WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Стрелкой отмечено расположение TNF- Однако, несмотря на наличие антител по данным вестерн-блоттинга, при использовании этой сыворотки в постановке ELISA сколько-нибудь значительной продукции поликлональных антител зафиксировано не было (данные не приведены). Следует отметить, что этот факт оказался для несколько неожиданным, так как чувствительность одних и тех же антител в ELISA, как правило, выше, чем в вестерн-блоттинге. Объяснение этого явления, возможно, связано с особенностями эпитопной специфичности образующихся антител против TNF-. в случае ДНК-иммунизации.

По литературным данным динамика продукции антител при ДНКиммунизации принципиально отличается от сероконверсии при стандартной схеме иммунизации белком. Ответ на ДНК-иммунизацию характеризуется небольшим максимумом после первой или второй инъекции ДНК, затем титр антител падает до нуля, и только через определенное время при условии продолжения инъекций ДНК претерпевает подъем. В настоящий момент не предложено модели, которая может адекватно объяснить такое поведение аппарата синтеза антител при ДНКиммунизации.

Подобный эффект наблюдался и в настоящей работе. После двух следующих инъекций pCD-TNF4 продукция поликлональных антител не наблюдалась ни в вестерн-блоттинге, ни в ELISA.

После 4-ой инъекции pCD-TNF4 в сыворотке животного появились антитела, реагирующие с рекомбинантным антигеном не только в вестерн-блоттинге, но и в ELISA. Результаты испытаний этой сыворотки приведены на Рис. 14.

0,0,0,0,0,1:200 1:400 1:разведение сыворотки разведение Рис. 14. Тестирование активности сывороток кролика после четырех инъекций pCD-TNF4 методом непрямого ELISA. Серые столбцы-А490, характеризующее продукцию поликлональных антител с экспериментальной иммунной сывороткой;

черные столбцы-A490, характеризующее отсутствие сигнала преиммунной (контрольной) сыворотки того же животного Делая вывод о результатах эксперимента по ДНК-доставке TNF- человека в ткани крыс и кролика, можно, прежде всего, отметить возможность использования предложенного нами дизайна генно-инженерных конструкций для получения внутриклеточной экспрессии белка in vivo, при условии, что детекция продукта осуществляется по уровню продукции поликлональных антител против него.

Однако следует отметить высокий разброс получаемых результатов, что, в конечном итоге, снижает перспективность ДНК-иммунизация как метода, альтернативного типовой иммунизации рекомбинатным белком.

Продукция антител, вызванная инъекциями животным конструкции pCDTNF3, которая рассчитана на внутриклеточную продукцию белка, в ряде случаев была выше, чем продукция антител, вызванная инъекциями рекомбинантного антигена. Продукция поликлональных антител после инъекций животным конструкции pCD-TNF4, дизайн которой предполагал секрецию кодируемого гена in vivo, отличалась большей стабильностью, но в ряде случаев показывала эффект несколько худший по сравнению с pCD-TNF3. В качестве возможного приема, позволяющего минимизировать риск неудачи при ДНК-иммунизации целесообразно планировать одновременное введение ДНК конструкций обоих типов.

Благодарности Автор работы выражает искреннюю благодарность: к.б.н. С. П. Домогатскому (Кардиологический центр им. Л.А. Мясникова), Ю. Сикулеву (Kimmel Cancer Center, Philadelphia, USA), В. Филичкиной (Кардиологический центр им.

Л.А. Мясникова), M. Безрученкову (Кардиологический центр им. Л.А. Мясникова).

A(490нм) Выводы 1. Созданы генно-инженерных конструкции для доставки растворимого TNF человека в клетки млекопитающих в секреторной и внутриклеточной форме, в том числе, для проведения ДНК-иммунизации. Впервые показана возможность доставки TNF- в организм млекопитающих с помощью плазмидных конструкций.

2. Получен гуморальный ответ против синтезированного in vivo TNF- человека, доставляемого с помощью ДНК-иммунизации. Подтверждено ранее сделанное наблюдение о двухфазной динамике сероконверсии специфических антител в ответ на ДНК-иммунизацию у кролика.

3. На основе E. coli получен новый штамм-продуцент TNF- человека и предложена методика ренатурации TNF из телец включения.

4. В результате экспрессии в клетках Drosophila melanogaster получен экстраклеточный домен высокоаффинного рецептора TNF- типа 1. Показано связывание рецептора и лиганда in vitro, что подтверждает нативность структуры TNF-, приобретенной в результате ренатурации.

5. Показана перспективность использования поликлональных аффинноочищенных антител против TNF для исследования клинических материалов, в том числе, сывороток больных рассеянным и боковым амиотрофическим склерозами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Суровцева Е.В., Кузнецова Т.В., Шевелев А..Б. Использование рекомбинантной технологии для изучения взаимодействия рецепторов и их лигандов на примере TNF и TNFR1. // Тезисы. Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Москва, стр. 72.

2. Суровцева Е.В., Кузнецова Т.В., Хоменков В.Г., Домогатский С.П., Шевелев А.Б. Новый штамм-продуцент фактора некроза опухолей человека на основе E.coli. // Биоорганическая химия. 2005, 5, С 1-3. Суровцева Е.В., Аникеева Н., Сикулев Ю., Шевелев А.Б. Получение растворимой формы рецептора фактора некроза опухоли человека путем экспрессии в клетках Drosophila. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2005, 3, С 34-

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»