WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА РАН на правах рукописи СУРОВЦЕВА Елена Владимировна Методы ДНК-доставки и мониторинга фактора некроза опухолей человека на животных моделях Специальности 03.00.04 - «Биохимия» 03.00.03 - «Молекулярная биология» Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2005 Научный руководитель: кандидат биологических наук А.Б. Шевелев Официальные оппоненты: доктор биологических наук, проф. Б.С. Народицкий кандидат биологических наук А.В. Жердев Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава Защита состоится 15 ноября 2005 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета К002.247.01 при Институте биохимии им А.Н. Баха РАН по адресу:119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу:119071, Москва, Ленинский проспект, д.33 строение 1 Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2 Общая характеристика работы Актуальность проблемы Секреторные белковые медиаторы большинства важнейших процессов в организме человека и млекопитающих функционируют в очень низких физиологических концентрациях. При этом высокая биологическая активность ростовых факторов и цитокинов в отношении клеток организма, как правило, компенсируется их стремительной деградацией. Высокая скорость распада и синтеза ростовых факторов приводит к формированию квазистационарных концентрационных градиентов вблизи клеток-продуцентов, которые, по-видимому, возникают за счет распределения ростовых и сигнальных факторов в организме.

Создание именно таких устойчивых во времени градиентов является желательным условием тестирования действия лимфокинов и ростовых факторов на животных моделях, однако эта задача не реализуема при введении испытуемых белков в систему в форме готовой субстанции.

Наиболее физиологичным методом доставки ростовых факторов представляется индуцированная экспрессия клеточных медиаторов собственными клетками организма in vivo, которая может быть достигнута при введении в отдельные клетки животного генной конструкции, несущей соответствующий структурный ген. В настоящее время многие проекты, направленные на создание средств борьбы с вирусными и онкологическими заболеваниями, включают введение в организм человека ДНК, несущей ген соответствующего цитокина [Bartlett et al., 2003]. В этом случае уровень экспрессии определяется, прежде всего, силой промотора, а также возможностью доставки ДНК к тканям-мишеням.

Доля клеток, непосредственно подвергающихся трансфекции в результате внутримышечной инъекции неупакованной ДНК, очень невелико (не более 10-5 в непосредственно вблизи точки инъекции), поэтому напрямую оценивать эффективность доставки конструкций по появлению белкового продукта или специфического транскрипта представляется затруднительным. В этой связи наиболее доступными являются косвенные методы оценки на основе измерения уровня продукции специфических антител в ответ на синтезированный in situ рекомбинантный белок. Выявление таких антител, легко доступное в техническом отношении, может служить доказательством факта доставки ДНК в заданный участок ткани-мишени.

Цель и задачи исследования В качестве цели настоящей работы рассматривалась разработка генноинженерных конструкций для доставки растворимого TNF-1 человека в секреторной и внутриклеточной форме в клетки млекопитающих. Эффективность разработанных конструкций оценивалась по критерию появления в крови животного в результате парентерального введения плазмидной ДНК специфических поликлональных антител против TNF- человека.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

1) создание иммунохимической системы детекции TNF- на основе антител, выработанных при иммунизации кролика рекомбинантным белком;

TNF- – фактор некроза опухолей 2) получение биологически активного стандарта стандарта для разработки тест-системы;

3) характеристика специфичности аффинноочищенных антител против TNF- человека;

4) создание конструкций для доставки TNF- человека в клетки млекопитающих в секреторной и внутриклеточной форме;

5) изучение свойств полученных конструкций в тестах на животных моделях.

Научная новизна работы Впервые показана возможность доставки TNF- человека на животной модели с помощью свободной ДНК. В нашем случае доставка TNF- человека проведена параллельно на двух видах животных, причем сопоставлена эффективность действия секретируемого и несекретируемого вариантов белков.

Подтверждено ранее высказанное предположение [Chowdhury et al., 2001;

Gardsvoll et al., 2000] о значительных различиях характера ответа на антиген, доставляемый методом ДНК-иммунизации, в случае крысы и кролика. Это проявилось, в частности, в форме двухфазной динамики сероконверсии титра специфических антиткел у кролика.

Практическая ценность работы В представляемой работе первая часть посвящена получению рекомбинантного TNF- человека, необходимого в дальнейшей работе для иммунобиохимических тестов. Предложен оригинальный дизайн генной конструкции, приводящий к более высокому, по сравнению с ранее использовавшимися [Шингарова и др., 1997] уровню продукции целевого продукта (до 100 мг/л). Разработана оригинальная методика ренатурации TNF- из телец включения. Факт приобретения TNF- нативной конформации в результате ренатурации рекомбинантного белка подтвержден наличием связывания продукта ренатурации с экстраклеточным доменом рецептора TNF 1 типа в тесте in vitro.

Нативный рецептор TNF получен экспрессией в клетках Drosophila melanogaster.

Вторая часть работы посвящена характеристике полученных аффинно очищенных поликлональных антител против TNF- человека. Получены предварительные данные, подтверждающие перспективность использования этих антител при дифференциальной и уточняющей диагностике больных рассеянным склерозом.

Публикации По материалам диссертации опубликованы 3 печатные работы.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 125 страницах и состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (135 наименований). Диссертация содержит рисунков и 1 таблицу.

Апробация работы Материалы работы представлялись на ежегодном конкурсе работ института биохимии им.А.Н. Баха РАН (декабрь 2004) и на конференции “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, институт биороганической химии им.М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, февраль 2005г).

Материалы и методы Методы работы с культурами клеток эукариот Культивирование клеток линии цитотоксических лимфоцитов Линию нормальных цитотоксических лимфоцитов человека CERподдерживали в жидкой среде RPMI 1640 (Invitrogen, Германия) с добавлением 10% инактивированной лошадиной сыворотки при 37C и 8% CО2. Для стимуляции роста CER43 раз в 10 дней в клеточную культуру вносили 10-кратный избыток периферических моноцитов крови человека (PBMC), выделенных центрифугированием в градиенте фиколла.

PBMC выделяли из свежей крови здорового донора. В 50-мл. стерильную пробирку отбирали 35 мл крови. Далее на дно пробирки осторожно наслаивали 10 мл фиколла. После центрифугирования 10 мин 1500g отбирали среднюю фазу.

Процедуру повторяли три раза. Из 35 мл крови выделяли в среднем 50х106клеток.

Культивирование клеток эмбриональной линии Drosophila melanogaster Клетки стандартной лабораторной линии дрозофилы S2 (Invitrogen, Германия) выращивались на очищенной от белка среде Шнейдера Insect-Xpress (Biowhitaker, США) c добавлением 10% инактивированной лошадиной сыворотки при 26C, при качании со скоростью 115 об/мин. Клетки пересевали 2 раза в неделю, стараясь держать в логарифмической фазе роста 5х1051х106клеток/мл.

Генно-нженерное конструирование Получение кДНК из клеток линии CERСуммарную РНК выделяли с использованием Oligotex Direct mRNA Mini Kit (Qiagen, Германия), после чего с использованием ревертазы Mo MuLV (Eppendorf, Германия) и случайных праймеров (N6) получали первую цепь кДНК. Реакцию проводили при 37С в течение 1 ч и останавливали прогревом до 70С в течение 5 мин.

Сборка экспрессионной конструкции для получения TNFR1 в клетках дрозофилы На основании опубликованной нуклеотидной последовательности мPHK TNFR1 (номер доступа в NCBI Gene Bank - NCBI NM_001065) была подобрана пара олигонуклеотидных праймеров:

TNFR1-for (KpnI) (5’)-catagggtaccagcatgggcctctccaccgtgc-3’ TNFR2-rev (AgeI) (5’)-cattcaccggtggtgcacacggtgttctg-3’ В праймер TNFR1-for был введен элемент Козака (agca) и стартовый кодон ATG. С использованием ПЦР на амплификаторе марки (Applied Biosystem, США) был получен фрагмент ДНК ожидаемого размера 500 п.н., кодирующий TNFR1.

ПЦР-амплификат был расщеплен по сайтам KpnI/AgeI и клонирован в вектор pMT/V5-His (Invitrogen, Германия), предварительно линеаризованный теми же рестриктазами. В результате была получена плазмидная конструкция pMT-TNFR1, кодирующая рекомбинантный ed-TNFR1.

Сборка экспрессионных конструкций TNF- человека Праймеры TNF1, TNF2, TNF3 и TNF5 были сконструированы на основе нуклеотидной последовательности [NCBI M26331].

TNF-1 (NdeI) (5’)-ggcatatgatgcgcagcagcaggccgcaaccccgagcgataaa TNF-2 5’)-cgccaccacatgggccaccggtttatcactcggggtgc TNF-3 (BamHI) (5’)-ggggatccgttaacccgcaggctgaggggcagctccagtg TNF-5 (XbaI) (5’)-ggtctagagggcaataatcccaaagtag Для генноинженерного конструирования на базе вектора pET23a (Novagen, США) в работе использовали штамм E. coli BMH 71-18 (thi, supE, F’proAB, laclq ZM15) (Promega, США). Для проведения экспрессии под контролем промотора фага Т7 служил штамм BL21(DE3) (F-, ompT, hsd Sb(rb-, mb-), dcm, gal, (DE3), pLysS, Cmr).

ПЦР с геномной ДНК человека и праймерами TNF3 и TNF5 осуществлялась на термоциклере Tercyc MC-16 (ДНК-технология, Россия). При проведении ПЦР использовали ДНК-полимеразу Taq (Бионем, Россия). Геномную ДНК-матрицу вносили в реакционную смесь до конечной концентрации 0.01 мкг/мкл. ПЦР проводили в следующих условиях: 94°С -1 мин, 54°С – 45 с, 72°С -15 с, 30 циклов.

Получение генноинженерных конструкций для ДНК-иммунизации против TNF- человека Фрагмент ДНК для клонирования был получен ПЦР с использованием Тстандартного праймера (MBI Fermentas, Литва) и праймера TNF5 на матрице pTNF5.

На базе системы прямого клонирования ПЦР-продуктов pGem-T-Easy (Promega, США) была получена промежуточная конструкция pGem-TNF2.

Фрагмент ДНК, кодирующий зрелый TNF- человека, был получен рестрикцией плазмиды pGem-TNF2 по сайтам NotI и SpeI и клонирован в предварительно линеаризованный по сайтам NotI и XbaI вектор pC-DNA3.

Полученная плазмидная конструкция pCD-TNF3 использовалась далее для иммунизации животных.

Для получения конструкции pCD-TNF4 был синтезирован праймер:

TNF7(HindIII) (5’)-aaaagcttgatgcggatcctggagctggccgagga ПЦР-амплификат размером 1.8 т.п.н. был получен на матрице геномной ДНК человека с использованием праймеров TNF7 и TNF5. Далее этот амплификат был расщеплен рестриктазами HindIII/XbaI pC-DNA3, предварительно лианеризованный этими же рестриктазами. Полученная конструкция pCD-TNFбыла использована для иммунизации животных.

Иммунизация животных Иммунизация крыс рекомбинантным белком в виде телец включения и получение сыворотки против TNF- человека Иммунизацию 2-х крыс породы Wistar проводили подкожно 3 раза с интервалом 10 дней в присутствии при первой иммунизации полного, а в 2-х последующих неполного адъюванта Фрейнда. Для однократного введения одному животному использовали 500 мкг рекомбинантного TNF- в виде телец включения в суспензии в физиологическом растворе объемом 300 мкл. Кровь отбирали из хвостовой вены. Для дальнейшего анализа использовали цельную сыворотку, образовавшуюся после отделения естественного фибринового сгустка.

ДНК-имунизация В настоящее время не существует общепринятого протокола иммунизации животных ДНК. В нашей работе для решения этой задачи использовалась следующая экспериментальная методика:

ДНК-иммунизация крыс Крысы были проиммунизированы внутримышечно 3 раза с интервалом дней. При однократной инъекции одному животному вводили 300 мкг ДНК, растворенной в 300 мкл физиологического раствора. Кровь отбирали из хвостовой вены. Для анализов использовали цельную сыворотку.

ДНК-иммунизация кролика Кролик был проиммунизирован внутримышечно 3 раза конструкцией pCDTNF3 и 4 раза конструкцией pCD-TNF4 c интервалом 14 дней. При однократной инъекции животному вводили 1 мг ДНК, растворенной в 1 мл физиологического раствора. Кровь отбирали из ушной вены.

Результаты и их обсуждение Получение TNF- и тестирование его активности in vitro TNF- человека был получен в результате экспрессии в E. coli. Метод получения рекомбинантных белков в E. coli технически прост и экономически доступен. Для получения биологически активного продукта рекомбинантный белок, предварительно полученный в виде телец включения, подвергают процедуре ренатурации.

В качестве теста, позволяющего оценивать корректность фолдинга при ренатурации TNF- in vitro была использована его способность к связыванию с экстраклеточным доменом рецептора TNFR1.

Получение экспрессионных конструкций TNF- Экзон-интронная структура человеческого гена TNF- была исследована на основании последовательности, депонированной в банке генов NCBI. Первичный транскрипт TNF-, кодируемый локусом в составе 6-ой хромосомы человека, содержит 4 экзона. Лидерная последовательность кодируется экзоном 1 и частью экзона 2, зрелый TNF- кодируется 3 экзонами, из которых первые 2 имеют незначительную длину, кодируя в сумме лишь 19 аминокислот. Сходную экзонинтронную структуру имеют многие другие гены секреторных белков эукариот, в том числе ростовые факторы GM-CSF [NCBI X03020], фоллистатин [NCBI AH001463], инсулиноподобный фактор роста IGF1Еа [NCBI E01351].

Сборку гена, кодирующего зрелую форму TNF-, проводили, комбинируя клонирование ПЦР-амплификата и сборку ДНК из синтетических олигонуклеотидов. Для клонирования ПЦР-фрагмента кодирующей области, соответствующего экзону 3 геномного гена TNF-, была подобрана пара праймеров TNF3 и TNF5. Продукт ПЦР, полученный с использованием этой пары праймеров на матрице геномной ДНК человека, имел размер 436 п. н. Амплифицированный фрагмент был клонирован в экспрессионный вектор pET23a, в результате чего была получена промежуточная конструкция pTNF-1.

Недостающие в конструкции pTNF-1 два экзона были получены ферментативной достройкой пары частично комплементарных синтетических олигонуклеотидов (Рис. 1).

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»