WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

НР-азы из “аэробного” и “анаэробного” вариантов мицелия гриба F.oxysporum 11dn1 различались по удельной активности, молекулярной массе и температурному оптимуму (Таблица 1), что позволило предположить существование двух различных форм НР-аз, ассимиляторной, синтезируемой в аэробных условиях, и диссимиляторной, синтезируемой в анаэробных условиях.

Таблица 1. Сравнение свойств НР-аз из мицелия гриба F. oxysporum 11dn1, инкубируемого в аэробных и анаэробных условиях Свойства Аэробный мицелий Анаэробный мицелий Удельная активность НР-азы, мкмоль NO2-/мин*мг белка 0,01-0,1 0,4-1,Молекулярная масса НР-азы, кДа 265 Доноры электронов MVH, BPBH, MVH, NADPH, NADPH, NADH BPBH, NADH Температурный оптимум, оС 20 рН оптимум 6,0 – 7,0 6,0 – 7,Кофактор Мосо Мосо Влияние NH4+ на синтез НР-азы Ингибирует Не влияет Тип НР-азы Ассимиляторный Диссимиляторный Добавление циклогексимида (ингибитора синтеза белка на цитоплазматических рибосомах), к мицелию, выращеннему на аммонийсодержащей среде и затем перенесенному в анаэробные условия, предотвращало увеличение активности НР-азы, что указывало на синтез диссимиляторной НР-азы de novo. Исследование активного центра при помощи классического теста с апоНР-азой мутанта nit-1 гриба N. crassa, дефектной по Мосо показало, что диссимиляторная НР-аза, как и ее ассимиляторный аналог, содержала в активном центре Мосо. НР-аза “анаэробного” варианта мицелия F. oxysporum 11dnявляется вторым примером существования диссимиляторной НР-азы у эукариот.

Впервые диссимиляторная НР-аза была обнаружена у штамма MT 811 гриба F.

oxysporum [Uchimura et al., 2002].

II. Изучение НР-азы солетолерантного штамма дрожжей Rhodotorula glutinis, выращенного в присутствии 1 мМ вольфрамата.

Для оптимального роста микроорганизмов необходимы и достаточны низкие (микромолярные) концентрации молибдена (соли молибдена входят в стандартный набор микроэлементов). Вольфрам, обладая сходными с молибденом физико-химическими свойствами, способен замещать его в ферментах, образуя при этом каталитически неактивные аналоги, причем ингибирующее действие наблюдается уже в присутствии микромолярных концентраций [Afshar et al., 1998, 2002]. Высокие концентрации молибдена и вольфрама могут рассматриваться в качестве факторов стресса. Наши исследования показали, что солетолерантный штамм дрожжей Rh. glutinis, в отличие от несолеустойчивого штамма, способен расти на среде, содержащей высокие (1 мМ) эквимолярные концентрации вольфрама и молибдена, при этом наблюдалось значительное увеличение скорости роста дрожжей на нитрат-содержащей среде и увеличение уровня синтеза НР-азы.

Добавление 1 мМ вольфрамата к среде, содержащей нитрат и лишь следовые количества Мо (<0,001%), хотя и приводило к появлению длительной (40-60 ч) лаг-фазы, но не ингибировало рост полностью (Рис. 2). Методом гельхроматографии в бесклеточном экстракте выращенных таким образом дрожжевых клеток были обнаружены два пика с НР-азной активностью, что указывало на наличие двух изоформ фермента с различными молекулярными массами (НР1 – высокомолекулярная и НР2 - низкомолекулярная изоформы) (Рис. 3).

При комплементации препаратов НР1 и НР2 с апоНР-азой мутанта nit-1 гриба N. crassa в обоих вариантах было обнаружено совпадение НР-азной активности с активностью Мосо, что указывает на наличие Мосо в активном центре ферментов.

Анализ металлов в составе ферментов показал, что НР2 содержала лишь молибден, тогда как в НР1 – присутствовали как молибден, так и вольфрам.

A540 1,1,1,1,0,0,0,0,00 0 20 40 60 80 100 120 Время, ч Рис. 2. Кривые роста Rh.glutinis на модифицированной (не содержащей молибден) среде Ридера, в отсутствие добавленного молибдена (1) и в присутствии 1 мМ Na2WO4 (2). Столбики – активность НР-азы, нмоль NO2-/мин на мг белка.

При выращивании дрожжей на среде, содержащей 5 мМ NH4+ (репрессор синтеза НР-азы) и 1 мМ вольфрамат, также присутствовала высокомолекулярная Активность нитратредуктазы, нмоль NO /мин*мг фракция НР1, которая не обладала ферментативной активностью, но содержала вольфрам (Рис. 4).

Анализ полученных данных позволил предположить, что пик НР1 вероятнее всего состоял из вольфрам-связывающего белка и высокомолекулярной НР-азы (однако, нельзя исключить возможность существования неспецифической поверхностной сорбции вольфрама на НР1).

A1,2,1,1,0,1,0,0,0,0 0,0 5 10 15 20 № фракции Рис. 3. Гель - хроматография на колонке Toyopearl HW-55 экстракта из клеток дрожжей Rh. glutinis, выращенных в присутствии 1 мМ вольфрамата: 1 – поглощение при 280 нм; 2 – активность НР-азы, нмольNO2–/мин; 3 – активность Мосо, нмольNO2–/мин; 4 – содержание W, мкг/мл.

В дальнейшем мы сосредоточили свое внимание на изучении низкомолекулярной фракции НР2, поскольку ее вклад в общую клеточную НР Содержание W, мкг/мл Активность нитратредуктазы, нмоль NO /мин азную активность составлял 75,0 – 85,6% (в зависимости от метода разрушения клеток) и, по-видимому, изменение структуры и свойств именно этого фермента А2,1,1,1,1,0,0,0,0,0 0,0 5 10 15 20 № фракции Рис 4. Гель - хроматография на колонке Toyopearl HW-55 экстракта из клеток солетолерантного штамма дрожжей Rh. glutinis, выращенных на аммонийсодержащей среде в присутствии 1 мМ вольфрамата: 1 – поглощение при 280 нм;

2 – содержание вольфрама, мкг/мл. Активность НР-азы во фракциях отсутствовала.

предопределили возможность существования данного штамма дрожжей в условиях стресса. В результате разработанной схемы очистки бесклеточного экстракта, включающей осаждение сульфатом аммония (0-40%), ионообменную хроматографию на DEAE-Toyopearl 650 M, гель-хроматографию на Sephacryl S200 и ионообменную хроматографию на DEAE- cellulose DE-52, из бесклеточного Содержание W, мкг/мл экстракта солетолерантного штамма дрожжей Rh. glutinis был получен электрофоретически гомогенный препарат НР-азы (Рис.5). Свойства фермента суммированы в Таблице 2. Фермент представлял собой гомодимер с массой субъединиц 65 кДа, содержал в активном центре Мо в виде Мосо, обладал достаточно высоким температурным оптимумом (35-45оС), что не характерно для ферментов, выделенных из мезофильных организмов. Исследуемый фермент не ингибировался добавлением 1 мМ вольфрамата (сохранял 100%-ную активность).

Рис. 5. Нативный (1,2) и SDS (3,4) электрофорез гомогенного препарата НР-азы из солетолерантного штамма дрожжей Rh. glutinis. 1,3 - белки-стандарты; 2,4 – гомогенный препарат НР-азы.

Устойчивость дрожжей Rh. glutinis к вольфраму, по-видимому, обусловлена защитными механизмами, ранее описанными для некоторых микроорганизмов и растений, - синтезом металлсвязывающих белков и пептидов. Как уже упоминалось ранее, фракция НР1 содержала вольфрам-связывающий белок (с содержанием вольфрама - 4,6-9,9 мкг/мг), причем его синтез не зависел от источника азота и индуцировался высоким уровнем вольфрама в среде. Попытки выделения вольфрам-связывающего белка традиционными методами (использование детергентов – Triton X-100, Твина 80, Твина 85, гексадецилтриметиламмониум-бромида, холата Na, мочевины; очистка при помощи ионообменной, аффинной и гель-хроматографии) были безуспешными изза быстрой потери белком вольфрама. Факт, что при действии липолитических ферментов так же происходила диссоциация вольфрама, а при использовании растворителей белок обнаруживался во фракции хлороформа, указывал на высокое содержание липидов в белке.

Таблица 2. Свойства гомогенного препарата НР-азы дрожжей Rh. glutinis Удельная активность, мкмоль NO2-/мин*мг 1,Субъединичный состав Гомодимер Молекулярная масса субъединиц, кДа Металл в активном центре Мо Кофактор Мосо Температурный оптимум, оС 35 – рН оптимум 6,5-7,Км, мМ 0,74 ± 0,Влияние ингибиторов:

I0,5 (N3-), мкМ 44,I0,5 (CN-), мкМ 9,Na2WO4 (1 мМ) Не влиял Известно, что солеустойчивые штаммы дрожжей имеют повышенное содержание белков теплового шока Hsp26p и Hsp12p и (или) белкового фактора с молекулярной массой 140 кДа, способного связываться со stress-элементом в промоторе генов, кодирующих разные ферменты, что обуславливает их устойчивость к различным факторам стресса. Способность дрожжей Rh. glutinis расти на 1 мМ вольфраме может быть связана именно с такой устойчивостью солеустойчивого штамма к воздействию стресса.

III. Изучению свойств и структуры НР-азы галоалкалофильной бактерии Halomonas sp.штамм AGJ 1-3.

В предварительных опытах нами было показано, что при анаэробном выращивании клеток Halomonas sp. штамм AGJ 1-3 в присутствии 1 мМ вольфрама не наблюдалось ингибирования процесса денитрификации. Подобная устойчивость к воздействию фактора стресса могла быть обусловлена синтезом НР-азы, отличающейся по своим свойствам (например, повышенная устойчивость фермента к вольфраму, как в случае с Rh. glutinis) и/или структуре (перестройка активного центра) от ферментов, синтезирующихся в “нормальных” условиях.

Методом 2-стадийного препаративного электрофореза в неденатурирующих условиях был получен гомогенный препарат НР-азы штамма AGJ, представляющий собой мономер с молекулярной массой 130 кДа (Рис. 6).

Удельная активность гомогенного препарата НР-азы достигала 250 мкмоль NO2/мин на мг белка, что позволило оценить ее как высокую для данного класса диссимиляторных ферментов. Активность выделенного фермента уступала только активности НР-азы из гипертермофильной археи Pyrobaculum aerophilum, o измеренной при 70 C (326 мкмоль NO2-/мин на мг белка) [Afshar et al., 2001].

Свойства фермента представлены в Таблице 3.

Методом MALDI-спектроскопии показано, что НР-аза штамма AGJ - неизвестный ранее фермент, полная аминокислотная последовательность которого не имеет гомологии с первичной структурой известных редуктаз. Комплементация исследуемого препарата НР-азы с дефектной по Мосо НР-азой мутанта nit-1 гриба N. crassa не приводила к появлению активной НР-азы, что указывало на отсутствие молибдена и Мосо в составе активного центра фермента (Таблица 3).

Прямое определение металлов методами плазменной атомно-эмиссионной спектрометрии и плазменной масс-спектрометрии также показало отсутствие молибдена. Полученные данные указывают на то, что НР-аза, выделенная из штамма AGJ, является новым ферментом и принадлежит к классу альтернативных НР-аз, не содержащих молибден и Мосо.

Рис. 6. SDS (1, 2) и нативный (3-6) -электрофорез гомогенного препарата НР-азы из клеток Holomonas sp. штамм AGJ 1-3. 1 - белки-стандарты; 2 - гомогенный препарат НР-азы; Полианионредуктазная активность: 3 - контроль (окраска на белок); в присутствии: 4 – NO3–; 5 - NO2–; 6 - ClO3–.

Фермент характеризуется достаточно высоким содержанием “cтрессорных” аминокислот - глицина (15%) и аланина (13,6%), характерных для участков - спирали полипептидной цепи. Согласно данным металлоанализа и спектрометрии (характеристическое плечо в области 410 нм на спектре поглощения), фермент содержит ионы железа, однако пока остается неясным, в какой именно форме. Для установления природы активного центра, содержащего железо, необходимо проведение дальнейших исследований.

Несмотря на высокую щелочность среды роста клеток (рН 10,5), фермент имел четко выраженный оптимум при рН 7,0, что позволило высказать предположение о наличии в клетках высокоэффективных механизмов поддержания внутриклеточного рН-гомеостаза.

Таблица 3. Свойства гомогенного препарата НР-азы из клеток Holomonas sp.

штамм AGJ 1-3.

Удельная активность, мкмоль NO2-/мин*мг Субъединичный состав Мономер Молекулярная масса, кДа Металл в активном центре Fe Наличие Мосо отсутствует Температурный оптимум, оС 70-Термостабильность (I0,5 при 70 оС), мин рН оптимум 7,Влияние ингибиторов:

I0,5 (N3-), мкМ 36,I0,5 (CN-), мкМ 110,Субстратная специфичность: NO3–, ClO3–, NO2– Необычным свойством фермента является достаточно высокий температурный оптимум, составляющий 70 – 80 оС, и высокая термостабильность (галоалкалофильные бактерии, отнесенные к роду Halomonas, являются мезофилами). Повышенный температурный оптимум наблюдался у всех выделенных до сих пор безмолибденовых НР-аз и, по-видимому, является их отличительным признаком.

Причины высокой термостабильности и повышенного температурного оптимума НР-азы пока остаются неясными. Существует гипотеза, согласно которой содовые озера, являющиеся экологической нишей современных алкалофильных микробных сообществ, представляют собой модель жизни на континентах в докембрии (около 4 млрд. лет назад) и могут рассматриваться как центры происхождения микробного разнообразия [Заварзин и Жилина, 2000].

Поскольку этот геологический период сопровождался активной вулканической деятельностью, адаптация алкалофилов к существованию при высокой температуре окружающей среды являлась необходимым условием их выживания, обеспечивая тем самым развитие всей прокариотной биосферы, и сохранилась в их биологической памяти.

НР-аза штамма AGJ восстанавливала не только нитрат, но и нитрит и хлорат (Рис. 5, Таблица 3). Активность с нитритом составляла приблизительно 5 % от НРазной активности и проявлялась только в случае отсутствия нитрата в реакционной смеси. Способность к восстановлению ряда анионов была впервые показана для гем с-содержащего мембранного ферментного комплекса железовосстанавливающей бактерии Geobacter metallireducens [Murillo et al., 1999], катализирующего превращение нитратов, нитритов, хлоратов, селенатов, фумаратов и тиосульфатов. Не исключено, что именно перестройка активного центра, связанная с отсутствием в нем молибдена, обуславливает способность фермента к восстановлению ряда анионов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате проведенных исследований было обнаружено, что ответ микроорганизмов на воздействие факторов стресса зависит от особенностей метаболизма данного организма и природы фактора стресса. Выращивание гриба Fusarium oxysporum 11dn1 в условиях варьирования концентраций кислорода вызывало кардинальную перестройку метаболизма организма - переход от ассимиляторного типа азотного обмена к диссимиляторному. Рост дрожжей Rhodotorula glutinis на среде с высокими концентрациями вольфрама (антагониста молибдена), приводил к синтезу новой вольфрам-устойчивой формы НР-азы, одновременно синтезировался(лись) и вольфрам-связывающий(ие) белок(и), способствуя уменьшению внутриклеточной концентрации вольфрама. Рост бактерий Halomonas sp. в экстремальных условиях (высокая концентрация солей, рН 10,5) сопровождался синтезом альтернативной (безмолибденовой) НР-азы, отличающейся от “нормальных” НР-аз не только по строению активного центра, но и по своим физико-химическим свойствам (высокий оптимум температуры – 70оС, полианионредуктазная активность и др.).

ВЫВОДЫ.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»