WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

1. Для первого типа (I) характерно: белая незональная колония в виде плотной пленки, поверхность колонии порошистая; инверзум белый, мицелий образует на стенках чашки Петри обильные тяжи. Температурный оптимум 30°С, максимум 35-37°С. Колонии быстрорастущие. К этому типу относятся штаммы: GL2 (Кавказ), GL4 (Франция), GL5 (США), GL8 (Кавказ), GL9 (Крым), GL927 (Австрия).

2. Для второго типа (II) характерно: белая зональная колония с желтоватосерым плотным центром; край прижатый, поверхность порошистая;

инверзум в центре колонии светло-коричневый. Температурный оптимум 2728°С, максимум 32-33°С. Колонии характеризуются средней скоростью роста. К данному типу принадлежит штамм GL3 (Корея).

3. Третий тип колоний (III) характеризовался твердой, плотной коркой, обычно темно-коричневой, иногда кремовой, с белыми секторами. Колонии медленно растущие, зональные, с концентрическими кругами разной структуры, поверхность колонии порошистая. Край колонии прижат, инверзум темно-коричневый. Температурный оптимум 25°С, максимум 31°С.

К этому типу колоний принадлежат штаммы GL6 и GL7 из Московской области.

 Таблица 2. Сравнительный анализ штаммов по морфологическим и культуральным признакам Температурный Внешний Скорость Морфоло- Наличие максимум/ Штамм вид роста при гический тип хламидоспор Температурколоний 25°С ный оптимум °C GL2, GL4, GL5, GL8, Более 11 мм 34-37/I GL9, в сутки GL9-11 мм в GL3 32-33/II сутки Менее 8 мм в GL6, GL7 нет 31/III сутки Общим микроморфологическим признаком для всех изученных штаммов было наличие воздушного коралловидного мицелия с регулярно присутствующими пряжками (рис. 1а). У штаммов, относящихся к первому морфологическому типу (I), были обнаружены постоянно присутствующие многочисленные структуры на однородном мицелии в виде лимоновидных образований с толстыми стенками, сидящие на короткой ножке, в 1,5 - 2 раза превышающие по толщине мицелий (рис. 1б).

а) б) Рисунок 1. Микроморфология штаммов G. lucidum. Воздушный коралловидный мицелий с пряжками (а), хламидоспоры (б)  Эти структуры располагались как терминально, так и интеркалярно и полностью подходили под имеющееся в литературе описание хламидоспор афиллофороидных грибов (Решетников, 1991; Гарибова, 2000), в том числе, и непосредственно G. lucidum. Первое упоминание о наличии хламидоспор у G.

lucidum приводится в работе Steygaert, 1967 (цитировано по Решетникову, 1991). У штамма из Кореи (GL3) такие структуры наблюдались единично, у штаммов из Московской области (GL6 и GL7) хламидоспоры не встречались (табл. 2).

С помощью микроманипулятора были изолированы одиночные хламидоспоры с мицелия трех штаммов (GL2chl, GL4chl, GL5chl). На суслоагаре они прорастали на третьи сутки и давали типичный мицелий с пряжками.

Окраска ядерного аппарата хламидоспор раствором ДАПИ показала, что споры двуядерные.

При исследовании морфологии штаммов G. lucidum была выявлена способность чистых культур образовывать коралловидные плодовые тела на агаризованных средах (рис. 2а).

а) б) Рисунок 2. Коралловидные плодовые тела (а) и примордии (б) Базидии и жизнеспособные базидиоспоры формировались в этом случае прямо на поверхности коралловидных плодовых тел (рис. 2а, 3а, б).

Аналогичные структуры отмечены в работе Сео и Шин (Seo, Shin, 1995) при исследовании штаммов G. lucidum из Кореи и Папуа Новой Гвинеи и были названы авторами атипичными плодовыми телами (АПТ). Анализ всей нашей коллекции показал, что базидии и базидиоспоры формировались прямо на поверхности АПТ штаммов из Кореи (GL3) и Крыма (GL9) (рис. 2а, 3а, 3б), а также на апикальных частях примордиев у штаммов с Кавказа (GL8) и из Франции (GL4) (рис. 2б).

 Примордии штаммов GL2, GL5, и GL927 базидии и базидиоспоры не образовывали. Изученные штаммы G. applanatum атипичных плодовых тел не формировали.

а) б)  Рисунок 3. Базидии (а) и базидиоспоры (б), образованные АПТ штамма G. lucidum из Кореи (GL 3) Исследование микроморфологии АПТ показало, что они сформированы вегетативными и скелетными гифами, а также кутикулярными клетками.

Установлено, что такие абиотические факторы, как освещенность, аэрация, рН и некоторые источники углеродного и азотного питания не влияют на способность к образованию АПТ, а, следовательно, данный признак может считаться штаммовым.

Наиболее надежным способом установления вида в культуре является идентификация нормально развитых типичных базидиом, образующихся при культивировании.

Плодовые тела получали по методике В. Стэйметса разработанной специально для G. lucidum. Были использованы четыре варианта субстрата:

1-лузга, 2- дубовые опилки, 3-смесь лузги и дубовых опилок в соотношении 1:1. Четвертый вариант представлял собой предложенную в данной работе модификацию, к дубовым опилкам был добавлен дрожжевой экстракт в количестве 0.5-1.0 % от сухой массы субстрата (табл. 3).

Для формирования плодовых тел наиболее благоприятным оказался четвертый вариант. Были не только получены базидиомы у штаммов, ранее не плодоносивших, но и сроки получения плодовых тел сократились на 5 - суток. Следует отметить, что примордии были получены для всех штаммов.

 Таблица 7. Плодоношение на различных субстратах (сутки) Штаммы Опилки Лузга Опилки+лузга Опилки+дрож.

(1:1) экстракт GL2 (35-38) (40-45) (40-45) (29-34) GL3 (37-40) (45-50) (32-36) GL4 (35-40) (37-49) (35-40) (30-33) GL5 (34-45) (30-35) -GL-- - GL-- - GL-- -(30-35) GL-- -(30-35) GL-- - Типичные для вида лакированные веерообразные базидиомы получены у штаммов из Крыма (GL2), Кавказа (GL2, GL8) и США (GL5) (рис. 4а).

Штамм из Франции (GL4) формировал консолевидные матовые базидиомы (рис. 4б). Штамм GL3 из Кореи образовывал базидиомы, именуемые в литературе «Оленьи рога» (Stamets, 1993) (рис. 4в).

а) б) в)  Рисунок 4. Плодовые тела, полученные методом экстенсивного культивирования: а) лакированные базидиомы; б) матовые базидиомы; в) «оленьи рога» Из полученных базидиом штаммов GL2, GL4, GL5 были реизолированы тканевым методом культуры и названы GL2re, GL4re, GL5re, морфология которых при дальнейшем изучении оказалась идентичной морфологии исходных штаммов.

 Вегетативная несовместимость и репродуктивная изоляция штаммов G. lucidum Достоверное разграничение видов в современной микологии является сложнейшей проблемой, т. к. многие грибные популяции в природе представлены генетически сходными клонами, возникающими в результате бесполого размножения, причем клональную природу имеют и многие высшие базидиальные грибы, регулярно формирующие половые структуры (Шнырева с соавт., 2003).

Для установления генетических границ одной особи используют тест на вегетативную несовместимость, заключающийся в попарном сращивании дикариотических мицелиальных культур на агаризованных средах.

Фенотипическим проявлением реакции вегетативной несовместимости считается мицелиальный валик или барраж, образующийся в зоне контакта культур.

Нами был проведен тест на вегетативную несовместимость дикариотических природных изолятов коллекции.

Наиболее сильный антагонистический ответ был отмечен при сращивании штаммов G. lucidum с двумя дикариотическими штаммами G. applanatum (рис. 5а). Менее сильная реакция вегетативной несовместимости отмечалась при сращивании штаммов G. lucidum между собой во всех возможных комбинациях (рис. 5б). И лишь в зоне контакта 2-х мицелиев, принадлежащих к одному штамму, активно образовывались анастомозы с последующим слиянием (рис. 5в).

а) б) в) Рисунок 5. Результаты теста на вегетативную несовместимость: антагонистические реакции - сильная (а), умеренная (б); совместимость (в) Образование барража при сращивании внутри вида G. lucidum позволяет заключить, что исследуемые штаммы не являются клонами, а представляют собой генетически различные индивидуумы.

 Показано, что генетическая эволюция многих грибов, приводящая к полной или частичной репродуктивной изоляции (интерстерильности), опережает морфологическую эволюцию, и зачастую некоторые морфологические виды представляют собой ассоциации видов-двойников (Дьяков, 1993). Чтобы внести ясность и избежать недоразумений при разделении видов базидиальных грибов, проводят анализ генетической (репродуктивной) изоляции между особями (Adaskaveg et al., 1986, Шнырева с соавт., 2003).

Вид G. lucidum обладает типичной тетраполярной, или двухфакторной, системой гомогенной несовместимости (Adaskaveg, Gilbertson, 1986). Для проведения фертильных (совместимых) скрещиваний необходимы различия по обоим факторам совместимости, т. е. гибридизация возможна только между монокарионами, гетероаллельными по каждому фактору.

Тетраполярный тип половой несовместимости позволяет выделить для каждой интерстерильной группы по четыре монокариотических штамматестера.

Для трех штаммов (GL4, GL8, GL9) было получено по 12-15 моноспоровых монокариотических культур. Были проведены мон-мон скрещивания и выделены три набора тестеров (по четыре монокариотические культуры с различными факторами спаривания).

Таблица 4. Выделение интерстерильных групп GL4 GL8 GL4m1 4m2 4m6 4m7 8m1 8m1 8m5 8m9 9m1 9m2 9m7 9m4m1 - + - - - - - - - - - 4m2 + - - - - - - - - - - 4m6 - - - + - - - - - - - 4m7 - - + - - - - - - - - 8m1 - - - - - - - + + + + + 8m3 - - - - - - + - + + + + 8m5 - - - - - + - - + + + + 8m9 - - - - + - - - + + + + 9m1 - - - - + + + + - - + - 9m2 - - - - + + + + - - - + 9m7 - - - - + + + + + - - 9m7 - - - + + + + - + - Условные обозначения: «+»- образование пряжек, т. е. половая совместимость штаммов;

«-»-отсутствие пряжек, репродуктивный барьер.

 GLGLGLCкрещивания между тестерами показали, что штамм из Франции (GL4) относится к одной интерстерильной группе, а штаммы с Кавказа и из Крыма (GL8 и GL9, соответственно) к другой (табл. 4).

Уточнение принадлежности к выделенным интерстерильным группам остальных дикариотических штаммов провели с использованием ди-мон- скрещиваний (новый дикарион образуется за счет слияния гиф первичного монокариотического мицелия с гифами дикариотического мицелия) (табл. 5).

Из полученных данных видно, что штамм из Австрии (GL927) вошел в интерстерильную группу, образованную штаммом из Франции (GL4), а штамм с Кавказа (GL2) - в интерстерильную группу штаммов южных регионов (GL8 -Кавказ и GL9 -Крым). Штаммы из Кореи (GL3), США (GL5) и Московской области (GL6 и GL7) не вошли ни в одну из выделенных интерстерильных групп, что позволяет предположить их репродуктивную изоляцию.

В то же время показано, что дикариотизация в ди-мон скрещиваниях может происходить нерегулярно. В литературе это объясняется либо частичной репродуктивной изоляцией, либо погрешностью метода (Шнырева с соавт., 2003).

Таблица 5. Установление принадлежности дикариотических природных изолятов к выделенным интерстерильным группам GL4 GL8 GL4m1 4m2 4m6 4m7 8m1 8m3 8m5 8m9 9m1 9m2 9m4 9mGL2 - - - - + + + + + + + + GL3 - - - - - - - - - - - - GL4 - - - - - - - - - - - - GL5 - - - - - - - - - - - - GL6 - - - - - - - - - - - - GL7 - - - - - - - - - - - - GL8 - - - - - - - - + + + + GL9 - - - - - - - - + + + + GL927 + + + + - - - - - - - - Условные обозначения: «+»- образование пряжек, т. е. половая совместимость штаммов;

«-»-отсутствие пряжек, репродуктивный барьер.

 Сопоставление результатов анализа репродуктивной изоляции и данных, полученных при исследовании морфологических признаков, позволило заключить, что обе интерстерильные группы принадлежат к одному морфологическому типу.

Молекулярный и биохимический анализ штаммов G. lucidum При недостатке морфологических характеристик для идентификации изолятов различных видов многие исследователи обращаются к белковым и молекулярным маркерам, способным обеспечить большим количеством значимых для оценки изменчивости признаков. С помощью молекулярных маркеров была показана высокая гетерогенность комплексного вида G.

lucidum (Moncalvo, 1995; Hseu et al., 1996; Buchanan, 2001). Молекулярнофилогенетический анализ aмериканских, aзиатских и европейских коллекций G. lucidum с использованием маркеров рДНК позволил выделить несколько внутривидовых групп (G. lucidum sensu stricto, G. resinaceum complex sensu lato, G. curtisii complex, G. tropicum complex sensu lato) (Moncalvo, 2000).

Однако отсутствие корреляции между филогенией по рДНК и морфологическим разделением комплекса G. lucidum стимулирует поиск новых молекулярных маркеров, способных стать исчерпывающим критерием при описании штаммов.

В нашей работе был использован метод RAPD-PCR, чувствительность которого отвечает требованиям исследований, касающихся изменчивости внутри вида G. lucidum. RAPD-полиморфизм данной выборки был исследован с использованием десятичленных олигонуклеотидных праймеров, уже продемонстрировавших свою эффективность на большой группе штаммов, относящихся к роду Ganoderma (Hseu et al., 1996). В ходе работы была обнаружена высокая степень молекулярного полиморфизма исследуемой выборки.

Наибольшее количество вариабельных полос было получено с праймерами R1, R3 и R5.

При сравнении молекулярных профилей (паттернов амплификации), полученных с помощью праймера R1, был обнаружен фрагмент размером 620 п.н. (пар нуклеотидов), проявляющийся только у штаммов G. lucidum. В составе RAPD-спектров штаммов G. applanatum данный фрагмент не присутствовал, что позволило предположить видоспецифичность полученного фрагмента (рис. 6).

 Рисунок 6. Электрофореграмма RAPD-полиморфизма штаммов Ganoderma spp., полученная при использовании праймера R1 (стрелкой обозначен фрагмент, видоспецифичный для штаммов G. lucidum; м - маркер GeneRulerTM 1kb DNA Ladder, Fermentas, размеры маркерных фрагментов (п.н.) указаны справа от фотографии). Gl - G. lucidum ; Gapp - G. applanatum Полученные методом RAPD-PCR результаты были обработаны с помощью метода кластерного анализа. Все дендрограммы обладали сходной топологией, а наиболее устойчивой оказалась дендрограмма, построенная на основе анализа суммарной матрицы по всем паттернам амплификации (среднее значение индекса бутстрепа 82%) (рис.7).

Рисунок 7. UPGMA-дендрограмма генетического сходства RAPD-профилей штаммов Ganoderma spp  Основной кластер дендрограммы включил все штаммы G. lucidum. Штаммы вида G. applanatum образовали отдельную внешнюю группу, монофилия которой поддерживалась высокими значениями индекса бутстрепа (до 100%).

Данные кластерного RAPD-анализа подтвердили высокую гетерогенность вида G. lucidum, объединяя штаммы на протяжении широкого интервала условных единиц генетической дистанции (от 0,1 до 0,42) (рис. 7).

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»