развивающейся бактериальной популяции. В последнем разделе собрано множество фактов описывающих межклеточную агрегацию бактерий, растущих в жидких питательных средах и различные факторы участвующие в этом процессе.

Во второй главе Выращивание бактериальных культур.

Rhodococcus rhodochrous, штамм NCIMB 13805, был выращен аэробно при 37°C в колбах при перемешивании (125 мл среды в колбы с объемом 750 мл, скорость перемешивания 250 об/мин и 70 об/мин) в богатой питательной среде broth E (Himmedia, Индия) или модифицированной среде Сатона (на г/л): 0,5 MgSO4. 7H2O; 4 L-аспарагин; мл глицерина; 0,05 железоаммонийный цитрат; 2 трёхзамещённый цитрат натрия; 0,1 мл 1% раствора ZnSO4.7H20; 7,75 K2HPO4.3H20; 4,25 NaH2PO4.2H20.

Micrococcus luteus, штамм NCIMB 13267 был выращен аэробно при 30°C в колбах при перемешивании (200 мл среды в колбы с объемом 750 мл, скорость перемешивания 200 об/мин и 70 об/мин) в богатой питательной среде broth E («Himedia» Индия) или минимальной среде с лактатом лития (LMM) (г/л): КН2РО4 – 8; NH4Cl – 4; лактат лития – 5; (мг/мл): ZnSO4 – 0,05; H3BO4 – 0,05; CuSO4 – 0,024; Na2MoO4 – 0,025; Ca(NO3)2*6H2O – 0,05; MnCl2 – 0,5; MgSO4 – 7,0; FeSO4 – 1,0; биотин – 5; метионин – 20; инозин – 40;

тиамин – 40.

2.3. Общее число клеток (ОЧК) в миллилитре культуры оценивали при помощи камеры Горяева по формуле n/5. 108, где n - среднее количество клеток в одном малом квадрате.

2.4. Микроскопические исследования проводили с помощью микроскопа Eclipse E(Nikon, Япония), используя приставку для фазового контраста и цифровую камеру Camedia C-4040 (Olympus, Япония). Для определения степени повреждения мембраны клетки окрашивали пропидиум иодидом (4 мкМ в фосфатном буфере), который окрашивает только клетки с поврежденной мембраной за счет проникновения внутрь клеток и взаимодействия с нуклеиновыми кислотами, длина волны возбуждения 510-нм и эмиссия 590 нм.

2.5. Распределение клеток. Распределение клеток и клеточных агрегатов по размерам регистрировали с помощью дифракции лазерного луча на дифракционном определителе размера частиц "Malvern 3600Ec". Для анализа распределений частиц по размерам была использована зависимость: ni=f(ri), где ni - численная доля размерной группы ri.

Для этих целей мы также использовали фотонный спектрометр (PhotoCor Instruments Inc., США). Измерения проводили при 250С. Отобранные аликвоты бактериальных культур в объёме 0,4 мл помещали в специальную кварцевую кювету.

Сигнал записывался с помощью фотон-считывающей системы PhotoCor-PC 3 и затем перерабатывался с помощью коррелирующей программы PhotoCor-FC, входящую в комплект прибора. Полученная функция обрабатывалась с помощью программы DynaLS (Alango, Израиль).

2.6. Получение супернатантов для стимуляции роста бактерий. Культуры: R.

rhodochrous и M. luteus были выращены на среде Сатона и ЛММ соответственно. После центрифугирования (12,000 g, 20 мин), супернатанты стерилизовали при помощи фильтрации через стерильный фильтр («Whatman», США) с диаметром пор 0.22 мкм.

Автоклавировали супернатант из-под M. luteus при 1210С 20 минут. Для диализа использовали диализные мешки фирмы Sigma (Германия). Диализовали напротив воды в течение 24 часов со сменой воды. Для концентрирования супернатанта использовали роторный испаритель фирмы Labconco (США).

2.7. Анализ супернатанта. Анализ супернатанта проводили с помощью гель-фильтрации на колонке с носителем Sephadex G-10 (Pharmacia, США). На колонку наносили сконцентрированный супернатант (1% от объёма колонки) и элюировали минимальной средой с лактатом, после чего получившиеся фракции тестировали на биологическую активность в культуральных плашках при 300С на качалке 200 об/мин. После этого ещё раз наносили супернатант на колонку, но элюировали водой, после чего полученные фракции в зависимости от того какую биологическую активность они давали анализировали с помощью хроматомассспектроскопии.

2.7. Электрофорез белков в ПААГ по Лэммли. Денатурирующий электрофорез белка в присутствии додецилсульфата натрия проводили по стандартным методикам в электрофоретической камере фирмы («Bio-Rad» США) при 40С, ток 30 мА на 1 пластину.

Для фореза использовали 12% гель. 5Электродный буфер (0,25М трис, 2М Глицин, 0,5М додецилсульфат натрия рН=8,8). 8Буфер для разделяющего геля (3М трис-HCl, рН=8,8).

4Буфер для концентрирующего геля (0,5М трис-HCl, рН=6,8) 2.8. Иммуноблоттинг рекомбинантных белков.

Иммуноблоттинг рекомбинантных белков осуществляли по стандартной схеме (см. напр.

Каталог “Sigma 1999”, стр.1490-1491):

Электрофорез белков проводили в двух одинаковых пластинах 12% SDS ПААГ, одну из которых затем окрашивали коллоидным Кумасси G-250, а вторую использовали для собственно электроблоттинга в приборе BIORAD в буфере ТГЭС (трис-3,2 г/л, глицин-14,4 г/л, SDS – 1 г/л, этанол – 200 мл, дист. воды до 1 л). Блоттинг проходил в течение 16 часов при 50 мА при 4оС на мембрану Millipore Nitrocellulose HAHY с размером пор 0,45 мкм.

Забивку неспецифики проводили инкубацией мембраны в буфере TBS+3%BSA при 37оС в течение часа при перемешивании (50 rpm), после чего мембрану промывали 3 раза по 10 мл TBS при 37оС. Буфер TBS: 20 мМ трис-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl (20 ml 1 M trisHCl pH 8.0; 8.7 g NaCl; H20 до 1 л); BSA – Бычий сывороточный альбумин.

Первичные АТ (поликлональные кроличьи АТ против Rpf:100 мкл препарата АТ “А3” в 8 мл TBS) инкубировали с мембраной в течение 1-2 часов при 37оС при перемешивании (50 rpm), после чего мембрану промывали 3 раза по 5 мин. 10 мл TBS+Tween 80 (0,05%) при 37оС при перемешивании (50 rpm).

Вторичные АТ (AntiRabbit AT conjugate with Alcalic Phosphatase (Sigma)) использовали в разведении 1:5000 (2 мкл AntiRabbit AT conjugate / 10 мл TBS+Tween (0,05%)); AT инкубировали в течение 40 мин. при 37оС при перемешивании.

Мембрану промывали 3 раза по 5 мин. 10 мл TBS+Tween 80 (0,05%) при 37оС, затем аналогично - TBS, после чего окрашивали 3-5 мин SIGMA FAST BCIP/NBT Alcaline Phosphatase Substrate (Sigma) при комнатной температуре.

2.9. Иммуноферментный анализ. Бактериальный супернатант (0.2 мл) был помещен в пластиковые 96-луночные планшеты («Costar», США), Которые инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Затем лунки промывали 3 раза PBS-T (фосфатный буфер, содержащий 0.05% твина-80). Первичные анти-Rpf антитела кролика были добавлены в разведении 1:10000 в каждую лунку и дальнейшая инкубация проходила при 37°C в течение 45 минут.

После 3-х кратной промывки PBS-T были добавлены вторичные антитела (анти-кроличий алкалин-фосфатазный коньюгат (Sigma, 1:5,000)). Затем после очередного цикла промывки PBS-T был добавлен субстрат щелочной фосфатазы (таблетка пнитрофенилфосфата, «Sigma») и инкубация проходила при комнатной температуре в течение 30 минут. Интенсивность окраски определяли сканированием планшетов при нм («Labsystem optical reader», Финляндия). Для калибровки метода использовали различные концентрации рекомбинантного белка Rpf в соответствующей культуральной среде.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»