WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Изучение эффективности взаимодействия ed-TNFR1 с рекомбинантным TNF- человека и тестирование его функциональной активности in vitro Эффективность взаимодействия полученного ed-TNFR1 с человеческим TNF- была протестирована с помощью ELISA в сравнении с эффективностью взаимодействия моноклональных антител к TNF-. Полученные графики представлены на Рис. 7. Можно предположительно оценить аффинность ed-TNFR1, сопоставив ее с аффинностью моноклональных антител, исходя из утверждения об одновалентности иммобилизованного ed-TNFR1 и двухвалентности антитела.

Молекулярная масса ed-TNFR1 (20 кДа), что приблизительно в 6 раз меньше массы IgG (140 кДа). Следовательно, Mr одновалентного лиганд-связывающего центра edTNFR1 меньше Mr одновалентного антиген-связывающего центра IgG примерно в 3 раза. Таким образом, при сорбции на планшеты mAb2 и ed-TNFR1 в равных массовых концентрациях (5 мкг/мл), ed-TNFR1 находился в 3-х кратном молярном избытке по сравнению с mAb. Несмотря на это величина сигнала (A490) (Рис. 7), показывающая количество TNF-, связавшегося с рецептором, существенно больше в случае mAb, чем ed-TNFR1. Из представленных рассуждений можно сделать вывод о более высокой аффинности моноклональных антител к TNF- по сравнению с растворимым рецептором.

0,1 моноклональные 0,антитела 0,0,2 рецептор TNF 0,0,0,0,0,0 100 200 300 400 500 концентрация TNF- (нг/мл) Рис. 7. Эффективность взаимодействия ренатурированного TNF- с моноклональными антителами и экстраклеточным доменом рецептора типа 1, протестированная методом ELISA3: 1 - связывание ренатурированного TNF и моноклональных антител (квадраты); 2 - связывание ренатурированного TNF- и его рецептора (треугольники) Данные, представленные на Рис. 7, позволяют сделать вывод о связывании TNF- как с моноклональными антителами, так и с нативным экстраклеточным доменом рецептора ed-TNF-R1 и, следовательно, о наличии у ренатурированного из телец включения TNF- естественной третичной структуры.

mAb – моноклональные антитела к TNF- ELISA – твердофазный иммуноферментный анализ A(490нм) Получение поликлональной антисыворотки иммунизацией рекомбинантным TNF- человека. Использование аффинно-очищенных антител для тестирования продукции TNF- в сыворотках больных рассеянным склерозом Иммунизация животных рекомбинантным продуктом, полученным при использовании конструкции pTNF5 в виде телец включения Получение антител к продукту того или иного вновь открытого гена с неизвестной функцией является распространенной задачей. Ее решение, однако, зачастую осложняется невозможностью эффективно ренатурировать продукт из телец включения. Эффективность ренатурации, в свою очередь, сдерживается сложностью ее оценки по функциональной активности. Таким образом, антитела, полученные против агрегированного нерастворимого белка, могут служить ценным инструментом на начальных этапах исследования локализации и функциональной активности вновь открытых генов и их продуктов. TNF- человека детально изучен в качестве антигена для иммунизации, поэтому он может рассматриваться в качестве удобного модельного объекта для изучения роли нативности антигена с точки зрения развития гуморального иммунного ответа.

В настоящей работе мы использовали в качестве антигена для иммунизации водную суспензию интактных телец включения, представляющих собой продукт конструкции pTNF5. Иммунизацию кролика проводили в три этапа по стандартной схеме, широко применяющейся при работе с разнообразными природными и рекомбинантными белками в нативной форме. При этом на каждой стадии иммунизации животным внутримышечно вводили 1 мг телец включения в виде суспензии в 1 мл физиологического раствора в смеси с полным адъювантом Фрейнда. Наличие продукции поликлональных антител в неочищенной кроличьей сыворотке протестировано вестерн-блоттингом с контрольным препаратом рекомбинантного TNF- человека (Reafan, Россия) (Pис. 8).

Поликлональную антисыворотку, полученную при иммунизации кролика тельцами включения, тестировали на способность связываться со специфическим антигеном в иммуноблоттинге. Было показано, что сыворотка без дополнительной очистки при разведении в 1500 раз избирательно реагирует с гомологичным антигеном (TNF-) в концентрациях не менее 2.5 нг в образце (Рис. 8), что свидетельствует о высокой аффинности полученных антител. Для проверки чувствительности в качестве антигена использовался контрольный препарат TNF- человека.

Рис. 8. Тестирование эффективности распознавания ренатурированного TNF неочищенной кроличьей поликлональной антисывороткой.

На дорожки нанесены:

1) 25 нг TNF-;

2) 2.5 нг TNF- Для аффинной очистки фракции поликлональных антител против человеческого TNF- был предварительно синтезирован сорбент. 0.6 мг ренатурированного TNF- связали с 2 мл сефарозы, активированной BrCN.

Тестирование содержания TNF в сыворотках больных рассеянным и боковым амиотрофическим склерозом с помощью аффинноочищенных кроличьих поликлональных антител Боковой амиотрофический (BAS) и рассеянный склерозы (MS) – это серьезные нейродегенеративные заболевания, преимущественно аутоиммунной природы, распространенные преимущественно у людей старшей возрастной группы. Они характеризуются сложной клинической симптоматикой, и для их распознавания зачастую используют методы лабораторной диагностики, в том числе, иммунологические.

Методом вестерн-блоттинга с помощью аффинноочищенных кроличьих поликлональных антител сравнили сыворотки 3 больных MS и 3 больных BAS (биологический материал был любезно предоставлен М.Н. Захаровой ин-т неврологии, МЗСР РФ). В качестве контрольной группы служили с 6 сывороток клинически здоровых доноров (предоставлены МГЦ «СПИД»). Как показано на Рис. 9, при окрашивании аффинноочищенными антителами против TNF- наблюдается выраженное различие состава белков сыворотки крови больных с одной стороны MS, и BAS и здоровых доноров – с другой.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Рис. 9. Анализ состава белков крови больных рассеянным и боковым амиотрофическим склерозом, методом вестерн-блоттинга с аффинноочищенными кроличьими поликлональными антителами. На дорожки нанесен материал сывороток: 1-6-здоровых доноров, 7-9-сывороток больных BAS, 10-12-сывороток больных MS, 13 – стандарт, рекомбинантный TNF- человека (1 нг на дорожку) Следует отметить, что картина, наблюдаемая при иммунохимическом окрашивании перенесенных на мембрану сывороточных белков антителами против TNF- не отличается у здоровых людей и больных BAS, но в тоже время резко отличается в случае больных MS. На основании полученных данных можно сделать вывод о потенциальной пригодности полученных антител для идентификации больных заболеваниями MS в отличие от BAS в тех случаях, когда этого удается сделать по анализу клинической картины.

ДНК-доставка TNF- на животной модели in vivo с детекцией результата по выработке антител В ряде случаев введение экспериментальным животным или человеку ДНК, несущей ген какого-либо ростового фактора, как правило, не приводит к выбросу заметных количеств антигена в кровоток, обеспечивая лишь локальное накопление продукта в ограниченной области близи точки инъекции. В этой связи непосредственная детекция продукта, доставляемого с помощью синтеза in situ, технически сложна. Облегчить решение этой задачи возможно путем выявления специфических антител, вырабатывающихся в ответ на появившийся антиген.

Антитела вне зависимости от распределения антигена накапливаются в кровотоке и циркулируют в течение долгого времени, значительно превышающего время существования самого продукта эктопической экспрессии.

В ряде случаев антитела, полученные в ответ на ДНК-иммунизацию, могут представлять практическую ценность, так как они вырабатываются в ответ на антиген, синтезированный в естественной для него среде. Таким образом, могут быть исключены искажения иммунного ответа, связанные с неестественным фолдингом продукта в гетерологичной системе или in vitro, а также с загрязнением антигена примесными белками продуцента.

ДНК-иммунизация – это недавно появившийся и недостаточно апробированный метод. Основанная масса результатов по ДНК-иммунизации касается выработки ответа против вирусных антигенов, как с целью получения антител, так и для вакцинации. В данной работе было показано, что этот метод может быть применим и в отношении других типов белков-антигенов, в частности, секреторных сигнальных факторов животных. ДНК-иммунизация позволяет значительно сократить временные затраты на получение антигена для иммунизации. Это обстоятельство особенно в том случае, если получение рекомбинантного белка в традиционных экспрессионных системах затруднено (например, для мембранносвязанных белков).

ДНК-иммунизация крыс Для доставки ДНК in vivo было получено 2 генно-инженерных конструкции pCD-TNF3 и pCD-TNF4. В первой из них под контролем CMV находится ген, кодирующий зрелый TNF- человека без секреторного лидера, а во второй - полный геномный ген TNF.

Схема их функциональных элементов конструкции представлена на Рис. 10.

1) CMV ПЦР-амплификат pCD-TNFNot I Spe I/Xba I Лидерный ПЦР-амплификат пептид 2) CMV pCD-TNFHind III Xba I Рис. 10. Схема генно-инженерных конструкций, использованных для ДНКиммунизации на базе вектора pC-DNA3; 1) pCD-TNF3, кодирующая зрелый TNF-;

2) pCD-TNF4, содержащая геномный (интронированный) вариант гена TNF-, кодирующая секретируемый вариант белка с лидерным пептидом (штриховкой отмечены экзоны) Предполагалось, что продукция антигена in vivo будет происходить под контролем СMV промотора, который обеспечивает высокий уровень конститутивной транскрипции. CMV промотор достаточно универсален, при этом от исследователей не требовалось изменять дизайн генно-инженерных конструкций при переходе от одной системы экспрессии in vivo к другой. Дизайн pCD-TNF4 предполагал, что продуцируемый in vivo антиген будет секретироваться в межклеточное пространство с помощью лидерного пептида; в случае pCD-TNFбудет осуществляться внутриклеточная экспрессия, при этом антиген не секретируется, но может попасть в межклеточное пространство за счет случайной гибели трансфицированных клеток.

0,0,0,0,0,0,0,0,0,1 2 3 4 5 6 7 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:разведение сыворотки Рис. 11. Предварительное тестирование конструкций для ДНК-иммунизации на крысах. Иммунизация животных конструкцией: 1 - pCD-TNF4 (треугольники); 2 - pCD-TNF3 (квадраты) Для предварительной проверки функциональности собранных конструкций крысы породы Wistar (самки) были проиммунизированы соответственно конструкциями pCD-TNF3 и pCD-TNF4 по стандартному протоколу, применяемому для белков: внутримышечно, с дозировкой ДНК 1 мг в 1 мл физиологического раствора на инъекцию. Уровень продукции человеческого TNF- тестировался путем титрования антисывороток в непрямом методе ELISA.

Полученные данные представлены на Рис. 11. При анализе полученных данных был сделан вывод о целесообразности использования в следующих опытах конструкции pCD-TNF3. В литературе встречаются данные о снижении выхода рекомбинантного белка в случае его секреции по сравнению с аналогичным белком, лишенным секреторного лидера и накапливающимся в цитоплазме.

Вероятно, этим можно объяснить трудности в продукции антител в случае pCDTNF4.

В следующем опыте 7 крыс породы Wistar (самки) были проиммунизированы раствором ДНК конструкции pCD-TNF3 по стандартной методике иммунизации описанной выше. В качестве положительного контроля животное подвергалось параллельной иммунизации рекомбинантным TNF- человека. Уровень продукции поликлональных антител тестировался путем титрования сывороток в непрямом ELISA. На Рис. 12 представлены данные, показывающие уровень продукции поликлональных антител у отдельных животных.

A(490нм) 1,1,1,1,белок 0,0,0,0,1 2 3 4 5 6 7 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:разведение разведение сывороток Рис. 12. Продукция поликлональных антител у крыс, проиммунизированных pCDTNF3, протестированная методом ELISA; 1-3 животные, иммунизированные pCD-TNF3 (круги и квадраты). (Треугольники) - контрольное животное, иммунизированное рекомбинантным белком TNF-. По оси абсцисс отложено разведение сывороток крыс Из 7-ми иммунизированных животных достоверно на иммунизацию ДНК прореагировали только три (у остальных четырех животных максимальное значение A490, определяющееся уровнем продукции поликлональных антител, в ELISA практически не отличалось от фонового и на Рис. 12 не приведены). При этом уровень продукции поликлональных антител у двух из них оказался невысоким, а иммунный ответ третьего оказался высоким, превысив уровень положительного контроля (при иммунизации белком).

Рассматривая итоги ДНК-иммунизации крыс генно-инженерной конструкцией pCD-TNF3, кодирующей ген зрелого TNF- человека, можно сделать вывод о значительном разбросе результатов эксперимента. Необходимо отметить, что исходя из литературных данных, в ряде случаев иммунный ответ на ДНКиммунизацию проходит не по гуморальному пути, то есть путем продукции антител, которые тестировались в этом случае, а только по клеточному пути.

Объясняя недостаточную воспроизводимость эффекта, мы предположили, что ход иммунного ответа организма на иммунизацию зависит от тонкой гистологической структуры сайта введения ДНК в организм (близость региональных лимфоузлов, сосудов, фасций и т.д.). Однако, остается неясным, какой из факторов привел к резкому усилению эффекту в случае 1-oго животного (Рис. 12).

ДНК-иммунизация кролика Для эксперимента был взят один кролик, которого изначально троекратно проиммунизировали внутримышечно конструкцией pCD-TNF3, при этом при одной инъекции ему вводили 1 мкг ДНК. В отличие от крыс при иммунизации кролика оказалось возможным исследовать динамику продукции антител. После каждой инъекции ДНК сыворотка кролика тестировалась вестерн-блоттингом и ELISA на предмет появления антител против синтезировавшегося in vivo TNF- А(490нм) человека. Следует отметить, что в результате иммунизации кролика конструкцией pCD-TNF3 сколько-нибудь значительной продукции антител получить не удалось.

После этого был сделан вывод о необходимости изменения протокола ДНКдоставки. Поэтому далее кролик был вторичной иммунизации конструкцией pCDTNF4. Уже после первой инъекции ДНК наличие антител против TNF- было подтверждено вестерн-блоттингом (Рис. 13).

Рис. 13. Тестирование продукции поликлональных антител в кроличьей ДНКиммунизационной сыворотке методом вестерн-блоттинга. Окрашивание мембран после переноса белков проведено a) преиммунной сывороткой; b) сывороткой, полученной после 2-кратной ДНК-иммунизации. На дорожки нанесены: 1,2 – клеточные лизаты E. coli BMH 71-18; 3) очищенный рекомбинантный TNF-.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»