WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |
на правах рукописи Морозкина Елена Владимировна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СТРЕССА НА СВОЙСТВА НИТРАТРЕДУКТАЗ МИКРООРГАНИЗМОВ.

Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2005 Работа выполнена в лаборатории биологического окисления Института биохимии им А.Н. Баха РАН Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Н.П. Львов доктор биологических наук, профессор Р.А. Звягильская Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Г.И. Эль-Регистан кандидат биологических наук О.В. Королева Ведущая организация: Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино Защита состоится «25 октября 2005 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.

33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «15» сентября 2005 г Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В последние десятилетия огромный интерес исследователей вызывает изучение действия факторов стресса на рост и развитие микроорганизмов. Согласно современным представлениям стрессогенными факторами считают не только экстремальные значения рН, температуры, высокие концентрации солей, но и другие факторы, не являющиеся традиционными для жизнедеятельности данного вида микроорганизмов. Особого внимания заслуживает ключевой фермент азотного обмена - нитратредуктаза (НР-аза), поскольку понимание механизмов его функционирования в “нормальных” условиях и условиях стресса (которым часто подвергаются микроорганизмы и растения), имеет не только фундаментальное, теоретическое, но и большое практическое значение. Несмотря на разнообразие форм НР-аз и различную локализацию в клетке, все до сих пор исследованные НР-азы микроорганизмов и растений, выращенных в “нормальных” условиях, содержали в активном центре молибден в виде молибденового кофактора (Мосо). Лишь в самое последнее время появились первые указания на то, что “необычные” условия жизнедеятельности микроорганизмов (высокие концентрации железа, ванадата и др.) могут приводить к структурной модификации НР-азы, связанной с перестройкой ее активного центра. Так, из диссимиляторной ванадат-восстанавливающей бактерии Pseudomonas isachenhovii, выращенной на среде с ванадатом и нитратом, в нашей лаборатории вперые были выделены две НР-азы (периплазматическая и мембранносвязанная), не содержащие молибден и молибденовый кофактор [Antipov et al., 1998]. Периплазматическая НР-аза содержала в активном центре ванадий, что могло быть связно с условиями обитания микроорганизма. Из железо-восстанавливающей бактерии Geobacter metallireducens, выращенной на среде, содержащей нитрат или железо, был выделен гем-содержащий мембранный ферментный комплекс, способный восстанавливать нитраты и не содержавший в своем составе молибден [Murillo et al., 1999]. Следовательно, изучение влияния факторов стресса на азотный обмен в целом и, в частности, на его ключевой фермент – НР-азу, является актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы стало изучение влияния факторов стресса на свойства и структуру НР-азы у прокариот (галоалкалофильные бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3) и эукариот (гриб Fusarium oxysporum, солетолерантные дрожжи Rhodotorula glutinis). Спектр стрессогенных факторов включал высокие концентрации солей, щелочные значения рН, смену условий культивирования (аэробиоз-анаэробиоз).

Научная новизна.

• Обнаружено, что гриб F. oxysporum штамм 11dn1 способен к денитрификации в анаэробных условиях, что выделяет его среди других эукариотических организмов. Гриб синтезирует de novo активную диссимиляторную НР-азу, существенно отличающуюся по своим свойствам от ассимиляторного фермента.

• Показано, что солетолерантные дрожжи Rhodotorula glutinis в ответ на воздействие 1 мМ вольфрамата способны синтезировать вольфрамсвязывающий белок, сорбирующий до 4,6-9,9 мкг вольфрама /мг белка.

Синтезируемая при этом НР-аза характеризуется необычной устойчивостью к высоким концентрациям вольфрама (сохранение 100 % -ой активности при воздействии 1 мМ вольфрамата).

• Обнаружено, что НР-аза галоалкалофильной денитрифицирующей бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3 не содержит молибден и Мосо, характеризуется высоким температурным оптимумом (70оС), повышенной термостабильностью и широкой субстратной специфичностью, что дает основание предполагать существование целого класса альтернативных безмолибденовых НР-аз, обладающих сходными свойствами.

Научно-практическое значение. Полученные данные позволяют существенно расширить представление о влиянии факторов стресса на свойства ключевого фермента азотного обмена - НР-азу. Настоящая работа является фундаментальным исследованием, однако уникальные свойства исследуемых НР-аз (высокий оптимум температуры, высокая стабильность и термостабильность) создают предпосылки для их практического применения в качестве биологических компонентов для очистки различных техногенных объектов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на XIII международной конференции молодых ученых по химии и химической технологии “МКХТ-99” (Москва, 1999), на школе-конференции “Горизонты физико-химической биологии” (Пущино, 2000), на III Съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), на школе-конференции “Биология – наука ХХI века” (Пущино, 2004).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, в числе которых 5 статей в ведущих российских журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 122 страницах. Список цитируемой литературы включает 231 наименований, в том числе 213 на иностранных языках. Иллюстративный материалы содержит рисунков и 7 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объекты исследования.

В работе использовали прокариотические (галоалкалофильные бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3) и эукариотические (микроскопические грибы Fusarium oxysporum штамм 11dn1 и солетолерантные дрожжи Rhodotorula glutinis) микроорганизмы.

Условия выращивания микроорганизмов.

Fusarium oxysporum штамм 11dn1 выращивали, как описано ранее [Kurakov et al., 2000]. Для создания анаэробных условий среду продували аргоном в течение мин.

Солетолерантный штамм дрожжей Rhodotorula glutinis выращивали на среде, не содержащей молибден, с добавлением высоких (0,33 г/л) концентраций Na2WO4*2H2O [L'vov et al., 2000]. В качестве контроля использовали среду аналогичного состава, не содержащую вольфрамат натрия.

Клетки галоалкалофильной денитрифицирующей бактерии Halomonas sp., штамм о AGJ 1-3, культивировали анаэробно в течение 2-3 дней при 30 С в 5-литровых бутылях в среде, содержащей (г/л): Na2CO3-20; NaHCO3-10; NaCl-5; K2HPO4-1;

КNO3-1; MgSO4*7H2O-0,1; дрожжевой экстракт-0,2; CH3COONa*3H2O-1,0;

Na2S2O3*5H2O-0,25, рН 10,5, и микроэлементы (1мл/л) по Пфенигу [Pfennig and Lippert, 1966] Получение бесклеточного экстракта.

Мицелий гриба F. oxysporum отделяли фильтрованием от культуральной среды, промывали дистиллированной водой, суспендировали в 0,1 М Naфосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,5 мМ РМSF (ингибитор протеаз), замораживали в жидком азоте и растирали в ступке в течение 5-7 мин.

Полученный гомогенат центрифугировали при 12 000 g в течение 30 мин и использовали супернатант для дальнейшей очистки.

Клетки дрожжей Rh. glutinis и бактерий Halomonas sp. осаждали центрифугированием при 7 000 g и 4°С в течение 15 минут, суспендировали в мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 0,5 мМ Na-ЭДТА и 0,3 мМ PMSF, и разрушали с помощью Френч-пресса при давлении 200-220 атм. Гомогенат центрифугировали при 15 000 g в течение 30 мин и полученный супернатант использовали для выделения гомогенных препаратов НР-аз.

Для выделения и очистки НР-аз использовали ионообменную хроматографию, гель-хроматографию и препаративный электрофорез.

Определение активности НР-азы.

Для определения метилвиологен-зависимой активности НР-азы в качестве донора электронов использовали восстановленный дитионитом метилвиологен (или бромфеноловый голубой). Реакционная смесь содержала: 80 мМ Naфосфатный буфер, pH 7,0, 0,8 мМ метилвиологен (или 0,5 мМ бромфенол); 20 мМ KNO3; 2,0 мМ дитионит натрия и исследуемый препарат (20_100 мкл). Реакцию инициировали добавлением дитионита и останавливали встряхиванием до исчезновения голубой окраски. Содержание нитритов в реакционной смеси определяли, как описано ранее [L'vov et al., 2000].

NADH - и NADPH – зависимую НР-азную активность определяли при 30 оС в течение 15 мин, используя реакционную смесь, содержащую: 60 мМ Naфосфатный буфер, рН 7,0; 0,15 мМ НАДФН; 0,01 мМ; 10 мМ KNO3 и 2,5 мМ NaMоO4*2H2O. Реакцию начинали добавлением NADH (NADPH) и останавливали кипячением в течение 15 минут для удаления избытка NADH (NADPH), мешающего окраске на нитриты. За единицу активности НР-азы принимали количество фермента, катализирующего образование 1 нмоль NO2– за 1 мин при оптимальной температуре.

Определение активности Мосо основано на использовании мутанта nit-1 гриба Neurospora crassa, содержащего дефектную по Мосо НР-азу. При комплементации Мосо с апоНР-азой мутанта nit-1 происходит сборка функционально активного фермента. Мутант nit-1 гриба N. сrassa выращивали и получали из него бесклеточный экстракт, как описано ранее [Nason et al., 1970]. Комплементацию исследуемых нами образцов с мутантом nit-1 гриба N. crassa проводили по методике, указанной в протоколе [Hawkes and Bray, 1984]. Активность вновь образовавшейся in vitro НР-азы определяли используя NADPH в качестве донора электронов.

Молекулярную массу белков оценивали методом гель - хроматографии на колонке Toyopearl HW-55 (2,9 х 61 см), уравновешенной 50 мМ Na-фосфатным буфером, рН 7,0, содержащим 0,1 М NaCl и 1 мМ ЭДТА. Элюцию белков проводили при температуре 4оС. Использовали следующие стандартные белкиметчики: ферритин (470 кДа), алкагольдегидрогеназу (150 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), цитохром С (12,3 кДа).

Нативный (неденатурирующий) электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ-ЭФ) проводили, используя градиент (5-15% в пластине размером 11х11см и толщиной 1 мм в буфере Tris-HCl, рН 8,8, по методу Дэвиса [Davis, 1965]. Для определения молекулярной массы гомогенного препарата НР-азы использовали высокомолекулярные белки-стандарты (Pharmacia Electrophoresis HMW Calibration Kits).

Субъединичный состав белков определяли методом электрофореза в денатурирующих условиях по методу [Laemmli, 1970] в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия и при концентрации разделяющего геля 5-20%. Белковые полосы окрашивали серебром по методу [Nesterenko, 1994].

Определение ферментативной активности в ПААГ проводили, используя в качестве хромогена раствор, содержащий: 0,1 М Na-фосфатный буфер, рН 6,8, мМ KNO3 (или 1мМ NaNO2, 1мМ KClO3), 1 мМ метилвиологен и 5 мМ дитионит натрия. Гель инкубировали в растворе хромогена при 70оС до появления на синем фоне геля прозрачных полос, образующихся вследствие окисления метилвиологена ферментом. Для фиксации окраски использовали 0,05% раствор трифенилтетразолийхлорида и 5% уксусную кислоту.

Содержание металлов в гомогенных препаратах НР-аз определяли методами плазменной атомно-эмиссионной спектрометрии и плазменной массспектрометрии на приборах Optima 2000 DV (PerkinElmer, США) и ELAN (PerkinElmer, США).

Содержание вольфрама определяли с помощью разработанного нами кинетического метода, основанного на способности молибдена и вольфрама катализировать реакцию окисления рубеановодородной кислоты. Диапазон измеряемых концентраций составил 0,05 до 0,4 мкг вольфрама/мл.

MALDI масс-спектрометрия. Масс-спектры гомогенного препарата НР-азы получали на MALDI-TOF-масс-спектрометре Reflex III (“Bruker”, США) с УФлазером (336 нм) в режиме положительных ионов в диапазоне масс 500-8000 Да.

Идентификацию белков проводили с помощью программы Mascot, Peptide Fingerprint (“Matrix Science”, США), с точностью определения массы МН+, равной 0,01%, и по базам данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI). Данные, приведенные в таблицах и на рисунках – средние арифметические значения из трех и более повторностей; стандартное отклонение которых не превышало 5% РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

I. Изучение свойств НР-азы гриба Fusarium oxysporum штамм 11dn1 при смене условий аэрации мицелия.

Из 50 изученных нами видов микроскопических грибов только Fusarium oxysporum, штаммы 11dn1 и 301, Fusarium solani 302 и Drechslera sp. 22dnоказались способными осуществлять процесс денитрификации на среде с нитратом в анаэробных условиях, при этом у них наблюдалось резкое увеличение активности НР-азы. Наиболее выраженное увеличение активности НР-азы (в раз), связанное с изменением условий аэрации, наблюдали у штамма 11dn1 гриба F. оxysporum, который и был выбран для дальнейших исследований.

Мицелий, выращенный аэробно на среде, содержащей 5 мМ аммоний (репрессор синтеза ассимиляторной НР-азы) в течение 72 часов, переносили на среду с нитратом (10 мМ) и последовательно инкубировали сначала в анаэробных (22 ч), а затем в аэробных (32 ч) условиях. Перенос мицелия из аэробных в анаэробные условия сопровождался резким увеличением активности НР-азы через 5 часов, высокая активность фермента сохранялась в ходе всего периода инкубации мицелия в анаэробных условиях, но резко снижалась до исходного уровня после смены анаэробных условиий на аэробные (Рис. 1). Активность НРазы в контрольном варианте мицелия, выращенного на среде с аммонием, перенесенного на нитрат-содержащую среду и инкубированного в аэробных условиях, изменялась незначительно, в пределах 20-22 нмоль/мин.мг (Рис. 1).

Перенос мицелия Анаэробные условия NO3Аэробные Аэробные условия, условия, NH4+ NO3К 0 72 80 90 100 110 120 Время, ч Рис. 1. Активность НР-азы F. оxysporum 11dn1 при смене условий аэрации.

Активность нитратредуктазы, нмоль NO /мин на мг К – контрольный вариант (аэробные условия в течение всего эксперимента).

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»