WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 ||

при использовании в качестве субстрата gp120I-III и гликозилированного полноразмерного gp120, а также контрольного субстрата – БСА. Продукты гидролиза анализировали при помощи ДСНПААГ и блоттинга (Рис. 32). Распад контрольного субстрата БСА под действием антител не наблюдался ни в одном из случаев. В то же время при инкубации антител, выделенных из мышей группы SJL-3, с gp120I-III и гликозилированным gpнаблюдалось появление единственного крупного продукта расщепления, обозначенного треугольником. В случае негликозилированного gp120I-III разница в молекулярной массе субстрата и продукта гидролиза, рассчитанная по изменению подвижности полос, составила около 3 кДа, что соответствует расположению сайта гидролиза в районе C-конца gp120 перед гексагистидиновым кластером либо в Nконцевой части белка.

Для точного определения сайта гидролиза gp120 антителами был использован слитный белок Trx-gp120I-III, полученный в растворимой форме. Он содержит одиночный гексагистидиновый кластер между доменами тиоредоксина и gp120 и два кластера на C-конце белка. Для отделения пептидных продуктов протеолиза gpи точного измерения их молекулярной массы была применена масс-спектометрия SELDI. Наличие у предполагаемых продуктов реакции гексагистидиновых класте Рис. 32. Катализируемый антителами гидролиз gp120I-III по данным ДСН-ПААГ (A), гликозилированного gp120 по данным ДСН-ПААГ (Б) и иммуноблоттинга (В); отсутствие гидролиза биотинилированного БСА по данным ДСН-ПААГ (Г) и иммуноблоттинга (Д). Гели окрашивали серебром (А, Б, Г) либо проводили иммуноблоттинг с использованием конъюгата нейтравидина и пероксидазы хрена (В, Д). Молекулярные массы полос маркера указаны стрелками и приведены в кДа, тяжелые цепи IgG, легкие цепи и продукты распада gp120 отмечены надписями Hc, Lc и треугольником, соответственно. Ат – антитела.

ров позволило использовать мишень, содержащую иммобилизованные комплексы нитрилтриуксусной кислоты и ионов никеля. Масс-спектрометрический анализ продуктов гидролиза Trx-gp120I-III под действием антител показал (рис. 33), что основной пик на опытном спектре соответствует пептиду с молекулярной массой 5526.8 Да, что соответствует расположению сайта гидролиза между остатками Pro493 и Leu494 (позиции обозначены в соответствии с номенклатурой HXB2CG).

В молекуле слитного белка Trx-gp120I-III этот сайт соответствует позициям 484485; теоретическая молекулярная масса отщепляемого пептида – 5528 Да, что соответствует ошибке определения 0,02%.

Выявленный сайт гидролиза находится в относительно консервативной области gp120. Согласно сведениям базы данных, содержащей большинство известных вариантов последовательностей белка gp120 ВИЧ-1 (HIV Sequence Database, 2002), 12-членный пептид, окружающий сайт гидролиза, содержится полностью в 34% последовательностей. 7-членные пептиды, содержащие сайт гидролиза и составляющие типичный линейный эпитоп, узнаваемый антителами, содержатся целиком в 48% последовательностей (среднее значение для 6 возможных пептидов). Таким Рис. 33. Масс-спектрометрический анализ гидролиза gp120 антителами.

По оси абсцисс отложено отношение массы молекулярных ионов к их заряду, по оси ординат - интенсивность сигнала. Основной пик, соответствующий C-концевому пептиду trxgp120I-III, обозначен стрелкой. Контрольные спектры сдвинуты вниз, молекулярные массы приведены в Да.

образом, около половины из охарактеризованных вариантов ВИЧ-1 потенциально чувствительны к действию изучаемых протеолитических антител.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые продемонстрирована каталитическая активность природных антител у мышей с SPF статусом линий MRL-lpr/lpr, SJL/J и NZB/NZW F1, характеризующихся как спонтанно возникающими, так и индуцируемыми аутоиммунными заболеваниями, что делает эти линии перспективной моделью для направленного получения и детального изучения специфических абзимов с различной активностью.

2. Впервые показана антиген-специфическая каталитическая активность аутоантител к основному белку миелина (ОБМ) у больных рассеянным склерозом (РС) и модельных животных, коррелирующая с тяжестью заболевания. Определены шесть преимущественных сайтов расщепления молекулы ОБМ абзимами, и оценены кинетические параметры данной реакции. По отношению к фрагментам ОБМ была изучена как связывающая, так и каталитическая активности аутоантител, выделенных из сывороток крови пациентов с РС, больных с другими нейродегенеративными заболеваниями, здоровых доноров и модельных животных. Гидролизу абзимами во всех приведенных случаях подвергался исключительно энцефалитогенный фрагмент ОБМ81-103. Обнаруженная связывающая и сайт-специфическая каталитическая активность анти-ОБМ антител при РС и других, мимикрирующих, нейродегенеративных заболеваниях позволила создать основу для новых дифференциальных методов диагностики РС.

3. На примере антитела 6B8E12 к субтилизину Карлсберг впервые показано, что антиидиотипические антитела, полученные к протеазе, могут осуществлять каталитическую функцию, схожую с первичным антигеном. Экспрессия антитела 6B8E12 в виде рекомбинантного одноцепочечного антитела и демонстрация его каталитической активности явилась наиболее убедительным доказательством «абзиматической» природы обнаруженной активности.

4. Впервые показано, что полученные в результате реакционной иммунизации пептидил дифенил фосфонатом (LAEEE-VPhos) поликлональные антитела обладают специфичностью по отношению к пептидному фрагменту «реакционного» гаптена и способны ковалентно взаимодействовать с фосфонатной составляющей, являющейся суицидальным ингибитором сериновых протеаз.

5. Разработана оригинальная схема иммунизации мышей линии SJL гибридным белком, состоящим из константных областей поверхностного антигена ВИЧ-gp120 и фрагмента ОБМ, приводящая к появлению протеолитических антител, из бирательно расщепляющих антиген. Показано, что полученные антитела способны специфически гидролизовать полноразмерный гликозилированный gp120, и установлен преимущественный сайт гидролиза gp120 Pro493-Leu494, находящийся в константной области белка. Разработанный подход может быть использован для получения «каталитических вакцин», способных целенаправленно разрушать белки, ответственные за развитие конкретных патологий.

6. При селекции полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека с использованием п-нитрофенил 8-метил-8азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфоната получены рекомбинантные одноцепочечные антитела, ковалентно взаимодействующие с необратимыми ингибиторами сериновых гидролаз. Определены аминокислотные остатки, участвующие в «ковалентном катализе». Показано, что отобранные рекомбинантные антитела способны гидролизовать амидную связь. Данные одноцепочечные антитела могут быть рассмотрены как пример простейшего устройства активного центра ферментов и использованы в качестве матрицы для получения новых искусственных ферментов методом целенаправленного улучшения их свойств.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи:

1. Н.А. Пономаренко, Е.С. Александрова, И.И. Воробьев, О.М. Дурова, А.В. Козырь, А.В. Колесников, Г.Б. Телегин, А.Р. Калинина, С.В. Сучков, А.Г. Габибов.

Каталитическая активность нативных антител у мышей с аутоиммунными нарушениями. // Доклады Академии Наук, 2000. Т. 375. С. 224-227.

2. N.A. Ponomarenko, O.M. Durova, I.I. Vorobiev, E.S. Aleksandrova, G.B. Telegin, O.G. Chamborant, L.L. Sidorik, S.V. Suchkov, Z.S. Alekberova, N.V. Gnuchev, A.G.

Gabibov. Catalytic antibodies in clinical and experimental pathology: human and mouse models. // J. Immunol. Methods. 2002. v. 269. №1-2 p.197-211.

3.А.Г. Габибов, А. Фрибуле, Д. Тома, А.В. Демин, Н.А. Пономаренко, И.И. Воробьев, Д. Пиле, М. Паон, Е.С. Александрова, Г.Б. Телегин, А.В. Решетняк, О.В.

Григорьева, Н.В. Гнучев, К.А. Малышкин, Д.Д. Генкин. Антитела – протеазы:

подходы к индукции каталитического ответа.// Биохимия, 2002, т. 67, с. 14131426.

4. Н.А. Пономаренко, О.М. Дурова, И.И. Воробьев, С.В. Сучков, А.Г. Габибов.

К вопросу о каталитической активности аутоантител при рассеянном склерозе.// Доклады Академии Наук, 2004 т.395, с.839-842.

5. Воробьев И.И., Пономаренко Н.А., Решетняк А.В., Дурова О.М., Мисиков В.К., Сучков С.В., Габибов А.Г. Каталитические антитела в медицине: специфическая деградация аутоантигенов и новые подходы к инактивации патогенов// Молекулярная медицина, 2004, №3, с.48-55.

6. Сучков С.В., Мисиков В.К., Дурова О.М., Черепахина Н.Е., Кимова М.В., Введенская О.Ю., Пономаренко Н.А., Пронина О.А., Котов С.В., Габибов А.Г.

Аутоантитела при рассеянном склерозе: патогенетическая и клиническая зависимость// Неврологический журнал, 2005, №4, т.10, с. 49-54.

7. С.В. Сучков, Т.Е. Наумова, А.Н. Хитров, В.А. Агеев, Е.А. Огнева, З.С. Алекберова, О.М. Дурова, Н.А. Пономаренко, А.Г. Габибов // Новые механизмы антителоопосредованной цитотоксичности и их возможная роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний// Молекулярная медицина, 2005, №1, С. 32-36.

8. Е.В. Калинина, Н.А. Пономаренко, О.М. Дурова, Ф.Н. Палеев, И.И. Воробьев, Н.Н. Кекенадзе, З.А. Шогенов, М.Е. Земцова, Н.В. Гнучев, А.Г. Габибов, С.В.

Сучков Каталитические аутоантитела при аутоиммунном миокардите: клиничкое и патогенетическое значение// Терапевтический архив, 2005, №(9), с. 65-70.

9. С.В. Сучков, З.С. Алекберова, Ф.Н. Палеев, Т.Е. Наумова, В.К. Мисиков, Е.С.

Кряжева, Н.А. Пономаренко, А.Г. Габибов // Достижения и перспективы клинической абзимологии// Вестник РАМН, 2005, №9, С. 38-43.

10. В.К. Мисиков, М.В. Кимова, О.М. Дурова, А.Г. Габибов, С.В. Сучков, И.И.

Воробьев, Н.А.Пономаренко Каталитические аутоантитела при рассеянном склерозе: патогенетические и клинические аспекты.// Бюл. Экс. Биол. Мед. т. 139. №(1), с. 98-101.

11. N. A. Ponomarenko, O. M. Durova, I. I. Vorobiev, A. A. Belogurov, A. G.

Petrenko, G. B. Telegin, S. V. Suchkov, V. K. Misikov, S. L. Kiselev, M. A. Lagarkova, V. M. Govorun, M. V. Serebryakova, B. Avalle, P. Tornatore, A. Karavanov, H.

C. Morse III, D. Thomas, A. Friboulet, A. G. Gabibov. Autoantibodies from MS patients and EAE developing mice exhibit site-specific cleavage of myelin basic protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006. V. 103. № 2, P.281-286.

12. N.A. Ponomarenko, O.M. Durova, I.I. Vorobiev, A.A. Belogurov, G.B. Telegin, S.V. Suchkov, V.K. Misikov, H.C. 3rd Morse, A.G. Gabibov. Catalytic activity of autoantibodies toward myelin basic protein correlates with the scores on the multiple sclerosis expanded disability status scale. // Immunol Lett. 2006. Т. 103. № 1 С. 4550.

13. Ponomarenko N.A., Vorobiev I.I., Alexandrova E.S., Reshetnyak A.V., Telegin G.B., Khaidukov S.V., Avalle B., Karavanov A., Morse H.C. 3rd, Thomas D., Friboulet A., Gabibov A.G. Induction of a protein-targeted catalytic response in autoimmune prone mice: antibody-mediated cleavage of HIV-1 glycoprotein GP120.// Biochemistry. 2006 Jan 10;45(1):324-330.

14. К.А. Мальцев, А.Н. Хитров, О.Ю. Введенская, Н.А. Пономаренко, М.А.

Исаева, М.В. Кимова, Е.Б.Третьяк, З.С. Шогенов, З.С. Алекберова, А.Г. Габибов, С.В. Сучков. //Каталитические аутоантитела - новый молекулярный инструмент в кардиологии и офтальмологии.// Терапевтический архив, 2006, №11, стр.70-76.

15. А.Н. Хитров, К.А. Мальцев, О.Ю. Введенская, Н.А. Пономаренко, М.А.

Исаева, М.В. Кимова, Е.Б.Третьяк, З.С. Шогенов, З.С. Алекберова, А.Г. Габибов, С.В. Сучков. //Каталитические аутоантитела как новый молекулярный ин струмент в ревматологической практике.// Терапевтический архив, №6, 2006, стр.59-66.

16. Gabibov A.G., Ponomarenko N.A., Tretyak E.B., Paltsev M.A., Suchkov S.V.

Catalytic autoantibodies in clinical autoimmunity and modern medicine.// Autoimmun Rev. 2006, №(5) p. 324-330.

17. Калинина Е.В., Воробьев И.И., Шогенов З.С., Пономаренко Н.А., Земцова М.Е., Дурова О.М., Палеев Ф.Н., Кекенадзе Н.Н., Габибов А.Г., Гнучев Н.В., Джанашия П.Х., Мальцев К. А., Сучков С.В. Феномен антителоопосредованного катализа при аутоиммунном миокардите.// Молекулярная медицина, 2006, №1, с.36-41.

18. Reshetnyak A.V., Armentano M.F., Ponomarenko N.A., Vizzuso D., Durova O.M., Ziganshin R., Serebryakova M., Govorun V., Gololobov G., Morse H.C.3rd, Friboulet A., Makker S.P., Gabibov A.G., Tramontano A. Routes to covalent catalysis by reactive selection for nascent protein nucleophiles.// J Am Chem Soc. 2007;v. 129, №(51), p. 16175-16182.

19. Ponomarenko N.A., Pillet D., Paon M., Vorobiev I..I, Smirnov I.V., Adenier H., Avalle B., Kolesnikov A.V., Kozyr A.V., Thomas D., Gabibov A.G., Friboulet A.

Anti-idiotypic antibody mimics proteolytic function of parent antigen.// Biochemistry.

2007, v. 46, №(50), p. 14598-14609.

20. А.В.Решетняк, М.Ф.Арментано, Г.С.Морзе, А.Фрибуле, С.П.Маккер, А.Трамонтано, В.Д.Кнорре, А.Г.Габибов, Н.А.Пономаренко. Механизмзависимая селекция библиотек генов иммуноглобулинов для получения ковалентных биокатализаторов.// Доклады Академии Наук, 2007, т. 415, №2, с. 268-272.

21. С.В. Сучков О.Ю. Введенская, И.В. Вострикова,А.Г. Габибов, М.В. Кимова, Ю.А. Бурдакова, Н.А. Пономаренко, М.А. Пальцев. Антителоопосредованный протеолиз ассоциированных с миелином белков как новый механизм контроля за процессами демиелинизации при рассеянном склерозе.// Вестник РАМН, 2007, №7, с. 32-36.

22. Белогуров А.А., Куркова И.Н., Мисиков В.К., Сучков С.В., Телегин Г.Б., Алехин А.И., Гончаров Н.Г., Кнорре В.Д., член-корреспондент РАН Габибов А.Г. и Пономаренко Н.А. К вопросу о субстратной специфичности каталитических аутоантител при нейродегенеративных процессах. // Доклады Академии Наук, 2007, т.413, №3, с. 408–411.

23. Belogurov A.A. Jr, Kurkova I.N., Friboulet A., Thomas D., Misikov V.K., Zakharova M.Y., Suchkov S.V., Kotov S.V., Alehin A.I., Avalle B., Souslova E.A., Morse H.C. 3rd, Gabibov A.G., Ponomarenko NA. Recognition and degradation of myelin basic protein peptides by serum autoantibodies: novel biomarker for multiple sclerosis.// J Immunol. 2008, v. 180, №2, p. 1258-1267.

24. Смирнов И.В., Воробьев И.И.,Фрибуле А.,Аваль Б., Тома Д., Кнорре В.Д., член-корреспондент РАН Габибов А.Г. и Пономаренко Н.А. Антиидиотипический подход для получения антитела-протеазы.// Доклады Академии Наук, 2008, т.420, №1, с. 1-4.

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»